ES2651621T3 - Marcadores genéticos para el alto contenido de ácido oleico en plantas - Google Patents

Abstract

Ácido nucleico mutado que codifica una enzima delta-12 oleato desaturasa (FAD2) de una planta Cruciferae, en el que dicho ácido nucleico mutado consiste en (i) una secuencia que comprende la mutación no conservativa de al menos un nucleótido de al menos un codón que representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: - el aminoácido en la posición 259 de la secuencia de aminoácidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 está constituida por 384 aminoácidos, o en la posición 258 cuando dicha secuencia de FAD2 está constituida por 383 aminoácidos, o (ii) la secuencia complementaria de dicha secuencia, codificando dicho ácido nucleico mutado una FAD2 que tiene una actividad menor que la de la correspondiente FAD2 natural medida en las mismas condiciones.

Description

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DESCRIPCION

Marcadores geneticos para el alto contenido de acido oleico en plantas

[0001] La presente invencion se refiere a nuevos marcadores geneticos y de protelnas utiles para la seleccion de plantas que tiene un alto contenido de acido oleico.

[0002] El alto contenido de acido oleico de aceites vegetales es un rasgo deseable tanto debido a los beneficios de la salud como a la estabilidad a la oxidacion y el calor del acido oleico. En particular, se ha demostrado que el acido oleico es eficaz en la reduccion de los niveles de colesterol en plasma (Bonanome et al, 1988; Liu et al, 2002). Ademas, su unico enlace insaturado hace del acido oleico (C18:1) un acido graso mucho menos vulnerable que sus homologos con multiples insaturaciones. Por ejemplo, la velocidad de oxidacion de acido linolenico (C18:3) es 100 veces la del acido oleico (Debruyne, 2004).

[0003] Uno de los caminos mas prometedores hacia tales plantas es seleccionar plantas esencialmente privadas de actividad de FAD2. De hecho, la FAD2 (delta12 oleato desaturasa) cataliza la transformacion de acido oleico (C18:1) a acido linoleico (C18:2); las plantas que tienen una actividad de FAD2 disminuida disfrutan as! de mayor contenido de acido oleico gracias al catabolismo limitado de esta ultima.

[0004] Por tanto, el documento WO 2004/072259 proporciona una planta de Brassica napus que tiene un alto contenido de acido oleico, en la que su gen fad2 presenta un codon de parada en lugar de un codon de glutamina (Q) en la posicion 185 de FAD2.

[0005] Ademas, el documento US 2005/0039233 proporciona una planta Brassica juncea que tiene un alto contenido de acido oleico, en la que su gen fad2 presenta un codon de parada en lugar de un codon de triptofano (W) en la posicion 101 de FAD2.

[0006] Brassica napus (colza) es un anfidiploide que contiene los genomas de dos ancestros diploides, Brassica rapa (el genoma A) y Brassica oleracea (el genoma C) (Pires et al., 2004). El contenido de acido oleico es del 61% para el aceite tradicional de semillas de colza (Stan Skrypetz, 2005).

[0007] La presente invencion surge en particular del descubrimiento, por los inventores, de cinco mutaciones no reconocidas previamente en los genes fad2 de plantas Brassica napus:

- sustitucion de G a A en la posicion 269 del gen fad2A (gen fad2 del genoma de B. rapa), correspondiente a una sustitucion de codon de W a parada en la posicion 90 de la protelna fAD2A,

- sustitucion de C a T en la posicion 346 del gen fad2A (gen fad2 del genoma de B. rapa), correspondiente a una sustitucion de codon de Q a parada en la posicion 116 de la protelna FAD2A,

- sustitucion de C a T en la posicion 646 del gen fad2C (gen fad2 del genoma de B. oleracea), correspondiente a una sustitucion de P a S en la posicion 216 de la protelna FAD2C,

- sustitucion de C a T en la posicion 775 del gen fad2A (gen fad2 del genoma de B. rapa), correspondiente a una sustitucion de P a S en la posicion 259 de la protelna FAD2A,

- sustitucion de C a T en la posicion 827 del gen fad2A (gen fad2 del genoma de B. rapa), correspondiente a una sustitucion de T a M en la posicion 276 de la protelna FAD2A,

que se correlacionan con un alto contenido de acido oleico de las plantas que los albergan. En particular, el contenido de acido oleico de estas semillas de colza mutadas varla del 66% al 82%, segun las condiciones de cultivo ambientales.

[0008] Por lo tanto, la presente solicitud describe una secuencia de acido nucleico mutada de un acido nucleico que codifica una enzima delta-12 oleato desaturasa (FAD2) de una planta, en particular una planta Cruciferae, en la que dicha secuencia de acido nucleico mutada comprende la mutacion no conservativa de al menos un nucleotido de al menos un codon que representa un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en:

- el aminoacido en la posicion 90 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2,

- el aminoacido en la posicion 116 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2,

- el aminoacido en la posicion 216 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 215 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos,

- el aminoacido en la posicion 259 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 258 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos,

- el aminoacido en la posicion 276 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 275 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos,

o una secuencia de acido nucleico homologa derivada de dicha secuencia de acido nucleico mutada por sustitucion, insercion o delecion de al menos un nucleotido, y que presenta al menos un 90% de homologla con dicha secuencia de acido nucleico mutada, siempre que dicha secuencia de acido nucleico homologa presente dicha mutacion y no codifice una FAD2 funcional,

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o una secuencia de acido nucleico de hibridacion que hibrida en condiciones rigurosas con dicha secuencia de acido nucleico mutada, siempre que la secuencia complementaria de dicha secuencia de acido nucleico de hibridacion presente dicha mutacion y no codifique una FAD2 funcional,

o las secuencias complementarias de dichas secuencia de acido nucleico mutada, homologa o de hibridacion.

[0009] De este modo, la presente invencion se refiere a un acido nucleico mutado que codifica una enzima delta-12 oleato desaturasa (FAD2) de una planta Cruciferae, en el que dicho acido nucleico mutado consiste en (i) una secuencia que comprende la mutacion no conservativa de al menos un nucleotido de al menos un codon que representa un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en:

- el aminoacido en la posicion 259 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 258 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por

383 aminoacidos, o (ii) la secuencia complementaria de dicha secuencia,

codificando dicho acido nucleico mutado una FAD2 que tiene una actividad menor que la de la FAD2 natural correspondiente medida en las mismas condiciones.

[0010] La presente invencion tambien se refiere a una planta que tiene una mayor contenido de acido oleico en comparacion con plantas que son geneticamente identicas excepto por la mutacion que se ha definido anteriormente, o una parte de dicha planta, en la que la planta o dicha parte de la planta comprende al menos un acido nucleico segun la invencion, que codifica una enzima FAD2 que tiene una actividad menor que la de la correspondiente FAD2 natural medida en las mismas condiciones.

[0011] La presente invencion tambien se refiere al uso de un acido nucleico segun la invencion para la seleccion de plantas, o parte de las plantas, que tiene un mayor contenido de acido oleico en comparacion con plantas que son geneticamente identicas excepto por la mutacion que se ha definido anteriormente.

[0012] La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento para seleccionar plantas que tienen un mayor contenido de acido oleico en comparacion con plantas que son geneticamente identicas excepto por la mutacion que se ha definido anteriormente, por mutagenesis, que comprende las siguientes etapas:

- someter una planta o parte de una planta a un tratamiento mutagenico,

- regenerar plantas, o parte de las plantas, a partir de dicha planta o parte de una planta tratadas,

- seleccionar a partir de las plantas regeneradas las que comprenden al menos un acido nucleico segun la invencion.

[0013] La presente invencion tambien se refiere a un kit para la seleccion de plantas que tienen un alto contenido de acido oleico, que comprende:

i) al menos una planta, o parte de planta, que comprende un acido nucleico segun la invencion, y

ii) al menos un acido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

- un fragmento de acido nucleico de un acido nucleico mutado segun la invencion que comprende al menos 10 nucleotidos y comprende al menos un nucleotido contiguo a al menos un codon que representa el aminoacido en la posicion 259 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por

384 aminoacidos, o en la posicion 258 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos, o la secuencia complementaria de dicho fragmento de acido nucleico,

- un fragmento de acido nucleico de un acido nucleico mutado segun la invencion que comprende al menos 10 nucleotidos incluyendo el nucleotido mutado, y comprende al menos un nucleotido contiguo a al menos un codon que representa el aminoacido en la posicion 259 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 258 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos, o la secuencia complementaria de dicho fragmento de acido nucleico,

- un fragmento de acido nucleico seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 3.

[0014] La presente invencion tambien se refiere a una enzima FAD2 mutada de la planta codificada por una secuencia de acido nucleico mutada segun la invencion.

[0015] La presente invencion tambien se refiere a un anticuerpo especlfico para una enzima FAD2 mutada de una planta segun la invencion.

[0016] La presente invencion tambien se refiere a un acido nucleico seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 38.

[0017] El porcentaje de homologla de una secuencia de acido nucleico dada con respecto a la secuencia de acido nucleico mutada se calcula contando el numero de nucleotidos identicos entre dicha secuencia de acido nucleico dada y la secuencia de acido nucleico mutada para todas las posiciones de una alineacion de secuencias optimo de dichoa secuencia de acido nucleico dada y la secuencia de acido nucleico mutada y dividiendo este numero por el numero total de nucleotidos de dicha secuencia dada.

[0018] La alineacion de secuencias optima se pueden producir manualmente, opcionalmente mediante la introduccion de huecos entre los nucleotidos, o mediante el uso de herramientas de alineacion basadas en ordenador, tales como BLAST (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-402).

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[0019] "Condiciones rigurosas" para una secuencia de acido nucleico dada pueden determinarse facilmente por el experto en la tecnica, por ejemplo, tal como se describe en Sambrook et al. (2001). Las condiciones rigurosas particulares comprenden en particular 15 mM NaCl/1,5 mM citrato de sodio (0,1 X SSC) y lauril sulfato de sodio (SDS) al 0,1% a 50-65°C.

[0020] Tal como se pretende en el presente documento, FAD2 de Cruciferae normalmente esta constituida por 383 o 384 aminoacidos. Sin embargo, esta dentro de la capacidad de un experto en la materia adaptar las posiciones dadas para las mutaciones definidas anteriormente a FAD2 que tiene mas o menos de 383 o 384 aminoacidos.

[0021] Una alineacion de ejemplo de secuencias de FAD2 de diversas especies de Cruciferae se proporciona en la figura 14.

[0022] Tal como se pretende en el presente documento, una secuencia de acido nucleico que "no codifica una FAD2 funcional" se refiere a una secuencia de acido nucleico que codifica una FAD2 que tiene una actividad menor que la de la FAD2 natural correspondiente medida en las mismas condiciones, en particular la FAD2 codificada no tiene actividad.

[0023] Ventajosamente, las plantas mutantes que llevan acidos nucleicos con las mutaciones definidas anteriormente tienen un mayor contenido de acido oleico en comparacion con plantas de otro modo geneticamente identicas (es decir, plantas que son geneticamente identicas, excepto por dichas mutaciones) y a las correspondientes plantas de tipo silvestre. Preferiblemente, las plantas mutantes que llevan acidos nucleicos con las mutaciones definidas anteriormente tienen un contenido de acido oleico de al menos 65%, mas preferiblemente de al menos 70%.

[0024] La solicitud tambien describe una secuencia de acido nucleico mutada como se define anteriormente, en la que dicha secuencia de acido nucleico mutada comprende al menos una mutacion seleccionada de:

- una sustitucion del codon que representa el aminoacido en la posicion 90 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 por un codon de parada,

- una sustitucion del codon que representa el aminoacido en la posicion 116 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 por un codon de parada,

- una sustitucion del codon que representa el aminoacido en la posicion 216 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 215 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos, por un codon que representa cualquier aminoacido diferente de P,

- una sustitucion del codon que representa el aminoacido en la posicion 259 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 258 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos, por un codon que representa cualquier aminoacido diferente de P,

- una sustitucion del codon que representa el aminoacido en la posicion 276 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 275 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos, por cualquier aminoacido diferente de T.

[0025] La solicitud tambien describe una secuencia de acido nucleico mutada tal como se define anteriormente, en la que:

- el codon que representa el aminoacido en la posicion 216 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 215 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos, esta sustituido por un codon que representa S,

- el codon que representa el aminoacido en la posicion 259 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 258 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos, esta sustituido por un codon que representa S,

- el codon que representa el aminoacido en la posicion 276 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o por lo la posicion 275 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos, esta sustituido por un codon que representa M.

[0026] En una realizacion preferida de la secuencia de acido nucleico mutada anteriormente definida, la planta es del genero Brassica.

[0027] Como se describe en el presente documento, la secuencia de acido nucleico mutada puede ser representada por la SEQ ID NO: 22 y comprende al menos una mutacion seleccionada del grupo constituido por:

- sustitucion G a A en la posicion 269 de la SEQ ID NO: 22,

- sustitucion C a T en la posicion 346 de la SEQ ID NO: 22,

- sustitucion C a T en la posicion 646 de la SEQ ID NO: 22,

- sustitucion C a T en la posicion 775 de la SEQ ID NO: 22,

- sustitucion C a T en la posicion 827 de la SEQ ID NO: 22,

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[0028] Tal como se describe en el presente documento, la secuencia de acido nucleico mutada se puede seleccionar del grupo constituido por:

SEQ ID NO: 24;

SEQ ID NO: 26;

SEQ ID NO: 28;

SEQ ID NO: 30;

SEQ ID NO: 32.

SEQ ID NO: 24 representa el gen fad2A de B. napus (es decir, el gen fad2 del genoma de B. rapa) que alberga una sustitucion de G a A en la posicion 269, que corresponde a una sustitucion de codon de W a parada en la posicion 90 de la protelna FAD2A. Esta mutacion se encuentra en particular en la llnea de semilla de colza sobreproductora de acido oleico indicada como 'HOR4' en el siguiente Ejemplo. 'HOR4' ha sido depositada en la NCIMB (Aberdeen, Escocia) el 17 de mayo de 2006 bajo el numero de acceso 41403.

SEQ ID NO: 26 representa el gen fad2A de B. napus que alberga una sustitucion de C a T en la posicion 346, que corresponde a una sustitucion de codon Q a parada en la posicion 116 de la protelna FAD2A. Esta mutacion se encuentra en particular en la llnea de semilla de colza sobreproductora de acido oleico indicada como 'HOR3' en el siguiente Ejemplo. 'HOR3' ha sido depositada en la NCIMB (Aberdeen, Escocia) el 17 de mayo de 2006 bajo el numero de acceso 41402.

SEQ ID NO: 28 representa el gen fad2C de B. napus (es decir, el gen fad2 del genoma de B. oleracea) que alberga una sustitucion de C a T en la posicion 646, que corresponde a una sustitucion de P a S en la posicion 216 de la protelna FAD2C. Esta mutacion se encuentra en particular en la llnea de semilla de colza sobreproductora de acido oleico indicada como 'HOR1' en el siguiente Ejemplo. 'HOR1' ha sido depositada en la NCIMB (Aberdeen, Escocia) el 17 de mayo de 2006 bajo el numero de acceso 41400.

SEQ ID NO: 30 representa el gen fad2A de B. napus que alberga una sustitucion de C a T en la posicion 775, que corresponde a una sustitucion de P a S en la posicion 259 de la protelna FAD2A. Esta mutacion se encuentra en particular en la llnea de semilla de colza sobreproductora de acido oleico indicada como 'HOR1' en el siguiente Ejemplo.

SEQ ID NO: 32 representa el gen fad2A de B. napus que alberga una sustitucion de C a T en la posicion 827, que corresponde a una sustitucion de T a M en la posicion 276 de la protelna FAD2A. Esta mutacion se encentra en particular en la llnea de semilla de colza sobreproductora de acido oleico indicada como 'HOR2' en el siguiente Ejemplo. 'HOR2' ha sido depositada en la NCIMB (Aberdeen, Escocia) el 17 de mayo de 2006 bajo el numero de acceso 41401.

[0029] La presente solicitud tambien describe un fragmento de acido nucleico de un acido nucleico mutado, tal como se define anteriormente, comprendiendo dicho fragmento al menos 10, preferiblemente al menos 100, mas preferiblemente al menos 1000 nucleotidos, y que comprende al menos un nucleotido contiguo a al menos un codon que representa un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en:

- el aminoacido en la posicion 90 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2,

- el aminoacido en la posicion 116 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2,

- el aminoacido en la posicion 216 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 215 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos,

- el aminoacido en la posicion 259 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 258 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos,

- el aminoacido en la posicion 276 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 275 cuando dichoa secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos,

o la secuencia complementaria de dicho fragmento de acido nucleico.

[0030] Como se describe en el presente documento, el fragmento de acido nucleico definido anteriormente puede comprender el nucleotido mutado.

[0031] Como se describe en el presente documento, el fragmento de acido nucleico definido anteriormente puede ser seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7.

[0032] La presente solicitud tambien describe una planta, preferiblemente una planta Cruaferae, mas preferiblemente una planta del genero Brassica, y aun mas preferiblemente una planta de la especie Brassica napus, que tiene un mayor contenido de acido oleico, o una parte de dicha planta, en la que la planta comprende al menos una secuencia de acido nucleico mutada, tal como se define anteriormente, o un fragmento de acido nucleico, tal como se define anteriormente, que comprende el nucleotido mutado.

[0033] Tal como se pretende en el presente documento, una parte de la planta se refiere en particular a una celula, una semilla, un meristemo, una cal, una inflorescencia, un brote o una hoja de planta.

[0034] En una realizacion particular de la planta anteriormente definida, o parte de la planta, al menos una copia del

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gen fad2 que esta comprendido en el genoma de dicha planta esta representada por un acido nucleico mutado tal como se define anteriormente.

[0035] En otra realizacion particular de la planta anteriormente definida, o parte de la planta, cada copia del gen fad2 que esta comprendido en el genoma de dicha planta esta representada por un acido nucleico mutado tal como se define anteriormente.

[0036] La solicitud tambien describe la planta anteriormente definida, o parte de la planta, en la que:

- una copia del gen fad2A esta representada por la SEQ ID NO: 30 y una copia del gen fad2C esta representada por la SEQ ID NO: 28, o

- una copia del gen fad2A esta representada por la SEQ ID NO: 32, o

- una copia del gen fad2A esta representada por la SEQ ID NO: 26, o

- una copia del gen fad2A esta representada por la SEQ ID NO: 24.

[0037] Tal como se describe en el presente documento, la planta anteriormente definida, o parte de la planta, puede

ser una planta de la especie Brassica napus, en la que ambas copias del gen fad2A estan representadas de forma independiente por la sEq ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 32, y/o ambas copias del gen fad2C estan representadas por la SEQ ID NO: 28.

[0038] Tal como se describe en el presente documento, la planta anteriormente definida, o parte de la planta, puede seleccionarse del grupo constituido por:

- la planta depositada en la NCIMB (Aberdeen, Escocia) el 17 de mayo de 2006 bajo el numero de acceso 41403;

- la planta depositada en la NCIMB (Aberdeen, Escocia) el 17 de mayo de 2006 bajo el numero de acceso 41402;

- la planta depositada en la NCIMB (Aberdeen, Escocia) el 17 de mayo de 2006 bajo el numero de acceso 41400;

- la planta depositada en la NCIMB (Aberdeen, Escocia) el 17 de mayo de 2006 bajo el numero de acceso 41401.

[0039] La presente solicitud tambien describe el uso de un acido nucleico, tal como se define anteriormente, para la seleccion de plantas, o parte de las plantas, que tiene un mayor contenido de acido oleico.

[0040] La presente solicitud tambien describe un procedimiento para la seleccion de plantas que tienen un mayor contenido de acido oleico por mutagenesis, que comprende las siguientes etapas:

- someter una planta o parte de una planta a un tratamiento mutagenico,

- regenerar plantas, o parte de las plantas, a partir de dicha planta o parte de una planta tratadas,

- seleccionar a partir de las plantas regeneradas las que comprenden al menos una secuencia de acido nucleico mutada, tal como se define anteriormente, o un fragmento de acido nucleico, tal como se define anteriormente, que comprende el nucleotido mutado.

[0041] La mutagenesis puede llevarse a cabo segun procedimientos bien conocidos por el experto en la tecnica, tales como los descritos en McCallum et al. (2000). En particular, la mutagenesis se lleva a cabo usando metanosulfonato de etilo (EMS).

[0042] La regeneracion de plantas a partir de partes de la planta, tales como celulas, puede llevarse a cabo segun procedimientos bien conocidos por el experto en la tecnica, tales como los descritos en Herman (2005).

[0043] La presente solicitud tambien describe un procedimiento para la seleccion de plantas que tienen un mayor contenido de acido oleico mediante cruzamiento, que comprende las siguientes etapas:

- cruzar una planta, o parte de una planta, con una planta parental, o parte de una planta parental, que comprende al menos una secuencia de acido nucleico mutada, tal como se define anteriormente, o un fragmento de acido nucleico, tal como se define anteriormente, que comprende el nucleotido mutado,

- seleccionar a partir de las plantas de la progenie, o parte de las plantas, obtenidas mediante cruzamiento, las que comprenden al menos una secuencia de acido nucleico mutada, tal como se define anteriormente, o un fragmento de acido nucleico, tal como se define anteriormente, que comprende el nucleotido mutado.

[0044] El cruzamiento puede llevarse a cabo segun procedimientos bien conocidos por el experto en la tecnica, tales como los descritos en Gallais (1997).

[0045] Tal como se pretende en el presente documento, "progenie" se refiere en particular a las plantulas de las plantas cruzadas. Se describe un procedimiento para seleccionar plantas que tienen un mayor contenido de acido oleico mediante cruzamiento, la planta parental se obtiene segun el procedimiento anteriormente definido para la seleccion de plantas que tienen un mayor contenido de acido oleico mediante mutagenesis.

[0046] En un aspecto del procedimiento anteriormente definido para la seleccion de plantas que tienen un mayor contenido de acido oleico mediante cruzamiento, la planta parental, o parte de la planta parental, se selecciona del grupo constituido por:

- la planta depositada en la NCIMB (Aberdeen, Escocia) el 17 de mayo de 2006 bajo el numero de acceso 41403;

- la planta depositada en la NCIMB (Aberdeen, Escocia) el 17 de mayo de 2006 bajo el numero de acceso 41402;

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- la planta depositada en la NCIMB (Aberdeen, Escocia) el 17 de mayo de 2006 bajo el numero de acceso 41400;

- la planta depositada en la NCIMB (Aberdeen, Escocia) el 17 de mayo de 2006 bajo el numero de acceso 41401.

[0047] En particular, las siguientes tecnicas pueden usarse en la etapa de seleccion de los procedimientos de seleccion anteriormente definidos: tecnicas de PCR, tales como ensayo TaqMan® (PCR de tiempo real) o PCR especlfica de alelo, transferencia Northern o Southern, micro-array o macro-array de ADN, balizas moleculares, DASH (hibridacion dinamica especlfica de alelo), extension del cebador, ligadura de oligonucleotidos y escision por endonucleasa.

[0048] En una realizacion de los procedimientos definidos anteriormente para la seleccion de las plantas, la etapa de seleccion se realiza por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), preferiblemente con al menos de uno de los siguientes pares de cebadores:

- SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 ,

- SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15,

- SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17,

- SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 36,

- SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36,

- SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 13,

- SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 14,

- SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 36.

[0049] La presente solicitud tambien describe una planta obtenible segun los procedimientos anteriormente definidos para la seleccion de plantas.

[0050] La presente solicitud tambien describe un kit para la seleccion de plantas que tienen un alto contenido de acido oleico, que comprende:

- al menos una planta, o parte de una planta, que comprende al menos una secuencia de acido nucleico mutada, tal como se define anteriormente, o un fragmento de acido nucleico, tal como se define anteriormente, que comprende el nucleotido mutado,

- al menos un fragmento de acido nucleico, tal como se define anteriormente.

[0051] Tal como se describe en el presente documento, el kit definido anteriormente puede comprender:

• al menos una planta, o parte de una planta, seleccionada del grupo constituido por

- la planta depositada en la NCIMB (Aberdeen, Escocia) el 17 de mayo de 2006 bajo el numero de acceso 41403;

- la planta depositada en la NCIMB (Aberdeen, Escocia) el 17 de mayo de 2006 bajo el numero de acceso 41402;

- la planta depositada en la NCIMB (Aberdeen, Escocia) el 17 de mayo de 2006 bajo el numero de acceso 41400;

- la planta depositada en la NCIMB (Aberdeen, Escocia) el 17 de mayo de 2006 bajo el numero de acceso 41401;

• al menos uno de los siguientes pares de cebadores:

- SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13,

- SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15,

- SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17.

- SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 36,

- SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36,

- SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 13,

- SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 14,

- SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 36.

[0052] La presente solicitud tambien describe una FAD2 mutada de la planta codificada por una secuencia de acido nucleico mutada, tal como se define anteriormente.

[0053] La presente solicitud tambien describe un acido nucleico seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO: 39.

[0054] La presente solicitud tambien describe a un anticuerpo especlfico para una enzima delta-12 oleato desaturasa (FAD2) mutada de la planta, tal como se define anteriormente.

[0055] Tal como se pretende en el presente documento, "anticuerpo" tambien abarca fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, F(ab)'2, o fragmentos scFv. Dicho anticuerpo se puede preparar facilmente por el experto en la tecnica a partir de las enzimas delta-12 oleato desaturasa mutadas segun la invencion mediante los siguientes procedimientos estandar. En una realizacion preferida de la invencion, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos segun la invencion son especialmente utiles para detectar las enzimas delta-12 oleato desaturasa mutadas segun la invencion, en particular en los extractos celulares de las plantas.

Breve descripcion de los dibujos

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La figura 1 muestra secuencias de nucleotidos genomicas parciales del gen fad2A (gen fad2 del genoma de B. rapa) clonadas de lineas “LLR1” (lineas “LLR1#S007” y “LLR1#PR-2601”) y lineas “HOR1” (lmeas “HOR1#S005”, “HOR1#B005” y “HOR1#NPZ-12”). La parte superior es la secuencia "LLr1" (SEQ ID NO: 1) y la parte inferior es la secuencia "HOR1" (SEQ ID NO: 3). La flecha indica una mutacion de un unico nucleotido de C a T, que da como resultado una modificacion de aminoacido. Los cebadores directo e inverso para el marcador especifico de alelo mutante basado en PCR estan en negrita y subrayados.

La figura 2 muestra secuencias de nucleotidos genomicas parciales del gen fad2C (gen fad2 del genoma de B. oleracea) clonadas de lineas “LLR1” (lineas “LLR1#S007” y “LLR1#PR-2601”) y lineas “HOR1” (lineas “HOR1#S005”, “HOR1#B005” y “HOR1#NPZ-12”). La parte superior es la secuencia "LLR1" (SEQ ID NO: 2) y la parte inferior es la secuencia "HOR1" (SEQ ID NO: 4). La flecha indica una mutacion de un unico nucleotido de C a T, que da como resultado una modificacion de aminoacido. Los cebadores directo e inverso para el marcador especifico de alelo mutante basado en PCR estan en negrita y subrayados.

La figura 3 muestra secuencias de nucleotidos genomicas parciales del gen fad2A (gen fad2 del genoma de B. rapa) clonadas de lineas “LLR1” (lineas “LLR1#S007” y “LLR1#PR-2601”) y lineas “hOr2”. La parte superior es la secuencia "LLR1" (SEQ ID NO: 1) y la parte inferior es la secuencia "HOR2" (SEQ ID NO: 5). La flecha indica una mutacion de un unico nucleotido de C a T, que da como resultado una modificacion de aminoacido. Los cebadores directo e inverso para el marcador especifico de alelo mutante basado en PCR estan en negrita y subrayados.

La figura 4 muestra secuencias de nucleotidos genomicas parciales del gen fad2A (gen fad2 del genoma de B. rapa) clonadas de lineas “LLR1” (lineas “LLR1#S007” y “LLR1#PR-2601”) y lineas “hOr3”. La parte superior es la secuencia "LLR1" (SEQ ID NO: 1) y la parte inferior es la secuencia "HOR3" (SEQ ID NO: 6). La flecha indica una mutacion de un unico nucleotido de C a T, que da como resultado un codon de parade (TAG) sombreado en gris. Los cebadores directo e inverso para el marcador especifico de alelo mutante basado en PCR estan en negrita y subrayados.

La figura 5 muestra secuencias de nucleotidos genomicas parciales del gen fad2A (gen fad2 del genoma de B. rapa) clonadas de lineas “LLR1” (lineas “LLR1#S007” y “LLR1#PR-2601”) y lineas “hOr4”. La parte superior es la secuencia "LLR1" (SEQ ID NO: 1) y la parte inferior es la secuencia "HOR4" (SEQ ID NO: 7). La flecha indica una mutacion de un unico nucleotido de G a A, que da como resultado un codon de parade (TAG) sombreado en gris. Los cebadores directo e inverso para el marcador especifico de alelo mutante basado en PCR estan en negrita y subrayados.

La figura 6 proporciona secuencias de aminoacidos de los genes fad2A, degeneradas a partir de la secuencia de nucleotidos genomica clonada de lineas “LLR1”, “HOR1”, un gen fad2 de B. rapa publicado y un gen fad2 de B. napus publicado. La flecha indica la posicion de la sustitucion de aminoacido (P a S) que resulta de una mutacion de un unico nucleotido (C a T) en la linea “HOR1”.

La figura 7 proporciona secuencias de aminoacidos de los genes fad2C, degeneradas a partir de la secuencia de nucleotidos genomica clonada de lineas “LLR1”, lineas “HOR1”, un gen fad2 de B. oleracea publicado y un gen fad2 de B. napus publicado. La flecha indica la posicion de la sustitucion de aminoacido (P a S) que resulta de una mutacion de un unico nucleotido (C a T) en la linea “HOR1”.

La figura 8 proporciona secuencias de aminoacidos de los genes fad2A, degeneradas a partir de la secuencia de nucleotidos genomica clonada de lineas “LLR1”, lineas “HOR2”, un gen fad2 de B. rapa publicado y un gen fad2 de B. napus publicado. La flecha indica la posicion de la sustitucion de aminoacidos (T a M) que resulta de una mutacion de un unico nucleotido (C a T) en la linea “HOR2”.

La figura 9 proporciona secuencias de aminoacidos de los genes fad2A, degeneradas a partir de la secuencia de nucleotidos genomica clonada de lineas “LLR1”, lineas “HOR3”, un gen fad2 de B. rapa publicado y un gen fad2 de B. rapa publicado. La flecha indica la posicion del codon de parada resultante de una mutacion de un unico nucleotido (C a T) en la linea “HOR3”.

La figura 10 proporciona secuencias de aminoacidos de los genes fad2A, degeneradas a partir de la secuencia de nucleotidos genomica clonada de lineas “LLR1”, lineas “HOR4”, un gen fad2 de B. rapa publicado y un gen fad2 de B. rapa publicado. La flecha indica la posicion del codon de terminacion resultante de una mutacion de un unico nucleotido (G a A) en la linea “HOR4”.

La figura 1l proporciona resultados de electroforesis de productos de PCR amplificados a partir de marcadores mutantes especificos de alelo para el gen fad2A (194 pb) y del gen fad3 (control de PCR interno, 57 pb) de una de las 6 poblaciones de DH. M, escalera de ADN de 25 pb; carril 1, “LLR1#S007”; carril 2, “HOR1#S005”; carril 3-23, lineas DH del cruzamiento de “LLR1#S007” y “HOR1#S005”; carril 24: control del agua. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 2,5% y se tineron con bromuro de etidio.

La figura 12 proporciona resultados de electroforesis de productos de PCR amplificados a partir de marcadores mutantes especificos de alelo para el gen fad2C (123 pb) y del gen fad3 (control de PCR interno, 57 pb) de una de las 6 poblaciones de DH. M, escalera de ADN de 25 pb; carril 1, “LLR1#S007”; carril 2, “HOR1#S005”; carril 3-23, lineas DH del cruzamiento de “LLR1#S007” y “HOR1#S005”; carril 24: control del agua. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 2,5% y se tineron con bromuro de etidio.

La figura 13 proporciona un histograma que muestra la correlacion de los marcadores especificos de alelo mutantes y el contenido de acido oleico en ensayos de campo e invernadero.

La figura 14 proporciona una alineacion de secuencias de FAD2 de diferentes especies de Brassica y de Arabidopsis thaliana. Las especies, numeros de acceso y nombres communes se indicant a continuacion:

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Genero y especie Numero de acceso de secuencia Nombre comun

1

Brassica rapa CAG26981 Nabo salvaje

2

Brassica rapa CAD30827 Nabo salvaje

3

Brassica napus AAS92240 Semilla de colza

4

Brassica rapa AAC99622 Nabo salvaje

5

Brassica napus AAT02411 Semilla de colza

6

Brassica napus AAF78778 Semilla de colza

7

Brassica oleracea AAF14564 Col

8

Brassica carinata AAD19742 Mostaza etlope

9

Arabidopsis thaliana NP8187819 Arabis

EJEMPLO

Material y procedimientos

1. Material Vegetal

[0057] En este estudio se utilizaron llneas de semillas de colza de invierno “LLR1#S007” (tipo salvaje), “LLR1#PR- 2601” (tipo salvaje), “HOR1#S005” (de tipo mutante), “HOR1#B005” (de tipo mutante), “HOR1#NPZ-12” (de tipo mutante), “HOR2” (de tipo mutante), “HOR3” (de tipo mutante) y “HOR4” (de tipo mutante) para la clonacion de alelos de fad2 (acido graso desaturasa-2) .

[0058] “HOR1#S005”, “HOR1#B005” y “HOR1#NPZ-12” se han obtenido mediante el cruzamiento de una llnea mutante con metanosulfonato de etilo (EMS) de “HOR1” con tres llneas de semillas de colza clasicos (S005, B005 y NPZ-12); estas tres llneas mutantes tienen un contenido de acido oleico en aproximadamente 80 a 90%.

[0059] “LLR1#S007” y “LLR1#PR-2601” son llneas de semilla de colza con contenido de acido oleico a aproximadamente 60%.

[0060] “HOR2”, “HOR3” y “HOR4” son tres llneas mutantes con EMS mas independientes con contenido de acido oleico a aproximadamente 75 a 85%.

[0061] Se desarrollaron seis poblaciones de dobles haploides (DH) mediante cultivo de microsporas de plantas F1 de cruzamientos entre (Coventry et al., 1988):

(1) las llneas de semilla de colza “LLR1#S007” y “HOR1#S005”,

(2) las llneas de semilla de colza “LLR1#PR-2601” y “HOR1#NPZ-12”,

(3) las llneas de semilla de colza “LLR1#S007” y “HOR1#B005”,

(4) las llneas de semilla de colza “LLR1#S007” y “HOR1#NPZ-12”,

(5) las llneas de semilla de colza “LLR1#PR-2601” y “HOR1#B005”,

(6) las llneas de semilla de colza “LLR1#PR-2601” y “HOR1#S005”.

[0062] Cada poblacion de DH comprendla 64, 32, 115, 72, 63 y 53 llneas respectivamente. Un analisis de acidos grasos completo de las semillas de las llneas DH y sus respectivos padres se implemento mediante el uso de cromatografla de gases. Todas las 399 llneas de DH se utilizaron para analisis de marcador y estadlstico. No se ha producido poblacion de DH con las llneas mutantes “HOR2”, “HOR3” y “HOR4”.

2. Extraccion y cuantificacion de ADN genomico

[0063] Se extrajo el ADN de ambas llneas parentales y 399 llneas DH de hojas de plantas de 2 semanas de vida cultivadas en el campo utilizando un procedimiento basado en CTAB modificado de Dellaporta et al. (1983). Se utilizo la absorbancia a 260 nm para la cuantificacion de ADN. En una placa de microtitulacion para UV, se anadieron 195 ml de agua ultrapura esteril en cada pocillo y despues se anadieron 5 ml de cada muestra de ADN. A continuacion, la placa se agito brevemente y se leyo usando el espectrofotometro de microplacas Spectra Max M2 de Molecular Devices.

3. Amplificacion por PCR

[0064] Las reacciones de amplificacion por PCR utilizados para la clonacion de alelos de fad2 contenlan 3-4 ng/ml de ADN genomico, 1,25 mM de cada cebador, 2,5 mM de MgCh, 0,3 mM de cada dNTP, 1 X tampon PCR y 0,12U/ml de Taq ADN polimerasa. Las amplificaciones se realizaron en un sistema PCR PTC-225 MJResearch programado para

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30 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 s a 60°C, 30 s a 72°C y terminando con 5 min a 72°C.

[0065] Para el genotipado de las 399 DH, se ha desarrollado un marcador interno de PCR para controlar la eficiencia de la PCR. Se han disenado un par de cebadores (SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11) en el gen fad3 para amplificar un fragmento de 57 pb. Las reacciones de amplificacion por PCR utilizadas para el genotipado de las 399 llneas de DH contenlan 3-4 ng/pl de ADN genomico, 0,625 pM de cada cebador (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11), 1,5 mM de MgCl2, 0,3 mM de cada dNTP, 1 X tampon PCR y 0,06 U/pl de Taq ADN polimerasa. Las amplificaciones se realizaron en un sistema PCR PTC-225 MJResearch programado para 30 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 60°C, 10 segundos a 72°C y terminando con 5 min a 72°C.

4. Clonacion de alelos de fad2

[0066] Los fragmentos fad2 de las llneas parentales “LLR1#S007”, “LLR1#PR-2601”, “HOR1#S005”, “HOR1#B005”, “HOR1#NPZ-12”, “HOR2”, “HOR3” y “HOR4” se amplificaron mediante el uso de cebadores disenados con el software Primer 3 en la secuencia de genes fad2 de acceso de GenBank AY577313. Los fragmentos fad2 amplificados a partir de cada uno de los parentales por los cebadores FAD2BnF1 y FAD2BnR1 se ligaron al vector de clonacion pGEM®-T Easy utilizando un kit pGEM®-T Easy Vector System (Promega Corp., Madison, EE.UU.) segun las instrucciones del fabricante. Los productos ligados se transformaron en celulas competentes y las celulas se emplacaron en placas con LB-agar que contenlan ampicilina, X-GAL y IPTG para permitir la seleccion blanco/azul. Las colonias blancas en las placas de transformation se seleccionaron y se verifico la identification de la productos de la PCR clonados mediante PCR usando cebadores directo e inverso M13 universales que flanqueaban el fragmento de inserto. La PCR revelo el fragmento de inserto del tamano esperado. Los clones positivos que contenlan el inserto se secuenciaron mediante Genome Express (Meylan, Francia).

5. Identificacion de mutaciones en los genes fad2

[0067] Haciendo referencia a las figuras 1-5, se utilizaron los cebadores disenados con el software Primer 3 en la secuencia de genes fad2 de acceso de GenBank AY577313 para amplificar fragmentos de ADN genomico del gen fad2 de las llneas de B. napus “LLR1#S007”, “LLR1#PR-2601”, “HOR1#S005”, “HOR1#B005”, “HOR1#NPZ-12”, “HOR2”, “HOR3” y “HOR4”. El par de cebadores FAD2BnF1: AGTGTCTCCTCCCTCCAAAAA (SEQ ID NO: 8) y FAD2BnR1: TCTTCTCACCTTGCCTGTCC (SEQ ID NO: 9) amplifico un fragmento fad2 de la misma longitud (1.100 pb) a partir de cada uno de los seis parentales Los fragmentos amplificados se clonaron a continuation y se secuenciaron para investigar las diferencias en la secuencia del gen fad2 entre los cinco parentales.

6. Analisis de secuencias y de datos

[0068] Se analizaron las secuencias y se alinearon utilizando el software Clustal W (Kyoto University Bioinformatics Center) y Genedoc (Nicholas et al., 1997). La asociacion de ligamiento entre los marcadores y el rasgo de alto contenido de oleico se determino mediante analisis de la prueba t.

Resultados

[0069] En este estudio, se secuenciaron 7 clones de “LLR1” (“LLR1#S007” y “LLR1#PR-2601”), 12 clones de “HOR1” (“HOR1#S005”, “HOR1#B005” y “HOR1#NPZ-12”), 12 clones de “HOR2”, 20 clones de “HOR3” y 20 clones de “HOR4”. Se identifico la alineacion de la secuencia de estos clones con secuencias fad2 de B. rapa y B. oleracea encontradas en bases de datos publicas:

(1) dos genes fad2 procedentes de B. rapa (fad2A) y B. oleracea (fad2C) para las llneas “HOR1”,

(2) un gen fad2 procedente de B. rapa (fad2A) para la llnea “HOR2”,

(3) un gen fad2 procedente de B. rapa (fad2A) para la llnea “HOR3” y

(4) un gen fad2 procedente de B. rapa (fad2A) para la llnea “HOR4”.

[0070] Para las llneas “HOR1”, el analisis de la secuencia identifico una mutation de un unico nucleotido en cada

gen fad2.

[0071] La mutacion de un unico nucleotido en el gen fad2A, C a T, en la position 752 del fragmento amplificado (es decir, la posicion 775 en el gen fad2A de longitud completa) aparecio en la secuencia del gen fad2A de todos los clones de “HOR1” (“HOR1#S005”, “HOR1#B005” y “HOR1#NPZ-12”) (SEQ ID NO: 3), pero no los 'clones “LLR1” (“LLR1#S007” y “LLR1#PR-2601”) (SEQ. ID NO: 1) (vease la figura 1).

[0072] La mutacion de un unico nucleotido en el gen fad2C, C a T, en la posicion 623 del fragmento amplificado (es decir, la posicion 646 en el gen fad2C de longitud completa) aparecio en la secuencia del gen fad2C de todos los clones de “HOR1” (“HOR1#S005”, “HOR1#BO05” y “HOR1#NPZ-12”) (SEQ ID NO: 4), pero no los clones “LLR1” (“LLR1#S007” y “LLR1#PR-2601”) (SEQ . ID NO: 2) (vease la figura 2).

[0073] El analisis adicional indico que estas mutaciones de un unico nucleotido aparecieron en la secuencia de codification de ambos genes fad2A y fad2C (veanse las figuras 6-7). Como se muestra ademas en las figuras 1-2 y

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las figuras 6-7, las mutaciones de C a T en los genes fad2A y fad2C aparecieron en el primer nucleotido de un codon que daba como resultado la sustitucion de una prolina (P) a serina (S) en el aminoacido 259 y 216, respectivamente. Despues de anotacion de la protelna usando TMHMM server v. 2.0 (prediccion de dominios transmembrana, dominios extracelulares e intracelulares), la sustitucion de prolina (P) a serina (S) en la protelna FAD2A ha sido localizada en un dominio extracelular, mientras que la sustitucion de prolina (P) a serina (S) en la protelna FAD2C se ha encontrado en un dominio transmembrana. La prolina es un aminoacido no polar que tiende a residir en el centro de la protelna, mientras que la serina es un aminoacido polar y relativamente hidrofobo que tiende a estar presente en la superficie de una protelna. Estas propiedades diferentes podrlan conducir a una modificacion estructural de las protelnas FAD2A y FAD2C resultantes en una delta 12 oleato desaturasa no activa.

[0074] Para la llnea de “HOR2”, el analisis adicional identifico una mutacion de un unico nucleotido en el gen fad2A. La mutacion de un unico nucleotido en el gen fad2A, C a T, en la posicion 804 del fragmento amplificado (es decir, la posicion 827 en el gen fad2A de longitud completa) aparecio en la secuencia del gen fad2A de todos los clones de “HOR2” (SEQ ID NO: 5), pero no los clones de “LLR1” (“LLR1#S007” y “LLR1#PR-2601”) (SEQ ID NO: 1.) (vease la figura 3). El analisis adicional indico que esta mutacion de un unico nucleotido aparecio en la secuencia de codificacion del gen fad2A (vease la figura 8). Como se muestra ademas en la figura 3 y la figura 8, la mutacion de C a T en el gen fad2A aparecio en el segundo nucleotido de un codon que daba como resultado la sustitucion de una treonina (T) a metionina (M) en el aminoacido 276. Despues de anotacion de la protelna usando TMHMM server v. 2.0 (prediccion de dominios transmembrana, dominios extracelulares e intracelulares), la sustitucion de treonina (T) a metionina (M) en la protelna FAD2A ha sido localizada en un dominio extracelular. La metionina (M) es un aminoacido no polar que tiende a residir en el centro de la protelna, mientras que la treonina (T) es un aminoacido polar y relativamente hidrofobo que tiende a estar presente en la superficie de una protelna. Estas propiedades diferentes podrlan conducir a una modificacion estructural de las protelna FAD2A resultante en una delta 12 oleato desaturasa no activa.

[0075] Para la llnea de “HOR3”, el analisis adicional identifico una mutacion de un unico nucleotido en el gen fad2A. La mutacion de un unico nucleotido en el gen fad2A, C a T, en la posicion 323 del fragmento amplificado (es decir, la posicion 346 en el gen fad2A de longitud completa) aparecio en la secuencia del gen fad2A de todos los clones de “HOR3” (SEQ ID NO: 6), pero no los clones de “LLR1” (“LLR1#S007” y “LLR1#PR-2601”) (SEQ ID NO: 1.) (vease la figura 4). El analisis adicional indico que esta mutacion de un unico nucleotido aparecio en la secuencia de codificacion del gen fad2A (vease la figura 9). Como se muestra ademas en la figura 4 y la figura 9, la mutacion de C a T en el gen fad2A aparecio en el primer nucleotido de un codon que creaba un codon de parada (TAG) que causa la termination temprana de la cadena del polipeptido durante la traduction. El codon de parada da lugar a la incorporation de solamente 115 aminoacidos en el polipeptido en lugar de los 384 aminoacidos del polipeptido de longitud completa.

[0076] Para la llnea de “HOR4”, el analisis adicional identifico una mutacion de un unico nucleotido en el gen fad2A. La mutacion de un unico nucleotido en el gen fad2A, G a A, en la posicion 246 del fragmento amplificado (es decir, la posicion 269 en el gen fad2A de longitud completa) aparecio en la secuencia del gen fad2A de todos los clones de “HOR4” (SEQ ID NO: 7), pero no los clones de “LLR1” (“LLR1#S007” y “LLR1#PR-2601”) (SEQ ID NO: 1.) (vease la figura 5). El analisis adicional indico que esta mutacion de un unico nucleotido aparecio en la secuencia de codificacion del gen fad2A (vease la figura 10). Como se muestra ademas en la figura 5 y la figura 10, la mutacion de G a A en el gen fad2A aparecio en el primer nucleotido de un codon que creaba un codon de parada (TAG) que causa la terminacion temprana de la cadena del polipeptido durante la traduccion. El codon de parada da lugar a la incorporacion de solamente 89 aminoacidos en el polipeptido en lugar de los 384 aminoacidos del polipeptido de longitud completa.

[0077] Se desarrollaron pruebas moleculares para el genotipado de las 6 poblaciones de dobles haploides. Para las pruebas dominantes, se ha desarrollado un marcador interno de PCR para controlar la eficiencia de la PCR. Se han disenado un par de cebadores (SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11) en el gen fad3 para amplificar un fragmento a 57 pb. Se han utilizado los cebadores directos e inversos de PCR (SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15, respectivamente) para la detection de la mutacion C752T para las llneas de genotipado DH del cruzamiento de “LLR1#S007” y “HOR1#S005” (vease la figura 11), el cruzamiento de “LLR1#PR-2601” y “HOR1#NPZ-12” (datos no mostrados), el cruzamiento de “LLR1#S007” y “hOr1#B005” (datos no mostrados), el cruzamiento de “LLR1#S007” y “HOR1#NPZ- 12” (datos no mostrados), el cruzamiento de “LLR1#PR-2601” y “HOR1#B005” (datos no mostrados) y el cruzamiento de “LLR1#PR-2601” y “HOR1#S005” (datos no mostrados). Se han utilizado los cebadores directos e inversos de PCR (SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13, respectivamente) para la deteccion de la mutacion C623T para el genotipado de las llneas DH del cruzamiento de “LLR1#S007” y “HOR1#S005” (vease la figura 12), el cruzamiento de “LLR1#PR-2601” y “HOR1#NPZ-12” (datos no mostrados), el cruzamiento de “LLR1#S007” y “HOR1#B005” (datos no mostrados), el cruzamiento de “LLR1#S007” y “HOR1#NPZ-12” (datos no mostrados), el cruzamiento de “LLR1#PR-2601” y “HOR1#B005” (datos no mostrados) y el cruzamiento de “LLR1#PR-2601” y “HOR1#S005” (datos no mostrados). Se han utilizado los cebadores directos e inversos de PCR (SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17, respectivamente) para la deteccion de la mutacion C804T para las pruebas de “HOR2” y llneas de tipo salvaje (datos no mostrados).

[0078] Ademas, se han utilizado cebadores directo e inverso de PCR para las pruebas de “HOR3” (SEQ ID NO: 34 y

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SEQ ID NO: 36), “HOR4” (SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36) y llneas de tipo salvaje.

[0079] Despues del genotipado, todas las 399 llneas DH, se encontro que la distribucion de alelos fue altamente correlacionada con C18:1 elevado (vease la figura 13, Tabla 1).

Tabla 1. Correlacion de los marcadores especlficos de alelo mutante y el contenido de acido oleico en ensayos de campo y de invernadero de diferentes categorlas de llneas DH.

Numero de llneas ensayadas invernadero/campo Contenido promedio de acido oleico (%)

Invernadero

Campo

Tipo salvaje

119/133 63,1 ± 5,8 62,6 ± 3,0

Con marcador FAD2 1C “HOR1” solo

83/102 66,2 ± 5,5 66,3 ± 3,0

Con marcador FAD2 2A “HOR1” solo

66/79 71,5 ± 4,2 71 ± 3,3

Con marcador FAD2 1C “HOR1” + FAD2 2A “HOR1”

57/67 77,1 ± 3,1 77,7 ± 2,4

[0080] Ademas, los cebadores de PCR se han disenado con el fin de proporcionar marcadores codominantes para determinar si las mutaciones se encuentran en solo uno (heterocigoto) o en los dos alelos (homocigoto) de un gen fad2.

[0081] Para la mutacion C646 (que se encuentra en “HOR1”) se utilizan los siguientes cebadores de PCR: cebador directo 5' ATT TCC ACC CCA ACC GCT 3' (SEQ ID NO: 37)

cebador inverso 5' AGG CCA CTC CCT GCG 3' (SEQ ID NO: 13)

[0082] Aprovechando la introduccion de un sitio de restriccion BsrBI por el cebador directo en el fragmento amplificado correspondiente al gen de tipo salvaje fad2C, el producto de amplificacion por PCR se corta por la enzima BsrBI, que produce el siguiente perfil de restriccion diferenciado:

- homocigoto de tipo salvaje: 16 pb + 108 pb

- homocigoto mutado: 124 pb

- heterocigoto: 16 pb + 108 pb + 124 pb

[0083] Para la mutacion C775T (que se encuentra en “HOR1”) se utilizan los siguientes cebadores de PCR:

- cebador directo 5' TCT ACC GCT ACG CTG CTG TC 3' (SEQ ID NO: 38)

- cebador inverso 5' GTG CGT GTC CGT GAT ATT GT 3' (SEQ ID NO: 15)

[0084] Aprovechando la supresion de un sitio de restriccion Mn/I en el gen fad2A mutado que alberga la mutacion C775T, el producto de amplificacion PCR se corta por la enziam Mn/I, que produce el siguiente perfil de restriccion diferenciado:

- homocigoto de tipo salvaje: 14 pb + 26 pb + 41 pb + 66 pb + 83 pb

- homocigoto mutado: 14 pb + 41 pb + 83 pb + 92 pb

- heterocigoto: 14 pb + 26 pb + 41 pb + 66 pb + 83 pb + 92 pb

[0085] Para las mutaciones C346T y G269A (que se encuentran, respectivamente, en “HOR3” y “HOR4”) se utilizan los siguientes cebadores de PCR:

- cebador directo 5' AGT GTC TCC TCC CTC CAA AAA 3' (SEQ ID NO: 39)

- cebador inverso 5' ATC GAG GCA ACT CCT TGG A 3' (SEQ ID NO: 36)

[0086] El producto de amplificacion por PCR se corta por la enzima BfaI, que produce el siguiente perfil de restriccion diferenciado:

• C346T

- homocigoto de tipo salvaje: 732bp

- homocigoto mutado: 410bp + 322bp

- heterocigoto: 732bp + 410bp + 322bp

• G269A

- homocigoto de tipo salvaje: 732bp

- homocigoto mutado: 244bp + 488bp

- heterocigoto: 732bp + 244bp + 488bp

SEQ ID NO:

Descripcion

1

secuencia parcial de nucleotidos parcial de “LLR1” de fad2A

2

secuencia parcial de nucleotidos parcial de “LLR1” de fad2C

5

10

15

20

25

3

secuencia parcial de nucleotidos parcial de “HOR1” de fad2A

4

secuencia parcial de nucleotidos parcial de “HOR1” de fad2C

5

secuencia parcial de nucleotidos parcial de “HOR2” de fad2A

6

secuencia parcial de nucleotidos parcial de “HOR3” de fad2A

7

secuencia parcial de nucleotidos parcial de “HOR4” de fad2A

8

cebador de PCR para amplificar un fragmento de fad2 de 1.100 pb

9

cebador de PCR para amplificar un fragmento de fad2 de 1.100 pb

10

cebador de PCR para amplificar un fragmento de fad3 de 57 pb

11

cebador de PCR para amplificar un fragmento de fad3 de 57 pb

12

Cebador de PCR directo para la deteccion de la mutacion C646T (“HOR1”)

13

Cebador de PCR inverso para la deteccion de la mutacion C646T (“HOR1”)

14

Cebador de PCR directo para la deteccion de la mutacion C775T (“HOR1”)

15

Cebador de PCR inverso para la deteccion de la mutacion C775T (“HOR1”)

16

Cebador de PCR directo para la deteccion de la mutacion C827T (“HOR2”)

17

Cebador de PCR inverso para la deteccion de la mutacion C827T (“HOR2”)

18

Secuencia de nucleotidos de fad2A de B. napus de tipo salvaie de eiemplo

19

Secuencia de protelna FAD2A de B. napus de tipo salvaie de eiemplo

20

Secuencia de nucleotidos de fad2C de B. napus de tipo salvaie de eiemplo

21

Secuencia de protelna FAD2C de B. napus de tipo salvaie de eiemplo

22

Secuencia de consenso para fad2 mutado

23

Secuencia de consenso para FAD2 mutada

24

Secuencia de nucleotidos para fad2 mutado con G269A

25

Secuencia de protelna para FAD2 mutada con W90STOP

26

Secuencia de nucleotidos para fad2 mutado con C346T

27

Secuencia de protelna para FAD2 mutada con Q116STOP

28

Secuencia de nucleotidos para fad2 mutado con C646T

29

Secuencia de protelna para FAD2 mutada con P216S

30

Secuencia de nucleotidos para fad2 mutado con C775T

31

Secuencia de protelna para FAD2 mutada con P259S

32

Secuencia de nucleotidos para fad2 mutado con C827T

33

Secuencia de protelna para FAD2 mutada con T276M

34

Cebador de PCR directo para la deteccion de la mutacion C346T (“HOR3”)

35

Cebador de PCR directo para la deteccion de la mutacion G269A (“HOR4”)

36

Cebador de PCR inverso para la deteccion de la mutacion C346T o G269A (“HOR3/4”)

37

Cebador de PCR directo para la deteccion de la mutacion C646T (codominante)

38

Cebador de PCR directo para la deteccion de la mutacion C775T (codominante)

39

Cebador de PCR directo para la deteccion de la mutacion C346T o G269A (codominante)

Referencias

[0087]

Bonanome A, Grundy SM. Effect of dietary stearic acid on plasma cholesterol and lipoprotein levels. N Engl J Med. 1988 May 12; 318(19):1244-8.

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Debruyne I. Soybean Oil Processing: Quality Criteria and Flavor Reversion. Oil Mill Gazetteer. Volumen 110, Julio 2004.

McCallum, C.M., Comai, L., Greene, E.A., and Henikoff, S. (2000). Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiol. 123, 439-442.

Herman E.B. (2005). Media and Techniques for Growth, Regeneration and Storage 2002-2005. Volumen 9 de Recent Advances in Plant Tissue Culture. Agricell Report.

Gallais A. (1997). Theorie de la selection en amelioration des plantes. Editions Masson.

Coventry,J; L Kott and W Beversdorf: 1988. Manual for microspore culture of Brassica napus. University of Guelph Technical Bulletin, OAC Publication 0489

Dellaporta SL, Wood J, and Hicks JB (1983) A plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol Biol Rep 1: 19-21. Nicholas K.B., Nicholas Jr H.B. & Deerfield II D.W. (1997) GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation.
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Stan Skrypetz, 2005. Le Bulletin bimensuel. Agriculture et Agroalimentaire Canada. Volumen 18 Numero 17. Konieczny A, Ausubel FM (1993) A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotypespecific

5

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65

LISTADO DE SECUENCIAS

[0088]

<110> INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE (INRA)

<120> MARCADORES GENETICOS PARA

EL ALTO CONTENIDO DE ACIDO OLEICO

<130> BET

07P0644

<160> 39

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1 <211> 1100 <212> ADN <213> Brassica napus

<400> 1 agtgtctcct

ccctccaaaa agtctgaaac cgacaacatc aagcgcgtac cctgcgagac

accgcccttc

actgtcggag aactcaagaa agcaatccca ccgcactgtt tcaaacgctc

gatccctcgc

tctttctcct acctcatctg ggacatcatc atagcctcct gcttctacta

cgtcgccacc

acttacttcc ctctcctccc tcaccctctc tcctacttcg cctggcctct

ctactgggcc

tgccagggct gcgtcctaac cggcgtctgg gtcatagccc acgagtgcgg

ccaccacgcc

ttcagcgact accagtggct ggacgacacc gtcggcctca tcttccactc

cttcctcctc

gtcccttact tctcctggaa gtacagtcat cgacgccacc attccaacac

tggctccctc

gagagagacg aagtgtttgt ccccaagaag aagtcagaca tcaagtggta

cggcaagtac

ctcaacaacc ctttgggacg caccgtgatg ttaacggttc agttcactct

cggctggcct

ttgtacttag ccttcaacgt ctcggggaga ccttacgacg gcggcttcgc

ttgccatttc

caccccaacg ctcccatcta caacgaccgt gagcgtctcc agatatacat

ctccgacgct

ggcatcctcg ccgtctgcta cggtctctac cgctacgctg ctgtccaagg

agttgcctct

atggtctgct tctacggagt tcctcttctg attgtcaacg ggttcttagt

tttgatcact

tacttgcagc acacgcatcc ttccctgcct cactatgact cgtctgagtg

ggattggttg

aggggagctt tggccaccgt tgacagagac tacggaatct tgaacaaggt

cttccacaat

atcacggaca cgcacgtggc gcatcacctg ttctcgacca tgccgcatta

tcatgcgatg

gaagctacga aggcgataaa gccgatactg ggagagtatt atcagttcga

tgggacgccg

gtggttaagg cgatgtggag ggaggcgaag gagtgtatct atgtggaacc

ggacaggcaa

ggtgagaaga

<210> 2 <211> 1100 <212> ADN <213> Brassica napus

<400> 2 agtgtctcct

ccctccaaaa agtctgaaac cgacaccatc aagcgcgtac cctgcgagac

5

10

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30

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accgcccttc

actgtcggag aactcaagaa agcaatccca ccgcactgtt tcaaacgctc 120

gatccctcgc

tctttctcct acctcatctg ggacatcatc atagcctcct gcttctacta 180

cgtcgccacc

acttacttcc ctctcctccc tcaccctctc tcctacttcg cctggcctct 240

ctactgggcc

tgccaagggt gcgtcctaac cggcgtctgg gtcatagccc acgagtgcgg 300

ccaccacgcc

ttcagcgact accagtggct tgacgacacc gtcggtctca tcttccactc 360

cttcctcctc

gtcccttact tctcctggaa gtacagtcat cgacgccacc attccaacac 420

tggctccctc

gagagagacg aagtgtttgt ccccaagaag aagtcagaca tcaagtggta 480

cggcaagtac

ctcaacaacc ctttgggacg caccgtgatg ttaacggttc agttcactct 540

cggctggccg

ttgtacttag ccttcaacgt ctcgggaaga ccttacgacg gcggcttcgc 600

ttgccatttc

caccccaacg ctcccatcta caacgaccgc gagcgtctcc agatatacat 660

ctccgacgct

ggcatcctcg ccgtctgcta cggtctcttc cgttacgccg ccgcgcaggg 720

agtggcctcg

atggtctgct tctacggagt cccgcttctg attgtcaatg gtttcctcgt 780

gttgatcact

tacttgcagc acacgcatcc ttccctgcct cactacgatt cgtccgagtg 840

ggattggttg

aggggagctt tggctaccgt tgacagagac tacggaatct tgaacaaggt 900

cttccacaat

attaccgaca cgcacgtggc gcatcatctg ttctccacga tgccgcatta 960

tcacgcgatg

gaagctacca aggcgataaa gccgatactg ggagagtatt atcagttcga 1020

tgggacgccg

gtggttaagg cgatgtggag ggaggcgaag gagtgtatct atgtggaacc 1080

ggacaggcaa

ggtgagaaga 1100

<210> 3 <211> 1100 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Secuencia parcial de mutante de fad2A de Brassica napus (HOR1)

<400> 3 agtgtctcct

ccctccaaaa agtctgaaac cgacaacatc aagcgcgtac cctgcgagac 60

accgcccttc

actgtcggag aactcaagaa agcaatccca ccgcactgtt tcaaacgctc 120

gatccctcgc

tctttctcct acctcatctg ggacatcatc atagcctcct gcttctacta 180

cgtcgccacc

acttacttcc ctctcctccc tcaccctctc tcctacttcg cctggcctct 240

ctactgggcc

tgccagggct gcgtcctaac cggcgtctgg gtcatagccc acgagtgcgg 300

ccaccacgcc

ttcagcgact accagtggct ggacgacacc gtcggcctca tcttccactc 360

cttcctcctc

gtcccttact tctcctggaa gtacagtcat cgacgccacc attccaacac 420

tggctccctc

gagagagacg aagtgtttgt ccccaagaag aagtcagaca tcaagtggta 480

cggcaagtac

ctcaacaacc ctttgggacg caccgtgatg ttaacggttc agttcactct 540

cggctggcct

ttgtacttag ccttcaacgt ctcggggaga ccttacgacg gcggcttcgc 600

ttgccatttc

caccccaacg ctcccatcta caacgaccgt gagcgtctcc agatatacat 660

5

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ctccgacgct

ggcatcctcg ccgtctgcta cggtctctac cgctacgctg ctgtccaagg 720

agttgcctct

atggtctgct tctacggagt ttctcttctg attgtcaacg ggttcttagt 780

tttgatcact

tacttgcagc acacgcatcc ttccctgcct cactatgact cgtctgagtg 840

ggattggttg

aggggagctt tggccaccgt tgacagagac tacggaatct tgaacaaggt 900

cttccacaat

atcacggaca cgcacgtggc gcatcacctg ttctcgacca tgccgcatta 960

tcatgcgatg

gaagctacga aggcgataaa gccgatactg ggagagtatt atcagttcga 1020

tgggacgccg

gtggttaagg cgatgtggag ggaggcgaag gagtgtatct atgtggaacc 1080

ggacaggcaa

ggtgagaaga 1100

<210> 4 <211> 1100 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Secuencia parcial de mutante de fad2C de Brassica napus (HOR1)

<400> 4 agtgtctcct

ccctccaaaa agtctgaaac cgacaccatc aagcgcgtac cctgcgagac 60

accgcccttc

actgtcggag aactcaagaa agcaatccca ccgcactgtt tcaaacgctc 120

gatccctcgc

tctttctcct acctcatctg ggacatcatc atagcctcct gcttctacta 180

cgtcgccacc

acttacttcc ctctcctccc tcaccctctc tcctacttcg cctggcctct 240

ctactgggcc

tgccaagggt gcgtcctaac cggcgtctgg gtcatagccc acgagtgcgg 300

ccaccacgcc

ttcagcgact accagtggct tgacgacacc gtcggtctca tcttccactc 360

cttcctcctc

gtcccttact tctcctggaa gtacagtcat cgacgccacc attccaacac 420

tggctccctc

gagagagacg aagtgtttgt ccccaagaag aagtcagaca tcaagtggta 480

cggcaagtac

ctcaacaacc ctttgggacg caccgtgatg ttaacggttc agttcactct 540

cggctggccg

ttgtacttag ccttcaacgt ctcgggaaga ccttacgacg gcggcttcgc 600

ttgccatttc

caccccaacg cttccatcta caacgaccgc gagcgtctcc agatatacat 660

ctccgacgct

ggcatcctcg ccgtctgcta cggtctcttc cgttacgccg ccgcgcaggg 720

agtggcctcg

atggtctgct tctacggagt cccgcttctg attgtcaatg gtttcctcgt 780

gttgatcact

tacttgcagc acacgcatcc ttccctgcct cactacgatt cgtccgagtg 840

ggattggttg

aggggagctt tggctaccgt tgacagagac tacggaatct tgaacaaggt 900

cttccacaat

attaccgaca cgcacgtggc gcatcatctg ttctccacga tgccgcatta 960

tcacgcgatg

gaagctacca aggcgataaa gccgatactg ggagagtatt atcagttcga 1020

tgggacgccg

gtggttaagg cgatgtggag ggaggcgaag gagtgtatct atgtggaacc 1080

ggacaggcaa

ggtgagaaga 1100

<210> 5 <211> 1100

16

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia parcial de mutante de fad2A de Brassica napus (HOR2) <400> 5

agtgtctcct ccctccaaaa agtctgaaac cgacaacatc aagcgcgtac cctgcgagac 60

accgcccttc actgtcggag aactcaagaa agcaatccca ccgcactgtt tcaaacgctc 120

gatccctcgc tctttctcct acctcatctg ggacatcatc atagcctcct gcttctacta 180

cgtcgccacc acttacttcc ctctcctccc tcaccctctc tcctacttcg cctggcctct 240

ctactgggcc tgccagggct gcgtcctaac cggcgtctgg gtcatagccc acgagtgcgg 300

ccaccacgcc ttcagcgact accagtggct ggacgacacc gtcggcctca tcttccactc 360

cttcctcctc gtcccttact tctcctggaa gtacagtcat cgacgccacc attccaacac 420

tggctccctc gagagagacg aagtgtttgt ccccaagaag aagtcagaca tcaagtggta 480

cggcaagtac ctcaacaacc ctttgggacg caccgtgatg ttaacggttc agttcactct 540

cggctggcct ttgtacttag ccttcaacgt ctcggggaga ccttacgacg gcggcttcgc 600

ttgccatttc caccccaacg ctcccatcta caacgaccgt gagcgtctcc agatatacat 660

ctccgacgct ggcatcctcg ccgtctgcta cggtctctac cgctacgctg ctgtccaagg 720

agttgcctcg atggtctgct tctacggagt tcctcttctg attgtcaacg ggttcttagt 780

tttgatcact tacttgcagc acatgcatcc ttccctgcct cactatgact cgtctgagtg 840

ggattggttg aggggagctt tggccaccgt tgacagagac tacggaatct tgaacaaggt 900

cttccacaat atcacggaca cgcacgtggc gcatcacctg ttctcgacca tgccgcatta 960

tcatgcgatg gaagctacga aggcgataaa gccgatactg ggagagtatt atcagttcga 1020

tgggacgccg gtggttaagg cgatgtggag ggaggcgaag gagtgtatct atgtggaacc 1080

ggacaggcaa ggtgagaaga 1100

<210> 6 <211> 1100 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia parcial de mutante de fad2A de Brassica napus (HOR3) <400> 6

agtgtctcct ccctccaaaa agtctgaaac cgacaacatc aagcgcgtac cctgcgagac 60

accgcccttc actgtcggag aactcaagaa agcaatccca ccgcactgtt tcaaacgctc 120

gatccctcgc tctttctcct acctcatctg ggacatcatc atagcctcct gcttctacta 180

cgtcgccacc acttacttcc ctctcctccc tcaccctctc tcctacttcg cctggcctct 240

ctactgggcc tgccagggct gcgtcctaac cggcgtctgg gtcatagccc acgagtgcgg 300

ccaccacgcc ttcagcgact actagtggct ggacgacacc gtcggcctca tcttccactc 360

cttcctcctc gtcccttact tctcctggaa gtacagtcat cgacgccacc attccaacac 420

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tggctccctc

gagagagacg aagtgtttgt ccccaagaag aagtcagaca tcaagtggta 480

cggcaagtac

ctcaacaacc ctttgggacg caccgtgatg ttaacggttc agttcactct 540

cggctggcct

ttgtacttag ccttcaacgt ctcggggaga ccttacgacg gcggcttcgc 600

ttgccatttc

caccccaacg ctcccatcta caacgaccgt gagcgtctcc agatatacat 660

ctccgacgct

ggcatcctcg ccgtctgcta cggtctctac cgctacgctg ctgtccaagg 720

agttgcctcg

atggtctgct tctacggagt tcctcttctg attgtcaacg ggttcttagt 780

tttgatcact

tacttgcagc acacgcatcc ttccctgcct cactatgact cgtctgagtg 840

ggattggttg

aggggagctt tggccaccgt tgacagagac tacggaatct tgaacaaggt 900

cttccacaat

atcacggaca cgcacgtggc gcatcacctg ttctcgacca tgccgcatta 960

tcatgcgatg

gaagctacga aggcgataaa gccgatactg ggagagtatt atcagttcga 1020

tgggacgccg

gtggttaagg cgatgtggag ggaggcgaag gagtgtatct atgtggaacc 1080

ggacaggcaa

ggtgagaaga 1100

<210> 7 <211> 1100 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Secuencia parcial de mutante de fad2A de Brassica napus (HOR4)

<400> 7 agtgtctcct

ccctccaaaa agtctgaaac cgacaacatc aagcgcgtac cctgcgagac 60

accgcccttc

actgtcggag aactcaagaa agcaatccca ccgcactgtt tcaaacgctc 120

gatccctcgc

tctttctcct acctcatctg ggacatcatc atagcctcct gcttctacta 180

cgtcgccacc

acttacttcc ctctcctccc tcaccctctc tcctacttcg cctggcctct 240

ctactaggcc

tgccagggct gcgtcctaac cggcgtctgg gtcatagccc acgagtgcgg 300

ccaccacgcc

ttcagcgact accagtggct ggacgacacc gtcggcctca tcttccactc 360

cttcctcctc

gtcccttact tctcctggaa gtacagtcat cgacgccacc attccaacac 420

tggctccctc

gagagagacg aagtgtttgt ccccaagaag aagtcagaca tcaagtggta 480

cggcaagtac

ctcaacaacc ctttgggacg caccgtgatg ttaacggttc agttcactct 540

cggctggcct

ttgtacttag ccttcaacgt ctcggggaga ccttacgacg gcggcttcgc 600

ttgccatttc

caccccaacg ctcccatcta caacgaccgt gagcgtctcc agatatacat 660

ctccgacgct

ggcatcctcg ccgtctgcta cggtctctac cgctacgctg ctgtccaagg 720

agttgcctcg

atggtctgct tctacggagt tcctcttctg attgtcaacg ggttcttagt 780

tttgatcact

tacttgcagc acacgcatcc ttccctgcct cactatgact cgtctgagtg 840

ggattggttg

aggggagctt tggccaccgt tgacagagac tacggaatct tgaacaaggt 900

cttccacaat

atcacggaca cgcacgtggc gcatcacctg ttctcgacca tgccgcatta 960

tcatgcgatg

gaagctacga aggcgataaa gccgatactg ggagagtatt atcagttcga 1020

5

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65

tgggacgccg gtggttaagg cgatgtggag ggaggcgaag gagtgtatct atgtggaacc ggacaggcaa ggtgagaaga

<210> 8 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR <400> 8

agtgtctcct ccctccaaaa a

<210> 9

<211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR <400> 9

tcttctcacc ttgcctgtcc

<210> 10 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR <400> 10

cttggtggtc gatcatgttg

<210> 11 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR <400> 11

ctggaccaac gaggaatgat

<210> 12 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR <400> 12

atttccaccc caacgctt

<210> 13

<211> 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR

<400> 13

aggccactcc ctgcg

<210> 14

<211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR <400> 14

tggtctgctt ctacggagtt t

<210> 15

<211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR <400> 15

gtgcgtgtcc gtgatattgt

<210> 16 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR <400> 16

tctaccgcta cgctgctgtc

<210> 17

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR <400> 17

aggcagggaa ggatgca

<210>

18

<211>

1155

<212>

ADN

<213>

Brassica napus

<220>

<221>

CDS

<222>

(1)..(1155)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

48

96

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624

672

720

768

816

<400> :

18

atg

ggt gca ggt gga aga atg caa gtg tct cct ccc tcc aaa aag tct

Met

Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser

1

5 10 15

gaa

acc gac aac atc aag cgc gta ccc tgc gag aca ccg ccc ttc act

Glu

Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr

20 25 30

gtc

gga gaa ctc aag aaa gca atc cca ccg cac tgt ttc aaa cgc tcg

Val

Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser

35 40 45

atc

cct cgc tct ttc tcc tac ctc atc tgg gac atc atc ata gcc tcc

Ile

Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser

50 55 60

tgc

ttc tac tac gtc gcc acc act tac ttc cct ctc ctc cct cac cct

cys

Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro

65

70 75 80

ctc

tcc tac ttc gcc tgg cct ctc tac tgg gcc tgc cag ggc tgc gtc

Leu

Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val

85 90 95

cta

acc ggc gtc tgg gtc ata gcc cac gag tgc ggc cac cac gcc ttc

Leu

Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe

100 105 110

agc

gac tac cag tgg ctg gac gac acc gtc ggc ctc atc ttc cac tcc

Ser

Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His

Ser

115 120 125

ttc

ctc ctc gtc cct tac ttc tcc tgg aag tac agt cat cga cgc cac

Phe

Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His

130 135 140

cat

tcc aac act ggc tcc ctc gag aga gac gaa gtg ttt gtc ccc aag

Hi s

Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys

145

150 155 160

aag

aag

tca gac atc aag tgg tac ggc aag tac ctc aac aac cct ttg

Lys

Lys

Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu

165 170 175

gga

cgc acc gtg atg tta acg gtt cag ttc act ctc ggc tgg cct ttg

Gly

Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu

180 185 190

tac

tta gcc ttc aac gtc tcg ggg aga cct tac gac ggc ggc ttc gct

Tyr

Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala

195 200 205

tgc

cat ttc cac ccc aac gct ccc atc tac aac gac cgt gag cgt ctc

Cys

His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu

210 215 220

cag

ata tac atc tcc gac gct ggc atc ctc gcc gtc tgc tac ggt ctc

Gln

Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu

225

230 235 240

tac

cgc tac gct gct gtc caa gga gtt gcc tct atg gtc tgc ttc

tac

Tyr

Arg Tyr Ala Ala Val Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe

Tyr

245 250 255

gga

gtt cct ctt ctg att gtc aac ggg ttc tta gtt ttg atc act tac

Gly

Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr

260 265 270

ttg cag cac acg cat cct tcc ctg cct cac tat gac tcg tct gag tgg 864

Leu Gln Hi s Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp

5

275 280 285

5

gat tgg ttg agg gga gct ttg gcc acc gtt gac aga gac tac gga atc 912

Asp T rp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile

290 295 300

10

ttg aac aag gtc ttc cac aat atc acg gac acg cac gtg gcg cat cac 960

Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His

305 310 315 320

ctg ttc tcg acc atg ccg cat tat cat gcg atg gaa gct acg aag gcg 1008

15

Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala

325 330 335

ata aag ccg ata ctg gga gag tat tat cag ttc gat ggg acg ccg gtg 1056

Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val

20

340 345 350

gtt aag gcg atg tgg agg gag gcg aag gag tgt atc tat gtg gaa ccg 1104

Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro

355 360 365

25

gac agg caa ggt gag aag aaa ggt gtg ttc tgg tac aac aat aag tta 1152

Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu

370 375 380

30

tga 1155

<210> : 19

<211> 384

35

<212> PRT

<213> 1 Brassi ca napus

<400> : 19

40

Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser

1 5 10 15

Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr

45

20 25 30

Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser

35 40 45

50

Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser

50 55 60

55

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65 70 75 80

60

Leu Ser S_ 1- Phe Ala Q_ L. 1- Pro Leu S_ 1- Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val

85 90 95

Leu Thr Gly Val Q_ L. 1- Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe

65

100 105 110

Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

115 120 125

Phe

Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His

130 135 140

Hi s

Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys

145

150 155 160

Lys

Lys

Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu

165 170 175

Gly

Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu

180 185 190

Tyr

Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala

195 200 205

cys

His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu

210 215 220

Gln

Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu

225

230 235 240

S_ 1-

Arg Tyr Ala Ala Val Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr

245 250 255

Gly

Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr

260 265 270

Leu

Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp

275 280 285

Asp

Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile

290 295 300

Leu

Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His

305

310 315 320

Leu

Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala

325 330 335

Ile

Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val

340 345 350

Val

Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro

355 360 365

Asp

Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu

370 375 380

<210> 20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

48

96

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624

672

720

<211> 1155

<212> ADN

<213> Brassica napus

<220>

<221> CDS <222> (1)..(U55)

<400> 20

atg

ggt gca ggt gga aga atg caa

Met

Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln

1

5

gaa

acc gac acc atc aag cgc gta

Glu

Thr Asp Thr Ile Lys Arg Val

20

gtc

gga gaa ctc aag aaa gca atc

Val

Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile

35 40

atc

cct cgc tct ttc tcc tac ctc

Ile

Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu

50 55

tgc

ttc tac tac gtc gcc acc act

Cys

Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr

65

70

ctc

tcc tac ttc gcc tgg cct

ctc

Leu

Ser Tyr Phe Ala Trp Pro

Leu

85

cta

acc ggc gtc tgg gtc ata gcc

Leu

Thr Gly Val Trp Val Ile Ala

100

agc

gac tac cag tgg ctt gac gac

Ser

Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp

115 120

ttc

ctc ctc gtc cct tac ttc tcc

Phe

Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser

130 135

cat

tcc aac act ggc tcc ctc gag

Hi s

Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu

145

150

aag

aag

tca gac atc aag tgg tac

Lys

Lys

Ser Asp Ile Lys Trp Tyr

165

gga

cgc acc gtg atg tta acg gtt

Gly

Arg Thr Val Met Leu Thr Val

180

tac

tta gcc ttc aac gtc tcg gga

Tyr

Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly

195 200

tgc

cat ttc cac ccc aac gct ccc

Cys

His Phe His Pro Asn Ala Pro

210

215

cag

ata tac atc tcc gac gct ggc

Gln

Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly

gtg

tct cct ccc tcc aaa aag tct

Val

Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser

10 15

ccc

tgc gag aca ccg ccc ttc act

Pro

Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr

25

30

cca

ccg cac tgt ttc aaa cgc tcg

Pro

Pro

His Cys Phe Lys Arg Ser

45

atc

tgg gac atc atc ata gcc tcc

Ile

Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser

60

tac

ttc cct ctc ctc cct cac cct

Tyr

Phe Pro Leu Leu Pro His Pro

75 80

tac

tgg gcc tgc caa ggg tgc gtc

Tyr

Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val

90 95

cac

gag tgc ggc cac cac gcc ttc

His

Glu Cys Gly His His Ala Phe

105

110

acc

gtc ggt ctc atc ttc cac tcc

Thr

Val Gly Leu Ile Phe His Ser

125

tgg

aag tac agt cat cga cgc cac

Trp

Lys Tyr Ser His Arg Arg His

140

aga

gac gaa gtg ttt gtc ccc aag

Arg

Asp Glu Val Phe Val Pro Lys

155 160

ggc

aag tac ctc aac aac cct ttg

Gly

Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu

170 175

cag

ttc act ctc ggc tgg ccg ttg

Gln

Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu

185

190

aga

cct tac gac ggc ggc ttc gct

Arg

Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala

205

atc

tac aac gac cgc gag cgt ctc

Ile

Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu

220

atc

ctc gcc gtc tgc tac ggt ctc

Ile

Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

768

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1155

225

230

235

240

ttc

cgt tac gcc gcc gcg cag gga gtg gcc tcg atg gtc tgc ttc tac

Phe

Arg Tyr Ala Ala Ala Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr

245 250 255

gga

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Gly

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260 265 270

ttg

cag cac acg cat cct tcc ctg cct cac tac gat tcg tcc gag tgg

Leu

Gln Hi s Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp

275 280 285

gat

tgg ttg agg gga gct ttg gct acc gtt gac aga gac tac gga atc

Asp

T rp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile

290 295 300

ttg

aac aag gtc ttc cac aat att acc gac acg cac gtg gcg cat cat

Leu

Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His

305

310 315 320

ctg

ttc tcc acg atg ccg cat tat cac gcg atg gaa gct acc aag gcg

Leu

Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala

325 330 335

ata

aag ccg ata ctg gga gag tat tat cag ttc gat ggg acg ccg gtg

Ile

Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val

340 345 350

gtt

aag gcg atg tgg agg gag gcg aag gag tgt atc tat gtg gaa ccg

Val

Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro

355 360 365

gac

agg caa ggt gag aag aaa ggt gtg ttc tgg tac aac aat aag tta

Asp

Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu

370 375 380

tga

<210> ;

21

<211> :

384

<212>

PRT

<213> 1

Brassi ca napus

<400>

21

Met

Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser

1

5 10 15

Glu

Thr Asp Thr Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr

20 25 30

Val

Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser

35 40 45

Ile

Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Q_ L. 1- Asp Ile Ile Ile Ala Ser

50 55 60

Cys

Phe S_ 1- S_ 1- Val Ala Thr Thr S_ 1- Phe Pro Leu Leu Pro His Pro

65 70 75 80

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Leu

Ser S_ 1- Phe Ala Q_ L. 1- Pro Leu S_ 1- Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val

85 90 95

Leu

Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe

100 105 110

Ser

Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His

Ser

115 120 125

Phe

Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His

130 135 140

Hi s

Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys

145

150 155 160

Lys

Lys

Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu

165 170 175

Gly

Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu

180 185 190

Tyr

Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala

195 200 205

cys

His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu

210 215 220

Gln

Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu

225

230 235 240

Phe

Arg Tyr Ala Ala Ala Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr

245 250 255

Gly

Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr

260 265 270

Leu

Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp

275 280 285

Asp

Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile

290 295 300

Leu

Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His

305

310 315 320

Leu

Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala

325 330 335

Ile

Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val

340 345 350

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro 355 360 365

Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu 370 375 380

<210> 22 <211> 1155

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Mutantes de fad2 de Brassica napus

<220>

<221> CDS <222> (1)..(U55)

<220>

<221> misc_feature <222> (59) . . (59)

<223> A o C

<220>

<221> misc_feature <222> (269)..(269)

<223> G o A

<220>

<221> misc_feature <222> (279) . .(279)

<223> G o A

<220>

<221> misc_feature <222> (282)..(282) <223> C o G

<220>

<221> misc_feature <222> (346) . .(346)

<223> C o T

<220>

<221> misc_feature <222> (354)..(354)

<223> G o T

<220>

<221> misc_feature <222> (369) . .(369)

<223> C o T

<220>

<221> misc_feature <222> (573) . .(573)

<223> T o G

<220>

<221> misc_feature <222> (600)..(600) <223> G o A

<220>

<221> misc_feature

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<222>

(646)..(646)

<223>

C o T

<220>

<221>

misc feature

<222>

(663)..(663)

<223>

T o C

<220>

<221>

misc feature

<222>

(722)..(722)

<223>

A o T

<220>

<221>

misc feature

<222>

(726)..(726)

<223>

C o T

<220>

<221>

misc feature

<222>

(732)..(732)

<223>

T o C

<220>

<221>

misc feature

<222>

(735)..(735)

<223>

T o C

<220>

<221>

misc feature

<222>

(737)..(737)

<223>

T o C

<220>

<221>

misc feature

<222>

(738)..(738)

<223>

C o G

<220>

<221>

misc feature

<222>

(741)..(741)

<223>

A o G

<220>

<221>

misc feature

<222>

(747)..(747)

<223>

T o G

<220>

<221>

misc feature

<222>

(753)..(753)

<223>

T o G

<220>

<221>

misc feature

<222>

(774)..(774)

<223>

T o C

<220>

<221>

misc feature

<222>

(775)..(775)

<223>

C o T

<220>

<221>

misc feature

<222>

(777)..(777)

<223>

T o G

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220> <221>

mi sc feature

<222>

(792) ..(792)

<223>

C 0 T

<220> <221>

mi sc feature

<222>

(795) ..(795)

<223>

G 0 T

<220> <221>

mi sc feature

<222>

(799) ..(799)

<223>

T 0 C

<220> <221>

mi sc feature

<222>

(801) ..(801)

<223>

A 0 C

<220> <221>

mi sc feature

<222>

(804) ..(804)

<223>

T 0 G

<220> <221>

mi sc feature

<222>

(827) ..(827)

<223>

C 0 T

<220> <221>

mi sc feature

<222>

(849) ..(849)

<223>

T 0 C

<220> <221>

mi sc feature

<222>

(852) ..(852)

<223>

C 0 T

<220> <221>

mi sc feature

<222>

(858) ..(858)

<223>

T 0 C

<220> <221>

mi sc feature

<222>

(888) ..(888)

<223>

C 0 T

<220> <221>

mi sc feature

<222>

(936) ..(936)

<223>

C 0 T

<220> <221>

mi sc feature

<222>

(939) ..(939)

<223>

G 0 C

<220> <221>

mi sc feature

<222>

(960) ..(960)

<223>

C 0 T

<220> <221>

mi sc feature

<222>

(969) ..(969)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

48

96

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624

<223>

G o C

<220>

<221>

mi sc feature

<222>

(972) ..(972)

<223>

C o G

<220>

<221>

mi sc feature

<222>

(987) ..(987)

<223>

T o C

<220>

<221>

mi sc_ feature

<222>

(1002) . . (1002)

<223>

G o C

<400>

22

atg ggt

gca ggt gga aga atg caa gtg tct cct ccc tcc aaa aag tct

Met Gly

Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser

1

5 10 15

gaa acc

gac anc atc aag cgc gta ccc tgc gag aca ccg ccc ttc act

Glu Thr

Asp Xaa Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr

20 25 30

gtc gga

gaa ctc aag aaa gca atc cca ccg cac tgt ttc aaa cgc tcg

Val Gly

Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser

35 40 45

atc cct

cgc tct ttc tcc tac ctc atc tgg gac atc atc ata gcc tcc

Ile Pro

Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser

50

55 60

tgc ttc

tac tac gtc gcc acc act tac ttc cct ctc ctc cct cac cct

Cys Phe

Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro

65

70 75 80

ctc tcc

tac ttc gcc tgg cct ctc tac tng gcc tgc can ggn tgc gtc

Leu Ser

Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Xaa Ala Cys Xaa Gly Cys Val

85 90 95

cta acc

ggc gtc tgg gtc ata gcc cac gag tgc ggc cac cac gcc ttc

Leu Thr

Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe

100 105 110

agc gac

tac nag tgg ctn gac gac acc gtc ggn ctc atc ttc cac tcc

Ser Asp

Tyr Xaa Trp Xaa Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser

115 120 125

ttc ctc

ctc gtc cct tac ttc tcc tgg aag tac agt cat cga cgc cac

Phe Leu

Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His

130

135 140

cat tcc

aac act ggc tcc ctc gag aga gac gaa gtg ttt gtc ccc aag

His Ser

Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys

145

150 155 160

aag aag

tca gac atc aag tgg tac ggc aag tac ctc aac aac cct ttg

Lys Lys

Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu

165 170 175

gga cgc

acc gtg atg tta acg gtt cag ttc act ctc ggc tgg ccn ttg

Gly Arg

Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu

180 185 190

tac tta

gcc ttc aac gtc tcg ggn aga cct tac gac ggc ggc ttc gct

Tyr Leu

Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

672

720

768

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1155

195

200

205

tgc cat ttc cac ccc aac gct ncc atc tac aac gac cgn gag cgt ctc

Cys His Phe His Pro Asn Ala Xaa Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu

210 215 220

cag ata tac atc tcc gac gct ggc atc ctc gcc gtc tgc tac ggt ctc

Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu

225 230 235 240

tnc cgn tac gcn gcn gnn can gga gtn gcc tcn atg gtc tgc ttc tac

Xaa Arg Tyr Ala Ala Xaa Xaa Gly Val Ala Xaa Met Val Cys Phe Tyr

245 250 255

gga gtn ncn ctt ctg att gtc aan ggn ttc ntn gtn ttg atc act tac

Gly Val Xaa Leu Leu Ile Val Xaa Gly Phe Xaa Val Leu Ile Thr Tyr

260 265 270

ttg cag cac ang cat cct tcc ctg cct cac tan gan tcg tcn gag tgg

Leu Gln His Xaa His Pro Ser Leu Pro His Xaa Xaa Ser Xaa Glu Trp

275 280 285

gat tgg ttg agg gga gct ttg gcn acc gtt gac aga gac tac gga atc

Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile

290 295 300

ttg aac aag gtc ttc cac aat atn acn gac acg cac gtg gcg cat can

Leu Asn Lys Val Phe His Asn Xaa Thr Asp Thr His Val Ala His Xaa

305 310 315 320

ctg ttc tcn acn atg ccg cat tat can gcg atg gaa gct acn aag gcg

Leu Phe Xaa Thr Met Pro His Tyr Xaa Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala

325 330 335

ata aag ccg ata ctg gga gag tat tat cag ttc gat ggg acg ccg gtg

Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val

340 345 350

gtt aag gcg atg tgg agg gag gcg aag gag tgt atc tat gtg gaa ccg

Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro

355 360 365

gac agg caa ggt gag aag aaa ggt gtg ttc tgg tac aac aat aag tta

Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu

370 375 380

tga

<210> 23

<211> 384

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<221> misc_feature <222> (20)..(20)

<22 3> El ‘Xaa’ en la posicion 20 representa Asn o Thr. <220>

<221> misc_feature <222> (90)..(90)

<22 3> El ‘Xaa’ en la posicion 90 representa Trp o STOP. <220>

<221> misc_feature <222> (93)..(93)

<22 3> El ‘Xaa’ en la posicion 93 representa Gln.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220> <221> <222> <223>

misc feature (U6)..(U6) El ‘Xaa’ en la posi cion 116 representa Gln o STOP

<220> <221> <222> <223>

misc feature (U8)..(U8) El ‘Xaa’ en la posi cion 118 representa Leu.

<220> <221> <222> <223>

misc feature (216)..(216) El ‘Xaa’ en la posi cion 216 representa Pro o Ser.

<220> <221> <222> <223>

misc feature (241)..(241) El ‘Xaa’ en la posi ci on 241 representa Tyr o Phe.

<220> <221> <222> <223>

misc feature (246)..(246) El ‘Xaa’ en la posi cion 246 representa Ala o Val .

<220> <221> <222> <223>

misc feature (247)..(247) El ‘Xaa’ en la posi cion 247 representa Gln.

<220> <221> <222> <223>

misc feature (251)..(251) El ‘Xaa’ en la posi cion 251 representa Ser.

<220> <221> <222> <223>

misc feature (259)..(259) El ‘Xaa’ en la posi cion 259 representa Pro o Ser.

<220> <221> <222> <223>

misc feature (264)..(264) El ‘Xaa’ en la posi cion 264 representa Asn.

<220> <221> <222> <223>

misc feature (267)..(267) El ‘Xaa’ en la posi cion 267 representa Leu.

<220> <221> <222> <223>

misc feature (276)..(276) El ‘Xaa’ en la posi cion 276 representa Thr o Met.

<220> <221> <222> <223>

misc feature (283)..(283) El ‘Xaa’ en la posi cion 283 representa Tyr.

<220> <221> <222> <223>

misc feature (284)..(284) El ‘Xaa’ en la posi cion 284 representa Asp.

<220> <221>

mi sc_feature

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<222> (286)..(286)

<223> El ‘Xaa’ en la posicion 286 representa Ser. <220>

<221> misc_feature <222> (312)..(312)

<22 3> El ‘Xaa’ en la posicion 312 representa Ile. <220>

<221> misc_feature <222> (320)..(320)

<22 3> El ‘Xaa’ en la posicion 320 representa His. <220>

<221> misc_feature <222> (323)..(323)

<22 3> El ‘Xaa’ en la posicion 323 representa Ser. <220>

<221> misc_feature <222> (329) . .(329)

<22 3> El ‘Xaa’ en la posicion 329 representa His. <220>

<22 3> Mutantes de fad2 de Brassica napus <400> 23

Met

Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser

1

5 10 15

Glu

Thr Asp Xaa Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr

20 25 30

Val

Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser

35 40 45

Ile

Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser

50 55 60

Cys

Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro

65

70 75 80

Leu

Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Xaa Ala Cys Xaa Gly Cys Val

85 90 95

Leu

Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe

100 105 110

Ser

Asp Tyr Xaa Trp Xaa Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His

Ser

115 120 125

Phe

Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His

130 135 140

His

Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys

145

150 155 160

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Lys

Lys

Ser Asp Ile Lys Q_ L. 1- S_ 1- Gly Lys S_ 1- Leu Asn Asn Pro Leu

165 170 175

Gly

Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu

180 185 190

Tyr

Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala

195 200 205

Cys

Hi s Phe His Pro Asn Ala Xaa Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu

210 215 220

Gln

Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu

225

230 235 240

Xaa

Arg Tyr Ala Ala Xaa Xaa Gly Val Ala Xaa Met Val Cys Phe Tyr

245 250 255

Gly

Val Xaa Leu Leu Ile Val Xaa Gly Phe Xaa Val Leu Ile Thr Tyr

260 265 270

Leu

Gln His Xaa His Pro Ser Leu Pro His Xaa Xaa Ser Xaa Glu Trp

275 280 285

Asp

Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile

290 295 300

Leu

Asn Lys Val Phe His Asn Xaa Thr Asp Thr His Val Ala His Xaa

305

310 315 320

Leu

Phe Xaa Thr Met Pro His Tyr Xaa Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala

325 330 335

Ile

Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val

340 345 350

Val

Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro

355 360 365

Asp

Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu

370 375 380

<210> 24

<211> 1155

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Mutante de fad2A por G269A de Brassica napus

<220>

<221> CDS <222> (1)..(270)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

48

96

144

192

240

290

350

410

470

530

590

650

710

770

830

890

950

1010

1070

1130

1155

<400>

24

atg

ggt gca ggt gga aga atg caa gtg tct cct ccc tcc aaa aag tct

Met

Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser

1

5 10 15

gaa

acc gac aac atc aag cgc gta ccc tgc gag aca ccg ccc ttc act

Glu

Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr

20 25 30

gtc

gga gaa ctc aag aaa gca atc cca ccg cac tgt ttc aaa cgc tcg

Val

Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro Hi s Cys Phe Lys Arg Ser

35 40 45

atc

cct cgc tct ttc tcc tac ctc atc tgg gac atc atc ata gcc tcc

Ile

Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser

50 55 60

tgc

ttc tac tac gtc gcc acc act tac ttc cct ctc ctc cct cac cct

Cys

Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro

65

70 75 80

ctc

tcc tac ttc gcc tgg cct ctc tac tag gcctgccagg gctgcgtcct

Leu

Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr

85

aaccggcgtc

gctggacgac

gaagtacagt

tgtccccaag

acgcaccgtg

cgtctcgggg

ctacaacgac

ctacggtctc

agttcctctt

tccttccctg

cgttgacaga

ggcgcatcac

aaagccgata

gagggaggcg

gttctggtac

tgggtcatag

accgtcggcc

catcgacgcc

aagaagtcag

atgttaacgg

agaccttacg

cgtgagcgtc

taccgctacg

ctgattgtca

cctcactatg

gactacggaa

ctgttctcga

ctgggagagt

aaggagtgta

aacaataagt

cccacgagtg

tcatcttcca

accattccaa

acatcaagtg

ttcagttcac

acggcggctt

tccagatata

ctgctgtcca

acgggttctt

actcgtctga

tcttgaacaa

ccatgccgca

attatcagtt

tctatgtgga

tatga

cggccaccac

ctccttcctc

cactggctcc

gtacggcaag

tctcggctgg

cgcttgccat

catctccgac

aggagttgcc

agttttgatc

gtgggattgg

ggtcttccac

ttatcatgcg

cgatgggacg

accggacagg

gccttcagcg

ctcgtccctt

ctcgagagag

tacctcaaca

cctttgtact

ttccacccca

gctggcatcc

tctatggtct

acttacttgc

ttgaggggag

aatatcacgg

atggaagcta

ccggtggtta

caaggtgaga

actaccagtg

acttctcctg

acgaagtgtt

accctttggg

tagccttcaa

acgctcccat

tcgccgtctg

gcttctacgg

agcacacgca

ctttggccac

acacgcacgt

cgaaggcgat

aggcgatgtg

agaaaggtgt

<210> 25

<211> 89

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Mutante de fad2A por G269A de Brassica napus <400> 25

Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser

1 5 10 15

Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr

5

20 25 30

Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro Hi s Cys Phe Lys Arg Ser

35 40 45

10

Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Q_ L. 1- Asp Ile Ile Ile Ala Ser

50 55 60

15

Cys Phe S_ 1- S_ 1- Val Ala Thr Thr S_ 1- Phe Pro Leu Leu Pro His Pro

65 70 75 80

20

Leu Ser Tyr Phe Ala Q_ L. 1- Pro Leu Tyr

85

<210> 26 25 <211> 1155

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

30 <223> Mutante de fad2A por C346T de Brassica napus

<220>

<221> CDS

35 <222> (1)..(348)

<400> 26

atg ggt gca ggt gga aga atg caa gtg tct cct ccc tcc aaa aag tct

Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser

40

1 5 10 15

gaa acc gac aac atc aag cgc gta ccc tgc gag aca ccg ccc ttc act

Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr

45

20 25 30

gtc gga gaa ctc aag aaa gca atc cca ccg cac tgt ttc aaa cgc tcg

Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser

35 40 45

50

atc cct cgc tct ttc tcc tac ctc atc tgg gac atc atc ata gcc tcc

Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser

50 55 60

tgc ttc tac tac gtc gcc acc act tac ttc cct ctc ctc cct cac cct

55

Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro

65 70 75 80

ctc tcc tac ttc gcc tgg cct ctc tac tgg gcc tgc cag ggc tgc gtc

Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val

60

85 90 95

cta acc ggc gtc tgg gtc ata gcc cac gag tgc ggc cac cac gcc ttc

Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe

100 105 110

agc gac tac tag tggctggacg acaccgtcgg cctcatcttc cactccttcc Ser Asp Tyr 115

48

96

144

192

240

288

336

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

448

508

568

628

688

748

808

868

928

988

1048

1108

1155

tcctcgtccc

ccctcgagag

agtacctcaa

ggcctttgta

atttccaccc

acgctggcat

cctctatggt

tcacttactt

ggttgagggg

acaatatcac

cgatggaagc

cgccggtggt

ggcaaggtga

ttacttctcc

agacgaagtg

caaccctttg

cttagccttc

caacgctccc

cctcgccgtc

ctgcttctac

gcagcacacg

agctttggcc

ggacacgcac

tacgaaggcg

taaggcgatg

gaagaaaggt

tggaagtaca

tttgtcccca

ggacgcaccg

aacgtctcgg

atctacaacg

tgctacggtc

ggagttcctc

catccttccc

accgttgaca

gtggcgcatc

ataaagccga

tggagggagg

gtgttctggt

gtcatcgacg

agaagaagtc

tgatgttaac

ggagacctta

accgtgagcg

tctaccgcta

ttctgattgt

tgcctcacta

gagactacgg

acctgttctc

tactgggaga

cgaaggagtg

acaacaataa

ccaccattcc

agacatcaag

ggttcagttc

cgacggcggc

tctccagata

cgctgctgtc

caacgggttc

tgactcgtct

aatcttgaac

gaccatgccg

gtattatcag

tatctatgtg

gttatga

aacactggct

tggtacggca

actctcggct

ttcgcttgcc

tacatctccg

caaggagttg

ttagttttga

gagtgggatt

aaggtcttcc

cattatcatg

ttcgatggga

gaaccggaca

<210> 27

<211> 115

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Mutante de fad2A por C346T de Brassica napus <400> 27

Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser 1 5 10 15

Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr 20 25 30

Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser 35 40 45

Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser 50 55 60

Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro 65 70 75 80

Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val 85 90 95

Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe 100 105 110

Ser Asp Tyr 115

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

48

96

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624

<210> 28 <211> 1155

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<22 3> Mutante de fad2C por C646T de Brassica napus

<220>

<221> CDS <222> (1) . . (1155)

<400> 28

atg

ggt gca ggt gga aga atg caa

Met

Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln

1

5

gaa

acc gac acc atc aag cgc gta

Glu

Thr Asp Thr Ile Lys Arg Val

20

gtc

gga gaa ctc aag aaa gca atc

Val

Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile

35 40

atc

cct cgc tct ttc tcc tac ctc

Ile

Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu

50 55

tgc

ttc tac tac gtc gcc acc act

Cys

Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr

65

70

ctc

tcc tac ttc gcc tgg cct

ctc

Leu

Ser Tyr Phe Ala Trp Pro

Leu

85

cta

acc ggc gtc tgg gtc ata gcc

Leu

Thr Gly Val Trp Val Ile Ala

100

agc

gac tac cag tgg ctt gac gac

Ser

Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp

115 120

ttc

ctc ctc gtc cct tac ttc tcc

Phe

Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser

130 135

cat

tcc aac act ggc tcc ctc gag

Hi s

Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu

145

150

aag

aag

tca gac atc aag tgg tac

Lys

Lys

Ser Asp Ile Lys Trp Tyr

165

gga

cgc acc gtg atg tta acg gtt

Gly

Arg Thr Val Met Leu Thr Val

180

tac

tta gcc ttc aac gtc tcg gga

Tyr

Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly

195 200

gtg Val

tct Ser 10 cct Pro ccc Pro tcc Ser aaa Lys aag Lys 15 tct Ser

ccc Pro 25

tgc Cys gag Glu aca Thr ccg Pro ccc Pro 30 ttc Phe act Thr

cca Pro

ccg Pro cac His tgt Cys ttc Phe 45 aaa Lys cgc Arg tcg Ser

atc Ile

tgg Trp gac Asp atc Ile 60 atc Ile ata Ile gcc Ala tcc Ser

tac Tyr

ttc Phe cct Pro 75 ctc Leu ctc Leu cct Pro cac His cct Pro 80

tac Tyr

tgg Trp 90 gcc Ala tgc Cys caa Gln ggg Gly tgc Cys 95 gtc Val

cac His 105

gag Glu tgc Cys ggc Gly cac His cac His 110 gcc Ala ttc Phe

acc Thr

gtc Val ggt Gly ctc Leu atc Ile 125 ttc Phe cac His tcc Ser

tgg Trp

aag Lys tac Tyr agt Ser 140 cat His cga Arg cgc Arg cac His

aga Arg

gac Asp gaa Glu 155 gtg Val ttt Phe gtc Val ccc Pro aag Lys 160

ggc Gly

aag Lys 170 tac Tyr ctc Leu aac Asn aac Asn cct Pro 175 ttg Leu

cag Gln 185

ttc Phe act Thr ctc Leu ggc Gly tgg Trp 190 ccg Pro ttg Leu

aga Arg

cct Pro tac Tyr gac Asp ggc Gly 205 ggc Gly ttc Phe gct Ala

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

672

720

768

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1155

tgc cat

ttc cac ccc aac gct tcc atc tac aac gac cgc gag cgt ctc

Cys His

Phe His Pro Asn Ala Ser Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu

210

215 220

cag ata

tac atc tcc gac gct ggc atc ctc gcc gtc tgc tac ggt ctc

Gln Ile

Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu

225

230 235 240

ttc cgt

tac gcc gcc gcg cag gga gtg gcc tcg atg gtc tgc ttc tac

Phe Arg

Tyr Ala Ala Ala Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr

245 250 255

gga gtc

ccg ctt ctg att gtc aat ggt ttc ctc gtg ttg atc act tac

Gly Val

Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr

260 265 270

ttg cag

cac acg cat cct tcc ctg cct cac tac gat tcg tcc gag tgg

Leu Gln

Hi s Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp

275 280 285

gat tgg

ttg agg gga gct ttg gct acc gtt gac aga gac tac gga atc

Asp Trp

Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile

290

295 300

ttg aac

aag gtc ttc cac aat att acc gac acg cac gtg gcg cat cat

Leu Asn

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305

310 315 320

ctg ttc

tcc acg atg ccg cat tat cac gcg atg gaa gct acc aag gcg

Leu Phe

Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala

325 330 335

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ccg ata ctg gga gag tat tat cag ttc gat ggg acg ccg gtg

Ile Lys

Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val

340 345 350

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gcg atg tgg agg gag gcg aag gag tgt atc tat gtg gaa ccg

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355 360 365

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caa ggt gag aag aaa ggt gtg ttc tgg tac aac aat aag tta

Asp Arg

Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu

370

375 380

tga

<210> ;

29

<211>

384

<212>

PRT

<213> :

Secuencia artificial

<220>

<223>

Mutante de fad2C por C646T de Brassica napus

<400>

29

Met Gly Ala

Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser

1

5 10 15

Glu Thr

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20 25 30

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Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ile

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50 55 60

Cys

Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro

65

70 75 80

Leu

Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val

85 90 95

Leu

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100 105 110

Ser

Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His

Ser

115 120 125

Phe

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130 135 140

Hi s

Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys

145

150 155 160

Lys

Lys

Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu

165 170 175

Gly

Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu

180 185 190

Tyr

Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala

195 200 205

Cys

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210 215 220

Gln

Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu

225

230 235 240

Phe

Arg Tyr Ala Ala Ala Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr

245 250 255

Gly

Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr

260 265 270

Leu

Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp

275 280 285

Asp

Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile

290 295 300

Leu

Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His

305

310 315 320

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

48

96

144

192

240

288

336

384

432

480

Leu Phe

Ser Thr Met Pro Hi s S_ > 1- His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala

325 330 335

Ile Lys

Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val

340 345 350

Val Lys

Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro

355 360 365

Asp Arg

Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu

370

375 380

<210>

30

<211>

1155

<212> ,

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

Mutante de fad2A por C775T de Brassica napus

<220>

<221>

CDS

<222>

(1).. (1155)

<400>

30

atg ggt

gca ggt gga aga atg caa gtg tct cct ccc tcc aaa aag tct

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1

5 10 15

gaa acc

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35 40 45

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50

55 60

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65

70 75 80

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85 90 95

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Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe

100 105 110

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115 120 125

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130

135 140

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5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

528

576

624

672

720

768

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1155

Hi s 145

Ser Asn Thr Gly Ser 150 Leu Glu

aag Lys

aag Lys

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ata Ile tac Tyr atc Ile tcc Ser gac Asp 230 gct Ala ggc Gly

tac Tyr

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gga Gly

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gat Asp

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ctg Leu

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ata Ile

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tga

<210> : <211> : <212> <213> !

31 384 PRT Secuencia artificial

<220>

Arg

Asp Glu 155 Val Phe Val Pro Lys 160

ggc Gly

aag Lys 170 tac Tyr ctc Leu aac Asn aac Asn cct Pro 175 ttg Leu

cag Gln 185

ttc Phe act Thr ctc Leu ggc Gly tgg Trp 190 cct Pro ttg Leu

aga Arg

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atc Ile

tac Tyr aac Asn gac Asp 220 cgt Arg gag Glu cgt Arg ctc Leu

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5

10

15

20

25

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35

40

45

50

55

60

65

<223> Mutante de fad2A por C775T de Brassica napus <400> 31

Met

Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser

1

5 10 15

Glu

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20 25 30

Val

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35 40 45

Ile

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50 55 60

cys

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65

70 75 80

Leu

Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val

85 90 95

Leu

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100 105 110

Ser

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115 120 125

Phe

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130 135 140

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145

150 155 160

Lys

Lys

Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu

165 170 175

Gly

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180 185 190

Tyr

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195 200 205

Cys

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210 215 220

Gln

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225

230 235 240

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Arg Tyr Ala Ala Val Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr

245 250 255

5

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15

20

25

30

35

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45

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55

60

65

Gly

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260 265 270

Leu

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275 280 285

Asp

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290 295 300

Leu

Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His

305

310 315 320

Leu

Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala

325 330 335

Ile

Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val

340 345 350

Val

Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro

355 360 365

Asp

Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu

370 375 380

<210> 32

<211> 1155

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<223>

Mutante de fad2A por C827T de Brassica napus

<220>

<221> !

CDS

<222>

(1).. ■(1155)

<400>

32

atg ggt

gca ggt gga aga atg caa gtg tct cct ccc tcc aaa aag tct

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1

5 10 15

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65

336

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528

576

624

672

720

768

816

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912

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1056

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85

90

95

cta

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Leu

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100 105 110

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130 135 140

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aag

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Lys

Lys

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Gly

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180 185 190

tac

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Tyr

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195 200 205

tgc

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Cys

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210 215 220

cag

ata tac atc tcc gac gct ggc atc ctc gcc gtc tgc tac ggt ctc

Gln

Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu

225

230 235 240

tac

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tac

Tyr

Arg Tyr Ala Ala Val Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe

Tyr

245 250 255

gga

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Gly

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260 265 270

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Leu

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275 280 285

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Asp

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290 295 300

ttg

aac aag gtc ttc cac aat atc acg gac acg cac gtg gcg cat cac

Leu

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310 315 320

ctg

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Leu

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325 330 335

ata

aag ccg ata ctg gga gag tat tat cag ttc gat ggg acg ccg gtg

Ile

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340 345 350

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tga

<210> 33

<211> 384

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Mutante de fad2A por C827T de Brassica napus <400> 33

Met

Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser

1

5 10 15

Glu

Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr

20 25 30

Val

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35 40 45

Ile

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50 55 60

Cys

Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro

65

70 75 80

Leu

Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val

85 90 95

Leu

Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe

100 105 110

Ser

Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His

Ser

115 120 125

Phe

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130 135 140

Hi s

Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys

145

150 155 160

Lys

Lys

Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu

165 170 175

Gly

Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu

180 185 190

Tyr

Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

195 200 205

Cys

Hi s Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu

210 215 220

Gln

Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu

225

230 235 240

S_ 1-

Arg Tyr Ala Ala Val Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr

245 250 255

Gly

Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr

260 265 270

Leu

Gln His Met His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp

275 280 285

Asp

T rp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile

290 295 300

Leu

Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His

305

310 315 320

Leu

Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala

325 330 335

Ile

Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val

340 345 350

Val

Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro

355 360 365

Asp

Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu

370 375 380

<210> 34

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR <400> 34

cacgccttca gcgactact

<210> 35

<211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR <400> 35

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

ttcgcctggc ctctctacta

<210> 36

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR <400> 36

atcgaggcaa ctccttgga

<210> 37

<211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR <400> 37

atttccaccc caaccgct

<210> 38

<211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR <400> 38

tctaccgcta cgctgctgtc

<210> 39

<211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR <400> 39

agtgtctcct ccctccaaaa a

Claims (19)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Acido nucleico mutado que codifica una enzima delta-12 oleato desaturasa (FAD2) de una planta Cruciferae, en el que dicho acido nucleico mutado consiste en (i) una secuencia que comprende la mutacion no conservativa de al menos un nucleotido de al menos un codon que representa un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en:

   - el aminoacido en la posicion 259 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 258 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos,

   o (ii) la secuencia complementaria de dicha secuencia,

   codificando dicho acido nucleico mutado una FAD2 que tiene una actividad menor que la de la correspondiente FAD2 natural medida en las mismas condiciones.
2. 2. Acido nucleico mutado, segun la reivindicacion 1, en el que la secuencia de dicho acido nucleico mutado comprende al menos una mutacion que es una sustitucion del codon que representa el aminoacido en la posicion 259 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 258 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos, por un codon que representa cualquier aminoacido diferente de P.
3. 3. Acido nucleico mutado, segun la reivindicacion 2, en el que:

   - el codon que representa el aminoacido en la posicion 259 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 258 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos, esta sustituido por un codon que representa S.
4. 4. Acido nucleico mutado, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la planta es del genero Brassica.
5. 5. Acido nucleico mutado, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha secuencia de FAD2 es la secuencia de FAD2A.
6. 6. Acido nucleico mutado, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la secuencia esta representada por la SEQ ID NO: 22 y comprende al menos una mutacion que es una sustitucion de C a T en la posicion 775 de la SEQ ID NO: 22.
7. 7. Acido nucleico mutado, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la secuencia es SEQ ID NO: 30.
8. 8. Planta que tiene un mayor contenido de acido oleico en comparacion con plantas que son geneticamente identicas, excepto por la mutacion definida en la reivindicacion 1, o una parte de dicha planta, en la que la planta o dicha parte de la planta comprende al menos un acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que codifica una enzima FAD2 que tiene una actividad menor que la de la FAD2 natural correspondiente medida en las mismas condiciones.
9. 9. Planta o parte de planta, segun la reivindicacion 8, en el que dicha planta o dicha parte de la planta comprende ademas al menos otro acido nucleico en la que la secuencia de dicho acido nucleico comprende la mutacion no conservativa de al menos un nucleotido de al menos un codon que representa un aminoacido en la posicion 216 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 215 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos.
10. 10. Planta o parte de planta, segun la reivindicacion 9, en la que una copia de un gen de FAD2A es la SEQ ID NO: 30 y una copia de un gen de FAD2C es la SEQ ID NO: 28.
11. 11. Utilizacion de un acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la seleccion de plantas, o parte de las plantas, que tienen un mayor contenido de acido oleico en comparacion con plantas que son geneticamente identicas, excepto por la mutacion definida en la reivindicacion 1.
12. 12. Procedimiento para seleccionar plantas que tienen un mayor contenido de acido oleico en comparacion con plantas que son geneticamente identicas, excepto por la mutacion definida en la reivindicacion 1, mediante mutagenesis, que comprende las siguientes etapas:

    - someter una planta o parte de una planta a un tratamiento mutagenico,

    - regenerar plantas, o parte de las plantas, a partir de dicha planta o parte de una planta tratadas,

    - seleccionar a partir de las plantas regeneradas las que comprenden al menos un acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
13. 13. Procedimiento, segun la reivindicacion 12, en el que la etapa de seleccion se realiza mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR).
14. 14. Procedimiento, segun la reivindicacion 13, en el que la PCR se lleva a cabo con al menos uno de los siguientes pares de cebadores:

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    - SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15,

    - SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 14.
15. 15. Kit para la seleccion de plantas que tienen un alto contenido de acido oleico, que comprende:

    i) al menos una planta, o parte de una planta, que comprende un acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y

    ii) al menos un nucleico acido seleccionado del grupo que consiste en:

    - un fragmento de acido nucleico de un acido nucleico mutado, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende al menos 10 nucleotidos y comprende al menos un nucleotido contiguo a al menos un codon que representa el aminoacido en la posicion 259 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 258 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos, o la secuencia complementaria de dicho fragmento de acido nucleico,

    - un fragmento de acido nucleico de un acido nucleico mutado, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende al menos 10 nucleotidos, incluyendo el nucleotido mutado, y comprende al menos un nucleotido contiguo a al menos un codon que representa el aminoacido en la posicion 259 de la secuencia de aminoacidos de dicha FAD2 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 384 aminoacidos, o en la posicion 258 cuando dicha secuencia de FAD2 esta constituida por 383 aminoacidos, o la secuencia complementaria de dicho fragmento de acido nucleico,

    - un fragmento de acido nucleico seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 3.
16. 16. Kit, segun la reivindicacion 15, que comprende

    - al menos una planta o parte de una planta, que comprende un acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y

    - al menos uno de los siguientes pares de cebadores:

    - SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15,

    - SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 14.
17. 17. Enzima FAD2 mutada de la planta codificada por una secuencia de acido nucleico mutada, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
18. 18. Anticuerpo especlfico para una enzima FAD2 mutada de la planta, segun la reivindicacion 17.
19. 19. Acido nucleico seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 38.