CN104513823A - 一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，包括下述步骤：(1)获得玉米转录因子基因ZmPIF3核苷酸序列及氨基酸序列；(2)用RT-PCR获得玉米ZmPIF3基因片段；(3)用荧光定量PCR的方法分析玉米转录因子基因ZmPIF3在逆境胁迫时的表达谱，将ZmPIF3基因片段构建到质粒载体中；(4)利用电击法将步骤(3)得到的带有ZmPIF3的质粒转化农杆菌；(5)将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物；(6)目标植物转基因阳性苗的鉴定；(7)目标植物转基因T2代阳性纯合植株的筛选；(8)转基因纯合植株的抗逆分析。本发明玉米PIFs家族转录因子基因ZmPIF3提高了转基因植物的耐旱及耐盐能力。

Description

一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法。

背景技术

全球干旱、半干旱地区约占耕地面积的一半，这些地区水分供应不足，森林植被疏稀，生态环境恶化，水土流失严重，自然灾害频繁。即使在土壤水分充足的情况下，水分亏缺也常常会发生，从而影响到光合作用、物质运输、蛋白质合成和细胞伸长等生理过程。干旱、高盐会造成植物不同程度的脱水，引起植物体内一系列的生理代谢变化，所以又将干旱、高盐等非生物胁迫称为水分胁迫，或渗透胁迫。植物应答渗透胁迫的过程是一个涉及到多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程，大体上可将这些基因及其表达产物分成两类,即功能蛋白和调节蛋白。功能蛋白是指在抵抗渗透胁迫中直接起作用的蛋白质；而调节蛋白是在逆境中参与各种信号转导或调控基因表达，间接起保护作用的蛋白，主要包括：传递信号和调控基因表达的转录因子等。

植物在逆境胁迫下可诱导合成大量抗逆的化合物和蛋白质，这些与抗逆境相关的化合物和蛋白质又受转录因子在转录水平上的调控.转录因子可以通过与顺式作用元件结合，启动抗逆相关功能基因的转录，通过抗逆功能基因的表达使植物作出适应逆境胁迫的代谢调整。近年来，在提高作物抗逆性的分子育种中，研究重点已逐渐从改良个别基因转到改良或增强一个或多个发挥关键作用的转录因子上，这样能促使多个功能基因发挥作用，以期获得综合抗逆性状改良的植物。

植物PIFs家族转录因子能够与CANNTG序列，又称E-box，发生特异性作用，调节启动子中含E-box元件的功能基因或调控基因的表达，从而参与植物的各种抗逆性反应。目前有关PIFs家族转录因子的研究大部分来自拟南芥，而其它物种的研究报道不多。

本发明以玉米为研究材料，以拟南芥中的转录因子PIF3为查询序列，同源搜索玉米核苷酸数据库，通过生物信息学的方法找到玉米中的PIF3转录因子基因。

目前，缺乏一种对环境影响小的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种对环境影响小的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法。

本发明的技术方案如下：本发明的一种玉米转录因子基因ZmPIF3，其由序列表SEQ IDNo.5的核苷酸序列定义。

本发明的一种玉米转录因子基因ZmPIF3的编码蛋白，其特征在于：其由序列表SEQ IDNo.6的氨基酸序列定义。

本发明的一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，是用玉米ZmPIF3基因转化目标植物，获得转基因植物。

本发明所述的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，包括下述步骤：

(1)获得玉米转录因子基因ZmPIF3核苷酸序列及氨基酸序列；

(2)用RT-PCR获得玉米ZmPIF3基因片段；

(3)用荧光定量PCR的方法分析玉米转录因子基因ZmPIF3在逆境胁迫时的表达谱，将ZmPIF3基因片段构建到质粒载体中；

(4)利用电击法将步骤(3)得到的带有ZmPIF3的质粒转化农杆菌；

(5)将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物；

(6)目标植物转基因阳性苗的鉴定；

(7)目标植物转基因T₂代阳性纯合植株的筛选；

(8)转基因纯合植株的抗逆分析。

进一步地，在步骤(3)中，将含ZmPIF3基因的T/A克隆载体质粒经BglII+EcoRI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收DNA片段，将此片段与相应酶切的p1011载体相连，获得的载体命名为p1011-ZmPIF3。

进一步地，在步骤(4)中，将构建好的双元载体p1011-ZmPIF3导入根癌农杆菌中，农杆菌菌株为根癌农杆菌EHA105菌株。

更进一步地，在步骤(5)中，所述的目标植物是水稻。

本发明所述的玉米转录因子基因ZmPIF3及其编码蛋白在培育耐旱耐盐的转基因植物中的应用。

进一步地，所述转基因植物为玉米或水稻或拟南芥。

有益效果：本发明的ZmPIF3基因为玉米PIFs家族转录因子基因ZmPIF3,水稻转化的功能分析表明提高了转基因水稻的耐旱及耐盐能力,可用于其他作物的抗逆转基因应用。该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。

本发明通过对ZmPIF3基因转化水稻进行该基因的功能研究，获得效果如下：

(1)获得了对干旱及高盐胁迫有较高耐受性的转基因水稻。

(2)ZmPIF3基因具有抵抗干旱和高盐胁迫逆境的功能，为利用该基因在其他植物上的应用而提高植物抗逆性提供了理论依据及利用价值。

附图说明

图1是本发明ZmPIF3的核苷酸序列；

图2是本发明ZmPIF3的氨基酸序列；

图3是本发明ZmPIF3与拟南芥PIF3家族转录因子保守区的氨基酸序列同源性比对；

图4是本发明ZmPIF3与拟南芥PIFs转录因子氨基酸序列比对后所作进化树；

图5是本发明ZmPIF3基因在PEG、NaCl、ABA和低温条件下的诱导表达谱变化情况；

图6是本发明ZmPIF3转基因水稻T2代纯合株系内荧光定量检测。WT：野生型；VC：空载体；OE1-OE13：ZmPIF3转基因水稻；

图7是本发明ZmPIF3转基因水稻在溶液中的耐旱性研究。WT：野生型；VC：空载体；OE3、OE5、OE11：ZmPIF3转基因水稻；

图8是本发明ZmPIF3转基因水稻在土壤中的耐旱性研究。WT：野生型；VC：空载体；OE3、OE5、OE11：ZmPIF3转基因水稻；

图9是本发明ZmPIF3转基因水稻在溶液中的耐盐性研究。WT：野生型；VC：空载体；OE3、OE5、OE11：ZmPIF3转基因水稻；

图10是本发明ZmPIF3转基因水稻在土壤中的耐盐性研究。WT：野生型；VC：空载体；OE3、OE5、OE11：ZmPIF3转基因水稻。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

如图1至图10所示，本发明的一种玉米转录因子基因ZmPIF3，其由序列表SEQ ID No.5的核苷酸序列定义。

本发明的一种玉米转录因子基因ZmPIF3的编码蛋白，其特征在于：其由序列表SEQ IDNo.6的氨基酸序列定义。

本发明的一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，是用玉米ZmPIF3基因转化目标植物，获得转基因植物。

本发明所述的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，包括下述步骤：

(1)获得玉米转录因子基因ZmPIF3核苷酸序列及氨基酸序列；

本发明根据ZmPIF3基因的序列设计如下引物：

F：5’-ATGTCCGACAGCAGCGACTTCG-3’    SEQ ID NO.1，

R:5’-TCATGTTTCAGCCTCATTTCTTCC-3’    SEQ ID NO.2。

利用RT-PCR技术从玉米郑单958总cDNA中扩增得到ZmPIF3基因全长cDNA(开放阅读框部分)。经测序表明为PIFs家族转录因子，ZmPIF3的全长cDNA为1941bp，SEQ ID NO.5，编码一个由645个氨基酸组成的蛋白，SEQ ID NO：6。

本发明根据ZmPIF3基因的cDNA序列设计如下检测引物：

F:5’-CAATCCAGCCACCATTCCC-3’    SEQ ID NO.3，

R:5’-CTGTTGCTCCTGCACCATG-3’    SEQ ID NO.4。

(2)用RT-PCR获得玉米ZmPIF3基因片段；

(3)用荧光定量PCR的方法分析玉米转录因子基因ZmPIF3在逆境胁迫时的表达谱，将ZmPIF3基因片段构建到质粒载体中；将含ZmPIF3基因的T/A克隆载体质粒经BglII+EcoRI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收DNA片段，将此片段与相应酶切的p1011载体相连，获得的载体命名为p1011-ZmPIF3。

(4)利用电击法将步骤(3)得到的带有ZmPIF3的质粒转化农杆菌；将构建好的双元载体p1011-ZmPIF3导入根癌农杆菌中，农杆菌菌株为根癌农杆菌EHA105菌株。通过农杆菌介导法将ZmPIF3基因转化到水稻中，然后验证了转基因水稻对干旱、高盐胁迫的耐受能力得到提高。

(5)将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物；所述的目标植物是水稻。

(6)目标植物转基因阳性苗的鉴定；

(7)目标植物转基因T₂代阳性纯合植株的筛选；

(8)转基因纯合植株的抗逆分析。

本发明所述的玉米转录因子基因ZmPIF3及其编码蛋白在培育耐旱耐盐的转基因植物中的应用。

所述转基因植物为玉米或水稻或拟南芥。

检测玉米经过PEG、NaCl、ABA和冷处理后体内ZmPIF3基因的表达情况。结果表明ZmPIF3受PEG、NaCl、ABA和冷诱导表达。

实施例1

玉米转录因子ZmPIF3核苷酸序列及氨基酸序列的获得

登陆公共数据库NCBI主页，搜索到拟南芥中转录因子PIF3的氨基酸序列，以此氨基酸序列为查询探针，获得了一个玉米中高度同源的PIF3转录因子基因ZmPIF3的核苷酸序列和氨基酸序列如图1和图2所示。

实施例2

玉米转录因子ZmPIF3的分子克隆

取三叶一芯期玉米幼苗，品种为郑单958，液氮速冻，放置-70℃冰箱中保存以备提取总RNA。总RNA抽提采用TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂盒提取.玉米cDNA的合成按Fermentas公司的Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作进行第一链合成。

以上述试剂盒合成的cDNA第一链为扩增模板，以设计的F：5’-ATGTCCGACAGCAGCGACTTCG-3’  SEQ ID NO.1和R:5’-TCATGTTTCAGCCTCATTTCTTCC-3’  SEQID NO.2为引物，利用RT-PCR进行cDNA扩增，扩增条件为：94℃预热5min；94℃,40s,57℃,40s,72℃,2min,共35个循环；72℃,10min。PCR结束后进行电泳分析，采用百泰克公司的DNA回收试剂盒回收约1900bp的扩增片段。将扩增片段连接到TaKaRa公司的pMD19-T载体，转化感受态细胞，挑取白色菌落进行菌落PCR以鉴定阳性克隆，将阳性克隆送到华大公司测序。

根据序列测序结果，到NCBI数据库里进行序列比对，发现克隆到的基因序列与PIFs家族转录因子同源关系最近，和拟南芥转录因子PIF3有较高同源性，因此我们将其归入PIFs类转录因子，由于该基因是从玉米中克隆出来的，因此将其命名为ZmPIF3。ZmPIF3与PIFs类转录因子保守的DNA结合域比对及进化树分析如图3和图4所示。最终获得与拟南芥转录因子PIF3具有较高同源性的玉米转录因子基因ZmPIF3。

实施例3

转录因子基因ZmPIF3在逆境胁迫时的表达谱分析

将生长到四叶一芯期的水培玉米幼苗用于胁迫处理，干旱、高盐及ABA胁迫的幼苗即分别置于含20％PEG、200mM NaCl和100μM ABA的溶液中，而低温胁迫的的玉米幼苗则将其移入4℃环境中培养。不同胁迫下，分别于0,1,6,12,24小时剪取幼苗叶片，每个时间点至少取10株幼苗，每株幼苗取第四片充分展开的叶子的叶尖部分，约5厘米，迅速置于液氮中速冻，并转移到-70℃冰箱保存，直至RNA抽提。RNA抽提和cDNA的合成如实施例2所述。

荧光定量PCR在ABI公司的7500定量PCR仪上进行，以设计的F:5’-CAATCCAGCCACCATTCCC-3’  SEQ ID NO.3和R:5’-CTGTTGCTCCTGCACCATG-3’  SEQ ID NO.4为引物进行荧光定量PCR，反应条件为：95℃1min；95℃,15s,60℃,20s,72℃,31s,采集荧光信号，共40个循环；60℃to 95℃,每1℃采集一次荧光信号,持续1s。

反应结束后，用ABI 7500自带的软件进行分析及绘图。ABA及低温处理的表达谱如图5所示，经过干旱处理6小时后，ZmPIF3基因的表达量开始增加，处理12小时后该基因强烈表达，表达量约为未处理时的13.7倍，经过高盐处理1小时后，ZmPIF3基因的表达量开始增加，处理12小时后该基因强烈表达，表达量约为未处理时的11.2倍。

实施例4

转录因子基因ZmPIF3植物表达载体的构建

将含ZmPIF3基因的T/A克隆载体质粒经BglII+EcoRI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收1941bp，SEQ ID NO.1，左右的DNA片段，将此片段与相应酶切的p1011载体相连，获得的载体命名为p1011-ZmPIF3。

实施例5

农杆菌培养和植物转化

农杆菌菌株为根癌农杆菌EHA105菌株。质粒p1011-ZmPIF3经电击法导入农杆菌中。挑取单菌到25ml YEB培养基，50mg/l利福平，培养过夜，取5ml菌液转接到100ml YEB培养基，50mg/l利福平，培养至OD600＝0.7-0.8，菌液冰上放置10min，5000rpm离心10min，4℃，收集菌体，加入100ml无菌双蒸水清洗两次。加入4ml 10％甘油悬浮菌体，转到50ml离心管。5500rpm离心10min，4℃。收集菌体，加入500μl 10％甘油悬浮菌体，转到1.5ml离心管。取70μl感受态细胞，加入1μl重组质粒p1011-ZmPIF3。用去头的枪头混匀，转到0.1cm电击杯中。电击参数：200Ω，1.7KV，2.5F，电击后立即加入800μl SOC培养液。培养1小时后，取100μl涂抗性板筛选转化子，28℃培养。

植物转化采用农杆菌介导法取在超低温保存的根癌农杆菌菌种于含50mg/L卡那霉素Kanamycin，Km的LB固体培养基上活化后，挑取单菌落接种到3ml含50mg/L Km的LB液体培养基中，于28℃振摇培养过夜；再按1/100v/v接种量接种于AB液体培养基中。当培养至对数生长期时，离心收集农杆菌并重悬于10-15ml AAM，含100-400μmol/l乙酰丁香酮液体培养基中，立即用于水稻受体材料的共培养。将已培养好的未成熟胚或成熟胚来源的初生愈伤组织浸泡于此农杆菌菌液中。侵染20min后将愈伤组织放在无菌滤纸上吸干过多的菌液，然后将愈伤组织转入N₆D₂C培养基上于28℃黑暗条件下共培养3天。将经农杆菌浸染后的愈伤组织转入含25mg/l潮霉素和600mg/l头孢霉素的选择培养基CCD2S1培养基上进行第一轮筛选培养；两周后将长出的新鲜抗性愈伤组织再转入含50mg/l潮霉素和300mg/l头孢霉素的选择培养基CCD₂S₂上继续筛选2代，2周/代。愈伤组织经过连续3代筛选后，选择生长旺盛的新鲜抗性愈伤组织转移到预分化培养基MSPR上进行预分化。2周后再将预分化的抗性愈伤组织转移到分化培养基MSR上，于12hr光照/天、28℃条件下进行分化。再生的小苗在1/2MS₀培养基上生根壮苗，最后移到田间或温室栽培。转基因水稻按常规方法进行栽培管理。

利用50mg/mL潮霉素对转化植株叶片进行初筛，再通过PCR进一步鉴定，获得T₀代转基因植株，用同样的方法筛选获得T₁代转基因阳性植株及T₂代转基因纯合材料。

农杆菌转化过程所用各培养基组份如下：

N6基本培养基成分及其母液的配制方法如下：

实施例6

转基因水稻阳性植株的鉴定

采用SDS酚-氯仿法微量提取水稻基因组DNA，其步骤如下：

1.取两片幼嫩叶片，0.2g，剪碎装入2ml的离心管中，置于液氮中冷却，用筷子捣碎至粉末状；

2.加入700μl的抽提缓冲液A，轻轻混匀后，于65℃水浴30min，每5min上下颠倒混匀一次；

3.取出稍冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿，各350μl，上下颠倒充分混匀，抽提10min；

4.12000rpm，离心5min，吸取上清到一新的离心管中；

5.加0.7倍体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，可见絮状沉淀；

6.12000rpm，离心10min，弃去上清；

7.加入700μl的70％的乙醇清洗沉淀；

8.12000rpm，离心5min，弃去上清；

9.室温下晾干；

10.加入30μl的TER溶解，37℃温浴60min后，-20℃保存。

取1μl DNA作为模板，以实施例2中的引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预热5min；94℃,40s,58℃,40s,72℃,2min，共35个循环；72℃,10min。以转基因水稻DNA为模板，能扩增出长度为1941bp的目的片段，证明目的基因ZmPIF3已经整合入水稻基因组中。

实施例7

转录因子基因ZmPIF3转化水稻后的抗逆分析

如图6所示，获得13个纯合转化株系，进行ZmPIF3转基因水稻T₂代纯合株系内荧光定量检测，结果显示在这13个转基因纯合材料中ZmPIF3均表达，并未发生基因沉默。选取OE3、OE5和OE11三个转基因材料做进一步分析，主要有以下两方面：

植株抗干旱的研究。在进行干旱处理时，先将在1/2MS培养液中生长的2周大小的水稻植株转移到20％PEG的1/2MS溶液中进行培养，对野生型和转基因植株进行模拟干旱胁迫。如图6所示，在干旱胁迫2天后，野生型植株均已经发生萎蔫并呈现出倒伏状，而转基因植株则影响相对较小，呈现出轻微的萎蔫。将胁迫4天后的野生型植株和转基因植株放回不含PEG的培养液中恢复生长，转基因植株比野生型植株表现出更快的恢复速度，而野生型植株则未能恢复到原来的表型。恢复10天后野生型植株完全萎蔫死亡，而转基因植株恢复。上述试验结果表明，在遭受到干旱胁迫时，转基因水稻比野生型水稻表现出更强的干旱胁迫耐受性，而且在干旱胁迫处理终止后，转基因水稻比野生型水稻表现出更快的恢复速度。

此外还对土壤中生长40天左右且长势比较一致的野生型和ZmPIF3转基因株系的植株进行自然干旱胁迫处理，干旱胁迫7天后，将它们重新置于清水环境中进行恢复培养。如图8所示，在干旱胁迫7天后，野生型植株的叶片表现出严重的萎黄现象,部分植株并已死亡，而转基因植株虽有部分叶片发生萎黄，但大部分植株的叶片及茎干仍保持绿色并在盐胁迫后存活了下来。恢复10天后野生型植株无法恢复而死亡，转基因植株却能恢复生长变绿。

植株抗高盐的研究。在进行高盐处理时，先将在1/2MS培养液中生长的2周大小且长势比较一致的野生型和ZmPIF3转基因株系的植株水稻植株转移到含150mM NaCl的1/2MS溶液中进行培养，进行高盐胁迫实验。如图9所示，在胁迫2天后，野生型植株在经盐处理后所有的植株都出现很明显的萎蔫，而ZmPIF3转基因水稻OE3、OE5和OE11萎蔫相对较少。将胁迫2天后的野生型植株和转基因植株放回不含NaCl的培养液中中恢复生长，转基因植株比野生型植株表现出更快的恢复速度，而野生型植株则未能恢复到原来的表型。恢复7天后野生型植株完全萎蔫死亡，而转基因植株恢复。上述试验结果表明，在遭受到盐胁迫时，转基因水稻比野生型水稻表现出更强的盐胁迫耐受性，而且在盐胁迫处理终止后，转基因水稻比野生型水稻表现出更快的恢复速度。

此外还对土壤中生长的野生型和转基因植株进行盐胁迫处理，选取培养三周左右且生长比较一致的野生型和转基因植株进行实验。待培养土中的含水量比较少时，直接将培养钵浸于150mM NaCl溶液中，实时观察各植株的表型变化。如图10所示，在胁迫9天后，野生型植株的叶片表现出严重的卷缩现象,部分植株并已死亡，而转基因植株虽有部分叶片发生卷缩，但大部分植株的叶片及茎干仍保持绿色并在盐胁迫后存活了下来。恢复7天后野生型植株无法恢复而死亡，转基因植株却能恢复生长变绿。这些结果表明ZmPIF3基因的转入提高了水稻的对高盐的耐受力。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种玉米转录因子基因ZmPIF3，其特征在于：其由序列表SEQ ID No.5的核苷酸序列定义。

2.一种玉米转录因子基因ZmPIF3的编码蛋白，其特征在于：其由序列表SEQ ID No.6的氨基酸序列定义。

3.一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，是用玉米ZmPIF3基因转化目标植物，获得转基因植物。

4.根据权利要求3所述的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)获得玉米转录因子基因ZmPIF3核苷酸序列及氨基酸序列；

(2)用RT-PCR获得玉米ZmPIF3基因片段；

(3)用荧光定量PCR的方法分析玉米转录因子基因ZmPIF3在逆境胁迫时的表达谱，将ZmPIF3基因片段构建到质粒载体中；

(4)利用电击法将步骤(3)得到的带有ZmPIF3的质粒转化农杆菌；

(5)将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物；

(6)目标植物转基因阳性苗的鉴定；

(7)目标植物转基因T₂代阳性纯合植株的筛选；

(8)转基因纯合植株的抗逆分析。

5.根据权利要求4所述的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，将含ZmPIF3基因的T/A克隆载体质粒经BglII+EcoRI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收DNA片段，将此片段与相应酶切的p1011载体相连，获得的载体命名为p1011-ZmPIF3。

6.根据权利要求1所述的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，其特征在于：在步骤(4)中，将构建好的双元载体p1011-ZmPIF3导入根癌农杆菌中，农杆菌菌株为根癌农杆菌EHA105菌株。

7.根据权利要求4所述的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，其特征在于：在步骤(5)中，所述的目标植物是水稻。

8.根据权利要求1或2所述的玉米转录因子基因ZmPIF3及其编码蛋白在培育耐旱耐盐的转基因植物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，所述转基因植物为玉米或水稻或拟南芥。