CN108342506B - 甘蓝型油菜MI CMS系统恢复基因Rfm的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甘蓝型油菜MI CMS系统恢复基因Rfm的分子标记及其应用，属于作物分子育种领域。通过利用油菜单核苷酸多态性(SNP)芯片与Rfm基因近等基因系杂交来确定Rfm基因所处的基因组物理区间，进而以油菜基因组序列为基础开发简单序列重复(SSR)标记，筛选获得与Rfm恢复基因最为连锁的标记并实践中应用。本发明开发的分子标记不仅可以进行MI CMS系统恢复系的分子标记辅助育种，加快恢复系选育进程，提高育种效率；还可以鉴定MI CMS系统杂交种种子的纯度，准确率高。

Description

甘蓝型油菜MI CMS系统恢复基因Rfm的分子标记及其应用

技术领域

本发明公开了甘蓝型油菜MI CMS系统恢复基因Rfm的分子标记与利用，属于作物分子育种领域，涉及甘蓝型油菜MI CMS不育系统恢复基因的分子标记的开发及其利用方法。具体的说，是一种利用油菜MI CMS不育系统恢复基因分子标记进行油菜恢复系选育和杂交品种纯度鉴定中的技术。

背景技术

作物细胞质雄性不育系统(即Cytoplasm sterile system,CMS)，也称之为三系杂交系统，是作物杂交品种选育的非常重要的遗传系统。该系统主要由三个系组成，不育系(sterile line，即A系，基因型为s(rr))、保持系(maintainer line，即B系，基因型为S(rr))和恢复系(restorer line，即R系，基因型为N(RR))，其中S/s分别表示可育/不育细胞质基因，R/r分别表示显性/隐性核内恢复基因，N表示任何一种细胞质基因。在育种实践中，不育系与保持系杂交(A×B)用于繁衍不育系；保持系和恢复系均自身可育，可通过自交得以繁衍；杂交种F1可通过不育系与恢复系杂交得到商品种种子。由此可见，三系杂交系统的重要功能即是稳定繁衍具有杂种优势的F1种子，使作物在农业生产中达到高产。

CMS系统在植物中非常普遍，至今已有320多种植物中发现CMS现象(Kaul MLH，Male Sterility in Higher Plants.Springer,Berlin,1988)。而在当今的作物中CMS系统更为普遍，水稻、玉米、小麦、大豆、棉花、油菜等作物种均发现多种CMS系统，很多CMS系统已经成熟的应用于杂交品种选育中。

油菜(oilseedrape，Brassica napus L.)是世界上主要的油料作物，双低化(低芥酸和低硫苷)后的油菜品种称之为双低油菜，又称为卡诺拉(Canola)。值得注意的是，现今选育的油菜品种基本上都是双低品种，故而canola这个名称应用的越来越广泛。近五年来世界范围内的油菜产量在整个油料作物内稳居第二，仅次于大豆。油菜是CMS系统使用的最为广泛的作物之一，而且采用CMS系统育成的油菜品种也最多，在生产上广为使用。在中国，近五年内审定的三系杂交油菜品种约占到总审定品种数的50％。油菜为常异花授粉作物，异交容易且异交率高。在油菜三系杂交系统中，不育系一般通过与保持系连续回交得到改良，所以要改良不育系，务必先改良保持系，由此不育系一般较为稳定，不会轻易改变。而恢复系的改良只需保证恢复基因存在即可，其它遗传基因可自由更换。因此，在油菜三系品种改良实践中，频繁选育恢复系是杂交品种选育的重要工作。此外，三系杂交油菜品种的纯度是影响品种推广和产量发挥的重要因素。从一定意义上来说，三系品种的纯度决定了一个优秀杂交品种的前景。所谓保证纯度，即从遗传上保证F1种子的遗传物质一半来自于恢复系，而恢复系一个最重要的特点即是带有恢复基因。整体来讲，只要找到了恢复基因，就能保证恢复系的选育和杂交种种子纯度的鉴定。随着油菜分子生物学的发展，越来越多的油菜基因被精细定位和克隆。在涉及到CMS系统的研究中，克隆恢复基因已经成为三系杂交系统研究的重点工作。目前，油菜中主要使用的CMS系统有两个：萝卜质不育系统(Ogu CMS)和波里马不育系统(Pol CMS)。Ogu CMS系统中不育系的不育胞质基因和恢复系的恢复基因均来源于萝卜，通过远缘杂交和细胞融合技术导入至油菜中。Brown et al.(Brown GG,FormanováN,Jin H,et al.Plant J.2003,35(2):262-72),Desloire et al.(Desloire S,Gherbi H,Laloui W,etal.EMBO Rep.2003,4(6):588-94),Koizuka etal.(KoizukaN,ImaiR,Fujimoto H,etal.PlantJ,2003(34):407-415)等所属的三个研究团队分别克隆了萝卜质恢复基因(Rfo)，但Uyttewaal et al.(Uyttewaal M,Arnal N,Quadrado M et al.PlantCell 2008,20(12):3331-3345)最终在油菜上确定只有PPR-B是具有功能的Rfo基因。Hueyiet al.(2008)获得了新的优异恢复系R2000中Rfo基因的紧密分子标记用于品种选育。PolCMS系统中不育胞质基因来源于自然突变，恢复系通过大规模筛选得到，均为油菜资源基因库中的基因。刘平武等(刘平武、李赟、等。中国油料作物学报，2007，29(1)：14-19)、Zeng etal.(Zeng F,Yi B,TuJ,Fu T.Euphytica,2009,165:363-369)、Yun etal.(YunLi,Zhi liu,Qiang cai,et al.African Journal ofBiotechnology,2011,10(47):9563-9569)和Liu et al.(Liu Z,Liu P,Long F,et al.TheorAppl Genet 125(4):773-779)分别在不同时间对波里马系统恢复基因(Rfp)进行了定位，遗传距离逐步接近，而Liu et al.(Liu Z,Yang Z,Wang X,et al.Mol Plant 2016,9(7):1082-1084)最终克隆了Rfp基因，并找到了显性(Rfp)和隐性(rfp)基因差异位点。

实际上，在甘蓝型油菜中，还有若干CMS系统被用于杂交品种选育。MI CMS系统是江苏省农科院傅寿仲先生选育的三系杂交系统。不育系是利用已知不育胞质的Mutsu与具有不育核基因的Isuzu轮回杂交获得，恢复系通过广泛测交获得。至今利用该系统成功选育的杂交油菜品种已达十多个并都在生产上推广应用，其中宁杂一号油菜品种荣获江苏省科技进步一等奖。遗憾的是，对于MI CMS系统的恢复基因研究还不深，影响了恢复系选育进程和杂交种纯度鉴定。Weihua etal.(2011)通过轮回杂交方法成功获得了两个具有不同遗传背景的MI CMS系统恢复基因(Rfm)的近等基因系(T84-R和T84-r、ZS9-R和ZS9-r)，为Rfm的精细定位和克隆奠定了基础。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于：通过分子生物学技术获得MI CMS系统恢复基因(Rfm)的连锁分子标记，可以实现：(1)规模化筛选恢复系用于测交，选育三系杂交品种用于产量鉴定并最终成为高产审定品种；(2)准确鉴定杂交制种纯度。

技术方案

为了达到以上目的，本发明提供的甘蓝型油菜MI CMS系统恢复基因Rfm的分子标记为两对简单序列重复类型的标记即SSR标记，分别位于该恢复基因的两侧，其中一侧SSR标记命名为W9，SSR标记W9的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；另一侧SSR标记命名为W117，SSR标记W117的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4所示。

所述甘蓝型油菜MI CMS系统恢复基因Rfm分子标记的应用。是指用所述甘蓝型油菜MI CMS系统恢复基因Rfm分子标记SSR标记W9的引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2进行PCR反应扩增甘蓝型油菜材料，如果候选单株经PCR扩增后，其产物仅含有300～350bp的条带，表明该单株带有纯合显性Rfm基因；如果含有既含有300～350bp的条带，又含有250bp的条带，表明该单株极带有杂合Rfm基因；而如果其产物仅含有250bp的条带，则表明该单株带有隐性Rfm基因，也就是没有恢复基因的功能。

或者用所述甘蓝型油菜MI CMS系统恢复基因Rfm分子标记SSR标记W117的引物SEQID NO：3和SEQ ID NO：4进行PCR反应扩增甘蓝型油菜材料，如果候选单株经PCR扩增后，其产物仅含有150bp及以上的条带，表明该单株带有纯合显性Rfm基因；如果含有既含有150bp及以上的条带，又含有150bp及以下的条带，表明该单株带有杂合Rfm基因；而如果其产物仅含有150bp及以下的条带，则表明该单株带有隐性Rfm基因，也就是没有恢复基因的功能。

也可以是指所述甘蓝型油菜MI CMS系统恢复基因Rfm分子标记SSR标记W9和SSR标记W117的引物PCR反应扩增甘蓝型油菜材料，对于W9标记来说，如果候选单株经PCR扩增后，其产物仅含有300～350bp的条带，表明该单株带有纯合显性Rfm基因；如果既含有300～350bp的条带，又含有250bp的条带，表明该单株带有杂合Rfm基因；而如果其产物仅含有250bp的条带，则表明该单株带有纯合隐性Rfm基因，也就是没有恢复基因的功能；

同样的，对于W117标记来说，如果候选单株经PCR扩增后，其产物仅含有150bp及以上的条带，表明该单株带有纯合显性Rfm基因；如果含有既含有150bp及以上的条带，又含有150bp及以下的条带，表明该单株带有杂合Rfm基因；而如果其产物仅含有150bp及以下的条带，则表明该单株带有纯合隐性Rfm基因，也就是没有恢复基因的功能；

如果候选单株同时含有两个标记W9和W117确认的纯合显性Rfm基因或者杂合Rfm基因，表明该单株极有可能使MI CMS系统不育系恢复育性；反之，如果候选单株同时含有两个标记W9和W117确认的纯合隐性Rfm基因,则不能使MI CMS系统不育系恢复育性。

有益效果

本发明是通过以下步骤进行摸索定位得到MI CMS系统恢复基因(Rfm)的：

第一步，芯片杂交。利用Brassica 60k

Infinium SNP(SingleNucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)芯片与两个具有不同遗传背景的近等基因系DNA样品杂交。每个近等基因系材料提供两份样品，即重复杂交两次，共8份DNA样品。获得每个SNP位点在8份DNA样品的基因型结果。

第二步，SNP位点筛选。理论上与恢复基因连锁的SNP位点，其对应的基因型应同时具有以下特点：(1)同一样品两个重复的基因型一致。(2)T84-R和ZS9-R的基因型一致，同时T84-r和ZS9-r的基因型一致。(3)T84-R和T84-r的基因型不一致。同样的，ZS9-R和ZS9-r的基因型不一致。(4)所有的基因型应为纯合型，非杂合型。将不具备以上特点的SNP位点删除。

第三步，确定恢复基因在油菜基因组上的候选区域。通过中选SNP对应的序列信息BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)油菜基因组序列，确定恢复基因所在的染色体编号以及所在的物理区域。

第四步，设计SSR引物并进行筛选确定。针对目标基因所在的油菜基因组物理区域，利用软件搜寻SSR序列并设计SSR引物。利用这些因引物在F2分离群体中扩增，根据育性表型，利用Joinmap软件绘制遗传连锁图，选择遗传距离最近的标记作为恢复基因的实用性标记。

第四步，标记的应用。利用获得的SSR标记进行MI CMS系统恢复系的选育，同时也可以利用该标记鉴定MI CMS系统杂交种纯度。根据带型判断真实恢复系和真实杂交种。

通过本发明获得的恢复基因分子标记，可以：(1)可以在早期(理论上只要能提取DNA即可)对任意单株的基因组DNA进行PCR扩增，确定其基因型即可确定候选单株是否为恢复系，准确率高；(2)无论单株细胞质基因是否可育，均可进行鉴定；(3)可以对杂交制种(商品种)的单粒种子DNA进行扩增，观察其基因型即可确定该粒种子是否带有恢复基因。通过对群体种子进行鉴定即可评估种子样品的纯度是否合格，从而决定批量商品种是否能够进入市场和农业生产。

附图说明

图1SSR引物在分离群体不育单株中的表现。M表示DNA标准分子量(Marker)，P1表示带有恢复基因Rfm的亲本，P2表示不带恢复基因Rfm的亲本。每一个点样孔代表一个单株。RR表示纯合显性基因型，Rr表示杂合基因型，rr表示纯合隐性基因型。A为SSR引物W9的扩增效果；B为SSR引物W117的扩增效果。

图2恢复基因遗传图谱与物理图谱的对应。图中a为利用多态性SSR引物获得的Rfm基因的遗传图谱，两侧遗传距离最近的是W14和W117两个SSR标记；图中b为白菜基因组的物理图谱；图中c为甘蓝型油菜A09染色体含有Rfm基因的物理图谱。

序列说明

1、SEQ ID NO：1

5’-atcacacttgtctcgatttgga-3’

2、SEQ ID NO：2

5’-tatacggctagttttgtggcct-3’

3、SEQ ID NO：3

5’-gaaactcccaaagccaatga-3’

4、SEQ ID NO：4

5’-tcaatctcttccagccacaa-3’

具体实施案例

我们于2013～2016年采用本方法实施恢复基因分子标记的开发与利用。以下内容中涉及的一些常规分子生物学技术，如无特别注明均采用常规方法。

主要有以下步骤：

1、材料准备。在本方法中我们利用了在以前研究中创建的来自于两个遗传背景T84(龙卫华等，分子植物育种，2011，9(3)：261-269)和ZS9(龙卫华等，分子植物育种，2011，9(3)：261-269)的恢复基因Rfm近等基因系(Near isogenic lines,NIL)(龙卫华等，分子植物育种，2011，9(3)：261-269)。每套NIL包含两个株系，即含有恢复基因的株系和不含恢复基因的株系。从理论上说，每套NIL除了Rfm位点不同之外，其它位点均相同。NIL的构建通过连续多代回交并通过分子标记检测获得，其构建方法见：龙卫华等，分子植物育种，2011,9(3)：261-269.

2、芯片杂交。芯片采用已经商业化的Brassica 60k

Infinium SNP芯片，该芯片为单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)芯片，含有约52157个SNP位点，覆盖甘蓝型油菜的全部19对染色体。两个遗传背景(T84和ZS9)的NIL各提供两份样品，即重复杂交两次，共8份DNA样品，命名为T84-RR-1、T84-RR-2、T84-rr-1、T84-rr-2；ZS9-RR-1、ZS9-RR-2、ZS9-rr-1、ZS9-rr-2，其中R表示带有恢复基因，r表示不带有恢复基因。根据常规杂交步骤进行芯片杂交，软件会自动给出芯片杂交结果，从而获得所有SNP位点在8份DNA样品的基因型结果。整理杂交结果后，我们发现超过97％的SNP探针获得了杂交信号，表明芯片杂交获得成功。

3、SNP位点基因型分析与候选位点筛选。统计发现，T84背景的NIL具有93.40％(48715个位点)相同的杂交信号，ZS9背景的NIL具有96.65％(49889个位点)相同的杂交信号。本研究将重点放在那些差异信号的分析上来。理论上来说，与Rfm恢复基因连锁的SNP位点，其对应的基因型应同时具有以下特点：(1)同一样品两个重复的基因型应一致。(2)T84-R和ZS9-R的基因型应一致，同时T84-r和ZS9-r的基因型应一致。(3)T84-R和T84-r的基因型应为相对基因型。同样的，ZS9-R和ZS9-r的基因型也应为相对基因型。(4)所有的基因型应为纯合型，非杂合型。在总共52127个SNP探针中，T84背景下，421个位点为T84-R(基因型为AA)和T84-r(基因型为BB)，444个位点为T84-R(基因型为BB)和T84-r(基因型为AA)；而在ZS9背景下，323个位点为ZS9-R(基因型为AA)和ZS9-r(基因型为BB)，349个位点为ZS9-R(基因型为AA)和ZS9-r(基因型为BB)。通过筛选两个不同遗传背景下同时符合条件的SNP位点后发现，39个位点被选为最可能与Rfm恢复基因连锁的标记。

4、连锁区域的确定。我们创建了一个超大T84背景的F₂分离群体(共包含3842个单株)。首先，我们选取其中10株可育单株和10不育单株构成一个小筛选群体，命名为T84-SG。每个SNP位点的探针均为一段100-200bp的DNA序列，我们从以上获得的39个SNP位点中挑取了12个位点，并根据这些位点对应的核苷酸序列设计了引物，在T84-SG的每个单株上进行常规PCR扩增并对扩增产物进行测序，测序结果如表1所示。结果表明，芯片杂交结果获得SNP位点与育性具有一致性，这也表明这些SNP所处的物理位置与育性基因(即Rfm恢复基因)的位置很近，具备连锁关系。

进一步，理论上说，如果某个SNP位点与Rfm恢复基因遗传距离非常接近的话，其在隐性不育单株群体(也就是不育单株)上的碱基应高度一致。根据测序验证结果，我们初步选择了Bn-A09-p33406111、Bn-A09-p33427256和Bn-A09-p35476619这三个标记。另外，为了进一步证实所选标记的可靠性，我们又选择了一个还有100个单株(34个可育株和66个不育株)组成的一个中等筛选群体，命名为T84-MG。同样的，利用上述的测序方法进行验证，测序结果如表2所示。结果表明，这三个标记结果可靠。于是利用这三个标记对应的DNA序列搜寻白菜(Brassica rapa L.)基因组数据库(http://brassicadb.org/brad/blastPage.php)(当时甘蓝型油菜基因组数据库还未公布)，搜寻得到三个分布在A09染色体上的Scaffolds，即Scafflod000055、Scafflod000077和Scafflod000082。

5、候选区域紧密分子标记的开发，筛选与确定。根据三个候选Scaffolds的核苷酸序列，我们利用PERL5scriptMicroSAtellite软件来寻找SSR序列并同时设计SSR标记引物。我们将短片段序列(microsatellite)设置为从3个碱基到6个碱基长，因为更长的短片段序列极少；同时我们将重复次数设置为3个到12个，从而软件找到这些候选SSR序列。进一步，利用软件Primer3_core程序(http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)分析SSR两侧的序列并设计引物，引物长度设置为18～27bp，溶解温度设置为57～63℃，GC含量在30～70％之间，产物长度为100～300bp。最终我们设计了分布于三个Scaffolds上的116个SSR标记(26对、48对和42对分别分布在三个Scaffolds上)。通过利用这些引物，以T84-R和T84-r这两个亲本的DNA为模板进行PCR扩增，发现14对引物表现多态性。因此，将这些多态性引物在大分离群体T84-F2中的每个单株上进行PCR扩增并记录扩增带型，通过与表型(即育性)进行对应，利用Joinmap软件构建了Rfm恢复基因的遗传连锁图。同时，利用SSR引物的DNA序列利用BLAST在线软件搜寻甘蓝型油菜基因组的物理位置，并进行了遗传位置与物理位置的对应(见图2)。通过比较作图发现，Rfm恢复基因左右两边最邻近的分子标记为W9和W117。

6、利用临近SSR引物检测恢复基因的存在。对于W9标记来说，如果候选单株经PCR扩增后，其产物仅含有300～350bp的条带，表明该单株极有可能带有纯合显性Rfm基因；如果含有既含有300～350bp的条带，又含有250bp的条带，表明该单株极有可能带有杂合Rfm基因；而如果其产物仅含有250bp的条带，则表明该单株极有可能带有隐性Rfm基因，也就是没有恢复基因的功能(如图2A所示)。同样的，对于W117标记来说，如果候选单株经PCR扩增后，其产物仅含有150bp及以上的条带，表明该单株极有可能带有纯合显性Rfm基因；如果含有既含有150bp及以上的条带，又含有150bp及以下的条带，表明该单株极有可能带有杂合Rfm基因；而如果其产物仅含有150bp及以下的条带，则表明该单株极有可能带有隐性Rfm基因，也就是没有恢复基因的功能(如图2b所示)。综合来说，如果候选单株同时含有两个标记确认的纯合显性Rfm基因或者杂合Rfm基因，表明该单株极有可能使MI CMS系统不育系恢复育性；反之，则不能使MI CMS系统不育系恢复育性。在实际操作中，只要有一对引物检测具有纯合显性Rfm基因或者杂合Rfm基因，我们就认为其含有Rfm基因。但应当明确，两对引物检测的准确性高于一对引物检测的准确性。

7、Rfm恢复基因分子标记的利用。我们主要利用Rfm基因的临近分子标记进行了以下两个方面的应用：

(1)选育恢复系。有两个方面：第一，是利用已有的带有不育胞质基因的恢复系为母本，与优异亲本杂交，在后代筛选新型的带有不育胞质的恢复系。我们检测了两个组合：宁R7×ZS11和宁R7×HOC3，其中宁R7为MI CMS系统的一个恢复系，带有不育胞质基因和纯合显性恢复基因(公知公用，见龙卫华、胡茂龙、高建芹，等，分子植物育种，2011，9(3)：261-269)；ZS11，即甘蓝型油菜品种中双11号(公知公用，国家审定油菜品种，审定编号：国审油2008030)；HOC3为江苏农科院经作所选育的高含油量品系(公知公用，见傅寿仲、张洁夫、戚存扣，等，中国油料作物学报，2008，30(3)：279-283)。尽管可以在分离世代(F2代以后)花期通过查看单株育性的方法判断是否带有恢复基因，但获得结果的时期较晚。在早期提取单株DNA，利用W9和W14引物进行鉴定即可判定，可以节省苗期至花期的栽培工作，节省劳动量。第二，是以优异亲本为母本，已有的带有不育胞质基因的恢复系为父本进行杂交。以前的做法是等到后代株系至F4代以后进行测交来判定，等待时间长，工作量大。现在只需分离世代选取单株提取DNA，利用W9和W117引物进行鉴定，鉴定结果见表3。

(2)杂交种制种纯度鉴定。油菜杂交中的大面积制种一般是选取隔离条件较好的山区、小岛、农场等地方进行，但总有一些油菜或者近缘属种的花粉通过风以及蜜蜂等传播至制种田并与母本杂交，由此在收获母本上的种子时即出现假杂交种。我们于2014～2015年采用分子标记对我们选育审定的两个杂交品种宁杂15号和宁杂19号的商品种子进行了纯度鉴定。同时，我们在次年进行了田间育性鉴定，将两者结果进行了对比，结果差异在5％以内(见表4)，比较一致，表明该标记具有实用性价值。

表1候选SNP位点在小群体中的测序结果

注：S表示不育单株；F表示可育单株；/表示没有检测到。

表2三个SNP位点在T84-SG群体中的位点测序检测

注：S表示不育单株；F表示可育单株；/表示没有检测到。SNP1代表Bn-A09-p33406111；SNP2代表Bn-A09-p33427256；SNP3代表Bn-A09-p33427256。

表3、Rfm分子标记鉴定选育恢复系效果

表4、Rfm分子标记鉴定杂交种纯度效果

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 甘蓝型油菜MI CMS系统恢复基因Rfm的分子标记及其应用

<141> 2018-05-08

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcacacttg tctcgatttg ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatacggcta gttttgtggc ct 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaactccca aagccaatga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaatctctt ccagccacaa 20

Claims (2)

1.一种检测甘蓝型油菜MI CMS系统恢复基因Rfm的引物对，其上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

2.权利要求1所述检测甘蓝型油菜MI CMS系统恢复基因Rfm的引物对在进行甘蓝型油菜MI CMS系统恢复系的选育和鉴定MI CMS系统杂交种纯度方面的应用。

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