CN107828908A - 甘蓝型油菜种子高油酸含量的分子标记方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甘蓝型油菜种子高油酸含量的分子标记方法及应用,属于作物分子育种领域涉及一种甘蓝型油菜种子高油酸含量的CAPS(切割片段长度多态性，CleavedAmplified Polymorphic Sequences)标记。本发明基于甘蓝型油菜种子高油酸含量控制基因BnFad2的突变位点，开发出有实用价值的CAPS标记并利用该标记进行单株基因型鉴定和高油酸株系筛选。本发明开发的CAPS标记适用于各分离世代筛选高油酸基因型与株系，准确快速高效，十分有利于高油酸油菜品种的MAS(标记辅助选择，Marker‑Assisted Selection)育种。

Description

甘蓝型油菜种子高油酸含量的分子标记方法及应用

技术领域

本发明涉及甘蓝型油菜种子高油酸含量的分子标记方法及应用，属于作物分子育种领域。本发明开发的CAPS分子标记可以对高油酸甘蓝型油菜株系进行选择，为培育高油酸油菜新品种服务。

背景技术

油菜是世界上最重要的油料作物之一，近年来全球范围内菜籽油的年产量约为700万吨，仅次于大豆(USDA.http://www.ers.usda.gov/data-products/oil-crops-yearbook.aspx.2017)。正如其它任何一种植物油一样，菜籽油的脂肪酸组成是决定其使用方式和范围的关键特征。经过双低化(低芥酸和低硫苷)改良以后，一般而言菜籽油的脂肪酸组成为～7％的饱和脂肪酸(软脂酸C16:0和硬脂酸C18:0)、～61％的油酸(C18:1)、～11％的亚油酸(C18:2)和～21％的亚麻酸(C18:3)。高油酸(一般指油酸含量>75％)与其相比，具有几个明显优势：(1)较好的抗氧化能力，可使菜籽油具有更长的货架期同时也可避免氢化过程；(2)可以减低低密度脂蛋白，有利于心脑血管的人群；(3)与橄榄油具有几乎相同的脂肪酸组成，使人们在烹饪中减少花费；(4)具有更多的工业用途(如：润滑油，等)。因此，提高菜籽油中的油酸含量是油菜再次遗传改良中的重要品质目标。

分子标记辅助选择技术(MAS)是现代生物技术为传统的作物遗传育种提供了强有力的工具，因其具有早期选择、不受环境影响以及准确快速高效的优势，该技术已在各种作物中开展了实质性利用。分子标记的种类很多，在油菜这一作物中，从早期的RFLP(限制性片段长度多态性，Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、RAPD(随机扩增多态性，Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)、AFLP(扩增片段长度多态性，Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)发展到目前使用的最为广泛的SSR(简单重复序列，Simple Sequence Repeat，SSR)、SNP(核苷酸多态性，Single NucleotidePolymorphism，SNP)以及CAPS(酶切扩增多态性序列，CleavedAmplified PolymorphicSequence,CAPS)标记。CAPS，又称PCR-RFLP，他是一种将特异引物PCR与限制性内切酶消化结合而产生的一种分子标记检测技术，具有共显性、位点特异性、操作简单和成本低等特点，广泛运用于植物基因的分型、定位、图位克隆和分子鉴定等方面的研究(Komori T,NittaN.Utilization of the CAPS/dCAPS method toconvert rice SNPs into PCR-based markers.Breed Sci,2005,55:93-98)。

近年来，国内外研究者在油菜种子高油酸含量的品系筛选及其分子定位方面取得一定的进展。Schierholtet al.(Schierholt A,Becker HC,Ecke W.Mapping a higholeic acid mutation in winter oilseed rape(Brassica napus L.).TheorApplGenet.2000；101(5-6):897-901.))构建了一个由高油酸和普通油酸株系为亲本的DH群体，发现了连锁的三个AFLP标记Hu et al.(2006)(Hu X,Sullivan-Gilbert M,Gupta M,Thompson SA.Mapping of the loci controlling oleic and linolenic acidcontents and development of fad2 and fad3 allele-specific markers in canola(Brassica napus L.).TheorAppl Genet.2006；113(3):497-507.)从另外一个DH群体中发现BnFad4编码基因中一个SNP标记。Yang et al.(Yang Q,Fan C,Guo Z,Qin J,Wu J,Li Q,Fu T,ZhouY.Identification of FAD2 and FAD3 genes in Brassica napus genome anddevelopment of allele-specific markers for high oleic and low linolenic acidcontents.Theor Appl Genet.2012；125(4):715-29.)发现BnFad2-1中的一个4bp插入突变时导致品种SW Hickory产生高油酸性状的原因，并涉及了特异引物。刘列钊等(中国农业科学，2012,45(23):4931-4938)筛选得到高油酸品系10L422连锁的SSR标记。江苏省农科院通过辐射育种也获得了一个超高油酸含量的品系N1379T(专利CN201010513722.9-低剂量60Co-γ射线处理油菜萌动种子创建高油酸新种质的方法；保藏于中国微生物军中保藏管理委员会普通微生物中心，保藏好CGMCC NO.4106)，通过分子生物学研究，发现了其控制基因BnFad2同源基因中的突变位点并已申请专利(申请号CN201610835220.5，专利审查中)。本发明是基于基因中的突变位点，开发能够检测各种基因型的CAPS标记并将其用于高油酸油菜品种的分子育种中。

发明内容

技术问题

本发明的目的是针对已发现的可导致油菜种子产生高油酸含量性状的基因突变位点，开发实用的CAPS分子标记，为油菜高油酸品种选育提供一种准确快速有效地检测方法。

技术方案

本发明通过以下方案或步骤实现：

一种甘蓝型油菜种子高油酸含量的CAPS标记方法，其特征在于：

针对以下至少一个油菜种子高油酸含量的BnFad2基因核苷酸突变位点：(1)位于BnFad2同源基因BnFad2-1核苷酸序列316处G至A的置换，即：G316A，突变基因命名为BnFad2-1H；(2)位于BnFad2同源基因BnFad2-2核苷酸序列908处G至A的置换，即：G908A,突变基因命名为BnFad2-2H；

采用以下至少一对引物：

针对BnFad2-1中G316位点的上、下游引物，序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

针对BnFad2-2中G908位点的上、下游引物，序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

扩增编码甘蓝型油菜油酸去饱和酶FAD2即BnFad2基因的核苷酸序列片段，并选择相应的限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，可以标记油菜种子高油酸含量的BnFad2基因核苷酸SNP突变位点。

对所述PCR产物进行酶切的限制性内切酶为，其中针对BnFad2-1的突变位点选择BssSI酶，针对BnFad2-2的突变位点选择HinfI酶。

所述一种甘蓝型油菜种子高油酸含量的CAPS标记方法可以在各分离世代筛选高油酸基因型与株系的应用。其特征在于，

(1)通过权利要求1所述针对特定同源基因BnFad2突变位点设计的特异引物，利用PCR扩增出仅含有特定BnFad2同源基因中突变位点的片段；

(2)选择相应的限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切；

(3)对酶切产物进行水平凝胶电泳，根据DNA带型确定相应株系的基因型；

(4)根据基因型在不同分离世代选择得到高油酸单株或株系。

具体根据DNA带型确定相应株系的基因型方法为：

采用针对BnFad2-1中G316位点的上、下游引物P3、P4，序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；针对BnFad2-2中G908位点的上、下游引物P5、P6，序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示扩增甘蓝型油菜材料DNA。

(1)如在P3-P4引物对扩增的片段长度为731bp中有一个针对于BsssI酶的识别位点，可以酶切为295bp、436bp的带型,则扩增的片段含有同源基因BnFad2-1中的突变位点G316位点,基因型设为aa；

如在扩增的片段中无酶切位点，仍为731bp的带型,则扩增的片段不含有同源基因BnFad2-1中的突变位点G316位点，基因型设为AA，

如果扩增的片段中则为295bp、436bp、731bp的带型，则为杂合型，基因型设为Aa。

(2)如在P5-P6引物对扩增的片段长度为405bp中有三个针对于HinfI酶的识别位点，可以酶切为61bp、80bp、58bp、206bp的带型，则扩增的片段含有同源基因BnFad2-2中的突变位点G908位点，基因型设为bb；

如扩增的片段中61bp、80bp、264bp的带型，没有三个针对于HinfI酶的识别位点，则扩增的片段不含有同源基因BnFad2-2中的突变位点G908位点，基因型设为BB；

如扩增的片段中在HinfI酶切后的带型为61bp、80bp、58bp、206bp、264bp的带型，则为杂合型，基因型设为Bb。

有益效果

本发明成功的针对两个突变位点设计开发的CAPS标记(包括特异引物和限制酶选择)能够清晰分辨出亲本带型和杂合带型，可以在F2和BC1分离群体中进行基因型分型，从而筛选高油酸单株或株系。该标记在高油酸品种选育中可明显减少工作量，准确快速高效，有利于加快育种进程。

附图说明：

图1为四个基因的序列比较示意图。

ATG为四个基因的相同的起始密码子，TGA为相同的终止密码子。四个基因在41-46位有所不同，BnFad2-1和BnFad2-2一致，而BnFad2-3和BnFad2-4一致。空白方块表示BnFad2-3在基因序列有一段16bp的缺失碱基序列。BnFAD2-1在732、735位点均为T，而BnFAD2-2在732、735位点均为C。316和908分别示意两个基因的突变位点。

图2是特异引物对P3-P4(左)和P5-P6(右)对亲本和F1基因组DNA扩增产物的测序图。图中上方是普通油酸含量品种NY14的碱基峰图，中间是杂交种F1的碱基峰图；下方是高油酸亲本N1379T的碱基峰图。图中的数字表示突变碱基位点在整个基因中的位置(自ATG开始计算)。注意：杂交种F1在突变位点上呈现双峰，即为两个碱基同时存在。

图3是CAPS标记对F2和BC1群体的双亲本、F1和单株进行基因型检测。

M代表DNA分子量(片段大小从上到下依次位1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)。P1代表高油酸亲本N1379T，P2代表普通油酸亲本16wh53，F1代表N1379T×16wh53。左上图为BssSI酶在F2群体中的基因型检测情况，1-20代表F2分离群体中的单株；左下图为HinfI酶在F2群体中的基因型检测情况，1-20代表F2分离群体中的单株；右上图为BssSI酶在BC1群体中的基因型检测情况，1-9代表BC1分离群体中的单株；右上图为HinfI酶在BC1群体中的基因型检测情况，1-9代表BC1分离群体中的单株。图中使用的DNA分子量相同。

图4为分离群体中不同基因型株系的平均油酸含量。

中括号里的数字表示对应基因型的株系数目。斜线左右的数字表示南京或武汉的株系数目。A和B分别表示F2和BC1群体中的油酸含量情况。

具体实施方式

实施例

1、分离群体构建过程。

我们使用的材料为具有自主知识产权的油菜高油酸(油酸含量≥85％)突变体N1379T(公知公用,见公开专利申请号：201010513722.9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.4106)和普通油酸含量的甘蓝型油菜品种宁油14号(NY14)(公知公用，国家审定油菜品种，审定号：国审油2004024)。2010年春天将N1379T与NY14杂交(N1379T×NY14)，获得F1杂交种子，同时将双亲自交获得杂交种子，亦分别称之为N1379T和NY14。2010年秋将N1379T、NY14和F1三个品系分别同时种在南京(32°02’03”N，118°52’19”E)和武汉(32°34’57”N，114°20’11”E)。2011年春季，分别在两地将F1自交获得F2种子(F2群体，南京的称之为F2-1群体，武汉的称之为F2-2群体)，同时将F1为母本，以NY14为父本杂交获得BC1种子(BC1回交群体，南京的称之为BC1-1群体，武汉的称之为BC1-2群体)。将每个群体中取出>200粒的种子按照Downy and Harvey介绍的方法(Downy RK andHarvey BL.Methods of breeding for oil quality in rape.Can J Plant Sci.1963；43:271-5.)进行半粒法脂肪酸测定。对于群体中的单粒种子而言，用锋利刀片切下种子内其中一片子叶的部分组织放入离心管中进行气相色谱脂肪酸分析，剩下的带有胚的子叶放在湿润的吸水纸上并放于培养室内进行发芽，待芽长约为5～10mm时移栽进入大田生长成为一个单株同时进行单株精心管理。

2、DNA提取。

采用CTAB法提取高油酸品系N1379T和普通油酸品种宁油14号(NY14)叶片基因组DNA(Murray M G,et al.Nuclear Acid Research,1980,8(19):4321-4326),并将基因组DNA浓度调整为50ng/μL。

3、分析控制甘蓝型油菜种子油酸含量的几个同源基因BnFad2的序列分析。

我们从NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中下载了四个分别代表四个同源BnFad2基因(BnFad2-1、BnFad2-2、BnFad2-3和BnFad2-4)的序列，分别为JN992606、JN992607、JN992608和JN992609。利用DNAman 6.0软件进行序列比较分析后发现(图1)：首先，在基因编码区的41-46bp处(自ATG开始起计算)有一段6bp的碱基变化，BnFad2-1和BnFad2-2两个基因相同，为A[A/G]AAGT，而BnFad2-3和BnFad2-4两个基因相同，为GCTCCC，差异区域编码完全不同的氨基酸。其次，BnFad2-1与BnFad2-2区别为：BnFad2-1在732、735位点均为T；而BnFad2-2在732、735位点均为C。BnFad2-3与BnFad2-4的区别在于：BnFad2-3在223-237位有一段16bp的缺失碱基序列，而BnFad2-4的序列是正常的。

4、特异引物设计以及PCR扩增获得对应同源基因片段。

根据专利CN201610835220.5-指示油菜种子高油酸含量的核苷酸突变位点(专利已受理)中公布的高油酸基因突变位点，即BnFad2-1基因的G316A位点和BnFad2-2基因的G908A位点，我们需要设计引物来克隆获得含有突变位点的单一基因片段。也就是说，对于BnFad2-1基因的G316A位点来说，克隆的产物只能含有BnFad2-1基因的片段并且含有G316位点，不管是以任何DNA为模板。同样的，对于BnFad2-2基因的G908A位点来说，克隆的产物只能含有BnFad2-2基因的片段并且含有G908位点，不管是以任何DNA为模板。然后才能以单纯的PCR产物为对象选择合适的酶进行酶切。

引物设计至关重要，不仅需要利用BnFad2-1基因和BnFad2-2基因有限的差异位点(图1)，而且还要能够合适的退火温度，同时还要能够包含目标突变位点。我们利用Primmer5.0软件，针对BnFad2-1基因设计了分别设计了相应的5对上游引物和10对下游引物，上下游引物可组合为50对特异引物进行检测；针对BnFad2-2基因设计了分别设计了相应的7对上游引物和9对下游引物，上下游引物可组合为63对特异引物进行检测。

下一步即是针对BnFad2-1基因采用上述50对、针对BnFad2-2基因采用63对引物组合进行PCR扩增，并对引物进行测序验证产物单一性。以N1379T、NY14以及杂种F1基因组DNA为模板，分别以上述引物组合进行PCR克隆。按照2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司)说明书配置20μL PCR反应体系。在EppendorfEPgradientS型PCR仪上进行扩增，反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，理论退火温度下退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。PCR产物在1.5％(W/V)琼脂糖凝胶电泳中分离。

扩增结果发现，对于BnFad2-1基因仅有三对引物组合能够扩增出预期条带，而对于BnFad2-2基因仅有2对引物组合能够扩增出预期条带。为了能够更加准确的获得单一PCR产物，我们又进行了退火温度梯度试验。将退火温度设计为50-60℃范围，从而寻找每一对引物组合的最佳退火温度。选择具有高亮条带的退火温度后，再次进行最佳退火温度下的PCR扩增，并进行电泳。

将成像仪下的PCR产物条带用北京Tiangen公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209)纯化回收，连接于克隆载体pEASY-T1(购自北京全式金生物技术有限公司，目录号：CT101-01)，热激后转化大肠杆菌DH5α。通过蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定，将阳性克隆送于南京金斯瑞生物有限公司测序。

测序峰图(图2)显示，两个位点分别有一对引物对扩增的PCR产物具有清晰的碱基峰图，表明引物对成功扩增出了单一的BnFad2同源基因片段。通过片段的测序结果也显示了清晰的高油酸突变体的突变位点，在突变位点位置具有明显的峰图差异。同时，在杂交F1的基因组中明显的出现了双峰。这两对引物序列为：(1)针对BnFad2-1基因的引物为：上游引物P3:5’-GCAAGTGTCTCCTCCCTCCAARAAG-3’；下游引物P4:5’-AGGCAACTCCTTGGACAGCA-3’；(2)针对BnFad2-2基因的引物为：上游引物P5:5’-GCTACGGTCTCTTCCGTTACGGC-3’；下游引物P6:5’-CTTGCCTGTCCGGTTCCACATAGATA-3’。

针对BnFad2-1同源基因316位点，高油酸品系N1379T中BnFad2-1基因中的位点为A(我们讲基因型设为AA)，普通油酸品种NY14中BnFad2-1基因中的位点为G(我们讲基因型设为aa)，而F1中BnFad2-1基因中的位点为G/A(我们讲基因型设为Aa)。同理，针对BnFad2-2同源基因908位点，高油酸品系N1379T中BnFad2-2基因中的位点为A(我们讲基因型设为BB)，普通油酸品种NY14中BnFad2-1基因中的位点为G(我们讲基因型设为bb)，而F1中BnFad2-1基因中的位点为G/A(我们讲基因型设为Bb)。

5、酶切位点选择及其在分离群体中的带型

酶切有两种策略，第一是寻找野生基因型在突变位点处的合适的内切酶，预期结果为野生型单株的扩增产物可被酶切，突变型单株的扩增产物不可被酶切，而杂合基因型呈现两种带型；第一是寻找突变基因型在突变位点处的合适的内切酶，预期结果为野生型单株的扩增产物不可被酶切，突变型单株的扩增产物可被酶切，而杂合基因型呈现两种带型。

我们利用在线酶切位点寻找工具NEBcutterV2.0(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)对特异引物扩增的PCR产物序列进行分析后，只能采用第一种策略，即野生型可被酶切，突变型不可被酶切。分别采用了以下限制性内切酶：(1)针对BnFad2-1同源基因316位点，选择BsssI(酶切位点为CACGAG)、BseDI(酶切位点为CCNNGG)和BtgI(酶切位点为CCRYGG)；(2)针对BnFad2-2同源基因908位点，选择TfiI(酶切位点为GAWTC)、HinfI(酶切位点为GANTC)。其中R是指A或G碱基，Y是指C或T碱基；W是指A或T碱基，N是指A或G或C或T碱基。

我们首先将上述酶应用于杂交双亲和F1中，通过其酶切带型来选择确定最好的限制性酶种类。酶切体系为：5μlPCR产物，2μl酶反应Buffer，0.5μl(10U)酶液以及12.5μlddH2O，共20μl反应体系。酶切反应在推荐温度水浴中反应1小时。酶切后，产物在2％(W/V)琼脂糖凝胶上进行电泳(100V，50min)。电泳完成后将凝胶取出放于凝胶成像仪(ChemiDocMP型，Biorad公司)下照相。经过带型比较分析后表明，针对BnFad2-1同源基因突变位点的BsssI酶和针对BnFad2-2同源基因突变位点的HinfI能够有效酶切PCR产物，并且双亲的带型明显不同，而F1的带型为双亲的组合。因此，我们确定使用这两种酶来进行群体酶切鉴定。

于此同此，我们进行了PCR产物序列分析以及酶切带型分析。(1)在P3-P4引物对扩增的片段(长度为731bp)中有一个针对于BsssI酶的识别位点，在NY14扩增的片段中可以酶切为295bp、436bp的带型(基因型设为aa)；在N1379T扩增的片段中无酶切位点，仍为731bp的带型(基因型设为AA)，而在F1扩增的片段中则为295bp、436bp、731bp的带型(基因型设为Aa)。(2)在P5-P6引物对扩增的片段(长度为405bp)中有三个针对于HinfI酶的识别位点，在NY14扩增的片段中可以酶切为61bp、80bp、58bp、206bp的带型(基因型设为bb)；在N1379T扩增的片段中61bp、80bp、264bp的带型(基因型设为BB)，而在F1扩增的片段中则为61bp、80bp、58bp、206bp、264bp的带型(基因型设为Bb)。注意，在HinfI酶切后的带型中，61bp、80bp、58bp这三条带由于长度非常接近，因此凝胶电泳未能将其分开，故在带型中呈现为一条DNA条带，但目标酶切位点的带型能够清晰分开。

针对分离群体的带型，如果单株的带型与N1379T相同，其基因型设为AA或BB；如果单株的带型与F1相同，其基因型设为Aa或Bb。因此，群体中每个单株的基因型均能能到确认(图3)。

6、分离群体中各种基因型的油酸含量

我们将F2和BC1群体中的各个株系都进行了基因型鉴定，其中F1群体中有9种基因型，BC1群体中有4种基因型。同时，将每个株系的油酸含量进行了测定，并计算了同一种基因型下所有株系油酸含量的平均值和误差(图4)。结果发现：(1)具有AABB基因型的株系，也就是与高油酸亲本N1379T基因型相同的株系，其在南京的平均值达到84.18％，在武汉的平均值达到86.06％。这些株系的油酸含量基本与高油酸亲本相当。(2)具有aabb基因型的株系，也就是与普通油酸亲本NY14基因型相同的株系，其在南京的平均值达到63.11％，在武汉的平均值达到63.26％。这些株系的油酸含量基本与普通油酸亲本相当。对于各个基因型的平均油酸含量以及基因型中显性基因的数量发现，株系基因型中含有的显性等位基因越多，油酸含量越高。在分离群体中选择具有AABB基因型的单株或株系，即为高油酸含量的单株或株系。

7.高油酸株系的筛选以及筛选效率

利用上述开发的高油酸性状的CAPS标记，分别于2012年和2013年筛选了两个遗传背景的杂交F1(N1379T×16wh53)和(16wh62×N1379T)衍生的F2和F3分离群体，以及回交群体(N1379T×16wh53)×16wh53和(16wh62×N1379T)×16wh62的两个回交世代(BC1代和BC2代)。每个群体约筛选200个单株，结果发现，高油酸筛选效率为100％。

DNA序列

SEQ ID NO:1

P3:5’-GCAAGTGTCTCCTCCCTCCAARAAG-3’

SEQ ID NO:2

P4:5’-AGGCAACTCCTTGGACAGCA-3’

SEQ ID NO:3

P5:5’-GCTACGGTCTCTTCCGTTACGGC-3’

SEQ ID NO:4

P6:5’-CTTGCCTGTCCGGTTCCACATAGATA-3’

SEQ ID NO:5

SEQ ID NO:6

序列表SEQ ID NO:1是扩增BnFad2-1中特异片段的上游引物(核苷酸序列)，序列长度为25bp(R表示A或G)；

序列表SEQ ID NO:2是扩增BnFad2-1中特异片段的下游引物(核苷酸序列)，序列长度为20bp；

序列表SEQ ID NO:3是扩增BnFad2-2中特异片段的上游引物(核苷酸序列)，序列长度为23bp；

序列表SEQ ID NO:4是扩增BnFad2-2中特异片段的下游引物(核苷酸序列)，序列长度为26bp；

序列表SEQ ID NO:5是特异引物在基因BnFad2-1中的扩增产物(核苷酸序列)，序列长度为731bp(加粗字体表示酶切碱基序列，下划线碱基表示突变位点)；

序列表SEQ ID NO:6是特异引物在基因BnFad2-2中的扩增产物(核苷酸序列)，序列长度为405bp(加粗字体表示酶切碱基序列，下划线碱基表示突变位点)。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 甘蓝型油菜种子高油酸含量的分子标记方法及应用

<130> 0

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<220>

<221> 5’UTR

<222> (1)..(25)

<400> 1

gcaagtgtct cctccctcca araag 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 5’UTR

<222> (1)..(20)

<400> 2

aggcaactcc ttggacagca 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 5’UTR

<222> (1)..(23)

<400> 3

gctacggtct cttccgttac ggc 23

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 5’UTR

<222> (1)..(26)

<400> 4

cttgcctgtc cggttccaca tagata 26

<210> 5

<211> 731

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(731)

<400> 5

gcaagtgtct cctccctcca aaaagtctga aaccgacaac atcaagcgcg taccctgcga 60

gacaccgccc ttcactgtcg gagaactcaa gaaagcaatc ccaccgcact gtttcaaacg 120

ctcgatccct cgctctttct cctacctcat ctgggacatc atcatagcct cctgcttcta 180

ctacgtcgcc accacttact tccctctcct ccctcaccct ctctcctact tcgcctggcc 240

tctctactgg gcctgccagg gctgcgtcct aaccggcgtc tgggtcatag cccacgagtg 300

cggccaccac gccttcagcg actaccagtg gctggacgac accgtcggcc tcatcttcca 360

ctccttcctc ctcgtccctt acttctcctg gaagtacagt catcgacgcc accattccaa 420

cactggctcc ctcgagagag acgaagtgtt tgtccccaag aagaagtcag acatcaagtg 480

gtacggcaag tacctcaaca accctttggg acgcaccgtg atgttaacgg ttcagttcac 540

tctcggctgg cctttgtact tagccttcaa cgtctcgggg agaccttacg acggcggctt 600

cgcttgccat ttccacccca acgctcccat ctacaacgac cgtgagcgtc tccagatata 660

catctccgac gctggcatcc tcgccgtctg ctacggtctc taccgctacg ctgctgtcca 720

aggagttgcc t 731

<210> 6

<211> 405

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(405)

<400> 6

gctacggtct cttccgttac gccgccgcgc agggagtggc ctcgatggtc tgcttctacg 60

gagtcccgct tctgattgtc aatggtttcc tcgtgttgat cacttacttg cagcacacgc 120

atccttccct gcctcactac gattcgtccg agtgggattg gttgagggga gctttggcta 180

ccgttgacag agactacgga atcttgaaca aggtcttcca caatattacc gacacgcacg 240

tggcgcatca tctgttctcc acgatgccgc attatcacgc gatggaagct accaaggcga 300

taaagccgat actgggagag tattatcagt tcgatgggac gccggtggtt aaggcgatgt 360

ggagggaggc gaaggagtgt atctatgtgg aaccggacag gcaag 405

Claims (6)

1.一种甘蓝型油菜种子高油酸含量的CAPS标记方法，其特征在于,

针对以下至少一个油菜种子高油酸含量的BnFad2基因核苷酸突变位点：(1)位于BnFad2同源基因BnFad2-1核苷酸序列316处G至A的置换，即：G316A，突变基因命名为BnFad2-1H；(2)位于BnFad2同源基因BnFad2-2核苷酸序列908处G至A的置换，即：G908A,突变基因命名为BnFad2-2H。

采用以下至少一对引物：

针对BnFad2-1中G316位点的上、下游引物，序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

针对BnFad2-2中G908位点的上、下游引物，序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

扩增编码甘蓝型油菜油酸去饱和酶FAD2即BnFad2基因的核苷酸序列片段，并选择相应的限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，可以标记油菜种子高油酸含量的BnFAD2基因核苷酸SNP突变位点。

2.根据权利要求1所述的一种甘蓝型油菜种子高油酸含量的CAPS标记方法，其特征在于，能够对PCR产物进行酶切的限制性内切酶为，其中针对BnFad2-1的突变位点选择BssSI酶，针对BnFad2-2的突变位点选择HinfI酶。

3.权利要求1或2所述一种甘蓝型油菜种子高油酸含量的CAPS标记方法的应用。

4.权利要求1或2所述一种甘蓝型油菜种子高油酸含量的CAPS标记方法在各分离世代筛选高油酸基因型与株系的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，

(1)通过权利要求1所述针对特定同源基因BnFad2突变位点设计的特异引物，利用PCR扩增出仅含有特定BnFad2同源基因中突变位点的片段；

(2)选择相应的限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切；

(3)对酶切产物进行水平凝胶电泳，根据DNA带型确定相应株系的基因型；

(4)根据基因型在不同分离世代选择得到高油酸单株或株系。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，

采用针对BnFad2-1中G316位点的上、下游引物P3、P4，序列分别如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示；针对BnFad2-2中G908位点的上、下游引物P5、P6，序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示扩增甘蓝型油菜材料DNA。

(1)如在P3-P4引物对扩增的片段长度为731bp中有一个针对于BsssI酶的识别位点，可以酶切为295bp、436bp的带型，则扩增的片段含有同源基因BnFad2-1中的突变位点G316位点,基因型设为aa；

如在扩增的片段中无酶切位点，仍为731bp的带型,则扩增的片段不含有同源基因BnFad2-1中的突变位点G316位点，基因型设为AA；

如果扩增的片段中则为295bp、436bp、731bp的带型，则为杂合型，基因型设为Aa。

(2)如在P5-P6引物对扩增的片段长度为405bp中有三个针对于HinfI酶的识别位点，可以酶切为61bp、80bp、58bp、206bp的带型，则扩增的片段含有同源基因BnFad2-2中的突变位点G908位点,基因型设为bb；

如扩增的片段中61bp、80bp、264bp的带型，没有三个针对于HinfI酶的识别位点，则扩增的片段不含有同源基因BnFad2-2中的突变位点G908位点，基因型设为BB；

如扩增的片段中在HinfI酶切后的带型为61bp、80bp、58bp、206bp、264bp的带型，则为杂合型，基因型设为Bb。