CN101490259B - 植物中高油酸含量的遗传标记物 - Google Patents
植物中高油酸含量的遗传标记物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及来自十字花科(Cruciferae)植物的编码δ-12油酸去饱和酶(FAD2)的核酸的突变核酸序列，其中所述突变核酸序列包含表示选自下述的氨基酸的至少一个密码子的至少一个核苷酸的非保守突变：在所述FAD2的氨基酸序列的位置259处的氨基酸，在所述FAD2的氨基酸序列的位置216处的氨基酸，在所述FAD2的氨基酸序列的位置90处的氨基酸，在所述FAD2的氨基酸序列的位置116处的氨基酸，在所述FAD2的氨基酸序列的位置276处的氨基酸。
Description
本发明涉及可用于选择具有高油酸含量的植物的新型遗传和蛋白质标记物。
由于健康利益以及油酸对于氧化和热的稳定性，植物油的高油酸含量是所希望的性状。特别地，已显示，油酸在降低血浆胆固醇水平方面是有效的(Bonanome等人，1988；Liu等人，2002)。此外，它的单不饱和键使得油酸(C18:1)成为相比其多不饱和的对应物而言易损性小得多的脂肪酸。例如，亚麻酸(C18:3)的氧化速率是油酸的100倍(Debruyne，2004)。
最有希望的通向此类植物的途径之一是选择基本上丧失了FAD2活性的植物。事实上，FAD2(δ12油酸去饱和酶)催化油酸(C18:1)转化成亚油酸(C18:2)；由于油酸的有限的分解代谢，因此具有降低的FAD2活性的植物具有更高的油酸含量。
如此，WO 2004/072259提供了具有高油酸含量的欧洲油菜(Brassica napus)植物，其中它的fad2基因在FAD2的位置185处具有终止密码子而不是谷氨酰胺(Q)密码子。
此外，US 2005/0039233提供了具有高油酸含量的芥菜(Brassicajuncea)植物，其中它的fad2基因在FAD2的位置101处具有终止密码子而不是色氨酸(W)密码子。
欧洲油菜(油籽油菜(rapeseed))是包含两个二倍体祖先的基因组——芜菁(Brassica rapa)(A基因组)和甘蓝(Brassicaoleracea)(C基因组)的双二倍体(Pires等人，2004)。关于油籽油菜的传统油，油酸含量为61％(Stan Skrypetz，2005)。
本发明特别起因于本发明人在欧洲油菜植物的fad2基因中发现了5个先前未识别的突变：
-在fad2A基因(来自芜菁基因组的fad2基因)的位置269处G至A的置换，相应于在FAD2A蛋白的位置90处W至终止密码子的置换，
-在fad2A基因(来自芜菁基因组的fad2基因)的位置346处C至T的置换，相应于在FAD2A蛋白的位置116处Q至终止密码子的置换，
-在fad2C基因(来自甘蓝基因组的fad2基因)的位置646处C至T的置换，相应于在FAD2C蛋白的位置216处P至S的置换，
-在fad2A基因(来自芜菁基因组的fad2基因)的位置775处C至T的置换，相应于在FAD2A蛋白的位置259处P至S的置换，
-在fad2A基因(来自芜菁基因组的fad2基因)的位置827处C至T的置换，相应于在FAD2A蛋白的位置276处T至M的置换，
这些突变与拥有它们的植物的高油酸含量相关。特别地，这些经突变的油籽油菜的油酸含量根据环境载培条件而从66％至82％变化。
因此，本发明涉及来自植物(特别是十字花科(Cruciferae)植物)的编码δ-12油酸去饱和酶(FAD2)的核酸的突变核酸序列，其中所述突变核酸序列包含代表选自下述的氨基酸的至少一个密码子的至少一个核苷酸的非保守突变：
-在所述FAD2的氨基酸序列的位置90处的氨基酸，
-在所述FAD2的氨基酸序列的位置116处的氨基酸，
-当所述FAD2序列由384个氨基酸组成时，在所述FAD2的氨基酸序列的位置216处的氨基酸，或当所述FAD2序列由383个氨基酸组成时，在位置215处的氨基酸，
-当所述FAD2序列由384个氨基酸组成时，在所述FAD2的氨基酸序列的位置259处的氨基酸，或当所述FAD2序列由383个氨基酸组成时，在位置258处的氨基酸，
-当所述FAD2序列由384个氨基酸组成时，在所述FAD2的氨基酸序列的位置276处的氨基酸，或当所述FAD2序列由383个氨基酸组成时，在位置275处的氨基酸，
或者通过至少一个核苷酸的置换、插入或缺失而衍生自所述突变核酸序列，并且与所述突变核酸序列具有至少90％同源性的同源核酸序列，条件是所述同源核酸序列具有所述突变并且不编码功能性FAD2，
或者在严格条件下与所述突变核酸序列杂交的杂交核酸序列，条件是所述杂交核酸序列的互补序列具有所述突变并且不编码功能性FAD2，
或者所述突变核酸序列、同源核酸序列或杂交核酸序列的互补序列。
给定核酸序列相对于突变核酸序列而言的同源性百分比通过下述方式进行计算：计数对于所述给定核酸序列和所述突变核酸序列的最佳序列比对的所有位置而言在所述给定核酸序列和所述突变核酸序列之间相同核苷酸的数目，并且将这个数目除以所述给定序列的核苷酸的总数目。
可以手工地，任选地通过在核苷酸之间引入缺口，或者通过使用基于计算机的比对工具例如BLAST(Altschul等人(1997)NucleicAcids Res 25：3389-402)，来进行最佳序列比对。
关于给定核酸序列而言的“严格条件”可以由本领域技术人员容易地确定，例如如Sambrook等人(2001)中描述的。具体的严格条件特别包括：15mM NaCl/1.5mM柠檬酸钠(0.1 X SSC)和0.1％月桂基硫酸钠(SDS)，于50-65℃。
如本文所希望的，来自十字花科的FAD2通常由383或384个氨基酸组成。然而，下列方面在本领域技术人员的普通技能之内：使对于上文定义的突变所给出的位置适应于具有多于或少于383或384个氨基酸的FAD2。
图14中给出了来自各种十字花科物种的FAD2序列的示例性比对。
如本文所希望的，“不编码功能性FAD2”的核酸序列指这样的核酸序列，其编码具有比在相同条件下测量的相应天然FAD2的活性更低的活性的FAD2，特别地所编码的FAD2没有活性。
有利地，与在其他方面在遗传上相同的植物(即除所述突变外在遗传上相同的植物)和与相应的野生型植物相比较，携带具有上述突变的核酸的突变型植物具有增加的油酸含量。优选地，携带具有上述突变的核酸的突变型植物具有至少65％，更优选地至少70％的油酸含量。
在一个实施方案中，本发明特别涉及如上定义的突变核酸序列，其中所述突变核酸序列包含至少一个选自下述的突变：
-代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置90处的氨基酸的密码子被终止密码子置换，
-代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置116处的氨基酸的密码子被终止密码子置换，
-当所述FAD2序列由384个氨基酸组成时，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置216处的氨基酸的密码子，或当所述FAD2序列由383个氨基酸组成时，代表在位置215处的氨基酸的密码子，被代表不同于P的任意氨基酸的密码子置换，
-当所述FAD2序列由384个氨基酸组成时，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置259处的氨基酸的密码子，或当所述FAD2序列由383个氨基酸组成时，代表在位置258处的氨基酸的密码子，被代表不同于P的任意氨基酸的密码子置换，
-当所述FAD2序列由384个氨基酸组成时，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置276处的氨基酸的密码子，或当所述FAD2序列由383个氨基酸组成时，代表在位置275处的氨基酸的密码子，被代表不同于T的任意氨基酸的密码子置换。
在另一个实施方案中，更具体而言，本发明涉及如上定义的突变核酸序列，其中：
-当所述FAD2序列由384个氨基酸组成时，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置216处的氨基酸的密码子，或当所述FAD2序列由383个氨基酸组成时，代表在位置215处的氨基酸的密码子，被代表S的密码子置换，
-当所述FAD2序列由384个氨基酸组成时，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置259处的氨基酸的密码子，或当所述FAD2序列由383个氨基酸组成时，代表在位置258处的氨基酸的密码子，被代表S的密码子置换，
-当所述FAD2序列由384个氨基酸组成时，代表在所述FAD2的氨基酸序列的位置276处的氨基酸的密码子，或当所述FAD2序列由383个氨基酸组成时，代表在位置275处的氨基酸的密码子，被代表M的密码子置换。
在上文定义的突变核酸序列的一个优选实施方案中，所述植物是芸苔属(Brassica)的植物。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述突变核酸序列由SEQ IDNO：22表示，并且包含至少一个选自下述的突变：
-在SEQ ID NO：22的位置269处G至A的置换，
-在SEQ ID NO：22的位置346处C至T的置换，
-在SEQ ID NO：22的位置646处C至T的置换，
-在SEQ ID NO：22的位置775处C至T的置换，
-在SEQ ID NO：22的位置827处C至T的置换。
在本发明的另外一个实施方案中，所述突变核酸序列选自下述：
SEQ ID NO：24；
SEQ ID NO：26；
SEQ ID NO：28；
SEQ ID NO：30；
SEQ ID NO：32。
SEQ ID NO：24表示在位置269处具有G至A的置换的欧洲油菜fad2A基因(即来自芜菁基因组的fad2基因)，这相应于在FAD2A蛋白的位置90处W至终止密码子的置换。这种突变特别发现于在下列实施例中称为‘HOR4’的过量产生油酸的油籽油菜品系中。‘HOR4’已于2006年5月17日以登记号41403保藏在NCIMB(Aberdeen，Scotland)。
SEQ ID NO：26表示在位置346处具有C至T的置换的欧洲油菜fad2A基因，这相应于在FAD2A蛋白的位置116处Q至终止密码子的置换。这种突变特别发现于在下列实施例中称为‘HOR3’的过量产生油酸的油籽油菜品系中。‘HOR3’已于2006年5月17日以登记号41402保藏在NCIMB(Aberdeen，Scotland)。
SEQ ID NO：28表示在位置646处具有C至T的置换的欧洲油菜fad2C基因(即来自甘蓝基因组的fad2基因)，这相应于在FAD2C蛋白质的位置216处P至S的置换。这种突变特别发现于在下述实施例中称为‘HOR1’的过量产生油酸的油籽油菜品系中。‘HOR1’已于2006年5月17日以登记号41400保藏在NCIMB(Aberdeen，Scotland)。
SEQ ID NO：30表示在位置775处具有C至T的置换的欧洲油菜fad2A基因，这相应于在FAD2A蛋白的位置259处P至S的置换。这种突变特别发现于在下述实施例中称为‘HOR1’的过量产生油酸的油籽油菜品系中。
SEQ ID NO：32表示在位置827处具有C至T的置换的欧洲油菜fad2A基因，这相应于在FAD2A蛋白的位置276处T至M的置换。这种突变特别发现于在下述实施例中称为‘HOR2’的过量产生油酸的油籽油菜品系中。‘HOR2’已于2006年5月17日以登记号41401保藏在NCIMB(Aberdeen，Scotland)。
本发明还涉及如上定义的突变核酸的核酸片段，所述片段包含至少10个、优选至少100个、更优选至少1000个核苷酸，并且包含与代表选自下述的氨基酸的至少一个密码子邻接的至少一个核苷酸：
-在所述FAD2的氨基酸序列的位置90处的氨基酸，
-在所述FAD2的氨基酸序列的位置116处的氨基酸，
-当所述FAD2序列由384个氨基酸组成时，在所述FAD2的氨基酸序列的位置216处的氨基酸，或当所述FAD2序列由383个氨基酸组成时，在位置215处的氨基酸，
-当所述FAD2序列由384个氨基酸组成时，在所述FAD2的氨基酸序列的位置259处的氨基酸，或当所述FAD2序列由383个氨基酸组成时，在位置258处的氨基酸，
-当所述FAD2序列由384个氨基酸组成时，在所述FAD2的氨基酸序列的位置276处的氨基酸，或当所述FAD2序列由383个氨基酸组成时，在位置275处的氨基酸，
或者所述核酸片段的互补序列。
在本发明的一个优选实施方案中，上文定义的核酸片段包含突变核苷酸。
在本发明的另一个优选实施方案中，上文定义的核酸片段选自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6和SEQ ID NO：7。
本发明还涉及具有增加的油酸含量的植物，优选十字花科植物，更优选芸苔属的植物，和更加优选欧洲油菜物种的植物，或者所述植物的部分，其中所述植物包含至少一种上文定义的突变核酸序列或者含有所述突变核苷酸的上文定义的核酸片段。
如本文所希望的，植物的部分特别涉及植物细胞、种子、分生组织、愈伤组织、花序、芽或叶。
在上文定义的植物或植物的部分的一个具体实施方案中，在所述植物的基因组中所包含的fad2基因的至少一个拷贝由如上文定义的突变核酸来表示。
在上文定义的植物或植物的部分的另一个具体实施方案中，在所述植物的基因组中所包含的fad2基因的每一个拷贝由如上文定义的突变核酸来表示。
本发明的另一个实施方案涉及上文定义的植物或植物的部分，其中：
-一个拷贝的fad2A基因由SEQ ID NO：30表示，和一个拷贝的fad2C基因由SEQ ID NO：28表示，或
-一个拷贝的fad2A基因由SEQ ID NO：32表示，或
-一个拷贝的fad2A基因由SEQ ID NO：26表示，或
-一个拷贝的fad2A基因由SEQ ID NO：24表示。
在本发明的一个进一步的实施方案中，上文定义的植物或植物的部分是欧洲油菜物种的植物，其中fad2A基因的2个拷贝独立地由SEQID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32表示，和/或fad2C基因的2个拷贝由SEQ ID NO：28表示。
在另外一个具体实施方案中，上文定义的植物或植物的部分选自下述：
-于2006年5月17日以登记号41403保藏在NC IMB(Aberdeen，Scotland)的植物；
-于2006年5月17日以登记号41402保藏在NC IMB(Aberdeen，Scotland)的植物；
-于2006年5月17日以登记号41400保藏在NCIMB(Aberdeen，Scotland)的植物；
-于2006年5月17日以登记号41401保藏在NCIMB(Aberdeen，Scotland)的植物。
本发明还涉及上文定义的核酸的用途，所述用途为用于选择具有增加的油酸含量的植物或植物的部分。
本发明还涉及用于通过诱变来选择具有增加的油酸含量的植物的方法，其包括下述步骤：
-对植物或植物的部分实施诱变处理，
-从所述经处理的植物或植物的部分再生出植物或植物的部分，
-从所述再生的植物中选择出包含至少一种上文定义的突变核酸序列，或包含含有所述突变核苷酸的上文定义的核酸片段的那些。
可以根据本领域技术人员众所周知的方法，例如在McCallum等人(2000)中描述的那些方法，来进行诱变。特别地，使用甲磺酸乙酯(EMS)来进行诱变。
可以根据本领域技术人员众所周知的方法，例如在Herman(2005)中描述的那些方法，来进行从植物部分例如细胞中再生出植物。
本发明还涉及用于通过杂交来选择具有增加的油酸含量的植物的方法，其包括下述步骤：
-使植物或植物的部分与亲本植物或亲本植物的部分进行杂交，所述亲本植物或亲本植物的部分包含至少一种上文定义的突变核酸序列或包含含有所述突变核苷酸的上文定义的核酸片段，
-从通过杂交获得的子代植物或植物的部分中选择出包含至少一种上文定义的突变核酸序列的那些，或包含含有所述突变核苷酸的上文定义的核酸片段的那些。
可以根据本领域技术人员众所周知的方法，例如在Gallais(1997)中描述的那些方法，来进行杂交。
如本文所希望的，“子代”特别指杂交植物的幼苗。
在上文定义的用于通过杂交来选择具有增加的油酸含量的植物的方法的一个优选实施方案中，根据上文定义的用于通过诱变来选择具有增加的油酸含量的植物的方法来获得亲本植物。
在上文定义的用于通过杂交来选择具有增加的油酸含量的植物的方法的一个特别优选实施方案中，亲本植物或亲本植物的部分选自下述：
-于2006年5月17日以登记号41403保藏在NCIMB(Aberdeen，Scotland)的植物；
-于2006年5月17日以登记号41402保藏在NC IMB(Aberdeen，Scotland)的植物；
-于2006年5月17日以登记号41400保藏在NCIMB(Aberdeen，Scotland)的植物；
-于2006年5月17日以登记号41401保藏在NCIMB(Aberdeen，Scotland)的植物。
特别地，下列技术可以用于上文定义的选择方法的选择步骤中：PCR技术，例如TaqMan
测定法(实时PCR)或等位基因特异性PCR，Northern或Southern印迹法，DNA微阵列或大阵列(macro-array)，分子信标(Molecular Beacons)，DASH(动力等位基因特异性杂交(Dynamic Allele Specific Hybridization))，引物延伸，寡核苷酸连接和核酸内切酶切割。
在上文定义的用于选择植物的方法的一个实施方案中，选择步骤通过聚合酶链反应(PCR)来进行，优选使用下述引物对中的至少一种：
-SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13，
-SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15，
-SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，
-SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：36，
-SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36，
-SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：13，
-SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：14，
-SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：36。
本发明还涉及可根据上文定义的用于选择植物的方法获得的植物。
本发明还涉及用于选择具有高油酸含量的植物的试剂盒，其包含：
-至少一种植物或植物的部分，其包含至少一种上文定义的突变核酸序列，或包含含有所述突变核苷酸的上文定义的核酸片段，
-至少一种上文定义的核酸片段。
在本发明的一个优选实施方案中，上文定义的试剂盒包含：
●选自下述的至少一种植物或植物的部分：
-于2006年5月17日以登记号41403保藏在NCIMB(Aberdeen，Scotland)的植物；
-于2006年5月17日以登记号41402保藏在NCIMB(Aberdeen，Scotland)的植物；
-于2006年5月17日以登记号41400保藏在NCIMB(Aberdeen，Scotland)的植物；
-于2006年5月17日以登记号41401保藏在NCIMB(Aberdeen，Scotland)的植物；
●下述引物对中的至少一种：
-SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13，
-SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15，
-SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，
-SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：36，
-SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36，
-SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：13，
-SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：14，
-SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：36。
本发明还涉及由上文定义的突变核酸序列编码的突变的来自植物的FAD2。
本发明还涉及选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39的核酸。
本发明还涉及特异性抗体，其针对上文定义的突变的来自植物的δ-12油酸去饱和酶(FAD2)。
如本文所希望的，“抗体”还包含抗体片段，例如Fab、F(ab)’2或scFv片段。通过下列标准操作程序，由根据本发明的突变的δ-12油酸去饱和酶，本领域技术人员可以容易地制备此类抗体。在本发明的一个优选实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。根据本发明的抗体尤其可用于检测根据本发明的突变的δ-12油酸去饱和酶，特别是在植物细胞提取物中。
附图简述
图1显示了从‘LLR1’品系(‘LLR1#S007’和‘LLR1#PR-2601’品系)以及‘HOR1’品系(‘HOR1#S005’、‘HOR1#B005’和‘HOR1#NPZ-12’品系)中克隆的fad2A基因(来自芜菁基因组的fad2基因)的部分基因组核苷酸序列。上面是‘LLR1’序列(SEQ ID NO：1)，和下面是‘HOR1’序列(SEQ ID NO：3)。箭头指出C至T的单核苷酸突变，这导致氨基酸修饰。用于基于PCR的突变型等位基因特异性标记物的正向和反向引物为粗体并加有下划线。
图2显示了从‘LLR1’品系(‘LLR1#S007’和‘LLR1#PR-2601’品系)以及‘HOR1’品系(‘HOR1#S005’、‘HOR1#B005’和‘HOR1#NPZ-12’品系)中克隆的fad2C基因(来自甘蓝基因组的fad2基因)的部分基因组核苷酸序列。上面是‘LLR1’序列(SEQ ID NO：2)，和下面是‘HOR1’序列(SEQ ID NO：4)。箭头指出C至T的单核苷酸突变，这导致氨基酸修饰。用于基于PCR的突变型等位基因特异性标记物的正向和反向引物为粗体并加有下划线。
图3显示了从‘LLR1’品系(‘LLR1#S007’和‘LLR1#PR-2601’品系)以及‘HOR2’品系中克隆的fad2A基因(来自芜菁基因组的fad2基因)的部分基因组核苷酸序列。上面是‘LLR1’序列(SEQ ID NO：1)，和下面是‘HOR2’序列(SEQ ID NO：5)。箭头指出C至T的单核苷酸突变，这导致氨基酸修饰。用于基于PCR的突变型等位基因特异性标记物的正向和反向引物为粗体并加有下划线。
图4显示了从‘LLR1’品系(‘LLR1#S007’和‘LLR1#PR-2601’品系)以及‘HOR3’品系中克隆的fad2A基因(来自芜菁基因组的fad2基因)的部分基因组核苷酸序列。上面是‘LLR1’序列(SEQ ID NO：1)，和下面是‘HOR3’序列(SEQ ID NO：6)。箭头指出C至T的单核苷酸突变，这导致带有灰色阴影的终止密码子(TAG)。用于基于PCR的突变型等位基因特异性标记物的正向和反向引物为粗体并加有下划线。
图5显示了从‘LLR1’品系(‘LLR1#S007’和‘LLR1#PR-2601’品系)以及‘HOR4’品系中克隆的fad2A基因(来自芜菁基因组的fad2基因)的部分基因组核苷酸序列。上面是‘LLR1’序列(SEQ ID NO：1)，和下面是‘HOR4’序列(SEQ ID NO：7)。箭头指出G至A的单核苷酸突变，这导致带有灰色阴影的终止密码子(TAG)。用于基于PCR的突变型等位基因特异性标记物的正向和反向引物为粗体并加有下划线。
图6提供了从克隆自‘LLR1’品系、‘HOR1’的基因组核苷酸序列简并得到的fad2A基因，公开的芜菁fad2基因，和公开的欧洲油菜fad2基因的氨基酸序列。箭头指出在‘HOR1’品系中由于单核苷酸突变(C至T)而引起的氨基酸置换(P至S)的位置。
图7提供了从克隆自‘LLR1’品系、‘HOR1’品系的基因组核苷酸序列简并得到的fad2C基因，公开的甘蓝fad2基因，和公开的欧洲油菜fad2基因的氨基酸序列。箭头指出在‘HOR1’品系中由于单核苷酸突变(C至T)而引起的氨基酸置换(P至S)的位置。
图8提供了从克隆自‘LLR1’品系、‘HOR2’品系的基因组核苷酸序列简并得到的fad2A基因，公开的芜菁fad2基因，和公开的欧洲油菜fad2基因的氨基酸序列。箭头指出在‘HOR2’品系中由于单核苷酸突变(C至T)而引起的氨基酸置换(T至M)的位置。
图9提供了从克隆自‘LLR1’品系、‘HOR3’品系的基因组核苷酸序列简并得到的fad2A基因，公开的芜菁fad2基因，和公开的欧洲油菜fad2基因的氨基酸序列。箭头指出在‘HOR3’品系中由于单核苷酸突变(C至T)而引起的终止密码子的位置。
图10提供了从克隆自‘LLR1’品系、‘HOR4’品系的基因组核苷酸序列简并得到的fad2A基因，公开的芜菁fad2基因，和公开的欧洲油菜fad2基因的氨基酸序列。箭头指出在‘HOR4’品系中由于单核苷酸突变(G至A)而引起的终止密码子的位置。
图11提供了从关于fad2A基因的突变型等位基因特异性标记物(194bp)和从6个DH群体之一的fad3基因(内部PCR对照，57bp)扩增出的PCR产物的电泳结果。M：25bp DNA梯；泳道1：‘LLR1#S007’；泳道2：‘HOR1#S005’；泳道3-23：来自‘LLR1#S007’和‘HOR1#S005’杂交的DH品系；泳道24：水对照。通过在2.5％琼脂糖凝胶中电泳来分离PCR产物，并用溴化乙锭染色。
图12提供了从关于fad2C基因的突变型等位基因特异性标记物(123bp)和从6个DH群体之一的fad3基因(内部PCR对照，57bp)扩增出的PCR产物的电泳结果。M：25bp DNA梯；泳道1：‘LLR1#S007’；泳道2：‘HOR1#S005’；泳道3-23：来自‘LLR1#S007’和‘HOR1#S005’杂交的DH品系；泳道24：水对照。通过在2.5％琼脂糖凝胶中电泳来分离PCR产物，并用溴化乙锭染色。
图13提供了直方图，其显示了在田间和温室试验中所述突变型等位基因特异性标记物和油酸含量的相关性。
图14提供了来自不同芸苔属物种和来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的FAD2的序列比对。下面列出了物种、登记号和俗名：
| 属和种 | 序列登记号 | 俗名 | |
| 1 | 芜菁 | CAG26981 | 变萝卜 |
| 2 | 芜菁 | CAD30827 | 变萝卜 |
| 3 | 欧洲油菜 | AAS92240 | 油籽油菜 |
| 4 | 芜菁 | AAC99622 | 变萝卜 |
| 5 | 欧洲油菜 | AAT02411 | 油籽油菜 |
| 6 | 欧洲油菜 | AAF78778 | 油籽油菜 |
| 7 | 甘蓝 | AAF14564 | 卷心菜 |
| 8 | 隆线芸苔(Brassica carinata) | AAD19742 | 埃塞俄比亚芥 |
| 9 | 拟南芥 | NP_187819 | 鼠耳芥 |
实施例
材料和方法
1.植物材料
冬季油籽油菜品系‘LLR1#S007’(野生型)、‘LLR1#PR-2601’(野生型)、‘HOR1#S005’(突变型)、‘HOR1#B005’(突变型)、‘HOR1#NPZ-12’(突变型)、‘HOR2’(突变型)、‘HOR3’(突变型)和‘HOR4’(突变型)在本研究中用于克隆fad2(脂肪酸去饱和酶-2)等位基因。
已通过使甲磺酸乙酯(EMS)突变体品系‘HOR1’与三种传统油籽油菜品系(S005、B005和NPZ-12)杂交而获得了‘HOR1#S005’、‘HOR1#B005’和‘HOR1#NPZ-12’；这三种突变体品系具有约80-90％的油酸含量。
‘LLR1#S007’和‘LLR1#PR-2601’是具有约60％的油酸含量的油籽油菜品系。
‘HOR2’、‘HOR3’和‘HOR4’是具有约75-85％的油酸含量的三种更独立的EMS突变体品系。
通过小孢子培养从下述品系之间杂交的F1植物形成了6个双单倍体(DH)群体(Coventry等人，1988)：
(1)‘LLR1#S007’和‘HOR1#S005’油籽油菜品系，
(2)‘LLR1#PR-2601’和‘HOR1#NPZ-12’油籽油菜品系，
(3)‘LLR1#S007’和‘HOR1#B005’油籽油菜品系，
(4)‘LLR1#S007’和‘HOR1#NPZ-12’油籽油菜品系，
(5)‘LLR1#PR-2601’和‘HOR1#B005’油籽油菜品系，以及
(6)‘LLR1#PR-2601’和‘HOR1#S005’油籽油菜品系。
每个DH群体分别由64、32、115、72、63和53个品系组成。通过使用气相色谱来进行DH品系及其各自亲本的种子的完全脂肪酸分析。所有399个DH品系用于标记物和统计学分析。没有使用‘HOR2’、‘HOR3’和‘HOR4’突变体品系来产生DH群体。
2.基因组DNA的提取和定量
使用来自Dellaporta等人(1983)的经修改的基于CTAB的方法，从2周大的田间生长的植物的叶中提取亲本品系和399个DH品系的DNA。在260nm处的吸光度用于DNA定量。在UV-微量滴定板中，将195μl超纯无菌水加入至每个孔内，并随后添加5μl每种DNA样品。然后，使平板短暂摇动，并使用来自Molecular Devices的Spectra MaxM2微量培养板分光光度计进行阅读。
3.PCR扩增
用于fad2等位基因克隆的PCR扩增反应体系包含3-4ng/μl基因组DNA、1.25μM每种引物、2.5mM MgCl2、0.3mM每种dNTP、1 X PCR缓冲液和0.12U/μl Taq DNA聚合酶。在PTC-225 MJResearch PCR系统中进行扩增，所述PCR系统中所编制的程序为94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒的30个循环，和于72℃结束5分钟。
关于该399个DH的基因分型，已开发了内部PCR标记物以控制PCR效率。在fad3基因上已设计了一对引物(SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11)以扩增57bp的片段。用于对该399个DH品系进行基因分型的PCR扩增反应体系包含3-4ng/μl基因组DNA、0.625μM每种引物(SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11)、1.5mM MgCl2、0.3mM每种dNTP、1 X PCR缓冲液和0.06U/μl Taq DNA聚合酶。在PTC-225 MJResearch PCR系统中进行扩增，所述PCR系统中所编制的程序为94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 10秒的30个循环，和于72℃结束5分钟。
4.fad2等位基因的克隆
通过使用在来自Genbank登记号AY577313的fad2基因序列上用Primer 3软件设计出的引物来扩增亲本品系‘LLR1#S007’、‘LLR1#PR-2601’、‘HOR1#S005’、‘HOR1#B005’、‘HOR1#NPZ-12’、‘HOR2’、‘HOR3’和‘HOR4’的fad2片段。根据制造商的说明书，使用-T Easy Vector System试剂盒(Promega Corp.，Madison，USA)将通过引物FAD2BnF1和FAD2BnR1从每个所述亲本中扩增出的fad2片段连接至
-T Easy克隆载体。将连接产物转化到感受态细胞中，并将细胞铺板在包含氨苄青霉素、X-GAL和IPTG的LB-琼脂平板上，以使得能够进行白色/蓝色选择。挑取转化平板中的白色菌落，并通过使用通用M13正向和反向引物(位于所述插入片段的侧翼)的PCR来验证经克隆的PCR产物的鉴定。PCR揭示出了具有预期大小的插入片段。包含该插入片段的阳性克隆通过Genome Express(Meylan，France)进行测序。
5.fad2基因中的突变的鉴定
参考图1-5，将在来自Genbank登记号AY577313的fad2基因序列上用Primer 3软件设计出的引物用于从欧洲油菜品系‘LLR1#S007’、‘LLR1#PR-2601’、‘HOR1#S005’、‘HOR1#B005’、‘HOR1#NPZ-12’、‘HOR2’、‘HOR3’和‘HOR4’中扩增出fad2基因的基因组DNA片段。引物对FAD2BnF1：AGTGTCTCCTCCCTCCAAAAA(SEQ ID NO：8)和FAD2BnR1：TCTTCTCACCTTGCCTGTCC(SEQ ID NO：9)从所述6个亲本中的每一个之中扩增出相同长度(1100bp)的fad2片段。然后，克隆该经扩增的片段，并进行测序以研究5个亲本之间的fad2基因的序列差异。
6.序列和数据分析
通过使用Clustal W(Kyoto University Bioinformatics Center)和Genedoc软件(Nicholas等人，1997)来对序列进行分析和比对。通过t-检验分析来测定所述标记物和高油酸性状之间的关联。
结果
在本研究中，对7个‘LLR1’克隆(‘LLR1#S007’和‘LLR1#PR-2601’)、12个‘HOR1’克隆(‘HOR1#S005’、‘HOR1#B005’和‘HOR1#NPZ-12’)、12个‘HOR2’、20个‘HOR3’和20个‘HOR4’克隆进行了测序。这些克隆与在公共数据库中找到的芜菁和甘蓝fad2序列的序列比对鉴定出：
(1)对于‘HOR1’品系，2种源于芜菁(fad2A)和甘蓝(fad2C)的fad2基因，
(2)对于‘HOR2’品系，1种源于芜菁(fad2A)的fad2基因，
(3)对于‘HOR3’品系，1种源于芜菁(fad2A)的fad2基因，和
(4)对于‘HOR4’品系，1种源于芜菁(fad2A)的fad2基因。
对于‘HOR1’品系，序列分析在每种fad2基因中鉴定出单核苷酸突变。
在扩增出的片段的位置752(即全长fad2A基因中的位置775)处的在fad2A基因中的单核苷酸突变(C至T)出现在所有‘HOR1’克隆(‘HOR1#S005’、‘HOR1#B005’和‘HOR1#NPZ-12’)的fad2A基因序列(SEQ ID NO：3)中，但没有出现在‘LLR1’克隆(‘LLR1#S007’和‘LLR1#PR-2601’)的fad2A基因序列(SEQ ID.NO：1)中(参见图1)。
在扩增出的片段的位置623(即全长fad2C基因中的位置646)处的在fad2C基因中的单核苷酸突变(C至T)出现在所有‘HOR1’克隆(‘HOR1#S005’、‘HOR1#B005’和‘HOR1#NPZ-12’)的fad2C基因序列(SEQ ID NO：4)中，但没有出现在‘LLR1’克隆(‘LLR1#S007’和‘LLR1#PR-2601’)的fad2C基因序列(SEQ ID.NO：2)中(参见图2)。
进一步的分析表明，这些单核苷酸突变出现在fad2A和fad2C基因的编码序列中(参见图6-7)。如图1-2和图6-7中进一步显示的，fad2A和fad2C基因中C至T的突变出现在密码子的第一个核苷酸处，导致分别在氨基酸259和216处脯氨酸(P)至丝氨酸(S)的置换。在使用TMHMM Server v.2.0进行蛋白质注释(跨膜结构域、细胞外和细胞内结构域的预测)后，FAD2A蛋白中脯氨酸(P)至丝氨酸(S)的置换被定位于细胞外结构域中，而FAD2C蛋白中脯氨酸(P)至丝氨酸(S)的置换存在于跨膜结构域中。脯氨酸是非极性氨基酸，其趋于位于蛋白质的中心内，而丝氨酸是极性且相对疏水的氨基酸，其趋于呈现在蛋白质的表面上。这些不同的性质可以引起FAD2A和FAD2C蛋白的结构修饰，从而导致无活性的δ12油酸去饱和酶。
对于‘HOR2’品系，序列分析在fad2A基因中鉴定出单核苷酸突变。在扩增出的片段的位置804(即全长fad2A基因中的位置827)处的在fad2A基因中的单核苷酸突变(C至T)出现在所有‘HOR2’克隆的fad2A基因序列(SEQ ID NO：5)中，但没有出现在‘LLR1’克隆(‘LLR1#S007’和‘LLR1#PR-2601’)的fad2A基因序列(SEQ ID.NO：1)中(参见图3)。进一步的分析表明，这个单核苷酸突变出现在fad2A基因的编码序列中(参见图8)。如图3和图8中进一步显示的，fad2A基因中C至T的突变出现在密码子的第二个核苷酸处，导致在氨基酸276处苏氨酸(T)至甲硫氨酸(M)的置换。在使用TMHMMServer v.2.0进行蛋白质注释(跨膜结构域、细胞外和细胞内结构域的预测)后，FAD2A蛋白中苏氨酸(T)至甲硫氨酸(M)的置换被定位于细胞外结构域中。甲硫氨酸(M)是非极性氨基酸，其趋于位于蛋白质的中心内，而苏氨酸(T)是极性且相对疏水的氨基酸，其趋于呈现在蛋白质的表面上。这些不同的性质可以引起FAD2A蛋白的结构修饰，从而导致无活性的δ12油酸去饱和酶。
对于‘HOR3’品系，序列分析在fad2A基因中鉴定出单核苷酸突变。在扩增出的片段的位置323(即全长fad2A基因中的位置346)处的在fad2A基因中的单核苷酸突变(C至T)出现在所有‘HOR3’克隆的fad2A基因序列(SEQ ID NO：6)中，但没有出现在‘LLR1’克隆(‘LLR1#S007’和‘LLR1#PR-2601’)的fad2A基因序列(SEQ ID.NO：1)中(参见图4)。进一步的分析表明，这个单核苷酸突变出现在fad2A基因的编码序列中(参见图9)。如图4和图9中进一步显示的，fad2A基因中C至T的突变出现在密码子的第一个核苷酸处，从而形成终止密码子(TAG)，其引起多肽链在翻译过程中的早期终止。该终止密码子导致仅115个氨基酸掺入多肽中，而不是全长多肽的所有384个氨基酸。
对于‘HOR4’品系，序列分析在fad2A基因中鉴定出单核苷酸突变。在扩增出的片段的位置246(即全长fad2A基因中的位置269)处的在fad2A基因中的单核苷酸突变(G至A)出现在所有‘HOR4’克隆的fad2A基因序列(SEQ ID NO：7)中，但没有出现在‘LLR1’克隆(‘LLR1#S007’和‘LLR1#PR-2601’)的fad2A基因序列(SEQ ID.NO：1)中(参见图5)。进一步的分析表明，这个单核苷酸突变出现在fad2A基因的编码序列中(参见图10)。如图5和图10中进一步显示的，fad2A基因中G至A的突变出现在密码子的第一个核苷酸处，从而形成终止密码子(TAG)，其引起多肽链在翻译过程中的早期终止。该终止密码子导致仅89个氨基酸掺入多肽中，而不是全长多肽的所有384个氨基酸。
开发了用于对所述6个双单倍体群体进行基因分型的分子测试。对于显性测试(dominant tests)，开发了内部PCR标记物以控制PCR效率。在fad3基因上已设计了一对引物(SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11)以扩增57bp的片段。用于检测C752T突变的正向和反向PCR引物(分别为SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15)被用于对DH品系进行基因分型，所述DH品系来自：‘LLR1#S007’和‘HOR1#S005’的杂交(参见图11)、‘LLR1#PR-2601’和‘HOR1#NPZ-12’的杂交(数据未显示)、‘LLR1#S007’和‘HOR1#B005’的杂交(数据未显示)、‘LLR1#S007’和‘HOR1#NPZ-12’的杂交(数据未显示)、‘LLR1#PR-2601’和‘HOR1#B005’的杂交(数据未显示)以及‘LLR1#PR-2601’和‘HOR1#S005’的杂交(数据未显示)。用于检测C623T突变的正向和反向PCR引物(分别为SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13)被用于对DH品系进行基因分型，所述DH品系来自：‘LLR1#S007’和‘HOR1#S005’的杂交(参见图12)、‘LLR1#PR-2601’和‘HOR1#NPZ-12’的杂交(数据未显示)、‘LLR1#S007’和‘HOR1#B005’的杂交(数据未显示)、‘LLR1#S007’和‘HOR1#NPZ-12’的杂交(数据未显示)、‘LLR1#PR-2601’和‘HOR1#B005’的杂交(数据未显示)以及‘LLR1#PR-2601’和‘HOR1#S005’的杂交(数据未显示)。用于检测C804T突变的正向和反向PCR引物(分别为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17)被用于测试‘HOR2’和野生型品系(数据未显示)。
此外，正向和反向PCR引物被用于测试‘HOR3’(SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：36)、‘HOR4’(SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36)和野生型品系。
在对所有399个DH品系进行基因分型后，发现等位基因分布与高C18:1高度相关(参见图13，表1)。
表1.在不同DH品系类别的田间和温室试验中突变型等位基因特异性标记物和油酸含量的相关性。
此外，设计了PCR引物以便提供共显性标记物，用于确定所述突变存在于fad2基因的仅1个等位基因(杂合子)还是2个等位基因(纯合子)上。
对于C646突变(在‘HOR1’中发现)，使用下述PCR引物：
-正向引物5’ATT TCC ACC CCA ACC GCT 3’(SEQ ID NO：37)
-反向引物5’AGG CCA CTC CCT GCG 3’(SEQ ID NO：13)。
利用经由正向引物在相应于fad2C野生型基因的扩增出的片段中引入BsrBI限制位点，通过BsrBI酶来切割PCR扩增产物，这产生下述相区别的限制图谱：
-野生型纯合子：16bp+108bp
-突变的纯合子：124bp
-杂合子：16bp+108bp+124bp。
对于C775T突变(在‘HOR1’中发现)，使用下述PCR引物：
-正向引物5’TCT ACC GCT ACG CTG CTG TC 3’(SEQ ID NO：38)
-反向引物5’GTG CGT GTC CGT GAT ATT GT 3’(SEQ ID NO：15)。
利用在具有C775T突变的突变型fad2A基因中Mn1I限制位点的消除，通过Mn1I酶来切割PCR扩增产物，这产生下述相区别的限制图谱：
-野生型纯合子：14bp+26bp+41bp+66bp+83bp
-突变的纯合子：14bp+41bp+83bp+92bp
-杂合子：14bp+26bp+41bp+66bp+83bp+92bp。
对于C346T和G269A突变(分别在‘HOR3’和‘HOR4’中发现)，使用下述PCR引物：
-正向引物5’AGT GTC TCC TCC CTC CAA AAA 3’(SEQ ID NO：39)
-反向引物5’ATC GAG GCA ACT CCT TGG A 3’(SEQ ID NO：36)。
通过BfaI酶来切割PCR扩增产物，这产生下述相区别的限制图谱：
●C346T
-野生型纯合子：732bp
-突变的纯合子：410bp+322bp
-杂合子：732bp+410bp+322bp
●G269A
-野生型纯合子：732bp
-突变的纯合子：244bp+488bp
-杂合子：732bp+244bp+488bp。
| SEQ ID NO： | 描述 |
| 1 | ‘LLR1’fad2A的部分核苷酸序列 |
| 2 | ‘LLR1’fad2C的部分核苷酸序列 |
| 3 | ‘HOR1’fad2A的部分核苷酸序列 |
| 4 | ‘HOR1’fad2C的部分核苷酸序列 |
| 5 | ‘HOR2’fad2A的部分核苷酸序列 |
| 6 | ‘HOR3’fad2A的部分核苷酸序列 |
| 7 | ‘HOR4’fad2A的部分核苷酸序列 |
| 8 | 用于扩增1100bp fad2片段的PCR引物 |
| 9 | 用于扩增1100bp fad2片段的PCR引物 |
| 10 | 用于扩增57bp fad3片段的PCR引物 |
| 11 | 用于扩增57bp fad3片段的PCR引物 |
| 12 | 用于检测C646T突变(‘HOR1’)的正向PCR引物 |
| 13 | 用于检测C646T突变(‘HOR1’)的反向PCR引物 |
| 14 | 用于检测C775T突变(‘HOR1’)的正向PCR引物 |
| 15 | 用于检测C775T突变(‘HOR1’)的反向PCR引物 |
| 16 | 用于检测C827T突变(‘HOR2’)的正向PCR引物 |
| 17 | 用于检测C827T突变(‘HOR2’)的反向PCR引物 |
| 18 | 示例性的野生型欧洲油菜fad2A核苷酸序列 |
| 19 | 示例性的野生型欧洲油菜FAD2A蛋白质序列 |
| 20 | 示例性的野生型欧洲油菜fad2C核苷酸序列 |
| 21 | 示例性的野生型欧洲油菜FAD2C蛋白质序列 |
| 22 | 突变型fad2的共有序列 |
| 23 | 突变型FAD2的共有序列 |
| 24 | G269A突变型fad2的核苷酸序列 |
| 25 | W90Stop突变型FAD2的蛋白质序列 |
| 26 | C346T突变型fad2的核苷酸序列 |
| 27 | Q116Stop突变型FAD2的蛋白质序列 |
| 28 | C646T突变型fad2的核苷酸序列 |
| 29 | P216S突变型FAD2的蛋白质序列 |
| 30 | C775T突变型fad2的核苷酸序列 |
| 31 | P259S突变型FAD2的蛋白质序列 |
| 32 | C827T突变型fad2的核苷酸序列 |
| 33 | T276M突变型FAD2的蛋白质序列 |
| 34 | 用于检测C346T突变(‘HOR3’)的正向PCR引物 |
| 35 | 用于检测G269A突变(‘HOR4’)的正向PCR引物 |
| 36 | 用于检测C346T或G269A突变(‘HOR3/4’)的反向PCR引物 |
| 37 | 用于检测C646T突变(共显性)的正向PCR引物 |
| 38 | 用于检测C775T突变(共显性)的正向PCR引物 |
| 39 | 用于检测C346T或G269A突变(共显性)的正向PCR引物 |
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序列表
<110>INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE
<120>植物中高油酸含量的遗传标记物
<130>BET 07P0644
<160>39
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1100
<212>DNA
<213>欧洲油菜
<400>1
agtgtctcct ccctccaaaa agtctgaaac cgacaacatc aagcgcgtac cctgcgagac 60
accgcccttc actgtcggag aactcaagaa agcaatccca ccgcactgtt tcaaacgctc 120
gatccctcgc tctttctcct acctcatctg ggacatcatc atagcctcct gcttctacta 180
cgtcgccacc acttacttcc ctctcctccc tcaccctctc tcctacttcg cctggcctct 240
ctactgggcc tgccagggct gcgtcctaac cggcgtctgg gtcatagccc acgagtgcgg 300
ccaccacgcc ttcagcgact accagtggct ggacgacacc gtcggcctca tcttccactc 360
cttcctcctc gtcccttact tctcctggaa gtacagtcat cgacgccacc attccaacac 420
tggctccctc gagagagacg aagtgtttgt ccccaagaag aagtcagaca tcaagtggta 480
cggcaagtac ctcaacaacc ctttgggacg caccgtgatg ttaacggttc agttcactct 540
cggctggcct ttgtacttag ccttcaacgt ctcggggaga ccttacgacg gcggcttcgc 600
ttgccatttc caccccaacg ctcccatcta caacgaccgt gagcgtctcc agatatacat 660
ctccgacgct ggcatcctcg ccgtctgcta cggtctctac cgctacgctg ctgtccaagg 720
agttgcctct atggtctgct tctacggagt tcctcttctg attgtcaacg ggttcttagt 780
tttgatcact tacttgcagc acacgcatcc ttccctgcct cactatgact cgtctgagtg 840
ggattggttg aggggagctt tggccaccgt tgacagagac tacggaatct tgaacaaggt 900
cttccacaat atcacggaca cgcacgtggc gcatcacctg ttctcgacca tgccgcatta 960
tcatgcgatg gaagctacga aggcgataaa gccgatactg ggagagtatt atcagttcga 1020
tgggacgccg gtggttaagg cgatgtggag ggaggcgaag gagtgtatct atgtggaacc 1080
ggacaggcaa ggtgagaaga 1100
<210>2
<211>1100
<212>DNA
<213>欧洲油菜
<400>2
agtgtctcct ccctccaaaa agtctgaaac cgacaccatc aagcgcgtac cctgcgagac 60
accgcccttc actgtcggag aactcaagaa agcaatccca ccgcactgtt tcaaacgctc 120
gatccctcgc tctttctcct acctcatctg ggacatcatc atagcctcct gcttctacta 180
cgtcgccacc acttacttcc ctctcctccc tcaccctctc tcctacttcg cctggcctct 240
ctactgggcc tgccaagggt gcgtcctaac cggcgtctgg gtcatagccc acgagtgcgg 300
ccaccacgcc ttcagcgact accagtggct tgacgacacc gtcggtctca tcttccactc 360
cttcctcctc gtcccttact tctcctggaa gtacagtcat cgacgccacc attccaacac 420
tggctccctc gagagagacg aagtgtttgt ccccaagaag aagtcagaca tcaagtggta 480
cggcaagtac ctcaacaacc ctttgggacg caccgtgatg ttaacggttc agttcactct 540
cggctggccg ttgtacttag ccttcaacgt ctcgggaaga ccttacgacg gcggcttcgc 600
ttgccatttc caccccaacg ctcccatcta caacgaccgc gagcgtctcc agatatacat 660
ctccgacgct ggcatcctcg ccgtctgcta cggtctcttc cgttacgccg ccgcgcaggg 720
agtggcctcg atggtctgct tctacggagt cccgcttctg attgtcaatg gtttcctcgt 780
gttgatcact tacttgcagc acacgcatcc ttccctgcct cactacgatt cgtccgagtg 840
ggattggttg aggggagctt tggctaccgt tgacagagac tacggaatct tgaacaaggt 900
cttccacaat attaccgaca cgcacgtggc gcatcatctg ttctccacga tgccgcatta 960
tcacgcgatg gaagctacca aggcgataaa gccgatactg ggagagtatt atcagttcga 1020
tgggacgccg gtggttaagg cgatgtggag ggaggcgaag gagtgtatct atgtggaacc 1080
ggacaggcaa ggtgagaaga 1100
<210>3
<211>1100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>欧洲油菜fad2A突变体(HOR1)的部分序列
<400>3
agtgtctcct ccctccaaaa agtctgaaac cgacaacatc aagcgcgtac cctgcgagac 60
accgcccttc actgtcggag aactcaagaa agcaatccca ccgcactgtt tcaaacgctc 120
gatccctcgc tctttctcct acctcatctg ggacatcatc atagcctcct gcttctacta 180
cgtcgccacc acttacttcc ctctcctccc tcaccctctc tcctacttcg cctggcctct 240
ctactgggcc tgccagggct gcgtcctaac cggcgtctgg gtcatagccc acgagtgcgg 300
ccaccacgcc ttcagcgact accagtggct ggacgacacc gtcggcctca tcttccactc 360
cttcctcctc gtcccttact tctcctggaa gtacagtcat cgacgccacc attccaacac 420
tggctccctc gagagagacg aagtgtttgt ccccaagaag aagtcagaca tcaagtggta 480
cggcaagtac ctcaacaacc ctttgggacg caccgtgatg ttaacggttc agttcactct 540
cggctggcct ttgtacttag ccttcaacgt ctcggggaga ccttacgacg gcggcttcgc 600
ttgccatttc caccccaacg ctcccatcta caacgaccgt gagcgtctcc agatatacat 660
ctccgacgct ggcatcctcg ccgtctgcta cggtctctac cgctacgctg ctgtccaagg 720
agttgcctct atggtctgct tctacggagt ttctcttctg attgtcaacg ggttcttagt 780
tttgatcact tacttgcagc acacgcatcc ttccctgcct cactatgact cgtctgagtg 840
ggattggttg aggggagctt tggccaccgt tgacagagac tacggaatct tgaacaaggt 900
cttccacaat atcacggaca cgcacgtggc gcatcacctg ttctcgacca tgccgcatta 960
tcatgcgatg gaagctacga aggcgataaa gccgatactg ggagagtatt atcagttcga 1020
tgggacgccg gtggttaagg cgatgtggag ggaggcgaag gagtgtatct atgtggaacc 1080
ggacaggcaa ggtgagaaga 1100
<210>4
<211>1100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>欧洲油菜fad2C突变体(HOR1)的部分序列
<400>4
agtgtctcct ccctccaaaa agtctgaaac cgacaccatc aagcgcgtac cctgcgagac 60
accgcccttc actgtcggag aactcaagaa agcaatccca ccgcactgtt tcaaacgctc 120
gatccctcgc tctttctcct acctcatctg ggacatcatc atagcctcct gcttctacta 180
cgtcgccacc acttacttcc ctctcctccc tcaccctctc tcctacttcg cctggcctct 240
ctactgggcc tgccaagggt gcgtcctaac cggcgtctgg gtcatagccc acgagtgcgg 300
ccaccacgcc ttcagcgact accagtggct tgacgacacc gtcggtctca tcttccactc 360
cttcctcctc gtcccttact tctcctggaa gtacagtcat cgacgccacc attccaacac 420
tggctccctc gagagagacg aagtgtttgt ccccaagaag aagtcagaca tcaagtggta 480
cggcaagtac ctcaacaacc ctttgggacg caccgtgatg ttaacggttc agttcactct 540
cggctggccg ttgtacttag ccttcaacgt ctcgggaaga ccttacgacg gcggcttcgc 600
ttgccatttc caccccaacg cttccatcta caacgaccgc gagcgtctcc agatatacat 660
ctccgacgct ggcatcctcg ccgtctgcta cggtctcttc cgttacgccg ccgcgcaggg 720
agtggcctcg atggtctgct tctacggagt cccgcttctg attgtcaatg gtttcctcgt 780
gttgatcact tacttgcagc acacgcatcc ttccctgcct cactacgatt cgtccgagtg 840
ggattggttg aggggagctt tggctaccgt tgacagagac tacggaatct tgaacaaggt 900
cttccacaat attaccgaca cgcacgtggc gcatcatctg ttctccacga tgccgcatta 960
tcacgcgatg gaagctacca aggcgataaa gccgatactg ggagagtatt atcagttcga 1020
tgggacgccg gtggttaagg cgatgtggag ggaggcgaag gagtgtatct atgtggaacc 1080
ggacaggcaa ggtgagaaga 1100
<210>5
<211>1100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>欧洲油菜fad2A突变体(HOR2)的部分序列
<400>5
agtgtctcct ccctccaaaa agtctgaaac cgacaacatc aagcgcgtac cctgcgagac 60
accgcccttc actgtcggag aactcaagaa agcaatccca ccgcactgtt tcaaacgctc 120
gatccctcgc tctttctcct acctcatctg ggacatcatc atagcctcct gcttctacta 180
cgtcgccacc acttacttcc ctctcctccc tcaccctctc tcctacttcg cctggcctct 240
ctactgggcc tgccagggct gcgtcctaac cggcgtctgg gtcatagccc acgagtgcgg 300
ccaccacgcc ttcagcgact accagtggct ggacgacacc gtcggcctca tcttccactc 360
cttcctcctc gtcccttact tctcctggaa gtacagtcat cgacgccacc attccaacac 420
tggctccctc gagagagacg aagtgtttgt ccccaagaag aagtcagaca tcaagtggta 480
cggcaagtac ctcaacaacc ctttgggacg caccgtgatg ttaacggttc agttcactct 540
cggctggcct ttgtacttag ccttcaacgt ctcggggaga ccttacgacg gcggcttcgc 600
ttgccatttc caccccaacg ctcccatcta caacgaccgt gagcgtctcc agatatacat 660
ctccgacgct ggcatcctcg ccgtctgcta cggtctctac cgctacgctg ctgtccaagg 720
agttgcctcg atggtctgct tctacggagt tcctcttctg attgtcaacg ggttcttagt 780
tttgatcact tacttgcagc acatgcatcc ttccctgcct cactatgact cgtctgagtg 840
ggattggttg aggggagctt tggccaccgt tgacagagac tacggaatct tgaacaaggt 900
cttccacaat atcacggaca cgcacgtggc gcatcacctg ttctcgacca tgccgcatta 960
tcatgcgatg gaagctacga aggcgataaa gccgatactg ggagagtatt atcagttcga 1020
tgggacgccg gtggttaagg cgatgtggag ggaggcgaag gagtgtatct atgtggaacc 1080
ggacaggcaa ggtgagaaga 1100
<210>6
<211>1100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>欧洲油菜fad2A突变体(HOR3)的部分序列
<400>6
agtgtctcct ccctccaaaa agtctgaaac cgacaacatc aagcgcgtac cctgcgagac 60
accgcccttc actgtcggag aactcaagaa agcaatccca ccgcactgtt tcaaacgctc 120
gatccctcgc tctttctcct acctcatctg ggacatcatc atagcctcct gcttctacta 180
cgtcgccacc acttacttcc ctctcctccc tcaccctctc tcctacttcg cctggcctct 240
ctactgggcc tgccagggct gcgtcctaac cggcgtctgg gtcatagccc acgagtgcgg 300
ccaccacgcc ttcagcgact actagtggct ggacgacacc gtcggcctca tcttccactc 360
cttcctcctc gtcccttact tctcctggaa gtacagtcat cgacgccacc attccaacac 420
tggctccctc gagagagacg aagtgtttgt ccccaagaag aagtcagaca tcaagtggta 480
cggcaagtac ctcaacaacc ctttgggacg caccgtgatg ttaacggttc agttcactct 540
cggctggcct ttgtacttag ccttcaacgt ctcggggaga ccttacgacg gcggcttcgc 600
ttgccatttc caccccaacg ctcccatcta caacgaccgt gagcgtctcc agatatacat 660
ctccgacgct ggcatcctcg ccgtctgcta cggtctctac cgctacgctg ctgtccaagg 720
agttgcctcg atggtctgct tctacggagt tcctcttctg attgtcaacg ggttcttagt 780
tttgatcact tacttgcagc acacgcatcc ttccctgcct cactatgact cgtctgagtg 840
ggattggttg aggggagctt tggccaccgt tgacagagac tacggaatct tgaacaaggt 900
cttccacaat atcacggaca cgcacgtggc gcatcacctg ttctcgacca tgccgcatta 960
tcatgcgatg gaagctacga aggcgataaa gccgatactg ggagagtatt atcagttcga 1020
tgggacgccg gtggttaagg cgatgtggag ggaggcgaag gagtgtatct atgtggaacc 1080
ggacaggcaa ggtgagaaga 1100
<210>7
<211>1100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>欧洲油菜fad2A突变体(HOR4)的部分序列
<400>7
agtgtctcct ccctccaaaa agtctgaaac cgacaacatc aagcgcgtac cctgcgagac 60
accgcccttc actgtcggag aactcaagaa agcaatccca ccgcactgtt tcaaacgctc 120
gatccctcgc tctttctcct acctcatctg ggacatcatc atagcctcct gcttctacta 180
cgtcgccacc acttacttcc ctctcctccc tcaccctctc tcctacttcg cctggcctct 240
ctactaggcc tgccagggct gcgtcctaac cggcgtctgg gtcatagccc acgagtgcgg 300
ccaccacgcc ttcagcgact accagtggct ggacgacacc gtcggcctca tcttccactc 360
cttcctcctc gtcccttact tctcctggaa gtacagtcat cgacgccacc attccaacac 420
tggctccctc gagagagacg aagtgtttgt ccccaagaag aagtcagaca tcaagtggta 480
cggcaagtac ctcaacaacc ctttgggacg caccgtgatg ttaacggttc agttcactct 540
cggctggcct ttgtacttag ccttcaacgt ctcggggaga ccttacgacg gcggcttcgc 600
ttgccatttc caccccaacg ctcccatcta caacgaccgt gagcgtctcc agatatacat 660
ctccgacgct ggcatcctcg ccgtctgcta cggtctctac cgctacgctg ctgtccaagg 720
agttgcctcg atggtctgct tctacggagt tcctcttctg attgtcaacg ggttcttagt 780
tttgatcact tacttgcagc acacgcatcc ttccctgcct cactatgact cgtctgagtg 840
ggattggttg aggggagctt tggccaccgt tgacagagac tacggaatct tgaacaaggt 900
cttccacaat atcacggaca cgcacgtggc gcatcacctg ttctcgacca tgccgcatta 960
tcatgcgatg gaagctacga aggcgataaa gccgatactg ggagagtatt atcagttcga 1020
tgggacgccg gtggttaagg cgatgtggag ggaggcgaag gagtgtatct atgtggaacc 1080
ggacaggcaa ggtgagaaga 1100
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>8
agtgtctcct ccctccaaaa a 21
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>9
tcttctcacc ttgcctgtcc 20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>10
cttggtggtc gatcatgttg 20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>11
ctggaccaac gaggaatgat 20
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>12
atttccaccc caacgctt 18
<210>13
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>13
aggccactcc ctgcg 15
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>14
tggtctgctt ctacggagtt t 21
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>15
gtgcgtgtcc gtgatattgt 20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>16
tctaccgcta cgctgctgtc 20
<210>17
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>17
aggcagggaa ggatgca 17
<210>18
<211>1155
<212>DNA
<213>欧洲油菜
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1155)
<400>18
atg ggt gca ggt gga aga atg caa gtg tct cct ccc tcc aaa aag tct 48
Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
1 5 10 15
gaa acc gac aac atc aag cgc gta ccc tgc gag aca ccg ccc ttc act 96
Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
20 25 30
gtc gga gaa ctc aag aaa gca atc cca ccg cac tgt ttc aaa cgc tcg 144
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45
atc cct cgc tct ttc tcc tac ctc atc tgg gac atc atc ata gcc tcc 192
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
50 55 60
tgc ttc tac tac gtc gcc acc act tac ttc cct ctc ctc cct cac cct 240
Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
65 70 75 80
ctc tcc tac ttc gcc tgg cct ctc tac tgg gcc tgc cag ggc tgc gtc 288
Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
85 90 95
cta acc ggc gtc tgg gtc ata gcc cac gag tgc ggc cac cac gcc ttc 336
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
100 105 110
agc gac tac cag tgg ctg gac gac acc gtc ggc ctc atc ttc cac tcc 384
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
115 120 125
ttc ctc ctc gtc cct tac ttc tcc tgg aag tac agt cat cga cgc cac 432
Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
130 135 140
cat tcc aac act ggc tcc ctc gag aga gac gaa gtg ttt gtc ccc aag 480
His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys
145 150 155 160
aag aag tca gac atc aag tgg tac ggc aag tac ctc aac aac cct ttg 528
Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu
165 170 175
gga cgc acc gtg atg tta acg gtt cag ttc act ctc ggc tgg cct ttg 576
Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu
180 185 190
tac tta gcc ttc aac gtc tcg ggg aga cct tac gac ggc ggc ttc gct 624
Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala
195 200 205
tgc cat ttc cac ccc aac gct ccc atc tac aac gac cgt gag cgt ctc 672
Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu
210 215 220
cag ata tac atc tcc gac gct ggc atc ctc gcc gtc tgc tac ggt ctc 720
Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu
225 230 235 240
tac cgc tac gct gct gtc caa gga gtt gcc tct atg gtc tgc ttc tac 768
Tyr Arg Tyr Ala Ala Val Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr
245 250 255
gga gtt cct ctt ctg att gtc aac ggg ttc tta gtt ttg atc act tac 816
Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr
260 265 270
ttg cag cac acg cat cct tcc ctg cct cac tat gac tcg tct gag tgg 864
Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser ger Glu Trp
275 280 285
gat tgg ttg agg gga gct ttg gcc acc gtt gac aga gac tac gga atc 912
Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile
290 295 300
ttg aac aag gtc ttc cac aat atc acg gac acg cac gtg gcg cat cac 960
Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His
305 310 315 320
ctg ttc tcg acc atg ccg cat tat cat gcg atg gaa gct acg aag gcg 1008
Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala
325 330 335
ata aag ccg ata ctg gga gag tat tat cag ttc gat ggg acg ccg gtg 1056
Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val
340 345 350
gtt aag gcg atg tgg agg gag gcg aag gag tgt atc tat gtg gaa ccg 1104
Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro
355 360 365
gac agg caa ggt gag aag aaa ggt gtg ttc tgg tac aac aat aag tta 1152
Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu
370 375 380
tga 1155
<210>19
<211>384
<212>PRT
<213>欧洲油菜
<400>19
Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
20 25 30
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
50 55 60
Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
65 70 75 80
Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
85 90 95
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
100 105 110
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
115 120 125
Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
130 135 140
His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys
145 150 155 160
Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu
165 170 175
Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu
180 185 190
Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala
195 200 205
Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu
210 215 220
Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu
225 230 235 240
Tyr Arg Tyr Ala Ala Val Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr
245 250 255
Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr
260 265 270
Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp
275 280 285
Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile
290 295 300
Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His
305 310 315 320
Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala
325 330 335
Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val
340 345 350
Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu
370 375 380
<210>20
<211>1155
<212>DNA
<213>欧洲油菜
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1155)
<400>20
atg ggt gca ggt gga aga atg caa gtg tct cct ccc tcc aaa aag tct 48
Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
1 5 10 15
gaa acc gac acc atc aag cgc gta ccc tgc gag aca ccg ccc ttc act 96
Glu Thr Asp Thr Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
20 25 30
gtc gga gaa ctc aag aaa gca atc cca ccg cac tgt ttc aaa cgc tcg 144
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45
atc cct cgc tct ttc tcc tac ctc atc tgg gac atc atc ata gcc tcc 192
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
50 55 60
tgc ttc tac tac gtc gcc acc act tac ttc cct ctc ctc cct cac cct 240
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65 70 75 80
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Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
85 90 95
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Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
100 105 110
agc gac tac cag tgg ctt gac gac acc gtc ggt ctc atc ttc cac tcc 384
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
115 120 125
ttc ctc ctc gtc cct tac ttc tcc tgg aag tac agt cat cga cgc cac 432
Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
130 135 140
cat tcc aac act ggc tcc ctc gag aga gac gaa gtg ttt gtc ccc aag 480
His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys
145 150 155 160
aag aag tca gac atc aag tgg tac ggc aag tac ctc aac aac cct ttg 528
Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu
165 170 175
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Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu
180 185 190
tac tta gcc ttc aac gtc tcg gga aga cct tac gac ggc ggc ttc gct 624
Tyr Leu Ala Phe Asn Val ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala
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tgc cat ttc cac ccc aac gct ccc atc tac aac gac cgc gag cgt ctc 672
Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu
210 215 220
cag ata tac atc tcc gac gct ggc atc ctc gcc gtc tgc tac ggt ctc 720
Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu
225 230 235 240
ttc cgt tac gcc gcc gcg cag gga gtg gcc tcg atg gtc tgc ttc tac 768
Phe Arg Tyr Ala Ala Ala Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr
245 250 255
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Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr
260 265 270
ttg cag cac acg cat cct tcc ctg cct cac tac gat tcg tcc gag tgg 864
Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp
275 280 285
gat tgg ttg agg gga gct ttg gct acc gtt gac aga gac tac gga atc 912
Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile
290 295 300
ttg aac aag gtc ttc cac aat att acc gac acg cac gtg gcg cat cat 960
Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His
305 310 315 320
ctg ttc tcc acg atg ccg cat tat cac gcg atg gaa gct acc aag gcg 1008
Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala
325 330 335
ata aag ccg ata ctg gga gag tat tat cag ttc gat ggg acg ccg gtg 1056
Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val
340 345 350
gtt aag gcg atg tgg agg gag gcg aag gag tgt atc tat gtg gaa ccg 1104
Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro
355 360 365
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370 375 380
tga 1155
<210>21
<211>384
<212>PRT
<213>欧洲油菜
<400>21
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Glu Thr Asp Thr Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
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Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
50 55 60
Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
65 70 75 80
Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
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Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
100 105 110
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
115 120 125
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Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu
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Phe Arg Tyr Ala Ala Ala Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr
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Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr
260 265 270
Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp
275 280 285
Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile
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Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val
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Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223>G或C
<400>22
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Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
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gaa acc gac anc atc aag cgc gta ccc tgc gag aca ccg ccc ttc act 96
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gtc gga gaa ctc aag aaa gca atc cca ccg cac tgt ttc aaa cgc tcg 144
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Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
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130 135 140
cat tcc aac act ggc tcc ctc gag aga gac gaa gtg ttt gtc ccc aag 480
His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys
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Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu
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Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu
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tac tta gcc ttc aac gtc tcg ggn aga cct tac gac ggc ggc ttc gct 624
Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala
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Leu Phe Xaa Thr Met Pro His Tyr Xaa Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala
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Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val
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Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<222>(329)..(329)
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<220>
<223>欧洲油菜fad2突变体
<400>23
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Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
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Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
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Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
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Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Xaa Ala Cys Xaa Gly Cys Val
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Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
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Ser Asp Tyr Xaa Trp Xaa Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
115 120 125
Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
130 135 140
His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys
145 150 155 160
Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu
165 170 175
Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu
180 185 190
Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala
195 200 205
Cys His Phe His Pro Asn Ala Xaa Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu
210 215 220
Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu
225 230 235 240
Xaa Arg Tyr Ala Ala Xaa Xaa Gly Val Ala Xaa Met Val Cys Phe Tyr
245 250 255
Gly Val Xaa Leu Leu Ile Val Xaa Gly Phe Xaa Val Leu Ile Thr Tyr
260 265 270
Leu Gln His Xaa His Pro Ser Leu Pro His Xaa Xaa Ser Xaa Glu Trp
275 280 285
Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile
290 295 300
Leu Asn Lys Val Phe His Asn Xaa Thr Asp Thr His Val Ala His Xaa
305 310 315 320
Leu Phe Xaa Thr Met Pro His Tyr Xaa Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala
325 330 335
Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val
340 345 350
Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu
370 375 380
<210>24
<211>1155
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>欧洲油菜G269A fad2A突变体
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(270)
<400>24
atg ggt gca ggt gga aga atg caa gtg tct cct ccc tcc aaa aag tct 48
Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
1 5 10 15
gaa acc gac aac atc aag cgc gta ccc tgc gag aca ccg ccc ttc act 96
Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
20 25 30
gtc gga gaa ctc aag aaa gca atc cca ccg cac tgt ttc aaa cgc tcg 144
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45
atc cct cgc tct ttc tcc tac ctc atc tgg gac atc atc ata gcc tcc 192
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
50 55 60
tgc ttc tac tac gtc gcc acc act tac ttc cct ctc ctc cct cac cct 240
Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
65 70 75 80
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Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr
85
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gctggacgac accgtcggcc tcatcttcca ctccttcctc ctcgtccctt acttctcctg 410
gaagtacagt catcgacgcc accattccaa cactggctcc ctcgagagag acgaagtgtt 470
tgtccccaag aagaagtcag acatcaagtg gtacggcaag tacctcaaca accctttggg 530
acgcaccgtg atgttaacgg ttcagttcac tctcggctgg cctttgtact tagccttcaa 590
cgtctcgggg agaccttacg acggcggctt cgcttgccat ttccacccca acgctcccat 650
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cgttgacaga gactacggaa tcttgaacaa ggtcttccac aatatcacgg acacgcacgt 950
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Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
1 5 10 15
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20 25 30
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Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45
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Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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ggcctttgta cttagccttc aacgtctcgg ggagacctta cgacggcggc ttcgcttgcc 628
atttccaccc caacgctccc atctacaacg accgtgagcg tctccagata tacatctccg 688
acgctggcat cctcgccgtc tgctacggtc tctaccgcta cgctgctgtc caaggagttg 748
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245 250 255
gga gtt cct ctt ctg att gtc aac ggg ttc tta gtt ttg atc act tac 816
Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr
260 265 270
ttg cag cac atg cat cct tcc ctg cct cac tat gac tcg tct gag tgg 864
Leu Gln His Met His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp
275 280 285
gat tgg ttg agg gga gct ttg gcc acc gtt gac aga gac tac gga atc 912
Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile
290 295 300
ttg aac aag gtc ttc cac aat atc acg gac acg cac gtg gcg cat cac 960
Leu Asn Lyg Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His
305 310 315 320
ctg ttc tcg acc atg ccg cat tat cat gcg atg gaa gct acg aag gcg 1008
Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala
325 330 335
ata aag ccg ata ctg gga gag tat tat cag ttc gat ggg acg ccg gtg 1056
Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val
340 345 350
gtt aag gcg atg tgg agg gag gcg aag gag tgt atc tat gtg gaa ccg 1104
Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro
355 360 365
gac agg caa ggt gag aag aaa ggt gtg ttc tgg tac aac aat aag tta 1152
Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu
370 375 380
tga 1155
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<212>PRT
<213>人工序列
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<223>欧洲油菜C827T fad2A突变体
<400>33
Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
20 25 30
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
50 55 60
Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
65 70 75 80
Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
85 90 95
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
100 105 110
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
115 120 125
Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
130 135 140
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145 150 155 160
Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu
165 170 175
Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu
180 185 190
Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala
195 200 205
Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu
210 215 220
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225 230 235 240
Tyr Arg Tyr Ala Ala Val Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr
245 250 255
Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr
260 265 270
Leu Gln His Met His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp
275 280 285
Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile
290 295 300
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305 310 315 320
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agtgtctcct ccctccaaaa a 21
Claims (8)
1.来自十字花科(Cruciferae)植物的编码δ-12油酸去饱和酶的核酸的突变核酸序列，其中代表下述氨基酸的密码子经突变，从而导致成为丝氨酸密码子：当所述δ-12油酸去饱和酶序列由384个氨基酸组成时，在所述δ-12油酸去饱和酶的氨基酸序列的位置259处的脯氨酸，或当所述δ-12油酸去饱和酶序列由383个氨基酸组成时，在位置258处的脯氨酸，
或者所述突变核酸序列的互补序列。
2.根据权利要求1的突变核酸序列，其中所述植物是芸苔属(Brassica)的植物。
3.根据权利要求1-2中任一项的突变核酸序列，其中所述突变核酸序列为SEQ ID NO：30。
4.根据权利要求1-2中任一项的突变核酸序列，其中，代表下述氨基酸的密码子也经突变，从而导致成为丝氨酸密码子：当所述δ-12油酸去饱和酶序列由384个氨基酸组成时，在所述δ-12油酸去饱和酶的氨基酸序列的位置216处的脯氨酸，或当所述δ-12油酸去饱和酶序列由383个氨基酸组成时，在位置215处的脯氨酸。
5.根据权利要求1的核酸的用途，所述用途为用于选择具有增加的油酸含量的植物或植物的部分。
6.选自下列的引物对的用途，所述用途为用于选择具有增加的油酸含量的植物或植物的部分：(i)SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15；以及(ii)SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：15。
7.用于选择具有高油酸含量的植物的试剂盒，其包含：
-包含根据权利要求1-4中任一项的核酸的至少一种植物或植物的部分，和／或至少一种植物，其为于2006年5月17日以登记号41400保藏在NCIMB(Aberdeen，Scotland)的植物，和至少一种引物对，其为SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：15；
-至少一种引物对，其选自：(i)SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15；以及(ii)SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：15。
8.突变的来自植物的δ-12油酸去饱和酶，其由在权利要求1-4中任一项之中定义的突变核酸序列编码。
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