CN105838789A - 玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记及其应用，属于作物遗传育种领域。已获得的玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻材料具有明显的节水耐旱表型，本发明根据玉米转录因子ZmPIF1基因的核苷酸序列，在CDS内设计分子标记的引物，运用PCR技术获得ZmPIF1的DNA片段并对该DNA片段进行测序，依据ZmPIF1的特异性片段筛选得到本发明分子标记的引物，从而获得玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻特异的分子标记。本发明的分子标记重复性好、扩增稳定、操作简便、成本低廉，可以用来检测水稻背景中的玉米ZmPIF1基因，为今后利用ZmPIF1基因转基因水稻进行分子标记辅助选择提供坚实的基础。

Description

玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及一种玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记及其应用，属于作物遗传育种领域。
背景技术
1、玉米ZmPIF1转录因子简介
全球干旱、半干旱地区约占耕地面积的一半，这些地区水分供应不足、森林植被疏稀、生态环境恶化、水土流失严重、自然灾害频繁；即使在土壤水分充足的情况下，水分亏缺也常常会发生，从而影响到光合作用、物质运输、蛋白质合成和细胞伸长等生理过程。干旱会造成植物不同程度的脱水，引起植物体内一系列的生理代谢变化，所以又将干旱、高盐等非生物胁迫称为水分胁迫或渗透胁迫。
植物应答渗透胁迫的过程是一个涉及到多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程，大体上可将这些基因及其表达产物分成两类：即功能蛋白和调节蛋白；功能蛋白是指在抵抗渗透胁迫中直接起作用的蛋白质；而调节蛋白是在逆境中参与各种信号转导或调控基因表达，间接起保护作用的蛋白，其主要包括：传递信号和调控基因表达的转录因子等。
植物在逆境胁迫下可诱导合成大量抗逆的化合物和蛋白质，这些与抗逆境相关的化合物和蛋白质又受转录因子在转录水平上的调控。转录因子可以通过与顺式作用元件结合，启动抗逆相关功能基因的转录，通过抗逆功能基因的表达使植物作出适应逆境胁迫的代谢调整。近年来，在提高作物抗逆性的分子育种中，研究重点已逐渐从改良个别基因转到改良或增强一个或多个发挥关键作用的转录因子上，这样能促使多个功能基因发挥作用，以期获得综合抗逆性状改良的植物。
光敏色素作用因子(phytochrome-interacting factors,PIFs)也称PILs(phytochromeinteracting factor-like)，属于拟南芥bHLH转录因子家族的第15亚族。植物PIFs家族转录因子能够与CANNTG序列(又称E-box)发生特异性作用，调节启动子中含E-box元件的功能基因或调控基因的表达，从而参与植物的各种抗逆性反应。目前利用农杆菌介导的转基因技术获得玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻，通过对其后代群体生理生化功能的研究，发现ZmPIF1基因的水稻转基因植株具有明显的抗旱表型；但目前还没有追踪玉米ZmPIF1基因的分子标记，而发展ZmPIF1基因有效的特异分子标记对ZmPIF1转基因材料的后续利用十分必要。
2、分子标记技术的发展
2.1基于分子杂交技术的分子标记
限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)，1974年Grodzicker等创立了RFLP技术，用作腺病毒温度敏感突变的遗传标记(Grodzicker etal,1974)，它是一种以DNA-DNA杂交为基础的第一代遗传标记。利用特定的限制性内切酶切割不同的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，通过凝胶电泳分离出不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。
2.2基于PCR技术的分子标记
2.2.1随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphism DNA,RAPD)
1990年由Williams等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法(Williams etal,1990)。它利用随机引物(一般为8～10bp)通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。但是RAPD受反应条件影响较大，因而其检测的重复性较差。
2.2.2序列标签位点(Sequence Tagged Sites,STS)
1989年Olson等提出，是对以特定对引物序进行PCR特异扩增的一类分子标记的统称。通过设计特定的引物，使其与基因组DNA序列中特定结合位点结合，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析其多态性。
2.2.3简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSR)
也称微卫星DNA(Tautz et al,1989；Love et al,1990)，是一类由1～6个碱基组成的基序(motif)串联重复序列，其中最常见是双核苷酸重复和三核苷酸重复，如(CA)n、(AT)n、(TG)n、(GGC)n、(GAT)n等。每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目一般为10～60，它们广泛分布于绝大多数真核生物基因组中，其高度多态性主要来源于串联重复数目的不同。微卫星序列两侧一般是相对保守的单拷贝序列，根据保守序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定多态性。SSR标记一般检测到的是单一的多等位基因位点，而且呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子。但是，传统的SSR分子标记开发方法工作量大，需花费大量人力、物力，而且效率较低。
2.2.4简单重复序列间区(inter-simple sequence repeat,ISSR)
Zietkeiwitcz等于1994年提出的一种以微卫星为基础的分子标记，它检测的是两个SSR之间的一段短DNA序列上的多态性。由于SSR序列广泛分布于高等生物的基因组中，所以ISSR具有很强的多态性。目前，ISSR标记已广泛应用于多种植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性等研究中，但在长穗偃麦草中没有进行研究。
2.2.5反转座子位点间扩增多态性(inter-retrotransposon amplified polymorphism,IRAP)
其原理是根据反转录转座子中LTR的保守序列设计引物，这些引物在PCR过程中可以与LTR序列退火，从而扩增出相邻的同一家族的反转录转座子成员间的片段。也可以根据反转录酶基因的相对保守序列设计引物进行扩增(Kalendar et al.1999)。目前，IRAP分子标记技术已应用于大麦(Kalendar et al,1999；Kalendar et al,2000；Leigh et al,2003)、柑橘(Bretó et al,2001)、网茅(Yannic et al,2004)、马铃薯等植物的遗传研究中。
2.2.6反转座子微卫星扩增多态性(retrotransposon microsatellite amplified polymorphism,REMAP)
是一种基于反转录转座子的标记技术(Kalendar et al,1999)，REMAP技术原理是根据反转录转座子的LTR保守序列和微卫星序列设计引物，然后进行PCR，扩增出反转录转座子与邻近的微卫星间的片段，从而检测出反转录转座子与邻近简单重复序列之间的多态性。
2.3基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记
扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)AFLP是1993年荷兰科学家Zbaeau和Vos发展起来的一种检测DN A多态性的新方法(Zbaeau etal,1993)。AFLP是RFLP与PCR相结合的产物，先利用限制性内切酶将基因组DNA切割成不同大小的DNA片段，再使双链人工接头与酶切片段相边接，作为扩增反应的模板DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加1～3个选择性核苷酸作引物对模板DNA基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。随着技术的不断完善和发展，AFLP技术已广泛应用于植物种质鉴定(Thomas et al,1995)、遗传图谱构建(Margues et al,1998)、目的基因定位及遗传多态性检测(Pakniyat et al,1997)等方面。
2.4基于DNA芯片技术的分子标记
2.4.1单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)
Lander于1996年提出的第三代DNA遗传标记，是指在基因组水平上由于单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性,其多态性频率大于1％。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测。
2.4.2多样性微阵列技术(Diversity arrays technology,DArT)
Jaccoud等于2001年开发了一种新的分子标记技术多样性微阵列技术(Diversity arraystechnology,DArT)，并成功应用于水稻研究中。DArT技术是依赖芯片杂交的方法来区分基因组中座位多态性的差异；将待检测的不同样本的基因组DNA等量混合后经相关限制性内切酶处理，根据电泳结果选择回收不同大小DNA片段及一系列DNA操作而达到基因组复杂性减少，该部分DNA即为基因组代表(Genomic representation)，并通过相关过程将该部分DNA固定到玻片上形成点阵列的芯片。以不同样本单独经同样内切酶处理所获的基因组代表为探针，并组成相应的探针组合对芯片进行杂交，由于不同样本的基因组DNA序列有差异，因而与芯片上同一点序列杂交的效率不一致，芯片上只有与探针DNA互补的点才具有杂交信号，通过扫描仪可识辨不同颜色杂交信号的强弱或有无来确定待检测样本的遗传差别。
发明内容
针对现有技术中存在的缺点与不足，本发明提供了一种玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻分子标记及其应用；已获得的玉米转录因子ZmPIF1基因的转基因水稻材料具有明显的节水耐旱表型；根据玉米转录因子ZmPIF1基因的核苷酸序列，在蛋白质编码区CDS内设计本发明分子标记的引物，运用PCR技术获得玉米转录因子ZmPIF1的DNA片段并进行测序，依据玉米ZmPIF1的特异性片段筛选得到本发明分子标记的引物，而获得玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻分子标记；该分子标记重复性好、扩增稳定、操作简便、成本低廉。
本发明的技术方案如下：
本发明所述的玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记，长度为1189bp，其扩增序列如SEQ ID No.1所示。
本发明所述的玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记的引物，其序列如SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示：
SEQ ID No.2：ZmPIF1-F 5'CCGAGCCACAATCTGAGTT 3'；
SEQ ID No.3：ZmPIF1-R 5'AGTATTTGTGGATCTCCGGT 3'。
本发明还公开了玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记在检测转基因材料或分子标记辅助选择育种中的应用。
玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记的制备方法如下：根据玉米转录因子ZmPIF1的核苷酸序列，在蛋白编码区内设计所述分子标记的引物，运用PCR技术获得玉米转录因子ZmPIF1的DNA片段并对该DNA片段进行测序，依据玉米转录因子ZmPIF1的特异性片段筛选得到所述分子标记的引物，从而获得所述玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记。
本研究以玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻DNA为实验组、以野生型水稻(武运粳7号)DNA为对照组，通过普通PCR扩增可区分实验组和对照组之间序列的差异片段，这些片段可视为玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻DNA的特异片段，再结合普通PCR的富集，能高效地扩增出玉米ZmPIF1的DNA片段；经回收、测序，最后转化成玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记。
本发明具有如下的有益效果：
1、本发明利用PCR技术，获得玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的特异分子标记1个，成功效率高达100％。
2、本发明的分子标记重复性好，扩增稳定，操作简便，成本低廉，可以用来检测水稻背景中的玉米ZmPIF1基因，为今后利用ZmPIF1基因转基因水稻育种中进行分子标记辅助选择提供坚实的基础。
附图说明
图1为玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻T2代纯合株系内荧光定量检测；其中，WT-野生型，VC-空载体，OE1-OE11为ZmPIF1转基因水稻；
图2(a)和(b)为玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻在土壤中的耐旱性研究；其中，WT-野生型，VC-空载体，OE1、OE3、OE7为ZmPIF1转基因水稻；
图3为基因组特异分子标记在不同玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻材料中的扩增；其中，泳道1-5为ZmPIF1转基因水稻T0代，泳道6为阴性对照，泳道7为阳性对照；
图4为玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻基因组特异分子标记的稳定性检测；其中，M为Marker DL2000，泳道1为质粒，泳道2、3为WT、VC，泳道4-14为11个ZmPIF1转基因水稻T2代纯系。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：实验材料的获得
根据ZmPIF1基因的序列设计引物，利用RT-PCR技术从玉米品种郑单958(购于扬州田源种业公司)总cDNA中扩增得到ZmPIF1基因；利用农杆菌介导法转化到野生型水稻植株(武运粳7号)，获得玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻。
实施例2：PCR引物序列
根据玉米耐旱相关的转录因子ZmPIF1基因的核苷酸序列，在蛋白编码区内设计引物，引物的序列如下：
ZmPIF1-F：5'-CCGAGCCACAATCTGAGTT-3'(SEQ ID No.2)，
ZmPIF1-R：5'-AGTATTTGTGGATCTCCGGT-3'(SEQ ID No.3)；
其扩增片段为1189bp，即为玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记的序列(SEQ IDNo.1)。
实施例3：玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻阳性植株的鉴定
采用SDS酚-氯仿法微量提取水稻基因组DNA，其步骤如下：
1.取两片幼嫩叶片(约0.2g)，剪碎装入2ml的离心管中，置于液氮中冷却，用筷子捣碎至粉末状；
2.加入700μl的抽提缓冲液A，轻轻混匀后，于65℃水浴30min(每5min上下颠倒混匀一次)；
3.取出稍冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿(各350μl)，上下颠倒充分混匀，抽提10min；
4.12000rpm，离心5min，吸取上清到一新的离心管中；
5.加0.7倍体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，可见絮状沉淀；
6.12000rpm，离心10min，弃去上清；
7.加入700μl的70％的乙醇清洗沉淀；
8.12000rpm，离心5min，弃去上清；
9.室温下晾干；
10.加入30μl的TER溶解，37℃温浴60min后，-20℃保存。
取1μl DNA作为模板，以实施例2中的引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预热5min；94℃,40s,58℃,40s,72℃,2min，共35个循环；72℃,10min。以转基因水稻DNA为模板，能扩增出长度为1189bp的目的片段，证明目的基因ZmPIF1已经整合入水稻基因组中。
实施例4：转录因子ZmPIF1转化水稻后的抗逆分析
获得11个纯合转化株系，进行ZmPIF1转基因水稻T2代纯合株系内荧光定量检测，结果显示在这11个转基因纯合材料中ZmPIF1均表达，并未发生基因沉默(如图1所示)。选取OE1、OE3和OE7三个转基因材料做进一步分析，主要有以下内容：
植株抗干旱的研究。在进行干旱处理时，将土壤中生长40天左右且长势比较一致的野生型和ZmPIF1转基因株系的植株进行自然干旱胁迫处理，干旱胁迫7天后，将它们重新置于清水环境中进行恢复培养。如图2所示，在干旱胁迫7天后，野生型植株的叶片表现出严重的萎黄现象，部分植株并已死亡，而转基因植株虽有部分叶片发生萎黄，但大部分植株的叶片及茎干仍保持绿色。恢复10天后野生型植株无法恢复而死亡，转基因植株却能恢复生长变绿。上述试验结果表明，在遭受到干旱胁迫时，转基因水稻比野生型水稻表现出更强的干旱胁迫耐受性，而且在干旱胁迫处理终止后，转基因水稻比野生型水稻表现出更快的恢复速度。
实施例5：玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻特异分子标记的扩增和稳定性
获得的特异分子标记是否稳定对其应用非常重要，利用相同引物对ZmPIF1转基因水稻阳性材料进行PCR，结果表明所发展的特异分子标记是非常稳定的，可以跟踪玉米ZmPIF1转录因子。以武运粳7号为背景的玉米ZmPIF1转录因子转基因水稻，选择上述引物对T0、T2代进行扩增。从图3结果可以看出，所得扩增标记和预期条带大小一致，表明T0代中有玉米ZmPIF1基因的存在。相同分子标记在同一转基因材料的不同世代中可以稳定遗传，图4表明该株系T2代均有玉米ZmPIF1基因在不同单株中稳定存在。

Claims (4)

1.玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记，其特征在于，所述分子标记的扩增序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种权利要求1所述的玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记的引物，其特征在于，所述分子标记的引物的序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示：
SEQ ID No.2：ZmPIF1-F 5'CCGAGCCACAATCTGAGTT 3'；
SEQ ID No.3：ZmPIF1-R 5'AGTATTTGTGGATCTCCGGT 3'。
3.一种权利要求1所述的玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记在检测转基因材料或分子标记辅助选择育种中的应用。
4.一种玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记的制备方法，其特征在于，所述方法如下：根据玉米转录因子ZmPIF1的核苷酸序列，在蛋白编码区内设计如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物，运用PCR技术获得玉米转录因子ZmPIF1的DNA片段并对该DNA片段进行测序，依据玉米转录因子ZmPIF1的特异性片段筛选得到如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物，从而获得所述玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记。
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