CN106282206A - 指示油菜种子高油酸含量的核苷酸突变位点 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了指示油菜种子高油酸含量的核苷酸突变位点，涉及植物分子育种领域。当所述任一核苷酸突变位点存在于油菜某品种(系)中时，表明该品种(系)具有高油酸含量性状；两个核苷酸突变位点同时存在，则指示更高的油酸含量。本发明以一个油菜高油酸突变体为材料，通过对油菜油酸去饱和酶基因(BnFAD2)进行PCR扩增，获得该突变体中的两个高油酸突变位点。将含有这些突变位点的高油酸含量油菜品种(系)与普通品种(系)杂交，通过在后续分离世代株系中检测这些突变位点，可以高效准确的得到油酸含量达85％的油菜品种(系)。

Description

指示油菜种子高油酸含量的核苷酸突变位点
技术领域
本发明涉及指示油菜种子高油酸含量的核苷酸突变位点，属于植物分子育种领域，具体地说，涉及能够指示油菜高油酸含量性状的核苷酸突变位点的检测与利用。更具体的，涉及甘蓝型油菜高油酸基因核酸序列的分离、高油酸突变位点的发现及其检测方法以及具有种子高油酸性状油菜品种(系)的分子育种。
背景技术
甘蓝型油菜是世界上重要的油料作物，菜籽油是中国传统食用油，也是国产食用植物油第一大来源。菜籽油的品质对我国油脂的健康消费具有重要的影响作用(殷艳，等，中国农业科技导报，2010(3)：16-21)。菜籽油中主要有棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)和芥酸(C22:1)等脂肪酸。从二十世纪七十年代末期我国开展甘蓝型油菜“双低”(低硫苷和低芥酸)育种至今，国内甘蓝型油菜品种已普遍实现双低化(王汉中，中国油料作物学报，2004(26)：98-101)。现有品种生产的菜籽油中油酸含量基本在60-66％左右。油酸为十八碳单不饱和脂肪酸，油酸含量的升高则必然导致亚油酸和亚麻酸等多不饱和脂肪酸含量的下降，从而增加菜籽油的氧化稳定性。与普通双低菜籽油相比，高油酸含量的菜籽油具有更长的货架期。此外，从营养和医学的角度来说，高油酸可降低血液中低密度脂蛋白的含量，能够更有效的保护心脑血管，对人类健康更加有益(Chang et al.Lipids,1998,33:481-487)。因此，提高油酸含量已经成为甘蓝型油菜品质育种的一个重要目标。
国内外学者已通过基因工程技术和诱变技术获得高油酸材料。在我国现行政策下，转基因作物进入商业化应用必须经过非常严格苛刻的评价过程。可以预见，转基因高油酸材料的应用还需要相当长一段时间。而通过非转基因技术(如：诱变技术)获得的高油酸材料则可以迅速应用于科研和生产。目前通过非转基因方式创建获得的高油酸种质较多，如：Xueyi Hu等利用EMS诱变获得了一个高油酸(～77％)种质DMS100(Xueyi Hu etal.Plant Biotechnology 2007,24:397-400)。官春云等利用8～10伦琴60Co射线辐射甘蓝型油菜湘油15号干种子，通过对后代进行连续筛选后获得若干份高油酸材料(官春云，等，作物学报，2006，32(11)：1625-1629)。浦惠明等利用低剂量60Co-γ射线处理甘蓝型油菜萌动种子获得了高油酸新种质N1379T，经气相色谱测定油酸含量高达85％(中国专利，专利号ZL 201010513722.9)。尽管如此，生产上高油酸种质的实际应用还不够广泛，主要是由于油菜高油酸性状的遗传标志物(如：分子标记、核酸突变位点等)报道较少。在中国专利中仅有两例：(1)CN 101490259A中公布了5个位点，分别为G269A、C346T、C646T、C775T和C827T；(2)CN 101824472A中公开了一对高油酸SCAR分子标记。但遗憾的是，这两例分子标记对应的油菜油酸含量仅为76-77％。因此，在实际应用中仍然缺乏油菜超高油酸(至少>80％)含量的遗传标志物(如：分子标记、核苷酸突变位点等)。
发明内容
技术问题
本发明旨在弥补已有专利或技术的不足，以自有的具有自主知识产权的高油酸突变体N1379T(公知公用,专利申请号：201010513722.9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.4106)为材料，通过对油菜油酸去饱和酶基因的分离鉴定，提供油菜中能够指示超高油酸性状(油酸含量>85％)的核苷酸突变位点，从而为油菜高油酸分子育种服务。
技术方案
本发明通过以下方案实现：
指示油菜种子高油酸含量的核苷酸突变位点，其特征在于，该位点是位于编码甘蓝型油菜油酸去饱和酶基因FAD2的核苷酸序列，即BnFAD2基因序列，通过以下至少一个核苷酸非保守突变产生的突变核苷酸序列：(1)位于BnFAD2同源基因BnFAD2-1核苷酸序列316处G至A的置换，即：G316A,突变基因命名为BnFAD2-1H；(2)位于BnFAD2同源基因BnFAD2-2核苷酸序列908处G至A的置换，即：G908A,突变基因命名为BnFAD2-2H。
所述BnFAD2-1基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1，编码氨基酸序列为SEQ ID NO.2；所述BnFAD2-2基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3，编码氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
BnFAD2-1H基因序列为SEQ ID NO.5，由1155个碱基组成，编码甘蓝型油菜油酸去饱和酶Ⅰ，与其它来源的油菜油酸去饱和酶Ⅰ的核酸序列相比，BnFAD2-1H基因包含一处有义的碱基突变：G316A，即在序列316处存在G316A的置换；BnFAD2-1H核苷酸编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.6，由384个氨基酸残基组成，在序列106位置处的氨基酸残基为赖氨酸(K)；
BnFAD2-2H基因序列为SEQ ID NO.7，由1155个碱基组成，编码甘蓝型油菜油酸去饱和酶Ⅱ，与其它来源的油菜油酸去饱和酶Ⅱ的核酸序列相比，BnFAD2-2H基因包含一处有义的碱基突变：G908A，即在序列908处存在G908A的置换，BnFAD2-2核苷酸编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.8，由384个氨基酸残基组成，在蛋白序列303位置处的氨基酸残基为谷氨酸(E)。
所述突变核苷酸序列还包括突变基因BnFAD2-1H或BnFAD2-2H通过至少一个核苷酸的置换、插入或缺失而衍生的核苷酸序列，并且与所述突变基因BnFAD2-1H或BnFAD2-2H至少90％同源性的同源核酸序列或者互补序列。
所述指示油菜种子高油酸含量的核苷酸突变位点的特异引物,包括:
BnFAD2引物3：5'-CGTCTGGGTCATAGCCAACG-3'；
BnFAD2引物4：5'-CGTCTGGGTCATAGCCAACA-3'；
BnFAD2引物5：5'-GACGCTCACGGTCGTTGTAGATG-3'；
BnFAD2引物6：5'-CACCGTTGACAGAGACTTCGG-3'；
BnFAD2引物7：5'-CACCGTTGACAGAGACTTCGA-3'；
BnFAD2引物8：5'-ACACACCTTTCTTCTCACCTTGC-3'；
其中，BnFAD2引物3和BnFAD2引物5组配引物对，能对普通油菜(即野生型)BnFAD2-1的316位点碱基G进行特异扩增，扩增片段373bp；
BnFAD2引物4和BnFAD2引物5组配引物对，能特异的针对BnFAD2-1H基因的316位点的突变碱基A进行特异扩增，扩增片段373bp；
BnFAD2引物6和BnFAD2引物8组配引物对，能对野生型BnFAD2-2的908位点碱基G进行特异扩增，扩增片段244bp；
BnFAD2引物7和BnFAD2引物8组配引物对，能特异的针对BnFAD2-2H的908位点的突变碱基A进行特异扩增，扩增片段244bp。
所述指示油菜种子高油酸含量的核苷酸突变位点的特异引物可以在含有BnFAD2同源基因BnFAD2-1核苷酸序列G316A或BnFAD2同源基因BnFAD2-2核苷酸序列G908A突变位点的高油酸油菜品种(系)选育中得到应用。当利用含有G316A和G908A突变位点的高油酸油菜品种(系)与不含有上述突变位点的普通油酸含量的油菜品种(系)杂交后，在后续分离世代群体中，可以通过检测这些突变位点确定某株系是否具有高油酸性状，从而高效的筛选到高油酸含量的油菜品种(系)。
有益效果
本发明具有以下优点：(1)本发明所述的突变位点是我国新发现的具有自主知识产权的油菜高油酸位点；(2)所述突变位点指示的油酸含量更高，两位点同时存在时油酸最高可达85％～88％，超过以往公开的其它位点或分子标记对应的油酸含量；(3)通过检测这些突变位点，可以高效准确的筛选到具有高油酸含量性状的油菜品种(系)。
附图说明
图1普通(油酸含量约63％，左)和高油酸突变体(油酸含量约85％，右)油菜品种(系)生产的菜籽油的脂肪酸气相色谱图。C18:1是指油酸，C18:2是指亚油酸，C18:3是指亚麻酸。
图2两个指示高油酸核苷酸位点所在基因的核苷酸序列比较图。
注：方框内表示突变核苷酸以及对应基因的野生型核苷酸，方框上面标识的数字为突变核苷酸在对应基因编码区的碱基位置。JN992606和JN992607为Genebank中的基因序列号。NY14是指宁油14号。
图3两个指示高油酸核苷酸位点所在基因编码的氨基酸序列比较图。
注：方框内表示突变氨基酸以及对应基因的野生型氨基酸，方框上面标识的数字为突变氨基酸在对应基因编码区的氨基酸残基位置。JN992606和JN992607为Genebank中的基因序列号。NY14是指宁油14号。
图4突变核苷酸位点特异引物对在野生型和突变体中的扩增情况。
注：M表示DNA分子量标准，片段由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。编号1-8表示不同的点样孔。不同点样孔采用的DNA模板不同，其中点样孔1、3、5、7的模板为突变体N1379T基因组DNA，点样孔2、4、6、8的模板为宁油14号油菜品种基因组DNA。不同点样孔PCR体系采用的引物对也不相同，其中1、2为3-5引物对，3、4为4-5引物对；5、6为6-8引物对，7、8为7-8引物对。
图5突变核苷酸位点G316A的特异引物在若干个油菜品种中的扩增情况。
注：M表示DNA分子量标准，片段由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。编号1-8表示不同的点样孔。1-24号点样孔PCR使用3-5引物对扩增，25-48号点样孔PCR使用4-5引物对扩增。1-24号点样孔与25-48号点样孔使用的DNA模板依次相同，依次为宁油10号(国审油2001010)、宁油20号(苏审油201004)、宁杂15号(苏审油200703)、宁杂1818(国审油2013016)、中双11号(国审油2008030)、苏油4号(苏审油200705)、宁油12号(苏审油200303)、沪油17号(国审油2006006)、扬油6号(国审油2004026)、皖油20号(皖品审02070340)、宁杂21号(国审油2010004)、贵杂5号(黔审油2003004)、陕油17(陕审油2012008号)、川油41(川审油2002013)、中油杂12号(鄂审油2005003)、中双10号(国审油2005002)、华油杂9号(国审油2004008)、丰油737(国审油2011015)、秦油10号(国审油2006003)、浙双3号(国审油2001003)、秦油7号(国审号2002002)、宁油14号(国审油2004024)、N1379T、dH2O。
图6突变核苷酸位点G908A的特异引物在若干个油菜品种中的扩增情况。
注：M表示DNA分子量标准，片段由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。编号1-8表示不同的点样孔。1-24号点样孔PCR使用6-8引物对扩增，25-48号点样孔PCR使用7-8引物对扩增。1-48号点样孔PCR扩增使用的DNA模板与图5的1-48号点样孔相同。
具体实施方式
下列实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法。
1寻找并获得甘蓝型油菜高油酸性状的候选指示位点。
首先需要说明的是，我们使用的材料为具有自主知识产权的油菜高油酸(油酸含量>85％)突变体N1379T(公知公用,专利申请号：201010513722.9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.4106)和普通油酸含量(油酸含量约为65％)的甘蓝型油菜品种宁油14号(公知公用，国家审定油菜品种，审定号：国审油2004024)。
植物油酸的合成与降解途径较为明晰。油酸的合成途径有两条：一是以硬脂酸(C18:0)位底物，在硬脂酰-CoA去饱和酶(SAD)的作用下生成油酸(C18:1)，这是主要途径；二是以棕榈油酸(C16:1)位底物，在辅酶A的作用下延长碳链，生成油酸(C18:1)，这是次要途径。油酸合成后有三个去向：一是结合至甘油的碳架上成为最终储藏物；二是在油酸去饱和酶(FAD2)的作用下形成亚油酸(C18:2)；三是进一步在碳链延长酶的作用下生成二十碳烯酸(C20:1)。而具体到甘蓝型油菜这一特定油料作物来说，现今推广的均为低芥酸品种，油菜籽中的二十碳烯酸含量非常少，一般低于3％，故生成的二十碳烯酸(C20:1)几乎可以忽略不计。另外，通过对高油酸大豆、高油酸花生以及通过转基因方法获得高油酸油菜的研究结果(曹永强，等，大豆科学，2015，34(2)：329-334；陈静，植物遗传资源学报，2011,12(2)：190-196；田保明，等，中国油料作物学报，2009,31(2)：132-136；陈松等，江苏农业学报，2009，25(6)：1234-1237)表明，改变FAD2基因的基因表达可以对油菜籽中的油酸含量产生显著影响。因此，可以认为FAD2基因应是控制油菜籽中油酸含量高低的重要候选基因之一。我们进而试图通过克隆突变体N1379T和普通油酸含量品种宁油14号中的FAD2基因来寻找两者可能的差异位点。
1.1突变体和普通油酸含量品种的BnFAD2基因克隆。
利用关键词在NCBI公共数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中搜寻BnFAD2基因序列，发现有超过100条基因序列登录。通过将已经登录的BnFAD2基因序列进行比对，发现各登录基因序列同源性较高。由于甘蓝型油菜为异源四倍体(Brassica napus,AACC,2n＝38)，起源于白菜(Brassicarapa，AA，2n＝20)和甘蓝(Brassica oleracea，CC，2n＝20)的天然杂交与染色体加倍，因此推测BnFAD2可能为一个基因家族，存在多个同源基因。BnFAD2基因内部无内含子，因此可以基因组DNA为模板进行PCR扩增。根据同源序列设计一对引物以基因组DNA为模板来克隆BnFAD2基因编码区序列全长。
BnFAD2引物1：5’-ATGGGTGCAGGTGGAAGAATGC-3’；
BnFAD2引物2：5’-TCATAACTTATTGTTGTACCAGAACAC-3’。
采用CTAB法提取突变体N1379T和宁油14号叶片基因组DNA(Murray M G,etal.NuclearAcid Research,1980,8(19):4321-4326)，并将基因组DNA浓度调整为50ng/μL。以BnFAD2引物1和引物2配对(下称1-2引物对)进行PCR克隆宁油14号与突变体的BnFAD2-1，BnFAD2-2，BnFAD2-3和BnFAD2-4。按北京全式金生物技术有限公司2×TransStart FastPfuPCR SuperMix说明书配置20μL PCR反应体系。在EppendorfEPgradient S型PCR仪上进行扩增，反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。产物在1.2％(W/V)琼脂糖凝胶电泳中分离，用北京Tiangen公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209)纯化回收，连接于克隆载体pEASY-T1(购自北京全式金生物技术有限公司，目录号：CT101-01)，热激后转化大肠杆菌DH5α。通过蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定，由于BnFAD2基因可能有多个同源基因，故将两个试验材料的各200个阳性克隆送于南京金斯瑞生物有限公司测序。
1.2 BnFAD2同源基因的序列分析。
成功获得两个材料共约400个基因序列的编码区序列。分别将每个试验材料的测序序列输入DNAman序列分析软件后，发现整体同源性较高，达到98％以上。进一步深入比较分析后发现，根据序列特征可以将每个试验材料的测序序列可以分为四类，即四个同源的BnFAD2基因，分别命名为BnFAD2-1，BnFAD2-2，BnFAD2-3和BnFAD2-4。在NCBI公共数据库里分别选择一个同源基因序列与之对应并作为参考序列，依次分别为JN992606、JN992607、JN992608和JN992609。四个BnFAD2基因之间固定的碱基差异表现为：(1)BnFAD2-1，BnFAD2-2和BnFAD2-4的序列总长度均为1155bp，而BnFAD2-3序列内自222bp开始有一段16bp碱基缺失并导致表达框移码突变提前形成终止子，推测该基因可能不具备功能。(2)BnFAD2-1和BnFAD2-2在41-46位碱基段为A[A/G]AAGT，而BnFAD2-3和BnFAD2-4在41-46位碱基段位GCTCCC，差异碱基区域编码完全不同的氨基酸。(3)BnFAD2-1与BnFAD2-2区别为：BnFAD2-1来自于A基因组，在732、735位点均为T，在792、852位点均为C，在939、969位点均为G；而BnFAD2-2来自于C基因组，在732、735位点均为C，在792、852位点均为T，在939、969位点均为C。(4)BnFAD2-3与BnFAD2-4的区别在于：BnFAD2-3在222-237位有一段16bp的缺失碱基序列，而BnFAD2-4的序列是正常的。
1.3通过BnFAD2基因序列比较确定候选差异位点。
首先将两个材料的测序序列按照BnFAD2-1、BnFAD2-2、BnFAD2-3、BnFAD2-4的特点分别分为四类后，然后对各个类别中两个材料的序列进行比对。结果表明，与宁油14号中BnFAD2的四个基因序列相比，我们发现了四个候选的突变位点：(1)BnFAD2-1基因发生1处单碱基突变：G316A，使对应的蛋白序列第106处由谷氨酸(Glu，E)变为赖氨酸(Lys，K)；(2)BnFAD2-2基因发生1处单碱基突变：G908A，使对应的蛋白序列第303处由甘氨酸(Gly，G)变为谷氨酸(Glu，E)；(3)BnFAD2-4基因发生2处单碱基突变：G418A和C469T，分别对应的蛋白序列第140处由甘氨酸(Gly，G)变为丝氨酸(Ser，S)和第157处由亮氨酸(Leu，L)变为丙氨酸(Ala，F)。
2油酸含量分离群体构建。
通过将高油酸突变体N1379T与正常油酸含量品种杂交，并采用系谱法选择加异地夏繁的方法获得不同遗传背景的F6代分离群体。具体方法为：于2011年春季3月花期以高油酸突变体N1379T为父本，分别与甘蓝型油菜常规品种宁油14号(国审油2004024)、沪油17号(国审油2006006)和宁油22号(苏审油201004)等三个品种进行杂交，5月及时将偏黄颜色的杂交角果剪下，晾干并脱粒，得到3种不同遗传背景的F1种子。随后到青海省青海大学油菜育种基地(下称青海)夏繁播种，花期每个F1分别选3株生长一致的单株套袋自交，10月取成熟较早的主花絮角果收获晾干并脱粒，将每个F1的三株收获种子混合成为三个F1:2种子。F1:2种子随即至南京江苏省农科院溧水植物科学基地(下称南京)播种，每个F1:2种子播种30行，2012年3月花期每行依次套单株10株自交，不做任何选择。2012年5月及时将各套袋单株偏黄颜色的主花絮角果剪下，晾干并脱粒，同时每个自交单株编一个号码，称为F2群体(即F2:3种子)。2012年5月随即至青海夏繁，每个编号播一行，花期每行套两个单株，2012年10月收获时每行仅选择一个单株脱粒编号，称为F3群体(即F3:4种子)。此后的世代按照F2群体至F3群体的方式进行，直到于2014年5月得到F6分离群体(即F6:7种子)，每个遗传背景的分离群体共包括约300个单株。
3核苷酸突变位点与高油酸性状的相关性分析
3.1群体单株油酸含量的测定。
分别从三个群体各个单株的套袋自交种子种取样用于测定油酸含量。参考高建芹等(高建芹，等，江苏农业学报，2008，24(5)：581-585)的方法利用安捷伦气象色谱仪(型号：Agilent 6890N，)测定油酸含量。各个群体的油酸含量情况如表1。
表1三个群体的油酸含量情况
3.2候选位点与油酸含量相关性的初步验证。
分别从三个群体中各取10个油酸含量最高的株系(称为高油酸小群体)和10个油酸含量最低的株系(称为低油酸小群体)。从各株系取50粒种子置于加有八层滤纸的培养皿内，加适量水后放在培养室内发芽，7天后取小苗采用CTAB法提DNA。将各株系基因组DNA浓度调整为50ng/μL。以1-2引物对进行PCR克隆各个株系的BnFAD2基因，每个株系测序50个克隆，获得50条BnFAD2基因序列。
将每个株系的BnFAD2基因序列按照四个BnFAD2同源基因的特点分为四类。分别在高油酸小群体和低油酸小群体中寻找1.3中的候选差异位点，结果发现：高油酸小群体的BnFAD2-1基因的316位点既有G又有A，而低油酸小群体BnFAD2-1基因的316位点均为G；高油酸小群体的BnFAD2-2基因的908位点既有G又有A，而低油酸小群体BnFAD2-2基因的908位点均为G；高油酸小群体的BnFAD2-4基因的418位点既有G又有A，而低油酸小群体BnFAD2-4基因的418位点也是既有G又有A；高油酸小群体的BnFAD2-4基因的469位点既有C又有T，而低油酸小群体BnFAD2-1基因的469位点也是既有C又有T。由此可以分析：高油酸小群体的BnFAD2-1基因的316位点的A和BnFAD2-2基因的908位点的A均为特异的，低油酸小群体没有，但BnFAD2-4基因的418位点的A和469位点的T并非特有的。综合可以初步判断，G316A和G908A是高油酸株系的特异位点。
3.3突变位点的特异引物开发。
为了在大群体中进一步确认G316A和G908A与高油酸性状的相关性，靠测序的方法来进行差异位点的确认工作量很大，因此我们设计开发了两个突变位点的特异引物来进行大群体的基因型鉴定。
根据上述两个突变位点附近的序列特点，分别设计三条引物用于突变位点特异扩增。
具体来说如下：
BnFAD2引物3：5'-CGTCTGGGTCATAGCCAACG-3'；
BnFAD2引物4：5'-CGTCTGGGTCATAGCCAACA-3'；
BnFAD2引物5：5'-GACGCTCACGGTCGTTGTAGATG-3'；
BnFAD2引物6：5'-CACCGTTGACAGAGACTTCGG-3'；
BnFAD2引物7：5'-CACCGTTGACAGAGACTTCGA-3'；
BnFAD2引物8：5'-ACACACCTTTCTTCTCACCTTGC-3'；
其中BnFAD2引物3和BnFAD2引物5组配引物对(下称为3-5引物对)，能对普通油菜(即野生型)BnFAD2-1的316位点碱基G进行特异PCR扩增，扩增片段为373bp；BnFAD2引物4和BnFAD2引物5组配引物对(下称为4-5引物对)，能特异的针对BnFAD2-1H基因的316位点的突变碱基A进行特异PCR扩增，扩增片段为373bp。3-5引物对和4-5引物对的PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。同样类似的，BnFAD2引物6和BnFAD2引物8组配引物对(下称为6-8引物对)，能对野生型BnFAD2-2的908位点碱基G进行特异PCR扩增，扩增片段为244bp；BnFAD2引物7和BnFAD2引物8组配引物对(下称为7-8引物对)，能特异的针对BnFAD2-2H的908位点的突变碱基A进行特异PCR扩增，扩增片段为244bp。6-8引物对和7-8引物对的PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。所述四对引物对宁油14号(野生型)和突变体N1379T的基因组DNA进行PCR扩增结果如图4。由图4可以看出，3-5引物对对突变体和野生型均能扩出条带(点样孔1和2)，表明两者在316位点均存在G碱基；而4-5引物对对突变体和野生型扩增，仅突变体能扩出条带(点样孔3)，野生型无带(点样孔4)，表明突变体在316位点存在A碱基，而野生型中没有A碱基存在。同样的，6-8引物对对突变体和野生型均能扩出条带(点样孔5和6)，表明两者在908位点均存在G碱基；而7-8引物对对突变体和野生型扩增，仅突变体能扩出条带(点样孔7)，野生型无带(点样孔8)，表明突变体在908位点存在A碱基，而野生型中在908位点没有A碱基存在。综合表明，与野生型相比，突变体基因组中具有特异的在316位点存在A碱基以及在908位点存在A碱基。由此，我们成功的开发了针对了两个指示高油酸性状突变核苷酸位点的特异引物。
为了减少突变位点的杂合基因型对分析结果的影响，我们利用突变位点的特异引物检测与选择出F6群体中特异位点的纯合单株。利用四个引物对(分别为3-5引物对、4-5引物对、6-8引物对、7-8引物对)对每个自交单株检测突变位点。对于316位点，仅能被3-5引物对和4-5引物对中其中一对引物对扩增出目标大小条带的，认为是316位点的纯合单株；同样的，对于908位点，仅能被6-8引物对和7-8引物对中其中一对引物对扩增出目标大小条带的，认为是908位点的纯合单株。最终，三个遗传背景的F6群体依次各获得220、211和194个在特异位点的纯合单株。
3.4群体油酸含量数据分析。
核苷酸突变位点与油酸含量相关性见下表2。我们发现：(1)两个核苷酸突变位点均与高油酸性状高度相关；(2)同时含有两个突变位点株系的油酸含量大于含有仅含有一个突变位点株系的油酸含量，而不含突变位点的株系含量与普通油菜株系油酸含量相当；(3)同时含有两个突变位点株系的油酸含量平均为85％，比普通油菜油酸含量提高约20个百分点；含有任一突变位点株系的油酸含量为75％，比普通油菜油酸含量提高约10个百分点。
表2 DH群体中核苷酸突变位点与油酸含量的相关性
3.5突变位点在已有油菜品种中的特异性。
此外，为了验证核苷酸突变位点在其它油菜品种中是否特有特异性，我们以21个来自于全国不同油菜育种科研单位选育品种的基因组DNA为模板，以我们开发的针对这两个特异核苷酸位点的特异引物进行PCR扩增。在扩增过程中，以宁油14号和dH2O为阴性对照模板，以突变体N1379T为阳性对照模板，设置好对应引物对的退火温度。扩增结果如图5和图6。结果表明，在21个油菜品种中均无本专利所述核苷酸特异位点，进一步证明了本专利所述核苷酸位点具有特异性。
至此，可以确认，BnFAD2-1的G316A位点突变和BnFAD2-2的G908A位点突变是新发现的特异突变位点，可以用来指示油菜的高油酸含量性状。同时，利用突变核苷酸位点的特异引物进行扩增，可避免采用基因扩增产物测序的方法来检测特异位点的繁琐，减少了基因检测与后代株系选择过程中的工作量。
SEQ.
SEQ ID NO.1：BnFAD2-1基因核苷酸序列；(1155bp)
ATGGGTGCAGGTGGAAGAATGCAAGTGTCTCCTCCCTCCAAAAAGTCTGAAACCGACAACATCAAGCGCGTACCCTGCGAGACACCGCCCTTCACTGTCGGAGAACTCAAGAAAGCAATCCCACCGCACTGTTTCAAACGCTCGATCCCTCGCTCTTTCTCCTACCTCATCTGGGACATCATCATAGCCTCCTGCTTCTACTACGTCGCCACCACTTACTTCCCTCTCCTCCCTCACCCTCTCTCCTACTTCGCCTGGCCTCTCTACTGGGCCTGCCAGGGCTGCGTCCTAACCGGCGTCTGGGTCATAGCCCACGAGTGCGGCCACCACGCCTTCAGCGACTACCAGTGGCTGGACGACACCGTCGGCCTCATCTTCCACTCCTTCCTCCTCGTCCCTTACTTCTCCTGGAAGTACAGTCATCGACGCCACCATTCCAACACTGGCTCCCTCGAGAGAGACGAAGTGTTTGTCCCCAAGAAGAAGTCAGACATCAAGTGGTACGGCAAGTACCTCAACAACCCTTTGGGACGCACCGTGATGTTAACGGTTCAGTTCACTCTCGGCTGGCCTTTGTACTTAGCCTTCAACGTCTCGGGGAGACCTTACGACGGCGGCTTCGCTTGCCATTTCCACCCCAACGCTCCCATCTACAACGACCGTGAGCGTCTCCAGATATACATCTCCGACGCTGGCATCCTCGCCGTCTGCTACGGTCTCTACCGCTACGCTGCTGTCCAAGGAGTTGCCTCGATGGTCTGCTTCTACGGAGTTCCTCTTCTGATTGTCAACGGGTTCTTAGTTTTGATCACTTACTTGCAGCACACGCATCCTTCCCTGCCTCACTATGACTCGTCTGAGTGGGATTGGTTGAGGGGAGCTTTGGCCACCGTTGACAGAGACTACGGAATCTTGAACAAGGTCTTCCACAATATCACGGACACGCACGTGGCGCATCACCTGTTCTCGACCATGCCGCATTATCACGCGATGGAAGCTACGAAGGCGATAAAGCCGATACTGGGAGAGTATTATCAGTTCGATGGGACGCCGGTGGTTAAGGCGATGTGGAGGGAGGCGAAGGAGTGTATCTATGTGGAACCGGACAGGCAAGGTGAGAAGAAAGGTGTGTTCTGGTACAACAATAAGTTATGA
SEQ ID NO.2：BnFAD2-1基因编码氨基酸序列；(384个氨基酸)
SEQ ID NO.3：BnFAD2-2基因核苷酸序列；(1155bp)
ATGGGTGCAGGTGGAAGAATGCAAGTGTCTCCTCCCTCCAAGAAGTCTGAAACCGACACCATCAAGCGCGTACCCTGCGAGACACCGCCCTTCACTGTCGGAGAACTCAAGAAAGCAATCCCACCGCACTGTTTCAAACGCTCGATCCCTCGCTCTTTCTCCTACCTCATCTGGGACATCATCATAGCCTCCTGCTTCTACTACGTCGCCACCACTTACTTCCCTCTCCTCCCTCACCCTCTCTCCTACTTCGCCTGGCCTCTCTACTGGGCCTGCCAAGGGTGCGTCCTAACCGGCGTCTGGGTCATAGCCCACGAGTGCGGCCACCACGCCTTCAGCGACTACCAGTGGCTTGACGACACCGTCGGTCTCATCTTCCACTCCTTCCTCCTCGTCCCTTACTTCTCCTGGAAGTACAGTCATCGACGCCACCATTCCAACACTGGCTCCCTCGAGAGAGACGAAGTGTTTGTCCCCAAGAAGAAGTCAGACATCAAGTGGTACGGCAAGTACCTCAACAACCCTTTGGGACGCACCGTGATGTTAACGGTTCAGTTCACTCTCGGCTGGCCGTTGTACTTAGCCTTCAACGTCTCGGGAAGACCTTACGACGGCGGCTTCGCTTGCCATTTCCACCCCAACGCTCCCATCTACAACGACCGCGAGCGTCTCCAGATATACATCTCCGACGCTGGCATCCTCGCCGTCTGCTACGGTCTCTTCCGTTACGCCGCCGCGCAGGGAGTGGCCTCGATGGTCTGCTTCTACGGAGTCCCGCTTCTGATTGTCAATGGTTTCCTCGTGTTGATCACTTACTTGCAGCACACGCATCCTTCCCTGCCTCACTACGATTCGTCCGAGTGGGATTGGTTGAGGGGAGCTTTGGCTACCGTTGACAGAGACTACGGAATCTTGAACAAGGTCTTCCACAATATTACCGACACGCACGTGGCGCATCATCTGTTCTCCACGATGCCGCATTATCACGCGATGGAAGCTACCAAGGCGATAAAGCCGATACTGGGAGAGTATTATCAGTTCGATGGGACGCCGGTGGTTAAGGCGATGTGGAGGGAGGCGAAGGAGTGTATCTATGTGGAACCGGACAGGCAAGGTGAGAAGAAAGGTGTGTTCTGGTACAACAATAAGTTATGA
SEQ.4，BnFAD2-2氨基酸序列；
SEQ ID NO.5：BnFAD2-1H基因核苷酸序列；(1155bp)
ATGGGTGCAGGTGGAAGAATGCAAGTGTCTCCTCCCTCCAAAAAGTCTGAAACCGACAACATCAAGCGCGTACCCTGCGAGACACCGCCCTTCACTGTCGGAGAACTCAAGAAAGCAATCCCACCGCACTGTTTCAAACGCTCGATCCCTCGCTCTTTCTCCTACCTCATCTGGGACATCATCATAGCCTCCTGCTTCTACTACGTCGCCACCACTTACTTCCCTCTCCTCCCTCACCCTCTCTCCTACTTCGCCTGGCCTCTCTACTGGGCCTGCCAGGGCTGCGTCCTAACCGGCGTCTGGGTCATAGCCCACAAGTGCGGCCACCACGCCTTCAGCGACTACCAGTGGCTGGACGACACCGTCGGCCTCATCTTCCACTCCTTCCTCCTCGTCCCTTACTTCTCCTGGAAGTACAGTCATCGACGCCACCATTCCAACACTGGCTCCCTCGAGAGAGACGAAGTGTTTGTCCCCAAGAAGAAGTCAGACATCAAGTGGTACGGCAAGTACCTCAACAACCCTTTGGGACGCACCGTGATGTTAACGGTTCAGTTCACTCTCGGCTGGCCTTTGTACTTAGCCTTCAACGTCTCGGGGAGACCTTACGACGGCGGCTTCGCTTGCCATTTCCACCCCAACGCTCCCATCTACAACGACCGTGAGCGTCTCCAGATATACATCTCCGACGCTGGCATCCTCGCCGTCTGCTACGGTCTCTACCGCTACGCTGCTGTCCAAGGAGTTGCCTCGATGGTCTGCTTCTACGGAGTTCCTCTTCTGATTGTCAACGGGTTCTTAGTTTTGATCACTTACTTGCAGCACACGCATCCTTCCCTGCCTCACTATGACTCGTCTGAGTGGGATTGGTTGAGGGGAGCTTTGGCCACCGTTGACAGAGACTACGGAATCTTGAACAAGGTCTTCCACAATATCACGGACACGCACGTGGCGCATCACCTGTTCTCGACCATGCCGCATTATCATGCGATGGAAGCTACGAAGGCGATAAAGCCGATACTGGGAGAGTATTATCAGTTCGATGGGACGCCGGTGGTTAAGGCGATGTGGAGGGAGGCGAAGGAGTGTATCTATGTGGAACCGGACAGGCAAGGTGAGAAGAAAGGTGTGTTCTGGTACAACAATAAGTTATGA
SEQ ID NO.6：BnFAD2-1H基因编码氨基酸序列；(384个氨基酸)
SEQ ID NO.7：BnFAD2-2H基因核苷酸序列；(1155bp)
ATGGGTGCAGGTGGAAGAATGCAAGTGTCTCCTCCCTCCAAGAAGTCTGAAACCGACACCATCAAGCGCGTACCCTGCGAGACACCGCCCTTCACTGTCGGAGAACTCAAGAAAGCAATCCCACCGCACTGTTTCAAACGCTCGATCCCTCGCTCTTTCTCCTACCTCATCTGGGACATCATCATAGCCTCCTGCTTCTACTACGTCGCCACCACTTACTTCCCTCTCCTCCCTCACCCTCTCTCCTACTTCGCCTGGCCTCTCTACTGGGCCTGCCAAGGGTGCGTCCTAACCGGCGTCTGGGTCATAGCCCACGAGTGCGGCCACCACGCCTTCAGCGACTACCAGTGGCTTGACGACACCGTCGGTCTCATCTTCCACTCCTTCCTCCTCGTCCCTTACTTCTCCTGGAAGTACAGTCATCGACGCCACCATTCCAACACTGGCTCCCTCGAGAGAGACGAAGTGTTTGTCCCCAAGAAGAAGTCAGACATCAAGTGGTACGGCAAGTACCTCAACAACCCTTTGGGACGCACCGTGATGTTAACGGTTCAGTTCACTCTCGGCTGGCCGTTGTACTTAGCCTTCAACGTCTCGGGAAGACCTTACGACGGCGGCTTCGCTTGCCATTTCCACCCCAACGCTCCCATCTACAACGACCGCGAGCGTCTCCAGATATACATCTCCGACGCTGGCATCCTCGCCGTCTGCTACGGTCTCTTCCGTTACGCCGCCGCGCAGGGAGTGGCCTCGATGGTCTGCTTCTACGGAGTCCCGCTTCTGATTGTCAATGGTTTCCTCGTGTTGATCACTTACTTGCAGCACACGCATCCTTCCCTGCCTCACTACGATTCGTCCGAGTGGGATTGGTTGAGGGGAGCTTTGGCTACCGTTGACAGAGACTACGAAATCTTGAACAAGGTCTTCCACAATATTACCGACACGCACGTGGCGCATCATCTGTTCTCCACGATGCCGCATTATCACGCGATGGAAGCTACCAAGGCGATAAAGCCGATACTGGGAGAGTATTATCAGTTCGATGGGACGCCGGTGGTTAAGGCGATGTGGAGGGAGGCGAAGGAGTGTATCTATGTGGAACCGGACAGGCAAGGTGAGAAGAAAGGTGTGTTCTGGTACAACAATAAGTTATGA
SEQ ID NO.8：BnFAD2-2H基因编码氨基酸序列；(384个氨基酸)
SEQ ID NO.9：BnFAD2引物1；
5’-ATGGGTGCAGGTGGAAGAATGC-3’
SEQ ID NO.10：BnFAD2引物2；
5’-TCATAACTTATTGTTGTACCAGAACAC-3’
SEQ ID NO.11：BnFAD2引物3；
5'-CGTCTGGGTCATAGCCAACG-3'
SEQ ID NO.12：BnFAD2引物4；
5'-CGTCTGGGTCATAGCCAACA-3'
SEQ ID NO.13：BnFAD2引物5；
5'-GACGCTCACGGTCGTTGTAGATG-3'
SEQ ID NO.14：BnFAD2引物6；
5'-CACCGTTGACAGAGACTTCGG-3'
SEQ ID NO.15：BnFAD2引物7；
5'-CACCGTTGACAGAGACTTCGA-3'
SEQ ID NO.16：BnFAD2引物8；
5'-ACACACCTTTCTTCTCACCTTGC-3'
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 指示油菜种子高油酸含量的核苷酸突变位点
<130> 0
<160> 16
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1155
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜
<220>
<221> BnFAD2-1基因核苷酸序列
<222> (1)..(400)
<223>
<220>
<221> BnFAD2-1基因核苷酸序列
<222> (1)..(1155)
<223>
<400> 1
atgggtgcag gtggaagaat gcaagtgtct cctccctcca aaaagtctga aaccgacaac 60
atcaagcgcg taccctgcga gacaccgccc ttcactgtcg gagaactcaa gaaagcaatc 120
ccaccgcact gtttcaaacg ctcgatccct cgctctttct cctacctcat ctgggacatc 180
atcatagcct cctgcttcta ctacgtcgcc accacttact tccctctcct ccctcaccct 240
ctctcctact tcgcctggcc tctctactgg gcctgccagg gctgcgtcct aaccggcgtc 300
tgggtcatag cccacgagtg cggccaccac gccttcagcg actaccagtg gctggacgac 360
accgtcggcc tcatcttcca ctccttcctc ctcgtccctt acttctcctg gaagtacagt 420
catcgacgcc accattccaa cactggctcc ctcgagagag acgaagtgtt tgtccccaag 480
aagaagtcag acatcaagtg gtacggcaag tacctcaaca accctttggg acgcaccgtg 540
atgttaacgg ttcagttcac tctcggctgg cctttgtact tagccttcaa cgtctcgggg 600
agaccttacg acggcggctt cgcttgccat ttccacccca acgctcccat ctacaacgac 660
cgtgagcgtc tccagatata catctccgac gctggcatcc tcgccgtctg ctacggtctc 720
taccgctacg ctgctgtcca aggagttgcc tcgatggtct gcttctacgg agttcctctt 780
ctgattgtca acgggttctt agttttgatc acttacttgc agcacacgca tccttccctg 840
cctcactatg actcgtctga gtgggattgg ttgaggggag ctttggccac cgttgacaga 900
gactacggaa tcttgaacaa ggtcttccac aatatcacgg acacgcacgt ggcgcatcac 960
ctgttctcga ccatgccgca ttatcacgcg atggaagcta cgaaggcgat aaagccgata 1020
ctgggagagt attatcagtt cgatgggacg ccggtggtta aggcgatgtg gagggaggcg 1080
aaggagtgta tctatgtgga accggacagg caaggtgaga agaaaggtgt gttctggtac 1140
aacaataagt tatga 1155
<210> 2
<211> 384
<212> PRT
<213> 甘蓝型油菜
<220>
<221> BnFAD2-1基因编码氨基酸序列
<222> (1)..(384)
<223>
<400> 2
Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
20 25 30
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
50 55 60
Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
65 70 75 80
Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
85 90 95
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
100 105 110
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
115 120 125
Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
130 135 140
His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys
145 150 155 160
Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu
165 170 175
Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu
180 185 190
Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala
195 200 205
Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu
210 215 220
Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu
225 230 235 240
Tyr Arg Tyr Ala Ala Val Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr
245 250 255
Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr
260 265 270
Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp
275 280 285
Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile
290 295 300
Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His
305 310 315 320
Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala
325 330 335
Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val
340 345 350
Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu
370 375 380
<210> 3
<211> 1155
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜
<220>
<221> BnFAD2-2基因核苷酸序列
<222> (1)..(1155)
<223>
<400> 3
atgggtgcag gtggaagaat gcaagtgtct cctccctcca agaagtctga aaccgacacc 60
atcaagcgcg taccctgcga gacaccgccc ttcactgtcg gagaactcaa gaaagcaatc 120
ccaccgcact gtttcaaacg ctcgatccct cgctctttct cctacctcat ctgggacatc 180
atcatagcct cctgcttcta ctacgtcgcc accacttact tccctctcct ccctcaccct 240
ctctcctact tcgcctggcc tctctactgg gcctgccaag ggtgcgtcct aaccggcgtc 300
tgggtcatag cccacgagtg cggccaccac gccttcagcg actaccagtg gcttgacgac 360
accgtcggtc tcatcttcca ctccttcctc ctcgtccctt acttctcctg gaagtacagt 420
catcgacgcc accattccaa cactggctcc ctcgagagag acgaagtgtt tgtccccaag 480
aagaagtcag acatcaagtg gtacggcaag tacctcaaca accctttggg acgcaccgtg 540
atgttaacgg ttcagttcac tctcggctgg ccgttgtact tagccttcaa cgtctcggga 600
agaccttacg acggcggctt cgcttgccat ttccacccca acgctcccat ctacaacgac 660
cgcgagcgtc tccagatata catctccgac gctggcatcc tcgccgtctg ctacggtctc 720
ttccgttacg ccgccgcgca gggagtggcc tcgatggtct gcttctacgg agtcccgctt 780
ctgattgtca atggtttcct cgtgttgatc acttacttgc agcacacgca tccttccctg 840
cctcactacg attcgtccga gtgggattgg ttgaggggag ctttggctac cgttgacaga 900
gactacggaa tcttgaacaa ggtcttccac aatattaccg acacgcacgt ggcgcatcat 960
ctgttctcca cgatgccgca ttatcacgcg atggaagcta ccaaggcgat aaagccgata 1020
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<210> 4
<211> 384
<212> PRT
<213> 甘蓝型油菜
<220>
<221> BnFAD2-2氨基酸序列
<222> (1)..(384)
<223>
<400> 4
Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Thr Asp Thr Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
20 25 30
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
50 55 60
Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
65 70 75 80
Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
85 90 95
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
100 105 110
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
115 120 125
Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
130 135 140
His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys
145 150 155 160
Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu
165 170 175
Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu
180 185 190
Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala
195 200 205
Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu
210 215 220
Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu
225 230 235 240
Phe Arg Tyr Ala Ala Ala Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr
245 250 255
Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr
260 265 270
Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp
275 280 285
Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile
290 295 300
Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His
305 310 315 320
Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala
325 330 335
Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val
340 345 350
Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu
370 375 380
<210> 5
<211> 1155
<212> DNA
<213>
<220>
<221> BnFAD2-1H基因核苷酸序列
<222> (1)..(1155)
<223>
<400> 5
atgggtgcag gtggaagaat gcaagtgtct cctccctcca aaaagtctga aaccgacaac 60
atcaagcgcg taccctgcga gacaccgccc ttcactgtcg gagaactcaa gaaagcaatc 120
ccaccgcact gtttcaaacg ctcgatccct cgctctttct cctacctcat ctgggacatc 180
atcatagcct cctgcttcta ctacgtcgcc accacttact tccctctcct ccctcaccct 240
ctctcctact tcgcctggcc tctctactgg gcctgccagg gctgcgtcct aaccggcgtc 300
tgggtcatag cccacaagtg cggccaccac gccttcagcg actaccagtg gctggacgac 360
accgtcggcc tcatcttcca ctccttcctc ctcgtccctt acttctcctg gaagtacagt 420
catcgacgcc accattccaa cactggctcc ctcgagagag acgaagtgtt tgtccccaag 480
aagaagtcag acatcaagtg gtacggcaag tacctcaaca accctttggg acgcaccgtg 540
atgttaacgg ttcagttcac tctcggctgg cctttgtact tagccttcaa cgtctcgggg 600
agaccttacg acggcggctt cgcttgccat ttccacccca acgctcccat ctacaacgac 660
cgtgagcgtc tccagatata catctccgac gctggcatcc tcgccgtctg ctacggtctc 720
taccgctacg ctgctgtcca aggagttgcc tcgatggtct gcttctacgg agttcctctt 780
ctgattgtca acgggttctt agttttgatc acttacttgc agcacacgca tccttccctg 840
cctcactatg actcgtctga gtgggattgg ttgaggggag ctttggccac cgttgacaga 900
gactacggaa tcttgaacaa ggtcttccac aatatcacgg acacgcacgt ggcgcatcac 960
ctgttctcga ccatgccgca ttatcatgcg atggaagcta cgaaggcgat aaagccgata 1020
ctgggagagt attatcagtt cgatgggacg ccggtggtta aggcgatgtg gagggaggcg 1080
aaggagtgta tctatgtgga accggacagg caaggtgaga agaaaggtgt gttctggtac 1140
aacaataagt tatga 1155
<210> 6
<211> 384
<212> PRT
<213>
<220>
<221> BnFAD2-1H基因编码氨基酸序列
<222> (1)..(384)
<223>
<400> 6
Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
20 25 30
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
50 55 60
Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
65 70 75 80
Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
85 90 95
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Lys Cys Gly His His Ala Phe
100 105 110
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
115 120 125
Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
130 135 140
His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys
145 150 155 160
Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu
165 170 175
Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu
180 185 190
Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala
195 200 205
Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu
210 215 220
Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu
225 230 235 240
Tyr Arg Tyr Ala Ala Val Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr
245 250 255
Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr
260 265 270
Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp
275 280 285
Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile
290 295 300
Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His
305 310 315 320
Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala
325 330 335
Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val
340 345 350
Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu
370 375 380
<210> 7
<211> 1155
<212> DNA
<213>
<220>
<221> BnFAD2-2H基因核苷酸序列
<222> (1)..(1155)
<223>
<400> 7
atgggtgcag gtggaagaat gcaagtgtct cctccctcca agaagtctga aaccgacacc 60
atcaagcgcg taccctgcga gacaccgccc ttcactgtcg gagaactcaa gaaagcaatc 120
ccaccgcact gtttcaaacg ctcgatccct cgctctttct cctacctcat ctgggacatc 180
atcatagcct cctgcttcta ctacgtcgcc accacttact tccctctcct ccctcaccct 240
ctctcctact tcgcctggcc tctctactgg gcctgccaag ggtgcgtcct aaccggcgtc 300
tgggtcatag cccacgagtg cggccaccac gccttcagcg actaccagtg gcttgacgac 360
accgtcggtc tcatcttcca ctccttcctc ctcgtccctt acttctcctg gaagtacagt 420
catcgacgcc accattccaa cactggctcc ctcgagagag acgaagtgtt tgtccccaag 480
aagaagtcag acatcaagtg gtacggcaag tacctcaaca accctttggg acgcaccgtg 540
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agaccttacg acggcggctt cgcttgccat ttccacccca acgctcccat ctacaacgac 660
cgcgagcgtc tccagatata catctccgac gctggcatcc tcgccgtctg ctacggtctc 720
ttccgttacg ccgccgcgca gggagtggcc tcgatggtct gcttctacgg agtcccgctt 780
ctgattgtca atggtttcct cgtgttgatc acttacttgc agcacacgca tccttccctg 840
cctcactacg attcgtccga gtgggattgg ttgaggggag ctttggctac cgttgacaga 900
gactacgaaa tcttgaacaa ggtcttccac aatattaccg acacgcacgt ggcgcatcat 960
ctgttctcca cgatgccgca ttatcacgcg atggaagcta ccaaggcgat aaagccgata 1020
ctgggagagt attatcagtt cgatgggacg ccggtggtta aggcgatgtg gagggaggcg 1080
aaggagtgta tctatgtgga accggacagg caaggtgaga agaaaggtgt gttctggtac 1140
aacaataagt tatga 1155
<210> 8
<211> 384
<212> PRT
<213>
<220>
<221> BnFAD2-2H基因编码氨基酸序列
<222> (1)..(384)
<223>
<400> 8
Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Thr Asp Thr Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
20 25 30
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
50 55 60
Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
65 70 75 80
Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
85 90 95
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
100 105 110
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
115 120 125
Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
130 135 140
His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys
145 150 155 160
Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu
165 170 175
Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu
180 185 190
Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala
195 200 205
Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu
210 215 220
Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu
225 230 235 240
Phe Arg Tyr Ala Ala Ala Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr
245 250 255
Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr
260 265 270
Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp
275 280 285
Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Glu Ile
290 295 300
Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His
305 310 315 320
Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala
325 330 335
Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val
340 345 350
Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu
370 375 380
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213>
<220>
<221> BnFAD2引物1
<222> (1)..(22)
<223>
<400> 9
atgggtgcag gtggaagaat gc 22
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213>
<220>
<221> BnFAD2引物2
<222> (1)..(27)
<223>
<400> 10
tcataactta ttgttgtacc agaacac 27
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213>
<220>
<221> BnFAD2引物3
<222> (1)..(20)
<223>
<400> 11
cgtctgggtc atagccaacg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213>
<220>
<221> BnFAD2引物4
<222> (1)..(20)
<223>
<400> 12
cgtctgggtc atagccaaca 20
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213>
<220>
<221> BnFAD2引物5
<222> (1)..(23)
<223>
<400> 13
gacgctcacg gtcgttgtag atg 23
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213>
<220>
<221> BnFAD2引物6
<222> (1)..(21)
<223>
<400> 14
caccgttgac agagacttcg g 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213>
<220>
<221> BnFAD2引物7
<222> (1)..(21)
<223>
<400> 15
caccgttgac agagacttcg a 21
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213>
<220>
<221> BnFAD2引物8
<222> (1)..(23)
<223>
<400> 16
acacaccttt cttctcacct tgc 23

Claims (6)

1.指示油菜种子高油酸含量的核苷酸突变位点，其特征在于，该位点是位于编码甘蓝型油菜油酸去饱和酶FAD2的核苷酸序列，即BnFAD2基因序列，通过以下至少一个核苷酸非保守突变产生的突变核苷酸序列：(1)位于BnFAD2同源基因BnFAD2-1核苷酸序列316处G至A的置换，即：G316A,突变基因命名为BnFAD2-1H；(2)位于BnFAD2同源基因BnFAD2-2核苷酸序列908处G至A的置换，即：G908A,突变基因命名为BnFAD2-2H。
2.根据权利要求1所述的指示油菜种子高油酸含量的核苷酸突变位点，其特征在于，所述BnFAD2-1基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1，编码氨基酸序列为SEQ ID NO.2；所述BnFAD2-2基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3，编码氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
3.根据权利要求1或2所述的指示油菜种子高油酸含量的核苷酸突变位点，其特征在于，BnFAD2-1H基因序列为SEQ ID NO.5，由1155个碱基组成，编码甘蓝型油菜油酸去饱和酶Ⅰ,与其它来源的油菜油酸去饱和酶Ⅰ的核酸序列相比，BnFAD2-1H基因包含一处有义的碱基突变：G316A，即在序列316处存在G316A的置换；BnFAD2-1H核苷酸编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.6，由384个氨基酸残基组成，在蛋白序列106位置处的氨基酸残基为赖氨酸(K)；
BnFAD2-2H基因序列为SEQ ID NO.7，由1155个碱基组成，编码甘蓝型油菜油酸去饱和酶Ⅱ,与其它来源的油菜油酸去饱和酶Ⅱ的核酸序列相比，BnFAD2-2H基因包含一处有义的碱基突变：G908A，即在序列908处存在G908A的置换；BnFAD2-2H核苷酸编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.8，由384个氨基酸残基组成，在蛋白序列303位置处的氨基酸残基为谷氨酸(E)。
4.根据权利要求1或2所述的指示油菜种子高油酸含量的核苷酸突变位点，其特征在于，所述突变核苷酸序列还包括突变基因BnFAD2-1H或BnFAD2-2H通过至少一个核苷酸的置换、插入或缺失而衍生的核苷酸序列，并且与所述突变基因BnFAD2-1H或BnFAD2-2H至少90％同源性的同源核酸序列或者互补序列。
5.权利要求1-4之一所述指示油菜种子高油酸含量的核苷酸突变位点的特异引物,包括:
BnFAD2引物3：5'-CGTCTGGGTCATAGCCAACG-3'；
BnFAD2引物4：5'-CGTCTGGGTCATAGCCAACA-3'；
BnFAD2引物5：5'-GACGCTCACGGTCGTTGTAGATG-3'；
BnFAD2引物6：5'-CACCGTTGACAGAGACTTCGG-3'；
BnFAD2引物7：5'-CACCGTTGACAGAGACTTCGA-3'；
BnFAD2引物8：5'-ACACACCTTTCTTCTCACCTTGC-3'；
其中，BnFAD2引物3和BnFAD2引物5组配引物对，能对普通油菜(即野生型)BnFAD2-1的316位点碱基G进行特异扩增，扩增片段373bp；
BnFAD2引物4和BnFAD2引物5组配引物对，能特异的针对BnFAD2-1H基因的316位点的突变碱基A进行特异扩增，扩增片段373bp；
BnFAD2引物6和BnFAD2引物8组配引物对，能对野生型BnFAD2-2的908位点碱基G进行特异扩增，扩增片段244bp；
BnFAD2引物7和BnFAD2引物8组配引物对，能特异的针对BnFAD2-2H的908位点的突变碱基A进行特异扩增，扩增片段244bp。
6.权利要求5所述指示油菜种子高油酸含量的核苷酸突变位点的特异引物在含有BnFAD2同源基因BnFAD2-1核苷酸序列G316A或BnFAD2同源基因BnFAD2-2核苷酸序列G908A突变位点的高油酸油菜品种(系)选育中的应用。
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