CN103305507B - 玉米光周期基因特异分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子标记领域，具体地，涉及玉米光周期基因特异分子标记及其应用。本发明通过比对识别玉米3个光周期调控候选基因ZmPRR7，ZmZCN8，ZmPIF3在热带自交系CML166和温带自交系郑58的部分基因组DNA序列，设计3条不同的引物，其中一条引物为根据两个自交系中的相同序列设计的共同引物，另外两条引物为利用两个玉米自交系中的单碱基差异设计的郑58或CML166特异的PCR3’引物，这两条引物可分别与共同引物配对，使得每对引物仅在CML166或郑58一个自交系中或CML166×郑58杂交的F1中可以扩增出目标条带，且这些条带大小相同。在利用热带种质进行种质改良或自交系选育时、或玉米杂交种商品化制种时，都可以利用这些标记进行辅助选择育种和指导生产实际。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记领域，具体地，涉及玉米光周期基因特异分子标记及其应用。
背景技术
玉米作为重要的粮食、饲料和经济三元作物，在农业生产和国民经济中占有举足轻重的地位。来自玉米多样性中心的热带种质资源具有丰富的遗传变异类型，其中很多优良性状（如抗逆、抗病、抗虫等）是温带玉米所不具备的。将热带、亚热带玉米种质在温带育种中利用，可以拓宽温带玉米的种质基础，提高品种的抗逆、抗病虫能力，创造新种质，建立新的杂种优势模式。但光周期敏感性却限制了热带亚热带玉米种质在温带地区的利用和杂交种异地制种的质量产量。
光周期基因是一类整合了从光受体和生物钟传导过来的胞内信号，通过植物体内一系列反应和信号传递，从而实现日照长度对开花时间的调控的基因。目前，拟南芥和水稻在光周期调控基因取得显著进展，在玉米、小麦、大麦、烟草、牵牛花等多种植物中也发现了这些拟南芥光周期调控基因的直向同源物。虽然与拟南芥和水稻调控光周期反应的方式类似，但是有些基因在光周期途径中的调控位置及对环境信号的反应都在长期进化过程中发生了不同程度的调整，说明光周期调控基因在植物中具有一定的结构和功能保守性。与水稻相比，目前对玉米的光周期调控机制了解甚少。虽然玉米的60多个光周期调控位点已通过双亲作图群体进行了QTL初步定位，但这些QTL位点（DWARFT8除外）作用于光周期的分子基础尚不清楚。迄今为止，玉米中只发现少数与光周期相关的开花突变体，并且只有少量的开花基因（DWARFT8、DLF1、VGT1、ID1）被克隆。随着玉米全基因组测序的完成，为利用生物信息学方法对这些QTL区段进行分析从而预测玉米光周期候选基因提供了重要信息基础。通过巢式关联群体或类似的巢式关联的多个热带温带亲本重组自交系群体对不同日照长度反应的关联分析，将调控热带和温带玉米光周期性状的主要QTL定位于染色体的4个区域（ZmPR1-4），这4个区域包含有ELF4、Ghd7、Vgt1、ZCN8、CONZ1、HY1/SE5、TOC1/PRR7/PRR9、PIF3、CRY2、CCA1/LHY、ZCN1911个光周期候选基因。虽然基于玉米巢式关联群体关联分析能更好的提高作图群体的分辨率，减少环境互作，更好的检测上位性并能比较准确的预测玉米光周期相关的QTL位点，但这些主要QTL区域候选基因的与光周期的关系尚未经过证实。另一方面，玉米在由起源中心向世界各地传播过程中为适应不同光周期环境，经过长期自然选择和人工选择在开花位点积累了丰富的变异。因此，根据玉米光周期候选基因序列的这些特点，可以将这些待定的候选基因开发为依赖于PCR的功能基因分子标记。因此，在利用热带种质进行种质改良或自交系选育时、或玉米杂交种商品化制种时，都可以利用这些标记进行辅助选择育种和指导生产实际。这对于充分利用热带亚热带种质解决我国当前玉米生长上的种质资源基础狭窄问题，解决玉米杂交种的商品化制种区域局限性，节约成本，提高杂交种的商品性，具有重要的理论和现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供玉米光周期基因特异分子标记。
本发明的再一目的是提供上述玉米光周期基因特异分子标记的应用。
本发明通过比对识别玉米3个光周期调控候选基因ZmPRR7，ZmZCN8，ZmPIF3在热带自交系CML166和温带自交系郑58的部分基因组DNA序列，设计3条不同的引物，其中一条引物为根据两个自交系中的相同序列设计的共同引物，另外两条引物为利用两个玉米自交系中的单碱基差异设计的郑58或CML166特异的PCR3’引物，这两条引物可分别与共同引物配对，使得每对引物仅在CML166或郑58一个自交系中或CML166×郑58杂交的F1中可以扩增出目标条带，且这些条带大小相同，通过对比每对引物在两亲本及其杂交F1的PCR扩增结果，因此，当仅使用其中一对引物进行PCR扩增时，通过凝胶电泳即可检测热带自交系CML166×温带玉米自交系郑58的F2分离群体中的此标记的遗传分离情况。对比两对引物进行PCR扩增产物通过凝胶电泳得到的热带自交系CML166×温带玉米自交系郑58的F2分离群体中的此标记的遗传分离情况，结合SSR标记进行供试群体遗传连锁图谱的构建，并根据F2:3群体光周期表型调查数据进行QTL定位。可区分两亲本及其杂交F1不同的基因型，从而可以作为分子标记在F2分离群体中计算遗传交换率，显示为在热带自交系CML166和温带自交系郑58的光周期基因分子标记，用于构建遗传连锁群体。这将为从热带玉米群体中选育光周期敏感不敏感的自交系或辅助改良杂交种亲本的光周期敏感性提供了分子辅助选择基础。
根据本发明的具体实施方式，首先，克隆的玉米热带自交系CML166与温带玉米自交系郑58的ZmPIF3、ZmPRR7、ZmZCN8这3个光周期基因的核酸序列，该光周期基因的核酸序列具体为：
热带玉米自交系CML166中ZMPIF3基因的核酸序列如SEQ ID No.1所示；
温带玉米自交系郑58中ZMPIF3基因的核酸序列如SEQ ID No.2所示。
热带玉米自交系CML166中ZmPRR7基因的核酸序列如SEQ ID No.3所示；
温带玉米自交系郑58中ZmPRR7基因的核酸序列如SEQ ID No.4所示。
热带玉米自交系CML166中ZmZCN8基因的核酸序列如SEQ ID No.5所示；
温带玉米自交系郑58中ZmZCN8基因的核酸序列如SEQ ID No.6所示。
然后，采用CML166的ZmPIF3基因的部分DNA序列与郑58的序列相比，其中有一处发生颠换：CML166的碱基为G，而郑58的碱基为A。根据ZmPIF3基因这段序列单碱基差异的特点，分别将其设计为CML166或郑58特异的正向引物，而将其一段共用序列设计为反向引物,配对后形成两对引物:
(1)ZmPIF3-CML166：正向：5’-ACGCTGAGGGATGGATTGCTTG-3’
反向：5’-AATGCACTGACAAGATGGTGGCTATC-3’
(2)ZmPIF3-ZHENG58：正向：5’-ACGCTGAGGGATGGATTGCTTA-3’
反向：5’-AATGCACTGACAAGATGGTGGCTATC-3’
本发明还可以采用CML166的ZmPRR7基因的部分DNA序列与郑58的序列相比，其中有一处发生颠换：CML166的碱基为T，而郑58的碱基为C。根据ZmPRR7基因这段序列单碱基差异的特点，分别将其设计为CML166或郑58特异的正向引物，而将其一段共用序列设计为反向引物,配对后形成两对引物:
(1)ZmPRR7-CML166：正向：5’-TTGAGAACCTTGTTTCACTAAAGGA-3’
反向：5’-CCGTAAGTGCTGCTATGAAGGTAT-3’
(2)ZmPRR7-ZHENG58：正向：5’-TTGAGAACCTTGTTTCACTAAAGGA-3’
反向：5’-CCGTAAGTGCTGCTATGAAGGTAC-3’
本发明还可以采用CML166的ZmZCN8基因的DNA序列与郑58的序列相比，其中有一处发生颠换：CML166的碱基为A，而郑58的碱基为G。根据ZmZCN8基因这段序列单碱基差异的特点，分别将其设计为CML166或郑58特异的正向引物，而将其一段共用序列设计为反向引物,配对后形成两对引物:
（1）ZmZCN8-CML166：正向：5’-GAGAGTTCTAATAAGAGCAACGA-3
反向：5’-TGCAAGATTTAGGCATTTTGTTC-3’，
（2）ZmZCN8-ZHENG58：正向：5’-GAGAGTTCTAATAAGAGCAACGG-3’
反向：5’-TGCAAGATTTAGGCATTTTGTTC-3’
最后，根据基因序列信息计算的扩增片段长度（ZmPIF3：331bp，ZmPRR7：380bp，ZmZCN8：406bp）和引物设计的目的要求（仅采用一对引物扩增时，与其相匹配的材料出现目标条带而与其不匹配的材料则无，即每对引物仅在CML166或郑58一个自交系中或CML166×郑58杂交的F1中可以扩增出目标条带）判断PCR扩增的电泳图检测引物的正确性。然后筛选这两个亲本材料中出现扩增片段差异的引物，出现此种差异的为所需求的特异性引物。经检测，上述引物均达到筛选要求。具体为：
①采用ZmPIF3基因设计的两对引物，扩增CML166和郑58的片段长度均为331bp。采用正向引物ZmPIF3-CML166：5’-ACGCTGAGGGATGGATTGCTTG-3与反向引物5’-AATGCACTGACAAGATGGTGGCTATC-3’在CML166中进行PCR扩增出现目标片段，而郑58则无。采用正向引物ZmPIF3-ZHENG58：5’-ACGCTGAGGGATGGATTGCTTA-3’与反向引物5’-AATGCACTGACAAGATGGTGGCTATC-3’在郑58中进行PCR扩增出现扩增目标片段，而CML166则无。两对引物在CML166×郑58杂交的F1均扩增出目标条带(如附图1a)。
②采用ZmPRR7基因设计的两对引物，扩增CML166和郑58的片段长度均为380bp。采用引物ZmPRR7-CML166：正向5’-TTGAGAACCTTGTTTCACTAAAGGA-3与反向5’-CCGTAAGTGCTGCTATGAAGGTAT-3’在CML166中进行PCR扩增出目标片段，而郑58则无。采用引物ZmPRR7-ZHENG58：正向5’-TTGAGAACCTTGTTTCACTAAAGGA-3’,与反向5’-CCGTAAGTGCTGCTATGAAGGTAC-3’在郑58中进行PCR扩增出目标片段，而CML166则无。两对引物在CML166×郑58杂交的F1均扩增出目标条带(如附图1b)。
③采用ZmZCN8基因设计的两对引物，扩增CML166和郑58的片段长度均为406bp。采用正向引物ZmZCN8-CML166：5’-GAGAGTTCTAATAAGAGCAACGA-3与反向引物5’-TGCAAGATTTAGGCATTTTGTTC-3’在CML166中进行PCR扩增出目标片段，而郑58则无。采用引物ZmZCN8-ZHENG58：正向5’-GAGAGTTCTAATAAGAGCAACGG-3与反向5’-TGCAAGATTTAGGCATTTTGTTC-3’在郑58中进行PCR扩增出目标片段，而CML166则无。两对引物在CML166×郑58杂交的F1均扩增出目标条带（如附图1c）。
根据本发明的ZmPIF3、ZmZCN8、ZmPRR7基因的特异性引物，可以用于遗传图谱的构建。
1、F2遗传连锁图谱数据的获得
根据设计的ZmPIF3、ZmZCN8、ZmPRR7基因的特异性引物，分别按照筛选过程中的各个基因特异引物的PCR扩增体系和反应程序对CML166×郑58杂交的F2群体基因进行PCR扩增。采用与CML166匹配的引物扩增出现扩增目标条带，且采用与郑58匹配的引物扩增则不能扩增出目标条带的样品记作“A”，反之则记作“B”；皆出现扩增目标条带的记作“AB”(见图2)。
2、遗传图谱的构建
通过使用本发明所述的特异性扩增差异引物，以CML166×郑58杂交的F2群体材料的DNA为模板，通过PCR扩增检测其每份材料的扩增目标条带的情况（有/无），根据引物3’末端碱基的匹配与否直接影响PCR能否进行扩增原理，通过对比每对引物在CML166×郑58杂交的F2群体材料的PCR扩增结果，即可区分CML166×郑58杂交的F2群体材料不同的基因型（采用与CML166匹配的引物扩增出现扩增目标条带，且采用与郑58匹配的引物扩增并不出现扩增目标条带的样品基因型则与亲本CML166基因型相同，反之则样品的基因型与亲本郑58基因型相同，皆出现扩增目标条带的样品具有双亲的基因型），从而可以作为分子标记在F2分离群体中计算遗传交换率，用于构建遗传连锁群体。然后按照QTL lciMapping3.0软件的要求整理数据。结合已有的标记图谱数据，通过QTL lciMapping3.0软件处理，选择LOD值为3.0，将分析得到的数据再用此软件进行作图，得到遗传连锁图谱（如附图3）。
1、本发明使用的PCR体系，不需要特殊的PCR仪器和特殊的反应试剂，普通商业公司生产的产品均能达到要求。
2、本发明的PCR条件中对扩增效果影响最大的是特异引物的设计。本发明中所开发的光周期特异分子标记均来自本发明所获得的光周期基因片段，且用于扩增的特异标记的3条引物中，一条共用引物与其他两条引物分别配对形成两个引物对，进行PCR扩增时产生的片段虽然在长度上无差异，但在某一亲本自交系中只有与其完全配对一对引物可以扩增出条带，因此不会出现相互混淆或者干扰，可以保证结果准确。
3、利用碱基特异性设计了3对引物，结构简明，使用方便，且利用PCR技术检测快速高效，在短时间内能够精确鉴定不同来源的亲本玉米自交系，效果快捷明显，有良好的推广前景。
4、本发明所获得的玉米光周期特异分子标记为利用光周期敏感性不同的玉米材料进行高效转育并改良普通玉米栽培品种提供了分子辅助选择基础。
附图说明
图1：a、b、c显示光周期调控基因分子标记在CML166、郑58和CML166×郑58杂交F1的特异的电泳条带。
图2：（a）、（b）、（c）显示光周期调控基因分子标记在CML166×郑58的F2分离群体中电泳条带。
图3：（a）、（b）、（c）显示ZmPIF3、ZmPRR7、ZmZCN8基因分子标记在遗传连锁图谱中的遗传位置，其标记下面用“—”标出。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1：
1、基因序列：
首先利用本发明人克隆获得的玉米品种CML166和郑58的ZmPIF3基因的基因组DNA序列，通过软件Mega4.0比对核酸序列。
2、提取基因组DNA
采用CTAB法提取玉米自交系CML166与郑58的基因组DNA，以及CML166与郑58杂交F2群体的基因组DNA。
3、根据已知相关序列的差异部分设计引物：
比对ZmPIF3基因的CML166和郑58的部分DNA序列，CML166的ZmPIF3基因的DNA序列与郑58的序列相比，其中有一处发生颠换：CML166的碱基为G，而郑58的碱基为A。运用序列碱基发生颠换的特点，设计引物：
(1)ZmPIF3-CML166：正向：5’-ACGCTGAGGGATGGATTGCTTG-3’
反向：5’-AATGCACTGACAAGATGGTGGCTATC-3’
(2)ZmPIF3-ZHENG58：正向：5’-ACGCTGAGGGATGGATTGCTTA-3’
反向：5’-AATGCACTGACAAGATGGTGGCTATC-3’
4、PCR扩增：
以CML166和郑58的DNA为模板，应用步骤3设计的引物进行PCR扩增检测。
电泳检测：1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，130V，30min。
5、特异性扩增差异引物的筛选：
根据基因序列信息计算的扩增片段长度（ZmPIF3：331bp）和引物设计的目的要求（仅采用一对引物扩增时，与其相匹配的材料出现目标条带而另一材料无，即每对引物仅在CML166或郑58一个自交系中或CML166×郑58杂交的F1中可以扩增出目标条带）判断PCR扩增的电泳图检测引物的正确性。然后筛选这两个亲本材料中出现扩增片段差异的引物，出现此种差异的为所需求的特异性引物。经检测，步骤3所描述的引物均达到筛选要求（附图1a）。
6、遗传作图数据的获得：
根据获得的特异性差异扩增引物，分别按照筛选过程中的各自引物PCR扩增体系和PCR扩增程序对CML166×郑58杂交F2群体基因进行PCR扩增，与步骤4一致。采用与CML166匹配的引物扩增出现扩增目标条带，而当采用与郑58匹配的引物扩增并不出现扩增目标条带的样品记作“A”，反之则记作“B”；皆出现扩增目标条带的记作“AB”(附图2a)。
7、遗传图谱的构建
按照软件QTL lciMapping3.0的数据处理格式整理获得的CML166×郑58杂交F2群体的扩增数据，结合已有的标记图谱数据，设定LOD值为3.0分析数据，然后用此软件作图，获得遗传连锁图谱(附图2a)。
实施例2：
1、基因序列：
首先利用本发明克隆获得的玉米品种CML166和郑58的ZmPRR7基因的基因组DNA序列，通过软件Mega4.0比对核酸序列，获得序列比对。
2、同实施例1第2步。
3、根据已知相关序列的差异部分设计引物：
通过软件Mega4.0比对ZmPRR7基因的CML166和郑58的部分DNA序列，CML166的ZmPRR7基因的DNA序列与郑58的序列相比，其中有一处发生颠换：CML166的碱基为T,而郑58的碱基为C(附图2)。运用序列碱基发生颠换的特点，设计引物：
(1)ZmPRR7-CML166：正向：5’-TTGAGAACCTTGTTTCACTAAAGGAT-3’
反向：5’-CCGTAAGTGCTGCTATGAAGGTAT-3
(2)ZmPRR7-ZHENG58：正向：5’-TTGAGAACCTTGTTTCACTAAAGGAT-3’
反向：5’-CCGTAAGTGCTGCTATGAAGGTAC-3’
4、同实施例1第4步
5、特异性扩增差异引物的筛选
根据基因序列信息计算的扩增片段长度（ZmPRR7：380bp）和引物设计的目的要求（仅采用一对引物扩增时，与其相匹配的材料出现目标条带而另一材料无，即每对引物仅在CML166或郑58一个自交系中或CML166×郑58杂交的F1中可以扩增出目标条带）判断PCR扩增的电泳图检测引物的正确性。然后筛选这两个亲本材料中出现扩增片段差异的引物，出现此种差异的为所需求的特异性引物。经检测，步骤3所描述的引物均达到筛选要求（附图1b）。
6、同实施例1第6步(附图2b)。
7、同实施例1第7步(附图3b)。
实施例3：
1、基因序列：
首先利用本发明克隆获得的玉米品种CML166和郑58的ZmZCN8基因的基因组DNA序列，通过软件Mega4.0比对核酸序列，获得序列比对。
2、同实施例1第2步。
3、根据已知相关序列的差异部分设计引物：
通过软件Mega4.0比对ZmZCN8基因的CML166和郑58的部分DNA序列，CML166的ZmZCN8基因的DNA序列与郑58的序列相比，其中有一处发生颠换：CML166的碱基为A,而郑58的碱基为G。运用序列碱基发生颠换的特点，设计引物：
(1)ZmZCN8-CML166：正向：5’-GAGAGTTCTAATAAGAGCAACGA-3
反向：5’-TGCAAGATTTAGGCATTTTGTTC-3’
(2)ZmZCN8-ZHENG58：正向：5’-GAGAGTTCTAATAAGAGCAACGG-3’
反向：5’-TGCAAGATTTAGGCATTTTGTTC-3’
4、同实施例1第4步。
5、特异性扩增差异引物的筛选
根据基因序列信息计算的扩增片段长度（ZmZCN8：406bp）和引物设计的目的要求（仅采用一对引物扩增时，与其相匹配的材料出现目标条带而另一材料无，即每对引物仅在CML166或郑58一个自交系中或CML166×郑58杂交的F1中可以扩增出目标条带）判断PCR扩增的电泳图检测引物的正确性。然后筛选这两个亲本材料中出现扩增片段差异的引物，出现此种差异的为所需求的特异性引物。经检测，步骤3所描述的引物均达到筛选要求（附图1c）。
6、同实施例1第6步(附图2c)。
7、同实施例1第7步(附图3c)。
实施例4：
本实例以CML166×郑58杂交F2群体分析为例介绍本发明的应用过程。
1、基因的筛选
通过同源比较确定3个基因的基因组序列，并确认其在染色体上的位置与热带和温带玉米光周期群体的主要QTL区域候选基因相对应，然后根据基因序列设计引物用以检测表达水平。
2、遗传连锁图谱的构建
构建亲本为热带玉米自交系CML166×温带玉米自交系郑58的F2和F2:3群体，提取F2分离群体的基因组DNA，采用本发明的特异性引物对F2群体基因组DNA进行扩增。将扩增产物按本发明的电泳条件进行电泳，得到特异性电泳图谱（附图2）。设计3条不同的引物，其中一条为共用引物，另外两条引物可分别与其配对，使得每对引物仅在CML166或郑58一个自交系中或CML166×郑58杂交的F1中可以扩增出目标条带，且这些条带大小相同，通过对比每对引物在两亲本及其杂交F1的PCR扩增结果，即可区分两亲本及其杂交F1不同的基因型，采用与CML166匹配的引物扩增出现扩增目标条带，且当采用与郑58匹配的引物扩增并不出现扩增目标条带的样品记作“A”，样品基因型则与亲本CML166基因型相同，反之则记作“B”，样品的基因型与亲本郑58基因型相同，皆出现扩增目标条带的记作“AB”，样品具有双亲的基因型（附图2)。因此，当仅使用其中一对引物进行PCR扩增时,通过凝胶电泳即可检测热带自交系CML166×温带玉米自交系郑58的F2分离群体中的此标记的遗传分离情况。对比两对引物进行PCR扩增产物通过凝胶电泳得到的热带自交系CML166×温带玉米自交系郑58的F2分离群体中的此标记的遗传分离情况，按照软件QTLlciMapping3.0的数据处理格式整理获得的CML166×郑58杂交F2群体的扩增数据，结合已有的标记图谱数据，设定LOD值为3.0分析数据，然后用此软件对其作图，获得遗传连锁图谱（附图3）。
1、验证步骤3的结果
在雅安和西双版纳两地连续两年调查热带玉米自交系CML166×温带玉米自交系郑58的F2:3群体各个家系的光周期性状。与步骤3实验结果对比，验证光周期候选基因分子标记位点与QTL位点的一致性。
Claims (2)
1.用于鉴定玉米热带自交系CML166和玉米温带自交系郑58的光周期调控候选基因ZmPRR7、ZmZCN8、和ZmPIF3的基因型的特异性引物对，其特征在于，
鉴定光周期调控候选基因ZmPRR7的基因型的特异引物对为：
(1)ZmPRR7-CML166：正向：5’-TTGAGAACCTTGTTTCACTAAAGGA-3’
反向：5’-CCGTAAGTGCTGCTATGAAGGTAT-3’
(2)ZmPRR7-ZHENG58：正向：5’-TTGAGAACCTTGTTTCACTAAAGGA-3’
反向：5’-CCGTAAGTGCTGCTATGAAGGTAC-3’；
鉴定光周期调控候选基因ZmZCN8的基因型的特异引物对为：
(1)ZmZCN8-CML166：正向：5’-GAGAGTTCTAATAAGAGCAACGA-3
反向：5’-TGCAAGATTTAGGCATTTTGTTC-3’，
(2)ZmZCN8-ZHENG58：正向：5’-GAGAGTTCTAATAAGAGCAACGG-3’
反向：5’-TGCAAGATTTAGGCATTTTGTTC-3’；
鉴定光周期调控候选基因ZmPIF3的基因型特异引物对为：
(1)ZmPIF3-CML166：正向：5’-ACGCTGAGGGATGGATTGCTTG-3’
反向：5’-AATGCACTGACAAGATGGTGGCTATC-3’
(2)ZmPIF3-ZHENG58：正向：5’-ACGCTGAGGGATGGATTGCTTA-3’
反向：5’-AATGCACTGACAAGATGGTGGCTATC-3’。
2.权利要求1所述用于鉴定玉米热带自交系CML166和玉米温带自交系郑58的光周期调控候选基因ZmPRR7、ZmZCN8、和ZmPIF3的基因型的特异性引物对在玉米杂交育种中的应用。
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