CN103374616B

CN103374616B - 一种分离两个紧密连锁的水稻不育基因的方法

Info

Publication number: CN103374616B
Application number: CN201210125408.2A
Authority: CN
Inventors: 万建民; 赵志刚; 江玲; 张云辉; 刘喜; 刘世家; 陈亮明
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-04-25
Filing date: 2012-04-25
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2032-04-25
Also published as: CN103374616A

Abstract

本发明为一种分离两个紧密连锁的水稻不育基因的方法，属于水稻分子遗传学领域。以染色体片段置换系AIS34为母本、Asominori为父本杂交，F₁代开始，选择半不育植株进行杂交，得到BC₁F₁群体，在回交群体中通过分子标记辅助选择，结合表型鉴定，选择半不育的植株连续回交，一直回交到BC₄F₁世代，再自交得到分离群体，分别对两个紧密连锁的花粉不育基因和小穗不育基因进行定位。结果表明，通过这种方法，可将花粉不育基因精细定位在33kb区域，同时将紧密连锁的雌配子不育基因精细定位在90kb的区域内。

Description

一种分离两个紧密连锁的水稻不育基因的方法

技术领域

本发明属于水稻分子遗传领域，涉及一种分离两个紧密连锁的水稻不育基因的方法。

背景技术

Kubo等(1999，2002)利用分子标记辅助选择技术，构建了一套以粳稻品种Asominori为背景，籼稻品种IR24为供体的亚种间全基因组染色体片段置换系群体。我们经多年研究发现，其中一个置换系AIS34与Asominori杂交，F₁表现出半不育的特性。根据Kubo等(1999，2002)公布的原始图谱，AIS34在第4、6、8染色体具有小部分杂合基因型片段，在第5染色体具有部分置换的IR24染色体纯合基因型片段，其余部分均为Asominori背景基因型。在多年的种植中，我们发现AIS34置换系的株型等农艺性状有分离，但其育性始终是稳定的，说明在第4、6、8染色体上的基因型杂合区段并不影响小穗育性，即AIS34与Asominori杂交，F₁结实率表现出低育的特性，是由于第5染色体部分置换的IR24染色体片断与Asominori染色体形成的杂合基因型引起的。AIS34经多代自交后，我们从中选择到稳定的置换系AIS34，经分子标记检测，原置换系AIS34在第4、6、8染色体上对应的杂合型片段，在新的AIS34中已全部成为Asominori或IR24纯合基因型。经细胞学研究发现，AIS34与Asominori杂种F₁的花粉育性不正常，表现为半不育。且激光扫描共聚焦显微研究发现，杂种F₁的胚囊出现三种情况的异常；整体染色研究发现，F₁的受精率显著低于双亲。说明，胚囊部分败育也是导致杂交组合AIS34/Asominori杂种F₁部分不育的主要原因之一。

综合已有研究结果来看，目前对亚种间杂种不育的有关机理知之甚少，存在的主要原因有以下：1，籼粳交杂种F₁的主要表现为结实率低，而结实率是一个综合性状，它主要受花粉雄配子育性和雌配子育性的影响。2，籼粳交杂种不育的性状是一个数量性状，由多基因同时控制，研究起来非常困难。3，籼粳交杂种F₁的育性不稳定，容易受到外界的环境影响，如外界的低温容易导致杂种F₁的花粉育性变低。4，最后，籼粳交杂种F₁不育的模式虽然表现为等位基因的互作，但是常常在同一育性位点附近有多个不同类型的育性基因紧密连锁在一起，及在某一个染色体片段上同时存在控制花粉育性和雌配子育性的位点，这给研究雌雄配子的作用方式带来非常大的困难。目前研究还没有将紧密连锁的不同育性位点基因进行分离和克隆的报道。因此，本发明在以往研究基础上，以置换系AIS34为初始材料，构建AIS34/Asominori//Asominori回交群体，对引起AIS34/Asominori杂种F₁花粉不育基因和雌配子不育基因分别进行初定位。同时，通过分子标记筛选，对在该位点为杂合片段的植株，用轮回亲本Asominori回交、自交，结合表型鉴定，分别筛选出仅在不育位点有差异的不育株(在该位点为杂合基因型)和可育株(在该位点为纯合基因型)，经多代的回交和自交后，这样的不育株和可育株可看作近等基因系。在此过程中，应用分子标记，采用逐步逼近的方法，用大规模的群体和高密度的分子标记分别将杂种花粉不育基因和雌配子不育基因精细定位到较小的范围内。利用这种方法可以分别精细定位紧密连锁的控制不同类型的不育基因位点，为克服现阶段直接通过基因克隆来了解亚种间杂种不育的分子机理提供了一种较好的方法，为了解籼粳亚种间杂种F₁不亲和的分子机理和生理基础作出有益的探索，最终为籼粳亚种间杂交稻育种服务。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用染色体置换系分离和精细定位2个紧密连锁的水稻花粉不育和雌配子不育基因的方法。通过该方法可以较快地将2个紧密连锁的数量性状基因分离开，为大量性状基因的精细定位和图位克隆奠定基础，同时得到在育性位点为纯合基因型的单株，可在育种上直接利用，从而克服籼粳交杂种不育。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种分离两个紧密连锁的水稻不育基因的方法，包括：

1)以置换系AIS34(日本九州大学提供，该材料可购买索取)为母本、轮回亲本Asominori为父本进行杂交，从杂种BC₁F₁代开始，在杂交后代群体中，选择植株花粉育性和小穗育性都为半不育的植株，与轮回亲本Asominori再进行杂交；

2)上述单株种植后进行2个分子标记ZZ1和ZZ2的辅助选择，苗期各单株取叶片提取DNA，用ZZ1标记引物：

左端引物序列ZZ1-F：5′CCAGCCTCTACTACAACAGC 3′(SEQ ID NO.1)；

右端引物序列ZZ1-R：5′TGGATGAACAAGGAGGGAT 3′(SEQ ID NO.2)；

扩增上述各单株DNA，既能扩增得到193bp条带又能扩增到182bp条带的为含杂合片段的植株，只能扩增长度182bp条带的为纯合轮回亲本Asominori基因型的植株；选择既能扩增得到193bp条带又能扩增到182bp条带的含杂合片段的植株与轮回亲本Asominori再进行杂交；

另一个分子标记ZZ2位于置换片段的下端，ZZ2标记引物：

左端引物序列ZZ2-F：5′CCATCGCCGATCGTAGAT 3′(SEQ ID NO.3)；

右端引物序列ZZ2-R：5′AAGAAAGAAAAGGAGTCA 3′(SEQ ID NO.4)；

扩增上述各单株DNA，既能扩增得到218bp条带又能扩增到195bp条带的为含杂合片段的植株，只能扩增长度195bp条带的为纯合轮回亲本Asominori基因型的植株；选择既能扩增得到片段长度218bp的条带又能扩增到195bp条带的含杂合片段的植株与Asominori再进行杂交；

对获得的植株再进行表型的验证，选择植株花粉育性和小穗育性为半不育的单株，生育期、株高、株叶形态性状与轮回亲本Asominori一致的单株种植；选择4代后，自交一代，获得较大的分离群体进行花粉育性和小穗育性基因的定位；

3)通过分子标记ZZ1选择得到只有花粉半不育的单株，通过分子标记ZZ2选择得到只有小穗半不育的单株。在分离群体中进一步的开发分子标记，分别将花粉半不育基因和小穗半不育基因精细定位。

所述的分离两个紧密连锁的水稻不育基因的方法，优选包括：

(1)用AIS34与Asominori杂交，提取AIS34、Asominori和AIS34/Asominori F₁的叶片基因组DNA，合成第5染色体上引物：RM6300、RM7029、RM2010、RM5796、RM1024、RM5374、RM3345、ZZ3、ZZ4、ZZ5、ZZ6、ZZ7、ZZ8、ZZ9，对两个亲本和F₁进行分子标记检测，当连续多个标记在两亲本IR24和Asominori间具有多态性，而这些标记在AIS34/Asominori F₁中的DNA条带与Asominori相同时，则可认为置换的IR24染色体片段结束；

(2)AIS34/Asominori杂种雄配子不育基因的精细定位

AIS34/Asominori杂种不育基因的初步定位用AIS34/Asominori//Asominori回交群体，分别用花粉育性和结实率对引起AIS34/Asominori杂种F₁不育的基因进行初步定位；然后，再分别用花粉不育株和结实率低育株的单株与轮回亲本Asominori回交，根据基因初定位的结果，用分子标记ZZ1引物对ZZ1-F/ZZ1-R，对回交群体中花粉育性的个体进行基因型检测，选取在不育位点是杂合基因型而其余部分具有较多Asominori背景基因型的个体，与Asominori再回交，同时进行表型鉴定和分子标记检测，直至BC₄F₁，然后自交得到分离群体进行精细定位；

(3)AIS34/Asominori杂种雌配子不育基因的精细定位

在AIS34/Asominori//Asominori回交群体中低育性的个体进行基因型检测，选取不育位点是杂合基因型而其余部分具有较多Asominori背景基因型的个体再自交，用分子标记ZZ2引物对ZZ2-F/ZZ2-R，对所有的不育株和可育株进行分子标记检测，筛选出仅在不育位点有差异的不育株和可育株，经多代的回交和自交后，这样的不育株和可育株可看作近等基因系；在不育株和可育株近等基因系构建过程中，由于每一代均进行分子标记检测和表型鉴定，尤其在自交后代中，可获得大规模的自交群体，同时，通过自交，与杂种不育无关的位点将逐步纯合，这样在不育位点附近可不断加密分子标记，不断缩小不育位点两侧的分子标记距离，直至逼近该位点，最终精细定位。

步骤(3)所述的不育位点有差异的不育株在该位点为杂合基因型。

步骤(3)所述的可育株在该位点为纯合基因型，一种为纯合的Asominori基因型，另一种为纯合的IR24基因型。

结果表明，通过这种方法，可将花粉不育基因精细定位在33kb区域，同时将紧密连锁的雌配子不育基因精细定位在90kb的区域内。

有益效果

由于目前对亚种间杂种雌配子不育基因的研究还停留在定位阶段，对杂种雌配子不育基因的类型，作用方式，表达调控等知之甚少，因此无法根据预测基因的功能准确地选择候选基因。同时，研究发现在杂种F1中，如果存在两个不育位点，即使一个位点是纯合的，而另外一个位点是杂合的，则杂种小穗仍然表现低育性(Zhu等，2005)，这暗示一个位点基因的作用不能完全弥补另外一个位点因基因杂合而造成的小穗不育，即该基因的功能主要对该位点起作用。以上这些限制因素给有关杂种不育基因的转基因功能互补验证带来了困难。使得直接通过基因了解亚种间杂种雌配子不育的分子机理难度增大。

与现有技术相比，本发明所提供的一种分离两个紧密连锁的水稻不育基因的方法，具有如下优点：

1、本发明提供的方法在籼粳杂种不育基因定位和基因的克隆中有较大的优势。与传统定位方法相比，利用本方法，即利用染色体片段置换系和分子标记辅助选择的方法，能够快速地将花粉半不育和小穗半不育基因分离开来，可以排除遗传背景的影响，在全基因组鉴定出包含有不育基因位点的染色体片段，然后，通过构建次级分离群体，能够很快将不育位点进行精细定位。

2、杂种不育基因鉴定的指标属于数量性状，在统计学中为避免假阳性而提高最低显著水平标准常导致无法检测出效应值较低的QTL，即主效QTL会掩盖微效QTL的效应等等都会导致低估真实QTL数目，如在籼粳杂交不育基因位点中，我们都知道S5位点是一个效应非常大的位点(Chen et al.2008)，而往往由于它的存在，常常会掩盖其它微效QTL的效应，而通过使用全基因组染色体片段置换系就能够克服这个困难。

3、籼粳亚种间杂种不育主要是等位基因互作导致的，如采用生产上广泛应用的优异亲本作受体或背景亲本，把杂种不育基因位点进行籼粳置换，这种置换系就能直接作为杂交种的优良亲本加以利用，从而指导分子育种家采用染色体片段置换方法，来真正利用籼粳杂种优势。

附图说明

图1亲本及其杂种F₁的与花粉育性和小穗育性性状紧密连锁的简单重复序列(SSR)指纹图谱；

A图为ZZ1分子标记在群体的分布，其中1，7，8，11，12泳道代表亲本IAS34的带型；2，3，4泳道代表亲本Asominori的带型；6，9，10泳道代表花粉不育杂合株的带型。

B图为ZZ2分子标记在群体的分布，，其中1，7，8，11，12泳道代表亲本IAS34的带型；2，4，5，6泳道代表亲本Asominori的带型；3，9，10泳道代表小穗不育杂合株的带型。

图2亲本(Asominori和AIS34)和杂交组合F1(AIS34/Asominori)的花粉育性。

a为亲本Asominori，b为杂交组合F1；c亲本AIS34图3 亲本及其杂种F1的小穗育性分析图3亲本(Asominori和AIS34)和杂交组合F₁(AIS34/Asominori)的小穗育性，箭头表示不育的种子。

图4花粉育性紧密连锁的单株的表型分析，

A为W1065-1-1(BC5F2)花粉育性分布，横坐标表示花粉育性(％)，纵坐标表示单株数目，B为W1065-1-1(BC5F2)小穗育性分布，横坐标表示小穗育性(％)，纵坐标表示单株数目

图5 小穗育性紧密连锁的单株的表型分析

A为ZH6-6(BC5F2)花粉育性分布，横坐标表示花粉育性(％)，纵坐标表示单株数目，B为ZH6-6(BC5F2)小穗育性分布，横坐标表示小穗育性(％)，纵坐标表示单株数目。

图6 花粉半不育和小穗半不育基因的精细定位

具体实施方式

用AIS34与Asominori杂交，提取AIS34、Asominori和AIS34/Asominori F1的叶片基因组DNA，根据已发表的SSR分子标记连锁图谱和已公布的水稻全基因组序列，对照Kubo等(1999，2002)公布的原始图谱，合成第5染色体上相应的引物(表1)，对两个亲本和F₁进行分子标记检测，当连续多个标记在AIS34和Asominori间具有多态性，而这些标记在AIS34/Asominori F₁中的DNA条带与Asominori相同时，则可认为置换的IR24染色体片段结束。

表1 用于精细定位的分子标记

AIS34/Asominori杂种不育基因的初步定位

用AIS34/Asominori//Asominori回交群体，对引起AIS34/Asominori杂种F₁不育的基因进行初步定位。

不育株和可育株近等基因系的构建

用AIS34/Asominori与Asominori回交，根据基因定位的结果，用已明确的置换的IR24染色体片段内的分子标记，对回交群体中低育性的个体进行基因型检测，选取不育位点是杂合基因型而其余部分具有较多Asominori背景基因型的个体，与Asominori再回交，同时进行表型鉴定和分子标记检测，直至BC₄F₁，然后自交，同样对自交群体中低育性的个体进行基因型检测，选取不育位点是杂合基因型而其余部分具有较多Asominori背景基因型的个体再自交，对所有的不育株和可育株进行分子标记检测，筛选出仅在不育位点有差异的不育株(在该位点为杂合基因型)和可育株(在该位点为纯合基因型，一种为纯合的Asominori基因型，另一种为纯合的IR24基因型)，经多代的回交和自交后，这样的不育株和可育株可看作近等基因系。AIS34/Asominori杂种雌、雄配子不育基因的精细定位

在不育株和可育株近等基因系构建过程中，由于每一代均进行分子标记检测和表型鉴定(主要调查花粉育性和小穗育性)，尤其在自交后代中，可获得大规模的自交群体，同时，通过自交，与杂种不育无关的位点将逐步纯合，这样在不育位点附近可不断加密分子标记，不断缩小不育位点两侧的分子标记距离，直至逼近该位点，最终将花粉不育基因精细定位在20kb的区域内，将小穗不育基因精细定位到90kb范围内。

具体方法如下：

(一)水稻花粉育性和小穗育性的测定方法(Chaudhary 1981)：

①花粉育性调查：开花前，从每个单株的小穗上取3朵颖花，置于乙醇∶冰乙酸(3∶1)的溶液中于4℃冰箱保存。镜检时用1％I₂-KI染色、压片，10×20倍显微镜观察。每个颖花观察4个视野，保证花粉粒总数在200粒以上。根据花粉染色及形态判断其育性：圆形黑褐色的花粉粒为可育，形状不规则、黄色及不染色的花粉粒为不育。花粉育性用可育花粉百分率的平均值来表示(Chaudhary等，1981)。

②在成熟期，每单株取3穗，考察每穗上半部的结实率，取其平均值代表该单株的小穗育性。每个亲本种植20株，F₁种植10-20株，每个亲本和F₁分别取3-5株考察小穗育性，取其平均值代表该亲本和F₁的小穗育性，具体参见Wan等(1996)的方法。

(二)花粉半不育和小穗DNA指纹图谱的建立

1、水稻基因组DNA的分离采用微量法，具体步骤如下：

在分蘖期取亲本及各待测植株的新鲜叶片1张，在-20℃预冷研钵中用液氮研磨成粉末。然后转移到-20℃预冷的1.5ml离心管中，放入-20℃冰箱保存待用(过夜)。加入600ul SDS提取液摇匀，65℃，温浴30min。间或振荡3-4次。温浴至样液变墨绿色；加入1/4体积(约100ul)5M KAC、摇匀，冰浴30min。加入1/2体积(约300-400ul)的氯仿∶异戊醇(体积比：24∶1)，振荡器上充分摇匀(120rpm、30min)。离心：6000-8000rpm、15min，取上清。加入等体积(400ul左右)氯仿∶异戊醇(体积比：24∶1)，80-90rpm振荡30min。室温下6000-8000rpm离心15min。取上清。加入2倍体积(700ul左右)-20℃预冷的无水乙醇、摇匀。-20℃冰箱自由沉降20min。室温下12000rpm离心6min。弃上清，沉淀用等体积(400ul左右)70％乙醇洗涤10min。弃70％乙醇，DNA沉淀风干后，溶解于200ul TE(1/10)，4℃保存备用。用Perkin ElmerMBA 2000 DNA浓度测定仪测定，并平衡各个样品的DNA浓度为10-20ng/ul。用于PCR扩增。

2、微卫星的PCR扩增：PCR反应用10μl反应体系，包括：10mM Tris-HCl pH 8.3，50mMKCl，1.5mM MgCl₂，50μM dNTPs，0.2μM引物，0.5U Taq polymerase(TaKaRa，大连)和20ng DNA模板，扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃ 4min；94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，35个循环；72℃7min。

3、扩增产物的PAGE和银染检测：扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度为8％，凝胶大小180×120×2mm，电泳缓冲液为0.5×TBE，以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，200V恒压电泳。电泳结束后，凝胶用蒸馏水稍微冲洗。银染方法如下：含10％酒精，0.5％冰乙酸固定液固定2次，6分钟/次，然后0.2％AgNO₃溶液渗透10～12分钟，ddH₂O清洗2次，0.002％硫代硫酸钠溶液置代30s，用含NaOH1.5％、甲醛0.4％的溶液染色，最后用0.75％Na₂CO₃溶液终止显色反应。

4、花粉半不育和小穗半不育的SSR指纹图谱：亲本的SSR指纹图谱见图1，对苗期各单株取叶片提DNA，用分子标记ZZ1的引物进行扩增，扩增片段既有长度为193bp又有182bp片段的植株，即为杂合基因型的植株，扩增片段仅有长度为182bp片段的植株，即为具有轮回亲本纯合基因型的植株，因而该标记可用于花粉半不育基因型单株的选择。用分子标记ZZ2的引物进行扩增，扩增片段既有长度为218bp又有195bp片段的植株，即为杂合基因型的植株，扩增片段仅有长度为195bp片段的植株，即为具有轮回亲本纯合基因型的植株，因而该标记可用于小穗半不育基因型单株的选择。

Claims

1. 一种分离两个紧密连锁的水稻不育基因的方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）用AIS34与Asominori杂交，提取AIS34、Asominori和AIS34 /Asominori F₁的叶片基因组DNA，合成第5染色体上分子标记：RM6300、RM7029、RM2010、RM5796、RM1024、RM5374、RM3345、ZZ3、ZZ4、ZZ5、ZZ6、ZZ7、ZZ8、ZZ9的引物，对两个亲本和F₁进行分子标记检测，当连续多个标记在两亲本AIS34和Asominori间具有多态性，而这些标记在AIS34 /Asominori F₁中的DNA条带与Asominori相同时，则可认为置换的IR24染色体片段结束；其中，所述的分子标记RM6300的正向引物为SEQ ID NO.5，反向引物为SEQ ID NO.6；所述的分子标记RM7029的正向引物为SEQ ID NO.7，反向引物为SEQ ID NO.8；所述的分子标记RM2010的正向引物为SEQ ID NO.9，反向引物为SEQ ID NO.10；所述的分子标记RM5796的正向引物为SEQ ID NO.11，反向引物为SEQ ID NO.12；所述的分子标记RM1024的正向引物为SEQ ID NO.13，反向引物为SEQ ID NO.14；所述的分子标记RM5374的正向引物为SEQ ID NO.15，反向引物为SEQ ID NO.16；所述的分子标记RM3345的正向引物为SEQ ID NO.17，反向引物为SEQ ID NO.18；所述的分子标记ZZ3的正向引物为SEQ ID NO.19，反向引物为SEQ ID NO.20；所述的分子标记ZZ4的正向引物为SEQ ID NO.21，反向引物为SEQ ID NO.22；所述的分子标记ZZ5的正向引物为SEQ ID NO.23，反向引物为SEQ ID NO.24；所述的分子标记ZZ6的正向引物为SEQ ID NO.25，反向引物为SEQ ID NO.26；所述的分子标记ZZ7的正向引物为SEQ ID NO.27，反向引物为SEQ ID NO.28；所述的分子标记ZZ8的正向引物为SEQ ID NO.29，反向引物为SEQ ID NO.30；所述的分子标记ZZ9的正向引物为SEQ ID NO.31，反向引物为SEQ ID NO.32；

（2）AIS34 /Asominori杂种雄配子不育基因的精细定位

AIS34 /Asominori杂种不育基因的初步定位用AIS34/Asominori//Asominori回交群体，分别用花粉育性和结实率对引起AIS34 /Asominori杂种F₁不育的基因进行初步定位；然后，再分别用花粉不育株和结实率低育株的单株与轮回亲本Asominori回交，根据基因初定位的结果，用分子标记ZZ1引物对ZZ1-F/ZZ1-R，对回交群体中花粉育性的个体进行基因型检测，选取在不育位点是杂合基因型而其余部分具有较多Asominori背景基因型的个体，与Asominori再回交，同时进行表型鉴定和分子标记检测，直至BC₄F₁，然后自交得到分离群体进行精细定位；其中所述的用分子标记ZZ1引物对ZZ1-F/ZZ1-R，对回交群体中花粉育性的个体进行基因型检测方法为：

苗期各单株取叶片提取DNA，用ZZ1标记引物扩增上述各单株DNA，既能扩增得到193bp条带又能扩增到182bp条带的为含杂合片段的植株，只能扩增长度182bp条带的为纯合轮回亲本Asominori基因型的植株； ZZ1-F序列为SEQ ID NO.1，ZZ1-R序列为SEQ ID NO.2；

（3）AIS34 /Asominori杂种雌配子不育基因的精细定位

在AIS34/Asominori//Asominori回交群体中低育性的个体进行基因型检测，选取不育位点是杂合基因型而其余部分具有较多Asominori背景基因型的个体再自交，用分子标记ZZ2引物对ZZ2-F/ZZ2-R，对所有的不育株和可育株进行分子标记检测，筛选出仅在不育位点有差异的不育株和可育株，经多代的回交和自交后，这样的不育株和可育株可看作近等基因系；在不育株和可育株近等基因系构建过程中，由于每一代均进行分子标记检测和表型鉴定，尤其在自交后代中，可获得大规模的自交群体，同时，通过自交，与杂种不育无关的位点将逐步纯合，这样在不育位点附近可不断加密分子标记，不断缩小不育位点两侧的分子标记距离，直至逼近该位点，最终精细定位；其中所述的用分子标记ZZ2引物对ZZ2-F/ZZ2-R，对所有的不育株和可育株进行分子标记检测的方法为：苗期各单株取叶片提取DNA，用ZZ2标记引物扩增上述各单株DNA，既能扩增得到218bp条带又能扩增到195bp条带的为含杂合片段的植株，只能扩增长度195bp条带的为纯合轮回亲本Asominori基因型的植株；ZZ2-F序列为SEQ ID NO.3，ZZ2-R序列为SEQ ID NO.4。

2.根据权利要求1所述的一种分离两个紧密连锁的水稻不育基因的方法，其特征在于步骤（3）所述的不育位点有差异的不育株在该位点为杂合基因型。

3.根据权利要求1所述的一种分离两个紧密连锁的水稻不育基因的方法，其特征在于步骤（3）所述的可育株在该位点为纯合基因型，一种为纯合的Asominori基因型，另一种为纯合的IR24基因型。