ES2349892T3 - Procedimiento de modificación del contenido de aceite de semilla de algodón. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de producción de una planta de algodón transgénica que presenta un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla, que comprende: (i) producir mediante transformación plantas transgénicas de algodón que presentan una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC & 916;12-desaturasa o un fragmento génico del mismo operativamente en conexión con una secuencia promotora que puede proporcionar la expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de una planta de algodón; y (ii) cultivar dichas plantas durante un tiempo y en condiciones suficientes para que la expresión del gen endógeno de oleil-PC & 916;12-desaturasa correspondiente se reduzca en la semilla en virtud de la presencia de dicha secuencia nucleotídica en su genoma, (iii) seleccionar una planta de algodón transgénica que presenta un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla en comparación con una planta isogénica no transformada.

Description

DATOS DE LA SOLICITUD RELACIONADA

Esta solicitud reivindica prioridad de la USSN 60/198.124 presentada el 18 de abril de 2000.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a un nuevo procedimiento de modificación de la composición del ácido graso de los aceites de semilla de algodón para mejorar sus características nutritivas y funcionales y a las plantas, partes de la planta y a los metabolitos producidos a partir de la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La semilla del algodón es un producto valioso del algodón. La semilla del algodón contiene aproximadamente 25% de aceite de semilla de algodón, un aceite vegetal artículo de consumo muy conocido debido a su utilización como ingrediente alimenticio o como aceite para cocinar para la preparación de alimentos (Cherry, 1984). La producción mundial de aceite de semilla de algodón en 1997/98 fue de aproximadamente 4 millones de toneladas, siendo sexta en importancia detrás de los aceites de soja, aceite de palma, colza, girasol y cacahuete (Oil World Annual, 1998).

Globalmente, los cultivos de algodón constan de 4 especies de Gossypium spp. cultivadas, incluyendo las alotetraploides G. barbadense L. y G. hirsutum L. y las especies diploides G.arboreum L. y G. herbaceum L.. De estas cuatro especies, G. hirsutum (algodón de tierra alta) es la especie predominante, totalizando la aplastante mayoría de la producción de algodón en todo el mundo. Actualmente, la mayoría del aceite de semilla de algodón procede de G. hirsutum, posiblemente como consecuencia del hecho de que esta especie es la mayor fuente de fibra de algodón de todo el mundo y, las cosechas de algodón se cultivan principalmente por su fibra.

Los componentes principales del aceite de algodón son los ácidos grasos saturados, ácido palmítico (C16:0) y ácido esteárico (C18:0); el ácido graso monoinsaturado, ácido oleico (C18:1); y los ácidos grasos poliinsaturados, ácido linoleico (C18:2) y ácido α-linolénico (C18:3). Un perfil de ácido graso de semillas de algodón típico contiene grandes niveles de ácido palmítico (24%) y de ácido linoleico (54%), un nivel moderada de ácido oleico (18%) y muy bajo nivel de ácido esteárico (3%) y de ácido αlinolénico (1%).

El número, posición y configuración de un doble enlace en cada ácido graso presente en las semillas de algodón, influye en las propiedades físicas (tal como la temperatura de fusión), propiedades químicas y valor nutritivo del aceite de semilla de maíz, y las aplicaciones en las que puede introducirse, particularmente en la industria alimentaria.

Por ejemplo, la presencia de un doble enlace de carbono en un ácido graso monoinsaturado o un ácido graso poliinsaturado reduce su temperatura de fusión, en comparación con la temperatura de fusión de un ácido graso saturado de la misma longitud de la cadena de carbono, de modo que los ácidos grasos insaturados C-18, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico, son todos líquidos a temperatura ambiente.

Además, la sensibilidad de un ácido graso a la oxidación aumenta proporcionalmente con el número de doble enlaces de carbono presentes en la molécula de ácido graso, reduciendo drásticamente la idoneidad de los aceites que contienen ácidos grasos poliinsaturados a las aplicaciones que conllevan la utilización de calor prolongado en presencia de oxígeno, tal como cocinado y otras aplicaciones de servicio alimentario.

Para las aplicaciones que requieren componentes de grasa sólidos, tales como en las grasas para cocinar sólidas, mantequilla o margarinas, es necesario tener niveles moderadamente altos de ácidos grasos saturados, o los ácidos grasos trans funcionalmente equivalentes. Los ácidos grasos trans tienen enlaces dobles de carbono en orientación trans en lugar de en orientación cis natural.

Actualmente, los ácidos grasos insaturados se someten a hidrogenación química, para mejorar su idoneidad en aplicaciones de cocinado y servicio alimentario. El aceite de semilla de algodón hidrogenado es un producto valioso, porque el aceite de semilla de algodón tiene un nivel elevado natural de ácido palmítico, y pueden conseguirse fácilmente propiedades de fusión deseadas por el procedimiento de hidrogenación. En este procedimiento los ácidos grasos trans se producen como un artefacto.

La calidad nutritiva del aceite de semilla de algodón natural, y del aceite de semilla de algodón hidrogenado ha sido cuestionada debido a los efectos desfavorables publicados tanto de los ácidos grasos saturados como de los ácidos grasos trans (Wollett, 1994). La contribución de altos niveles de algunos ácidos grasos saturados en la dieta, particularmente ácido palmítico, en el aumento de colesterol en la sangre, y más particularmente en el aumento de lipoproteína de baja densidad (LDL), está bien demostrada. La LDL elevada en la sangre se ha asociado con un aumento de riesgo de enfermedad cardiovascular en la especie humana. Además, los ácidos grasos trans también elevan el colesterol LDL de manera similar al ácido palmítico. Debido a la asociación probada con riesgo de enfermedad cardiovascular, los nutricionistas y las autoridades sanitarias recomendaron generalmente limitar la ingesta alimenticia de ácido palmítico, y los ácidos grasos trans, a por lo menos inferior al 30% de la ingesta total de grasas. Los aceites naturales ricos en ácido palmítico y los aceites hidrogenados ricos en ácidos grasos trans, es de esperar que pierdan aceptación como consecuencia de estas recomendaciones.

Sin embargo, no todos los ácidos grasos saturados están asociados a un colesterol elevado. Por ejemplo, se ha publicado que el ácido esteárico tiene efectos neutros sobre el colesterol de la sangre (Wollett, 1994). A éste respecto, la alta temperatura de fusión del ácido esteárico (aproximadamente 70ºC) lo convierte asimismo en particularmente adecuado en aplicaciones de grasa sólida. Por consiguiente, debido a sus efectos neutrales sobre los niveles de colesterol en sangre, un aceite que contiene ácido esteárico elevado es un sustituto deseable de los aceites vegetales parcialmente hidrogenados utilizados actualmente en la producción de margarina. Debido a sus propiedades fisicoquímicas, el ácido esteárico es también adecuado para su utilización en la producción de cosméticos, productos farmacéuticos y velas (Topfer, 1995). Además, el nuevo aceite de semilla de algodón con proporciones aproximadamente iguales de palmítico, esteárico y oleico y por consiguiente con considerable potencial para su utilización como sustituto de la manteca de cacao.

Aunque los ácidos grasos poliinsaturados son beneficiosos desde el punto de vista del metabolismo de las lipoproteínas y de la salud cardiovascular, son muy sensibles a la peroxidación.

En resumen, debido a que la utilización principal del aceite de semilla de algodón es como artículo alimenticio, hay necesidad de desarrollar aceites mejorados que tengan valor nutritivo humano aumentado, tal como, por ejemplo, los aceites que han el ácido palmítico y/o son ricos en ácido esteárico. Además, existe también necesidad de mejorar las aplicaciones potenciales del aceite de semilla de algodón en la industria alimentaria, sin los desfavorables riesgos sanitarios asociados a la utilización de aceites ricos en muchos ácidos grasos saturados, proporcionando aceites con nuevas características de ácido graso insaturado. Por ejemplo, los aceites que tienen alto contenido en ácido oleico y/o bajo contenido en ácido linolénico tienen las propiedades fisicoquímicas deseadas de un aceite para cocinar y no requieren hidrogenación (Kinney, 1996).

Además, el triacilglicerol compuesto por aproximadamente proporciones iguales de ácido palmítico, ácido oleico y ácido esteárico (es decir, triacilglicerol tipo POS) tiene un punto de fusión muy definido alrededor de la temperatura corporal, haciéndole particularmente adecuado como sustituto de la manteca de cacao en la preparación de chocolate y de otros dulces (Fincke, 1976; Gunstone et al.,1986). Actualmente, las semillas del árbol del cacao, Theobroma cacao L., es la única fuente de manteca de cacao, y, en consecuencia, la manteca de cacao está con frecuencia falta de suministro y es costosa. El desarrollo de sustitutos de la manteca de cacao es de considerable importancia económica.

En algunos casos, los cultivadores de la planta han sido capaces de modificar el contenido o la composición del ácido graso de los aceites derivados de la semilla, incluyendo mutaciones en los genes de biosíntesis del ácido graso. La exposición del material vegetal, generalmente semillas, a determinados agentes mutágenos, tales como la radiación o mutágenos químicos, combinados con métodos de cultivo de la planta tradicionales, han producido con éxito una amplia gama de nuevas características del ácido graso en muchos cultivos de semillas oleosas, incluyendo los mutantes de colza (Auld et al.,1992), girasol (Soldatov, 1976) y soja (Rahman et al., 1994), que tienen aumentado el ácido oleico; mutantes de soja (Erickson et al., 1988), semillas de lino (Rowland y Bhatty, 1990) y girasol (Osorio et al., 1995) que tienen aumentado el ácido palmítico; mutantes de soja (Fehr et al., 1991) con ácido palmítico reducido; mutantes de soja (Graef et al., 1985; Rahman et al.,1995) y girasol (Osorio et al., 1995) que tienen aumentado el ácido esteárico; y mutantes de semillas de lino (Green, 1986), soja (Wilcox et al., 1984) y colza (Robbelen y Nitsch, 1975) con ácido linolénico reducido. En varios casos esto ha conducido a la explotación comercial de estos mutantes, tal como en el desarrollo de variedades comerciales de aceites de girasol rico en oleato (Miller et al.,

1987) y semillas de lino pobres en linolénico (Green et al., 1991) y colza (Scarth et al.,1988). Sin embargo, a pesar de dichos éxitos notables en la mayoría de otros cultivos de semillas aceitosas, no existen informes de modificación genética sustancial de la composición del ácido graso en el aceite de semilla de algodón utilizando mutagenia inducida.

Como resultado de la exhaustiva investigación bioquímica básica durante numerosas décadas, la serie de reacciones de síntesis de los ácidos grasos predominantes y de su ensamblaje ulterior en triglicéridos (aceites) de almacenamiento en semillas está actualmente bien entendido para muchas especies vegetales. Se han identificado casi todas la enzimas implicadas en el metabolismo del ácido graso, se han caracterizado las etapas biosintéticas catalizadas por éstas y se han clonado los genes que codifican dichas enzimas. En particular, los genes que codifican las estearoil-ACP Δ9desaturasas, y las oleil-ACP Δ12-desaturasas se han clonado en varias especies de semillas aceitosas, de la manera siguiente.

Los ADNc que codifican las enzimas ácido graso Δ9-desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) de aproximadamente 22 especies vegetales, incluyendo la semilla de ricino (Shanklin y Somerville 1991), cártamo (Thompson et al., 1991) y algodón (Liu et al., 1996) se han clonado, y sus secuencias nucleotídicas se han puesto a disposición del público en la base de datos del GenBank. Las construcciones génicas complementarias que comprenden una secuencia nucleotídica complementaria a la del ADNc de la estearoil-ACP Δ9-desaturasa de Brassica rapa se han utilizado para disminuir la expresión de los genes endógenos de estearoil-ACP Δ9-desaturasa de B. napus y B.rapa (Knutzon 1992), aumentando de este modo el ácido esteárico a expensas del ácido oleico en el aceite de la semilla. En este caso, el ácido esteárico se aumentó hasta el 40% del ácido graso total en la semilla.

Con respecto a los genes de ácido graso Δ12-desaturasa, se ha aislado un ADNc que contiene el marco de lectura abierto del gen FAD2 de Arabidopsis thaliana, y se ha demostrado que complementa la mutación de fad2 de A. thaliana, mutación que produce una insuficiencia en la actividad de la enzima oleil-PC Δ12-desaturasa (Miquel y Browce, 1992), lo que indica que el gen FAD2 codifica una oleil-PC Δ12-desaturasa (Okuley et al., 1994). Kinney (1997) disminuyó la expresión de los genes endógenos de la ácido graso Δ12-desaturasa de colza y soja, utilizando construcciones génicas de supresión con sentido (cosupresión) y de supresión antisentido, para producir aceites ricos en ácido oleico. En este trabajo, Kinney (1997) también describió la expresión disminuida de los genes de ácido graso Δ15-desaturasa, para producir aceites con bajo contenido en ácido linolénico tanto en colza como en soja. La cosupresion para reducir la expresión de un gen endógeno de ácido graso Δ12-desaturasa se ha descrito también que produce aceites ricos en ácido oleico en Brassica napus y Brassica juncea (Stoutjesdijk et al., 1999).

La patente US nº 5.850.026 (Cargill, Inc.), de fecha 15 de diciembre de 1998, describe también la producción de semillas de aceite ricas en ácido oleico en Brassica sp., utilizando construcciones génicas complementarias o de cosupresion dirigidas simultáneamente contra la expresión de la ácido graso Δ12-desaturasa microsómica y de la ácido graso Δ15-desaturasa microsómica. La semilla aceitosa descrita por estos investigadores era también baja en ácido erúcico y ácido α-linolénico.

La patente US nº 5.981.781 (E.I. du Pont de Nemours and Company), de fecha 9 de noviembre de 1999, da a conocer la utilización de la cosupresion, para reducir la expresión del gen GmFAD2-1 de la soja, que codifica una ácido grasa Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa), en esta especie. Mediante esta cosupresion se produjo un aceite de soja rico en ácido oleico, con alta estabilidad oxidativa.

Más recientemente, Liu et al. (1999a, 1999b) han descrito un gen de la ácido grasa Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa) del algodón.

No obstante el considerable número de genes de la biosíntesis del ácido graso vegetal disponibles al público que se han clonado y caracterizado, y la modificación descrita de los niveles en ácido graso en los aceites de Brassica spp. y de soja utilizando dichos genes, no se ha descrito ninguna modificación del metabolismo del ácido graso en el algodón, utilizando el cultivo tradicional de la planta, el cultivo mutacional o los métodos del ADN recombinante. La naturaleza tetraploide del algodón, y la existencia de grandes familias de genes específicos para la biosíntesis del ácido graso hace difícil determinar aquellos genes que, en virtud de expresarse de una manera específica para la semilla son dianas adecuadas para el silenciado con vistas a la modificación de la composición de la semilla aceitosa.

Además, el silenciado génico no es un procedimiento sencillo tal como se aplica al algodón. Existen solamente unos pocos artículos en la bibliografía de la transformación del algodón utilizando construcciones génicas de silenciado génico, y estos artículos se limitan a la utilización de la tecnología de la cadena complementaria. Por ejemplo, se ha utilizado tecnología de la cadena complementaria para reducir la expresión de genes implicados en la síntesis de fibras, sin embargo, en este artículo las plantas transgénicas no presentaban un fenotipo detectable, a pesar de una reducción en la biosíntesis enzimática, lo que sugiere que el silenciado en los genes del algodón es impredecible.

GENERAL

Los expertos en la materia apreciarán que pueden introducirse en la invención descrita en la presente memoria otras variaciones y modificaciones además de las descritas específicamente. Debe apreciarse que la invención descrita en la presente memoria incluye todas estas variaciones y modificaciones. La invención incluye además, todas estas etapas, características, composiciones y compuestos citados o indicados en la presente memoria, individualmente o en conjunto, en alguna y todas las combinaciones de dos o más de dichas etapas o características.

En toda la presente memoria, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, la palabra “comprenden” y, variaciones tales como “comprende” y “comprendiendo”, se sobreentenderá que implican la inclusión de un número entero indicado o un grupo de números enteros o etapas pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. La presente invención no está limitada en alcance por las formas de realización específicas descritas en la presente memoria, las cuales se destinan a título de ilustración solamente. Los productos, composiciones y procedimientos funcionalmente equivalentes, están evidentemente dentro del alcance de la invención, tal como se describe en la presente memoria.

Los detalles bibliográficos de las publicaciones citadas en esta memoria se recogen al final de la descripción. La referencia en la presente memoria a la técnica anterior, incluyendo una cualquiera o más de los documentos de la técnica anterior, no debe considerarse como un reconocimiento, o sugerencia, de que dicha técnica anterior es de conocimiento general común en Australia o forma parte del conocimiento general común en Australia.

Tal como se utiliza en la presente memoria la expresión “procedente de” debe considerarse que indica un número entero específico o un grupo de números enteros se ha originado a partir de las especies especificadas, sino que no se ha obtenido necesariamente directamente de la fuente especificada.

La presente memoria contiene información de la secuencia nucleotídica preparada utilizando el programa Patentin Version 3.0, presentado en la presente memoria después de las reivindicaciones. Cada secuencia nucleotídica está identificada en el listado de secuencias por el indicador numérico <210> seguido de identificador de la secuencia

[p. ej., <210>1, <210>2, etc.]. La longitud, tipo de secuencia [ADN, proteína (PRT), etc.] y el organismo de origen para cada secuencia nucleotídica están indicados por la información proporcionada en los campos de indicador numérico <211>, <212> y <213>, respectivamente. Las secuencias nucleotídicas citadas en la memoria están definidas por la expresión “SEC. ID. nº:", seguido por el identificador de la secuencia [p. ej., SEC. ID. nº: 1 se refiere a la secuencia en el listado de secuencias designada como <400>1].

La denominación de los restos nucleotídicos citados en la presente memoria son las recomendadas por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission, en la que A representa Adenina, C representa Citosina, G representa Guanina, T representa Timidina, Y representa un resto de pirimidina, R representa un resto de purina, M representa Adenina o Citocina, K representa Guanina o Timidina, S representa Guanina o Citocina, W representa Adenina o Timidina, H representa un nucleótido distinto de Guanina, B representa un nucleótido distinto de Adenina, V representa un nucleótido distinto de Timidina, D representa un nucleótido distinto de Citocina y N representa cualquier resto nucleotídico.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En el trabajo que conduce a la presente invención, se pretendía desarrollar un aceite de semilla de algodón modificadas con características nutritivas y fisicoquímicas mejoradas, tales como, por ejemplo, aceites con características de estabilidad oxidativa y punto de fusión mejoradas, sin necesidad de hidrogenación, y aceites con características nutritivas mejoradas, en virtud de su composición modificada en ácido graso. Más específicamente, se pretendía desarrollar aceites de semilla de algodón de especialidad que sean bajos en ácido palmítico y/o linoleico, y/o que sean ricos en ácido esteárico y/o ácido oleico, utilizando una combinación de tecnología de ADN recombinante y métodos clásicos de cultivo de plantas. Para conseguir este objetivo, se consideró necesario desarrollar los medios para aplicar de manera reproducible métodos de silenciado génico al algodón, y para identificar genes para la biosíntesis del ácido graso específico en el algodón que se expresan de manera específica en la semilla.

Por consiguiente, un aspecto de la invención proporciona un procedimiento de producción de una planta de algodón transgénica con un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla, que comprende:

(i)

producir por medio de transformación plantas transgénicas de algodón que tienen una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen o un fragmento del gen del mismo de oleil-PC Δ12-desaturasa operativamente en relación con una secuencia promotora susceptible de dotar expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de una planta de algodón; y

(ii)

cultivar dichas plantas durante un tiempo y en condiciones suficientes para que la expresión del correspondiente gen endógeno de oleil-PC Δ12-desaturasa se reduzca en la semilla en virtud de la presencia de dicha secuencia nucleotídica en su genoma,

(iii) seleccionar una planta de algodón transgénica con un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla en comparación con una planta isogénica no transformada.

De acuerdo con este aspecto de la invención, se han aislado moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican estos genes de la biosíntesis del ácido graso, tales como, por ejemplo, las secuencias nucleotídicas del algodón ilustradas en la presente memoria como SEC. ID. nº: 3 y nº: 5. Estas secuencias nucleotídicas se han utilizado para desarrollar nuevas construcciones génicas capaces de producir sobreexpresión, supresión con sentido, cosupresión, supresión antisentido y silenciado génico después de la transcripción (PTGS) de varios genes de ácido graso del algodón.

Se han aislado también el gen ghFAD2-1 genómico que codifica la enzima Δ12desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa) (Ejemplo 10). La SEC. ID. nº: 7 muestra la secuencia nucleotídica del promotor ghFAD2-1. A este respecto, la SEC. ID. nº: 7 contiene suficiente secuencia nucleotídica para dotar de la expresión en un gen estructural al que está operativamente conectado en la semilla de algodón. En particular, los 5006 nucleótidos de la SEC. ID. nº: 7 incluye 3784 nucleótidos corriente arriba del punto de partida de la transcripción del gen FAD2 (posición 3785), el primer intrón del gen (nucleótidos 3889 a 4998) y la región 5’-no traducida entera (UTR) del gen ghFAD2-1 (nucleótidos 3785 a 5006).

En particular, se desarrollaron construcciones génicas para facilitar el silenciado o la expresión específica de la semilla reducida de los genes de la ácido graso Δ9-desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) y de los genes de ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa) del algodón. Las construcciones génicas se han introducido en explantes de algodón para producir células transformadas que han sido regeneradas posteriormente en plantas completas. Sorprendentemente, el aceite de semilla de algodón producido por estirpes transgénicas que contienen cualquiera de las construcciones génicas introducidas es bajo en comparación del ácido palmítico con el aceite de estirpes isogénicas no transformadas. Como se ilustra en la presente memoria, el nivel de ácido palmítico en el aceite de semilla de las estirpes de algodón transformadas, se reduce a aproximadamente 50% del nivel de ácido palmítico detectado por las plantas no transformadas. Además, las estirpes transformadas que contienen construcciones de silenciado génicas que se dirigen contra los genes de ácido graso de Δ9-desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) del algodón y los genes de ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa) tienen ácido esteárico elevado y ácido oleico elevado, respectivamente, en el aceite de semilla de algodón, en comparación con estirpes isogénicas no transformadas. Como se ilustra en la presente memoria, el silenciado del gen de la ácido graso Δ9-desaturasa del algodón (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) ha producido plantas de algodón que tienen tanto como 15 veces el contenido de ácido esteárico de las estirpes no transformadas, totalizando el ácido esteárico hasta aproximadamente el 40% del lípido total del aceite. En las estirpes de élite con ácido oleico elevado, este ácido graso se acumula a expensas del ácido linoleico, totalizando el ácido oleico tanto como aproximadamente el 80% del lípido de la semilla total.

Los niveles intermedios de estos ácidos grasos pueden obtenerse por modificación del nivel del promotor utilizado para regular la expresión del gen de la biosíntesis del ácido graso introducido, y/o mediante la selección de estirpes transgénicas específicas con niveles deseados de un ácido graso específico en el aceite, y/o por recombinación de los fenotipos de plantas específicas tales como por hibridación sexual convencional. Dichos procedimientos están dentro del saber de un experto.

Se ha demostrado además que es posible combinar los restos ricos en ácido oleico y en ácido esteárico, y obtener niveles intermedios de estos ácidos grasos, por cultivo vegetal convencional de las estirpes de élite, preferentemente sin comprometer las características de ácido palmítico reducido.

Por consiguiente, un aspecto adicional de la invención proporciona una planta de algodón que tiene aumentado el ácido oleico y de ácido esteárico en la semilla en la que dicha planta se produce por hibridación sexual entre una primera planta de algodón que tiene aumentado el ácido oleico en la semilla, en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada y una segunda planta de algodón que tiene aumentado el ácido esteárico en la semilla en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada, y en la que dicha planta de algodón y/o dicha segunda planta de almidón se produce(n) de acuerdo con el método de la invención de expresión por disminución de un gel seleccionado de entre el grupo constituido por genes de ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa).

En una forma de realización alternativa, la invención proporciona una planta de algodón transgénica que tiene disminuido el ácido palmítico en la semilla, en la que dicha planta es producida por hibridación sexual entre una primera planta de algodón y una segunda planta de algodón, y en la que dicha primera planta de algodón y/o dicha segunda planta de algodón se produce(n) según el procedimiento de la invención de la expresión de regulación por disminución de un gen seleccionado de entre el grupo constituido por los genes del ácido graso del algodón Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12desaturasa).

Un aspecto adicional de la invención proporciona una planta de algodón transgénica que comprende en su genoma una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12-desaturasa, o un fragmento génico del mismo, operativamente en relación con una secuencia promotora capaz de comunicar expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de dicha planta de algodón; y en la que la expresión del correspondiente gen endógeno de oleil-PC Δ12-desaturasa se reduce en la semilla en virtud de la presencia de dicha construcción génica en su genoma, y con un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla en comparación con una planta isogénica no transformada. Este aspecto de la invención se extiende desde luego a las plantas de algodón constituidos por la descendencia de las plantas primarias transformadas que comprenden el gen o el fragmento génico de la biosíntesis del ácido graso introducido. Este aspecto de la invención se extiende además a todas las partes de la planta, y, en particular, a la semilla procedente de la planta primaria transformada o su descendencia. Preferentemente, la semilla comprenderá el gen o un fragmento del gen de la biosíntesis del ácido graso introducido, y, más preferentemente, dicha semilla contendrá un aceite con una composición de ácido graso modificada según la invención (es decir, poco ácido palmítico y opcionalmente mucho ácido oleico y/o mucho ácido esteárico y/o poco ácido linoleico).

La presente invención se extiende desde luego a alguno y a todas las construcciones génicas utilizadas en el funcionamiento del procedimiento de la invención tal como se describió en la presente memoria. En particular, este aspecto de la invención proporciona una construcción génica que comprende la secuencia nucleotídica de un gen de la biosíntesis del ácido graso, o un fragmento génico del mismo, colocado operativamente en relación con un promotor de secuencia que es operable en la semilla de algodón, en la que dicho gen se selecciona de entre el grupo constituido por genes de ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa).

Los datos proporcionados en la presente memoria indican que las construcciones de silenciado génicas que comprenden repeticiones invertidas tanto de las regiones codificadoras como no codificadoras de los genes de ácido graso desaturasa pueden utilizarse para modular eficazmente la composición del aceite de semilla de algodón. Además, la construcción génica puede comprender una secuencia de repetición invertida que se destruye, tal como, por ejemplo, mediante la inclusión de una secuencia de intrón entre las repeticiones invertidas, para modular eficazmente la composición del aceite de semilla de algodón. Además, las construcciones génicas que comprenden repeticiones invertidas de secuencias no codificadoras, particularmente las secuencias no codificadoras en 5’, rotas (es decir, interrumpidas) por una secuencia de intervención son particularmente útiles porque producen un aumento del número de transformados primarios que tienen la composición de ácido graso modificada en relación con las referencias inalteradas.

Los datos proporcionados en la presente memoria, demuestran además que la invención puede realizarse utilizando diversas secuencias promotoras para regular la expresión de la construcción de silenciado génica en la semilla de algodón. El promotor génico ghFAD2-1 y el promotor del gen de lectina de la soja son particularmente preferidos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es una representación gráfica que muestra el contenido en aceites de semilla de algodón, y la composición del ácido graso, en los embriones de la semilla de algodón en desarrollo. Se recogieron y analizaron muestras de los embriones de la semilla de algodón a los 15 a 65 DAA.

La Figura 2 es una representación esquemática que muestra las secuencias nucleotídica y de aminoácidos deducida del clon de ADNc ghSAD-1 que codifica el polipéptido de estearoil-ACP Δ9-desaturasa del algodón (SEC. ID. nº: 1). El punto de partida de la traducción ATG está subrayado. Un asterisco indica el codón de terminación. Dos motivos de enlace al hierro, separados por aproximadamente 100 aminoácidos, están indicados en letra negrita. La flecha indica un punto de escisión del supuesto péptido de tránsito. El motivo de la firma de la familia II de ácido graso desaturasa está también subrayado.

La Figura 3 es una copia de una representación fotográfica de una hibridación por inmunotransferencia Northern de los embriones de la semillas del algodón en desarrollo y del tejido foliar del algodón. El panel (A) muestra un gel con ARN teñido con bromuro de etidio. El panel (B) muestra la señal de hibridación obtenida utilizando una sonda específica para ghSAD-1 marcada con [α-32P]dCTP. Las bandas 1 a 4 representan muestras de ARN aisladas de los embriones a los 25, 30, 36 y 45 DAA respectivamente. La banda 5 representa ARN aislado de hojas tiernas.

La Figura 4 es una copia de una representación fotográfica de una hibridación por inmunotransferencia Southern del ADN genómico del algodón, sondeo con secuencias nucleotídicas procedentes del clon ghSAD-1 del ADNc de la Δ9 estearoil-ACP desaturasa. El panel (A) muestra los fragmentos de ADN genómico que hibridan el 3’-UTR de ghSAD

1. El panel (B) presenta los fragmentos de ADN genómico que hibridan la región de codificación de ghSAD-1. Banda 1, ADN de G. barbadense; banda 2, G. hirsutum cv ADN de Deltapine-16; banda 3, G.hirsutum cv ADN de Siokra; banda 4, ADN de G. herbaceum y banda 5, ADN de G. raimondii.

La Figura 5 es una representación esquemática que muestra las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos deducidas del clon ghFAD2-1 de ADNc que codifica el polipéptido oleil-PC Δ12-desaturasa del algodón (SEC. ID. nº: 3). El punto de inicio de la traducción (ATG) está en letra negrita. El punto de cebado para el oligonucleótido Δ12A4, que se utilizó como cebador de la RCP para ampliar el extremo 5’ del gen está subrayado, y la flecha indica la dirección de 5’ a 3’ del cebador. El asterisco indica el codón de terminación.

La Figura 6 es una representación esquemática que muestra las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos deducidas del clon de una longitud de 1422 pres de base ghFAD2-2 de ADNc que codifica el polipéptido oleil-PC Δ12-desaturasa del algodón. El punto de inicio de la traducción (ATG) está en negrita. El asterisco indica el codón de terminación.

La Figura 7 es una representación esquemática de una alineación de la secuencia de aminoácidos entre ghFAD2-1 (SEC. ID. nº: 4), ω-6 desaturasa microsómica de Glycine max (gmFAD2-2; SEC. ID. nº: 31), ω-6 desaturasa microsómica de A.thaliana (atFAD2; SEC. ID. nº: 32), ω-6 desaturasa microsómica de G. max (gmFAD2-1; SEC. ID. nº: 33), ω-3 desaturasa microsómica de B. napus (bnFAD3; SEC. ID. nº: 34) y ω-6 desaturasa plástido de G.max (gmFAD6; SEC. ID. nº: 35). Los restos indicados en letra negrita son aminoácidos que están conservados entre todas las secuencias. Las áreas sombreadas indican los restos homólogos en una o más de las diferentes secuencias de desaturasa. Los puntos indican espacios introducidos para maximizar las alineaciones. Tres secuencias de histidina propuestas que son importantes en el enlace con el hierro están subrayadas. Seis repeticiones de glicina en el terminal C afín del polipéptido ghFAD2-1 también están subrayadas.

La Figura 8 es una representación esquemática de una hibridación por inmunotransferencia Northern de los embriones de la semillas del algodón en desarrollo y del tejido foliar del algodón. El panel (A) muestra un gel con ARN teñido con bromuro de etidio. El panel (B) muestra la señal de hibridación obtenida utilizando una sonda específica para ghFAD2-1 marcada con [α-32P]dCTP. El panel (C) muestra la señal de hibridación obtenida utilizando una sonda específica para ghFAD2-2 marcada con [α-32P]dCTP. Las bandas 1 a 4 representan muestras de ARN aisladas de embriones a los 25, 30, 36 y 45 DAA respectivamente. La banda 5 representa ARN aislado de hojas tiernas.

La Figura 9 es una copia de una representación fotográfica de una hibridación por inmunotransferencia Southern del ADN genómico del algodón, sondeo con secuencias nucleotídicas procedentes del clon ghFAD2-1 del ADNc de Δ12 estearoil-ACP desaturasa. El panel (A) muestra los fragmentos de ADN genómico que hibridan el 3’-UTR de ghFAD2-1. El panel (B) muestra los fragmentos de ADN genómico que hibridan el 3'-UTR de ghFAD2-2. El panel (C) muestra los fragmentos de ADN genómico que hibridan la región de codificación de ghFAD2-1. Banda 1, ADN de G. barbadense; banda 2, G. hirsutum cv ADN de Deltapine-16; banda 3, G.hirsutum cv ADN de Siokra; banda 4, ADN de G. herbaceum; banda 5, ADN de G. raimondii y banda 6, G. robinsonii.

La Figura 10 es una representación esquemática del sector binario pBI121, y del promotor del gen de lectina de soja y del terminador de pGLe-10, que se utilizaron para producir el vector binario de pBI-lectina.

La Figura 11 es una representación gráfica que muestra la distribución de frecuencia del ácido esteárico en 15 semillas individuales de algodón Coker (panel superior) y de 60 semillas T2 individuales procedentes de 4 plantas T1 de algodón transgénico que comprenden una repetición invertida del terminal 5’ del clon ghSAD-1 de ADNc (panel inferior).

La Figura 12 es una representación gráfica que muestra la distribución de frecuencia del ácido oleico en 15 semillas individuales de algodón Coker (panel superior) y de 75 semillas T2 individuales procedentes de 5 plantas T1 de algodón transgénico que comprenden una repetición invertida del terminal 5’ del clon ghFAD2-1 de ADNc (panel inferior).

La Figura 13 es una representación gráfica que muestra la relación entre el contenido en ácido esteárico (eje x) y ácido oleico (abcisas), como porcentaje de los ácidos grasos totales en 86 semillas de F2 procedentes del cruzamiento 125-23 x 95-150 que se clasifican como semillas ricas en ácido oleico (О), semillas ricas en ácido esteárico (Δ), semilla rica en ácido esteárico y rica en ácido oleico (♦) o semilla de tipo Coker 315 (◊). Los datos demuestran que los niveles de ambos ácidos grasos pueden modularse para producir combinaciones ricas en ácido esteárico y ácido oleico, que no se encuentran en la estirpe original transformada ni en la original Coker 315 no transformada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN PREFERIDAS

Un aspecto de la invención proporciona un procedimiento producción de una planta de algodón transgénica con un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla, que comprende:

(i)

producir mediante la transformación de plantas de algodón transgénico que tienen una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12-desaturasa o un fragmento génico de la misma operativamente en relación con una secuencia promotora capaz de proporcionar la expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de una planta de algodón; y

(ii)

cultivar dichas plantas durante un tiempo y en condiciones suficientes para que la expresión del correspondiente gen endógeno de oleil-PC Δ12-desaturasa se reduzca en la semilla en virtud de la presencia de dicha secuencia nucleotídica en su genoma,

(iii) seleccionar una planta de algodón transgénica con un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla en comparación con una planta isogénica no transformada.

Para el presente objetivo “algodón “se considera que se refiere a cualquier planta que pertenece algodón genero Gossypium y a algunas silvestres afines, a la especie progenitora, al plasma germinal, al cultivo o variedades del mismo y a cualquier plasma germinal derivado, cultivo o variedad de los mismos.

Sin limitar el alcance de la presente invención, las especies de algodón a la que es aplicable el procedimiento de la invención pueden ser cualquier especie seleccionada de entre el grupo constiuido por: G. anapoides, G. anomatum, G. arboreum, G. areyslanum,

G. aridum, G. armourianum, G. australe, G. barbadense, G.barbosanum, G. benadirense, G.bickii, G. briccetti, G. capitis-viridis, G. costulatum, G. cunninghamii, G. darwinii,

G. davidsonii, G. enthyle, G.e xiguum, G.g ossyploides, G. harknessil, G. herbaceum,

G. hirsutum, G. incanum, G.klotzschianum, G. laxum, G. lobatum, G. londonderriense,

G. longycalix, G. marchantii, G. mustelinum, G. nandewarense, G. nelsonli, G. nobile,

G. pilosum, G. populifolium, G. pulchelium, G. raimondii, G. robinsonii, G. rotundifolium,

G. scwendimantii, G. somalense, G. soudanense, G. stocksii, G. sturtianum, G. thurberi,

G. timorense, G. tomentosum, G. trilobum, G. triphyllum y G. viridis.

Los expertos en la materia apreciarán que una “variedad” de algodón es una planta de algodón que está contenida dentro de un taxón botánico individual del orden inferior conocido, tal como, por ejemplo, una planta que pertenece a una especie específica o un híbrido de dos especies, en la que dicha planta expresa una o más características estables que la distinguen de cualquier otro grupo o agrupación. “Cultivo” significa una variedad cultivada. En el presente contexto, “plasma germinal” se definirá como una o más características fenotípicas, o uno o más genes que codifican una o más de dichas características fenotípicas, capaces de transmitirse entre generaciones.

Ya que, el procedimiento de la invención se refiere a la modificación de aceites de algodón, no es necesario que el algodón sea una variedad que sea comercialmente exitosa o de utilidad económica en virtud de su contenido y/o composición del aceite. Convenientemente, el algodón en el que se aplica el procedimiento de la invención es una variedad cultivada, o cultivo o plasma germinal que pertenece a una Gossypium sp. seleccionada de entre el grupo constituido por G. barbadense, G. hirsutum,

G. tomentosum, G. arboreum y G. herbaceum, o una especie derivada, plasma germinal o variedad de las mismas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “progenitor” se referirá a cualquiera de las especies, variedades, cultivos o plasma germinal, de las que procede una planta. Como es conocido por los expertos en la materia, el algodón más comercialmente útil es un alotetraploide natural derivado por hibridación sexual entre precursores del progenitor diploide antiguo. Basándose en lo dado a conocer en la presente memoria, los expertos en la materia pueden llevar a cabo fácilmente el procedimiento de la invención en uno o más algodones diploides o alotetraploides y producir híbridos sexuales entre las plantas transgénicas producidas a partir de éstos. La presente invención comprende desde luego dichas alternativas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “especie derivada, plasma germinal o variedad” se definirá como cualquier especie vegetal, plasma germinal o variedad que se produzca utilizando una especie de algodón, variedad, cultivo o plasma germinal indicado, utilizando procedimientos convencionales de hibridación sexual, tecnología de ADN recombinante, cultivos de tejidos, mutagenia o una combinación de uno o más de dichos procedimientos. Por ejemplo, los expertos en la materia conocen que existe compatibilidad entre las variedades o cultivos en las especies G. barbadense,

G. hirsutum y G. tomentosum, de las que G. barbadense y G. hirsutum son de particular significado económico. En particular, se han producido híbridos interespecíficos entre

G. barbadense y G. hirsutum, y entre determinadas especies diploides, y la producción de dichos híbridos interespecíficos es rutinaria para los expertos en la materia.

Los cultivos de algodón en la élite preferidos incluyen alguno de los principales cultivos australianos y de los Estados Unidos, tales como, por ejemplo, Siokra L22, Siokra L23, Siokra L23i, Siokra V15i, Sicala V2, Sicala V2i, Sicala 33, Sicala 34, Sicot 189i, CS50, Acala R, Suregrow125, Suregrow501, Suregrow404, Deltapine50, Deltapine51, DES56, DES119, DES24, Delcott277, Aubum 257-202, Stoneville 603, Stoneville 213, PD2164, Frego25 y Arkot 8110, entre otros, o un derivado de los mismos. De estos cultivos, por lo menos Siokra L22, Siokra L23, Sicala 33 y Sicala 34 contienen normalmente nivles relativamente altos de ácido palmítico y ácido linoleico, y cantidades moderadas de ácidos grasos monoinsaturados. Por consiguiente, es un objetivo particularmente preferido de la siguiente invención para reducir el nivel de ácido palmítico, y/o para aumentar el nivel de ácido esteárico y/o de ácido oleico, en estos cultivos.

Resulta evidente para los expertos en la materia cómo producir híbridos sexuales entre dos o más especies, variedades, cultivos o plasmas germinales de algodón, y modificar posteriormente la composición del aceite de dichos híbridos sexuales basándose en lo dado a conocer en la presente memoria. Por consiguiente, el procedimiento de la invención incluye desde luego la primera etapa adicional de producción de tales híbridos sexuales.

De acuerdo con el concepto de la invención, la planta de algodón transgénica tiene un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla. Esto significa que el contenido en ácido palmítico endógeno total de la semilla disminuye con relación a una planta isogénica no transformada.

Preferentemente, el contenido relativo de uno o más ácidos grasos en el aceite de semilla de algodón aumenta o disminuye, y, más preferentemente el contenido de uno o más ácidos grasos C16:0 y/o C18:0 se modifica.

Todavía más preferentemente, el procedimiento de la invención proporciona los medios para modificar (es decir, aumentar o disminuir) el contenido de un ácido graso seleccionado de entre el grupo constituido por ácido palmítico, ácido oleico, ácido linoleico y ácido esteárico.

En una forma de realización, particularmente preferida de la invención, el procedimiento de la invención proporciona además los medios para modificar la composición del aceite de la semilla de algodón en la que la modificación consiste en una composición de ácido graso modificada seleccionada de entre el grupo constituido por:

(i)

contenido de ácido esteárico aumentado del aceite en relación con el aceite de una planta de algodón isogénica no transformada;

(ii)

contenido de ácido oleico aumentado del aceite en relación con el aceite de una planta de algodón isogénica no transformada; y

(iii) contenido de ácido linoleico disminuido del aceite en relación con el aceite de una planta de algodón isogénica no transformada.

La presente invención se extiende desde luego a alguno y a todos los efectos sobre el contenido y/o la composición de aceite que proceden de la producción de una planta de algodón transgénico que tiene uno o más genes o fragmentos génicos de biosíntesis del ácido graso introducidos en su genoma, y, en particular, a los efectos que incluyen una reducción en el nivel de ácido palmítico en el aceite de semilla de algodón. Tal como se ilustró en la presente memoria, el algodón transgénico que tiene un gen o fragmento génico de ácido graso Δ9-desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) de algodón introducido en su genoma produce un aceite con ácido palmítico disminuido y ácido esteárico aumentado en relación con el aceite de una planta de algodón isogénica no transformada mientras que el algodón transgénico que tiene un gen o fragmento génico de ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa) del algodón aislado introducido en su genoma, produce un aceite con ácido palmítico disminuido, ácido linoleico disminuido y ácido oleico aumentado, en relación con el aceite de una planta de algodón isogénica no transformada. Por consiguiente, la presente invención se extiende desde luego a alguno y a todas las combinaciones de las composiciones de ácido graso modificado relacionadas anteriormente en la presente memoria.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “en relación con una planta de algodón isogénica no transformada” o una expresión similar, se definirá como que un número entero indicado tiene un valor atribuido a esto en virtud de una comparación con el valor de este número entero obtenido en condiciones similares o idénticas de una planta de algodón no transformada de la misma especie de la que procede la planta de algodón transgénico. Preferentemente, dicha comparación se hace con referencia al material vegetal de partida, del que deriva la planta de algodón transgénica o el material de la planta que tiene el mismo contenido y composición de aceite que dicho material vegetal de partida.

El contenido en aceite de la semilla de algodón, o el contenido de cualquier ácido graso en el aceite de una semilla de algodón, puede determinarse convenientemente como proporción del lípido total de la semilla. Los procedimientos para determinar el contenido en lípidos de la semilla de algodón, y para determinar el contenido y/o la composición de ácidos grasos en el aceite de la semilla de algodón, son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, el contenido de lípidos total de la semilla de algodón o del aceite de semilla, puede determinarse utilizando el procedimiento descrito por Folsch et al.,(1957) o la modificación de este procedimiento descrito en la presente memoria. El contenido y/o composición en ácido graso del aceite de la semilla de algodón puede determinarse convenientemente utilizando cromatografía gas-líquido frente a ácidos grasos patrones conocidos, comparando los picos del éster metílico del ácido graso y los tiempos de retención de los patrones con la muestra que se está determinando, y por integración convencional de los picos obtenidos. Sin embargo, la presente invención no está limitada por el procedimiento de determinación del contenido y/o por la composición del aceite de la semilla de algodón, en particular por los medios para determinar el ácido graso u otros componentes de lípidos.

De acuerdo con el concepto de la invención, una planta de algodón como la descrita anteriormente en la presente memoria, incluyendo cualquier progenitor o especie derivada, está modificada por la introducción de un gen o un fragmento del mismo para la biosíntesis de ácidos grasos, para producir una planta transgénica. Resultará evidente a partir de la exposición anterior que, en aras de modificación del aceite de semilla de algodón según el concepto de la invención, el gen de biosíntesis de ácido graso se selecciona de entre el grupo constituido por los genes de ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa).

Con la idea de la nomenclatura, las expresiones “ácido graso Δ9-desaturasa” y “Δ9 estearoil-ACP desaturasa” se definirá como que se refieren a un péptido, polipéptido, proteína o enzima que es capaz de producir un doble enlace de carbono en la posición C-9 de un ácido graso C18:0 saturado, para formar un ácido graso C18:1-ACP (es decir oleil-ACP) ácido graso.

Las expresiones “ácido graso Δ12-desaturasa” y “oleil-PC Δ12-desaturasa” se definirá como que se refiere a un péptido, polipéptido, proteína o enzima que es capaz de producir un doble enlace carbono en la posición C12 de un ácido graso C18:1 monoinsaturado (es decir oleil-PC), para formar un ácido graso C18:2-PC (es decir linoleil-PC) ácido graso.

La referencia en la presente memoria a un gen debe considerarse en su contexto más amplio e incluye:

(i)

un gen genómico clásico constituido por secuencias reguladores de la transcripción y/o traducción y/o una región codificadora y/o secuencias no traducidas (es decir intrones, secuencias en 5’ y 3’ no traducidas); o

(ii)

ARNm o ADNc correspondiente a las regiones de codificación (es decir exones) y a las secuencias en 5’ y 3’ no traducidas del gen; o

(iii) ADN monocatenario o bicatenario ampliado que procede del subpárrafo (i) o del subpárrafo (ii).

El término “gen” se utiliza también para describir moléculas de síntesis o de fusión que codifican todo o parte de un producto funcional, que puede proceder de un gen natural, ARNm o ADNc, por técnicas recombinantes convencionales, incluyendo algunas secuencias nucleotídicas adicionales procedentes de una fuente homóloga o heteróloga que puede añadirse a (i) o (ii) o (iii) o a dichas moléculas de síntesis o de fusión.

En el presente contexto, la expresión “gen de biosíntesis de ácido graso” o expresión similar se refiere a cualquier gen que, en su contexto natural por lo menos, comprende una secuencia nucleotídica que es capaz de codificar una ácido graso Δ9desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) o una ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa) tal como se definió anteriormente en la presente memoria.

En el presente contexto, la expresión “fragmento génico” se definirá como una parte de un gen de biosíntesis de ácido graso completo tal como se definió anteriormente en la presente memoria, en el que dicha parte es de una longitud, orientación y configuración adecuada, que es capaz de modular la expresión de un gen endógeno para la biosíntesis de ácido graso del algodón cuando se introduce en, y preferentemente se expresa en, un órgano de producción de aceite del algodón, tal como, por ejemplo, la semilla, incluyendo cualquier secuencia de repetición directa o invertida procedente de dicho gen. Por consiguiente, el término “parte” incluye desde luego cualquier fragmento individual del gen completo en orientación con sentido o antisentido, y cualquier secuencia de repetición invertida que tenga autocomplementariedad parcial o completa, siendo el único requisito que dichas partes sean capaces de modular la expresión de un gen de biosíntesis de ácido graso endógeno cuando se introduce en el algodón. Con respecto en particular a las secuencias de repetición invertidas, dichas secuencias se calificarán además como partes del gen completo ya estén o no contiguas las secuencias repetidas,

o alternativamente, ya estén o no interrumpidas las secuencias repetidas por una o más secuencias nucleotídicas intervinientes, tales como, por ejemplo, una o más secuencias de intrón. Los expertos en la materia podrán fácilmente de determinar si un gen parcial o un fragmento de gen es o no de longitud, orientación y configuración adecuada con objeto de modificar el aceite de semilla de algodón sin la debida experimentación, según lo dado a conocer en la presente memoria.

En aras de definir más el gen de la biosíntesis de ácidos grasos y sus fragmentos génicos que se utilizan para llevar a cabo el procedimiento de la invención, en la presente memoria se proporcionan secuencias nucleotídicas que codifican, o son complementarias de las secuencias nucleotídicas que codifican enzimas de biosíntesis de ácido graso, y fragmentos génicos de dichas secuencias nucleotídicas y de secuencias nucleotídicas complementarias, en la que dichas secuencias de biosíntesis de ácidos grasos se seleccionan de entre el grupo constituido por enzimas de ácido graso Δ9-desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) y de ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa) tal como se definió anteriormente en la presente memoria.

Cuando se desea aumentar la expresión de un gen para la biosíntesis del ácido graso del algodón endógeno con objeto de modificar la composición del aceite de la semilla, tal como, por ejemplo, expresando ectópicamente un gen para la biosíntesis del ácido graso del algodón heterólogo o extraño en la semilla de algodón, la secuencia nucleotídica introducida es preferentemente capaz de expresarse en el algodón en el nivel de la proteína. Por consiguiente para conseguir tal, es preferible que la secuencia nucleotídica introducida, tenga una utilización de codón en cualquier parte de la misma que codifica la proteína que es adecuada para la traducción en una planta de algodón. Según la invención en la que se desea disminuir la expresión de un gen endógeno para la biosíntesis de ácido graso del algodón con objeto de modificar la composición del aceite de la semilla, resulta preferido que haya complementariedad suficiente entre los ARNm codificados por el gen introducido y el gen endógeno a fin de dificultar, prevenir o reducir la expresión del gen endógeno en la semilla de algodón, tal como, por ejemplo, por hibridación entre dichos ARNm en el núcleo y/o citoplasma. Como resulta evidente para los expertos en la materia, cualquier mejora que provenga de utilizar genes introducidos para la biosíntesis del ácido graso con preferencias de utilización del codón del algodón, y/o gran identidad de secuencia nucleotídica con un gen endógeno de algodón, puede proporcionarse convenientemente utilizando las secuencias nucleotídicas procedentes del algodón.

En aras de la nomenclatura, la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. nº: 1 se refiere a un gen de ácido graso Δ9-desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa), denominado ghSAD-1, que comprende un clon de ADNc de 1553 pb obtenido por los presentes inventores, y que codifica el polipéptido de ácido graso Δ9-desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) mostrado en la presente memoria como SEC. ID. nº: 2.

La secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. nº: 3 se refiere a un primer gen de ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa), denominado ghFAD2-1, que comprende un clon de ADNc de 1411 pb obtenido por los presentes inventores, y que codifica el polipéptido ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa) mostrado en la presente memoria como SEC. ID. nº: 4.

La secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. nº: 5 se refiere a un segundo gen de ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa), denominado ghFAD2-2, que comprende un clon de ADNc de 1422 pb obtenido por los presentes inventores, y que codifica el polipéptido ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa) mostrado en la presente memoria como SEC. ID. nº: 6.

La secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. nº: 7 se refiere a la secuencia nucleotídica del gen genómico ghFAD2-1 que se prolonga corriente arriba 5006 pb desde el punto de partida de la traducción del gen, pero sin incluir dicho punto de partida de la traducción. Por consiguiente, en una forma de realización particularmente preferida, la presente invención comprende la utilización de una secuencia nucleotídica seleccionada dentro el grupo constituido por un SEC. ID. nº: 1, SEC. ID. nº: 3, SEC. ID. nº: 5 y SEC. ID.

nº: 7, o cualquiera de las secuencias nucleotídicas homólogas a ésta, o la secuencia nucleotídica degenerada, o una secuencia nucleotídica complementaria a ésta o un fragmento génico de ésta, para modificar el aceite en el algodón.

Con el presente objeto, “homólogos” de una secuencia nucleotídica se referirán a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido que tiene la misma actividad enzimática que la codificada por una secuencia nucleotídica indicada, no obstante la aparición en dicha secuencia homóloga, de una o más sustituciones, inserciones, eliminaciones o reestructuraciones de nucleótidos en relación con la secuencia nucleotídica indicada. Por consiguiente, la presente invención se extiende desde luego a la utilización de homólogos de las secuencias nucleotídicas mostradas en la presente memoria, incluyendo algunos homólogos de secuencias nucleotídicas complementarias y homólogos a éstas de cualquier secuencia nucleotídica degenerada. Particularmente los homólogos preferidos son aquellos genes y fragmentos génicos para la biosíntesis de ácido graso procedentes de otras especies aparte del algodón.

Por ejemplo, existen numerosos ejemplos de secuencias nucleotídicas y de aminoácidos para los genes de Δ9-desaturasa de la planta clonada introducidos en la base de datos GenBank (Tabla 1), y la similitud de secuencias entre estos genes (Shanklin, 1998; Mekhedov et al., 2000) es suficiente para facilitar el aislamiento de los genes homólogos equivalentes de otras especies vegetales por sondeo heterólogo y/o ampliación. Para determinar supuestos homólogos de genes de Δ9-desaturasa de algodón, se lleva a cabo una alineación múltiple entre las secuencias derivadas de aminoácidos codificadas por los genes de Δ9-desaturasa de la planta clonada, tales como, por ejemplo, los genes listados en la Tabla 1, para identificar regiones de máxima conservación. Los oligonucleótidos degenerados se modifican a la inversa a continuación basándose en la secuencia de aminoácidos de consenso de una o más de dichas secuencias de aminoácidos muy conservadas. En un método para aislar homólogos del algodón, se sondan directamente bancos génicos de algodón (p. ej., bancos de ADNc específicos para la semilla o de ADN genómico) utilizando los oligonucleótidos en condiciones de hibridación de baja severidad. Alternativamente, los oligonucleótidos se utilizan como cebadores de RCP para ampliar supuestos fragmentos de Δ9-desaturasa procedentes del ARNm de la semilla, o de un banco de ADNc especifico para la semilla equivalente de algodón. Los fragmentos parciales del gen de Δ9-desaturasa obtenidos de este modo se utilizan a continuación como sondas para aislar secuencias génicas completas procedentes del banco de ADNc. Alternativamente, o además, una secuencia nucleotídica parcial o completa obtenida a partir de un gen de Δ9-desaturasa de la planta ya clonada puede utilizarse para sondar directamente un banco de genes del algodón. En el caso de una familia multigénica, tal como la familia de genes de Δ9-desaturasa del algodón, el gen o los genes principal(es) expresados por la semilla se determina a continuación analizando el modelo de expresión del gen en una variedad de tejidos, incluyendo la semilla, utilizando RT-PCR, análisis de hibridación northern, métodos de nuclear run-on o nuclear run-off, entre otros.

Se utilizan métodos similares para aislar homólogos expresados por la semilla de conocidos genes de Δ12-desaturasa de la planta clonada en la base de datos GenBank (Tabla 2).

“Secuencia nucleotídica degenerada” significa una secuencia nucleotídica que

5

10

15

20

-19

tiene la misma capacidad codificadora de proteínas que una secuencia nucleotídica mostrada en las SEC. ID. nº: 1, SEC. ID. nº: 3 o SEC. ID. nº: 5.

Los fragmentos génicos preferidos adecuados para su utilización en el funcionamiento del procedimiento de la invención comprenden por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos derivados de la secuencia génica completa, más preferentemente por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud y aún más preferentemente por lo menos aproximadamente 350 nucleótidos de longitud. En una forma de realización particularmente preferida, el gen de la biosíntesis del ácido graso utilizado en la realización del procedimiento de la invención comprende la secuencia nucleotídica codificadora de proteínas de un gen de biosíntesis de ácido graso natural, o una secuencia nucleotídica complementaria a éste. Dichos fragmentos génicos pueden comprender aproximadamente 500 a aproximadamente 850 nucleótidos de longitud, por ejemplo, procedentes de la región codificadora de proteínas de un gen para la biosíntesis de ácidos grasos.

No están excluidos los fragmentos génicos adicionales, siendo el único requisito que dichos fragmentos génicos sean capaces de utilizarse para modular con éxito la expresión de un gen endógeno para la biosíntesis del ácido graso del algodón.

Tabla 1

Lista de genes microsómicos de Δ9-desaturasa y secuencias relacionadas

Especie vegetal nº de registro Referencia

Arabidopsis thaliana

X93461 GenBank X93461

Arachis hypogaea

AF172728 Tate et al.,1999

Brassica napus

X63364 Slocombe et al.,1992

Brassica juncea

AF153420 Vageeshbau et al., 1999

Brassica rapa

X60978 Knutzon et al.,1992

Elaeis guineensis

U68756 Shah and Rashid, 1996

Sesamum indicum

D42086 Yukawa et al., 1994

Carthamus tinctorius

M61109 Thompson et al., 1991

Coriandrum sativum

M93115 Cahoon et al.,1992

Cucumis sativa

M59858 Shanklin et al., 1991

G. hirsutum

AJ132636 Liu et al.2000

G. hirsutum

AI730379 Blewitt et al.,1999

Glycine max

L34346 Chen and Moon, 1995

Helianthus annuus

U70374 GenBank U70374

Linum usitatissimum

X90762 Singh et al., 1994

Linum usitatissimum

AJ006957 Jain, 1998

Linum usitatissimum

AJ0069578 Jain, 1998

Asclepias syriaca

U60277 Cahoon et al.,1997

Olea europaea

U58141 Baldoni et al., 1996

Pelargonium xhortorum

U40344 Schultz et al.,1996

Persea americana

AF116861 Madi and Pruskey, 1999

(continuación) Oryza sativa D38953 Akagi et al., 1995 Ricinus communis M59857 Shanklin et al., 1991 Sesamum indicum D42086 Yukawa et al., 2000 Solanum commersonii X78935 GenBank X78935 Simmondsia chinensis M83199 Sato et al.,1992 Spinacia oleracea X62898 Nishida et al., 1992 Solanum tuberosum M91238 Taylor et al., 1992

T. alata pTAD2 U07597 Cahoon et al., 1994

T. alata pTAD3 U07605 Cahoon et al., 1994

T. alata �6-δεσατυρασε U09269 Cahoon et al.,1994

Tabla 2

Lista de genes microsómicos de Δ12-desaturasa y secuencias relacionadas Especie vegetal ADNc o gen nº de registro Referencia

Arabidopsis thaliana ADNc L26296 Okuley et al., 1994 Arachis hypogaea ADNc AF030319 Jeong et al., 1997 Arachis hypogea ADNc AF030319 Jeong et al., 1994 Borago officinalis ADNc AF074324 Sayanova et al 1998 Brassica carinata ADNc AF124360 Marillia et al.,1999 Brassica juncea ADNc X91139 Singh et al., 1995 Brassica oleracea ADNc AF181726 Fourmann et al 1999 Brassica rapa ADNc AF042841 Tanhuanpaa 1999 Crepis alpina ADNc Y16285 Lee et al., 1998 Crepis palaestina ADNc CPY16284 Lee et al., 1998 Glycine max ADNc L43920 Heppard et al., 1996 Glycine max ADNc L43921 Heppard et al., 1996

G. hirsutum ADNc X97016 Liu et al., 1999

G. hirsutum ADNc Y10112 Liu et al., 1999 Helianthus annuus ADNc U91341 Hongtrakul et al 1997 Impatiens balsamina ADNc AF182520 Cahoon et al., 1999 Lactuca sativa ADNc AF162199 Lee et al., 1999 Lesquerella fendleri ADNc AF016104 Broun et al., 1998 Momordica charantia ADNc AF182521 Cahoon et al., 1999 Mucor rouxii ADNc AF161219 Passorn et al., 1999 Petroselinum crispum ADNc U86072 Somssich et al., 1997 Prunus armeniaca ADNc AF071892 Mbeguie-A-Mbeguie Richnus communis ADNc U22378 Van der Loo, 1995 Solanum commersonii ADNc X92847 Grillo, 1995 Vernonia galamensis ADNc AF188263 Hage et al., 1999 Vernonia galamensis ADNc AF188264 Hage et al., 1999

G. arboreum gene AJ244914 Liu et al.,2000 G australe gen AJ244901 Liu et al.,2000

G. australe gen AJ244902 Liu et al.,2000

G. australe gen AJ244903 Liu et al.,2000

G. barbadense gen AJ244918 Liu et al.,2000

(continuación)

G. barbadense gen AJ244919 Liu et al.,2000

G. bickii gen AJ244904 Liu et al.,2000

G. bickii gen AJ244905 Liu et al., 2000

G. bickii gen AJ244906 Liu et al.,2000

G. costulatum gen AJ244889 Liu et al.,2000

G. cunninghamii gen AJ244890 Liu et al.,2000

G. darwinii (A) gen AJ244920 Liu et al.,2000

G. darwinii (D) gen AJ244921 Liu et al.,2000

G. enthyle gen AJ244891 Liu et al.,2000

G. exiguum gen AJ244892 Liu et al.,2000

G. gossypioides gen AJ244912 Liu et al.,2000

G. herbaceum gen AJ244915 Liu et al.,2000

G. hirsutum (A) gen AJ244922 Liu et al., 2000

G. hirsutum (D) gen AJ244923 Liu et al.,2000

G. klotzschianum gen AJ244910 Liu et al., 2000

G. Iondonderriense gen AJ244893 Liu et al., 2000

G. marchantii gen AJ244894 Liu et al.,2000

G. mustelinum (A) gen AJ244924 Liu et al.,2000

G. mustelinum(D) gen AJ244925 Liu et al.,2000

G. nelsonii gen AJ244907 Liu et al.,2000

G. nelsonii gen AJ244908 Liu et al.,2000

G. nobile gen AJ244895 Liu et al.,2000

G. pilosum gen AJ244896 Liu et al.,2000

G. populifolium gen AJ244897 Liu et al.,2000

G. pulchellum gen AJ244898 Liu et al.,2000

G. raimondii gen AJ244913 Liu et al.,2000

G. robinsonii gen AJ244884 Liu et al.,2000

G. robinsonii gen AJ244885 Liu et al.,2000

G. rotundifolium gen AJ244899 Liu et al.,2000

G. somalense gen AJ244916 Liu et al.,2000

G. species novum gen AJ244900 Liu et al.,2000

G. stocksii gen AJ244917 Liu et al.,2000

G. sturtianum gen AJ244886 Liu et al.,2000

G. sturtianum gen AJ244887 Liu et al.,2000

G. sturtianum gen AJ244888 Liu et al.,2000

G. tomentosum (A) gen AJ244926 Liu et al.,2000

G. tomentosum (D) gen AJ244927 Liu et al.,2000

G. trilobum gen AJ244909 Liu et al.,2000

G. turneri gen AJ244911 Liu et al.,2000

“Expresión” significa transcripción y/o traducción con o sin posteriores episodios tras la traducción que modifican la actividad biológica, la localización celular o subcelular, 5 el recambio, el nivel en estado estacionario de la molécula de péptido, polipéptido, oligopéptido, proteína o enzima.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “modular la expresión”, o

expresión similar, se definirá como que la expresión de un número indicado se ha potenciado, aumentado o disminuido, o que la expresión de un número entero indicado se ha retardado, inhibido o activado. Dicha modulación de la expresión puede ponerse de manifiesto mediante el ensayo directo del número entero, tal como, por ejemplo, por comparación de las señales obtenidas en una hibridación northern, RT-PCR, u otros medios para medir los niveles en estado estacionario de ARNm, o alternativamente, comparando los niveles de proteínas en la célula utilizando ELISA u otro inmunoanálisis, SDS/PAGE, o análisis enzimático. Alternativamente, la modulación de la expresión puede ponerse de manifiesto por una modificación en el fenotipo asociada a un número entero indicado, tal como, por ejemplo, determinando la composición en ácidos grasos del aceite.

En el presente contexto, la expresión “modular la expresión de un gen para la biosíntesis de ácido graso del algodón endógeno” se definirá como que se modifica la expresión de un gen para la biosíntesis de ácidos grasos presente en una planta de algodón, y/o que se modifica la actividad enzimática de una enzima para la biosíntesis de ácidos grasos en el algodón, a pesar de que dicho efecto pueda ser producido por la expresión ectópica de una secuencia nucleotídica heteróloga (es decir extraña) o introducida en el algodón, o aumentando el número de copias de genes para la biosíntesis de ácidos grasos del algodón, siendo el único requisito que dichos efectos sean directa o indirectamente atribuibles a la presencia de un gen o fragmento génico del mismo para la biosíntesis de ácidos grasos introducidos.

Los expertos en la materia apreciarán si la expresión génica ha sido modificada por la realización de la invención en el algodón, sin indebida experimentación. Por ejemplo, el nivel de expresión de un gen especifico puede ser determinado por la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) seguida de transcripción inversa de una molécula plantilla de ARNm, esencialmente como describe McPherson et al., (1991). Alternativamente, el nivel de expresión de una secuencia genética puede determinarse por análisis de hibridación en mancha o por análisis de hibridación in situ o técnica similar, en los que el ARNm se transfiere a un soporte de membrana y se hibrida a una molécula de sonda que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia nucleotídica del ARNm transcrito codificado por el gen de interés, marcado con una molécula indicadora adecuada tal como un dNTP marcado con radioactividad (por ejemplo, [α-32P]dCTP o [α35S]dCTP) o dNTP biotinilado, entre otros. La expresión puede determinarse entonces detectando el aspecto de una señal producido por la molécula indicadora unida a la molécula de la sonda hibridada. Alternativamente, la velocidad de transcripción de un gen específico puede determinarse por experimentos de run-on nuclear y/o run-off nuclear, en los que se aíslan los núcleos de una célula o tejido específico y se determina la velocidad de incorporación de los NTPr en las moléculas de ARNm específicas. Alternativamente, puede determinarse la expresión de un gen específico por el análisis de protección de la RNasa, en la que una sonda de ARN marcada o “ribosonda” que es complementaria con la secuencia nucleotídica del ARNm codificado por dicho gen, se hibrida con dicho ARNm durante un tiempo y en condiciones suficientes para que se forme una molécula de ARNm bicatenaria, tras lo cual la muestra se somete a digestión por la RNasa para eliminar las moléculas de ARN monocatenario y en particular, para eliminar el exceso de ribosonda sin hibridar. Dichos métodos están descritos con detalle por Sambrook et al., (1989) y Ausubel (1987). Los expertos en la materia conocen varios métodos inmunológicos y enzimáticos para detectar el nivel de expresión de un gen específico en la proteína, por ejemplo, utilizando inmunoelectroforesis cuantitativa unidimensional, ELISA, radioinmunoanálisis y

técnicas de inmunoelectroforesis de inmunotransferencia western, entre otras.

Preferentemente, el gen o fragmento génico para la biosíntesis de ácidos grasos está en un formato adecuado para la expresión ectópica de un polipéptido para la biosíntesis de ácidos grasos en el algodón, o alternativamente, para el silenciado o la disminución de la expresión de un gen para la biosíntesis de ácidos grasos endógeno en el algodón.

Como conocerán los expertos en la materia, para expresar ectópicamente un polipéptido, la región del gen estructural que codifica dicho polipéptido se coloca en la orientación normal en relación operable con una secuencia promotora adecuada a fin de proporcionar la transcripción y traducción en la célula. En el presente contexto, a medida que dicha expresión ectópica se pretende conducir a un aumento en la actividad de un polipéptido para la biosíntesis de ácidos grasos, es esencial para la región del gen estructural codificar un polipéptido con actividad enzimática en la semilla de algodón. Por consiguiente, pueden utilizarse las secuencias nucleotídicas mostradas en la presente memoria o algunos fragmentos de las mismas que codifican enzimas funcionales, y algunas secuencias nucleotídicas degeneradas, o secuencias génicas homólogas a éstas procedentes de otras especies.

Aunque sin estar vinculados a ninguna teoría o modo de acción, los medios para el silenciado o de otro modo reducción de la expresión de un gen endógeno para la biosíntesis de ácidos grasos en el algodón incluyen medios que dirigen la transcripción y/o la estabilidad del ARNm y/o el recambio de ARNm y/o la accesibilidad del ARNm a los ribosomas o polisomas. Dichos medios incluyen la supresión con sentido, la cosupresión, la cosupresión antisentido, el silenciado génico mediado por ribosomas y el silenciado génico después de la transcripción (PTGS). Como en la expresión ectópica de los genes, es preferible introducir el ácido nucleico en relación operable con una secuencia promotora a fin de silenciar o sino reducir la expresión de un gen endógeno para la biosíntesis de ácidos grasos en el algodón.

La supresión con sentido y la cosupresión de la expresión génica utilizan secuencias nucleotídicas que están colocadas en la orientación normal en un formato expresable (es decir “moléculas transcritas”). Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “molécula transcrita” hará referencia a una molécula aislada de ácido nucleico que codifica o es complementaria con una molécula de ácido nucleico aislada que es capaz de codificar un polipéptido para la biosíntesis de ácidos grasos, incluyendo los polipéptidos completos que tienen actividad enzimática y los fragmentos de los mismos que carecen de actividad enzimática, en los que dicha molécula de ácido nucleico se proporciona en un formato adecuado para la expresión cuando se introducen en una planta de algodón por transfección o transformación.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “cosupresión” se definirá como una reducción en la expresión de un gen endógeno para la biosíntesis de ácidos grasos del algodón que se produce cuando se introducen en la célula una o más copias de dicho gen o una o más copias de un gen sustancialmente similar. La presente invención se extiende desde luego a la utilización de la cosupresión para inhibir la expresión de un gen endógeno para la biosíntesis de ácidos grasos en el algodón.

En la expresión “supresión con sentido” la expresión del gen endógeno para la biosíntesis de ácidos grasos disminuye en virtud de la expresión en la célula de una molécula transcrita dominante-negativa. Por ejemplo, una molécula transcrita, que codifica un polipéptido enzimáticamente inactivo para la biosíntesis de ácidos grasos, puede ser expresada en la semilla. Alternativamente, una molécula transcrita que codifica una especie de ARNm parcial o completo puede introducirse en el genoma del algodón de modo que los episodios de la inserción del transgén conduzcan a una reducción en la expresión tanto del gen endógeno como del transgén. Las moléculas transcritas dominantes-negativas comprenderán por lo menos uno o más dominios de proteína funcional de la proteína natural, tal como, por ejemplo, un dominio que está implicado en la dimerización con otras subunidades de polipéptido de una holoenzima funcional.

En el contexto de la presente invención, la expresión “supresión antisentido” se definirá como una supresión de la expresión génica que es mediada por la expresión de una molécula complementaria en la planta de algodón. Una “molécula complementaria” es una molécula de ARN que se produce por transcripción de la cadena de ADN que es complementaria con la que se transcribe normalmente para producir una molécula de ARNm “transcrita” capaz de traducirse en un polipéptido para la biosíntesis de ácidos grasos. La molécula complementaria es por lo tanto complementaria con el ARNm transcrito, o una parte del mismo. Aunque sin limitar el modo de actuación de las moléculas complementarias de la presente invención a ningún mecanismo específico, la molécula de ARN complementaria posee la capacidad de formar un ARNm bicatenario por emparejamiento de bases con el ARNm transcrito, que puede evitar la traducción del ARNm transcrito y la posterior síntesis de un polipéptido funcional para la biosíntesis de ácidos grasos.

Los ribozimas son moléculas de ARN sintético que comprenden una región de hibridación complementaria con dos regiones cada una de por lo menos 5 bases nucleotídicas contiguas en el ARNm diana transcrito. Además, los ribozimas poseen actividad de endorribonucleasa muy específica, que escinde autocatalíticamente el ARNm diana transcrito. Haselof y Gerlach (1988) presentan una descripción completa de la función de los ribozimas y está contenida en la solicitud de patente internacional nº WO 89/05852. La presente invención se extiende a los ribozimas que dirigen un ARNm transcrito que codifica un polipéptido para la biosíntesis de ácidos grasos del algodón endógeno, de modo que ya no es capaz de trasladarse para sintetizar un producto polipeptídico funcional.

En el contexto de la presente invención, el silenciado génico tras la transcripción (PTGS) es una reducción en la expresión génica que se produce introduciendo ácido nucleico a la célula que comprende una primera secuencia nucleotídica capaz de transcribirse en el ARNm transcrito, unida en la configuración cabeza con cabeza o cola con cola, con o sin ninguna intervención de secuencias nucleotídicas a una segunda secuencia nucleotídica capaz de transcribirse en el ARNm complementario, de modo que la molécula completa de ARNm que está transcrita procedente de dicho ácido nucleico comprende una secuencia de repetición invertida con autocomplementariedad. Aunque sin estar unido por ninguna teoría o modo de acción, el transcrito tiene potencial para formar una estructura secundaria, tal como, por ejemplo, un bucle en horquilla, en el núcleo y/o el citosol de una célula y para secuestrar el ARNm transcrito que está transcrito en ésta, de modo que las regiones monocatenarias del ARNm secuestrado se degradan rápidamente y/o se forma un complejo inactivo desde el punto de vista de la traducción. Las secuencias nucleotídicas que comprenden la repetición invertida incluyen la secuencia completa del gen diana, o un fragmento génico de la misma, incluyendo las secuencias nucleotídicas tanto de codificación como las no traducidas.

Como se ilustra en la presente memoria, puede realizarse PTGS muy eficaz utilizando fragmentos génicos de aproximadamente 90 nucleótidos de longitud o mayores, procedentes del extremo codificador 5’ o no codificador del gen diana, unido en configuración cabeza con cabeza o cola con cola. Sin embargo, la presente invención comprende desde luego la utilización de secuencias repetidas invertidas procedentes de los fragmentos de menos de 90 nucleótidos de longitud, y procedentes de otras regiones aparte del extremo 5’ del gen diana. En particular, la presente invención contempla la utilización de fragmentos génicos de solamente aproximadamente 25 nucleótidos de longitud o mayores, procedentes del extremo 5’ o 3’ de la secuencia nucleotídica diana, tal como, por ejemplo, 25 pb procedentes de los 5’-UTR o 3’-UTR de los ADNc de ghSAD-1 o ghFAD2-1. Como resultará evidente para los expertos en la materia las secuencias mayores de 90 nucleótidos de longitud son también útiles en la realización de la invención.

Además, la presente invención se extiende desde luego a la utilización de repeticiones invertidas que son repeticiones invertidas continuas de fragmentos génicos, o alternativamente, en la que cada fragmento génico que comprende la repetición invertida está separado o interrumpido, por la inserción de una o más de secuencias nucleotídicas intervinientes. La utilización de secuencias de intrón para espaciar o interrumpir cada uno de los fragmentos génicos que comprende la repetición invertida está particularmente contenida en la invención. La secuencia del intrón que se utiliza en esta forma de realización puede ser cualquier secuencia de intrón, y preferentemente, aunque no necesariamente, una secuencia de intrón vegetal. Tal como se ilustra en la presente memoria, se ha utilizado una repetición invertida de aproximadamente 90 nucleótidos de la región 5’ sin traducir del gen endógeno ghFAD2-1 en el que la repetición es destruida por la secuencia completa del intrón-1 del gen.

La presente invención se extiende desde luego a la utilización de otros fragmentos génicos en la realización del procedimiento de la invención aparte de los ilustrados específicamente en la presente memoria. Los fragmentos génicos preferidos para su utilización en los métodos complementario y/o de PTGS comprenderán una secuencia nucleotídica consistente por lo menos en aproximadamente 10 a 20 nucleótidos del gen diana para la biosíntesis de ácidos grasos, más preferentemente por lo menos aproximadamente 50 a 100 nucleótidos, o un transcrito de ARNm completo o sustantivo completo codificado por dicho gen diana.

En la técnica se entiende que pueden introducirse determinadas modificaciones, incluyendo sustituciones de nucleótidos, a los genes y fragmentos de genes utilizados en la realización del procedimiento de la invención, sin destruir la eficacia de dichas moléculas en la modulación de la expresión de un gen para la biosíntesis del ácido graso endógeno. Por consiguiente esta dentro del alcance de la presente invención incluir algunas variantes de secuencias nucleotídicas, homólogos o análogos de dichos genes y fragmentos de genes. Los genes y fragmentos de genes con utilidad en el procedimiento de la invención comprenderán preferentemente una secuencia nucleotídica que tiene por lo menos aproximadamente 60 a 70% de identidad, más preferentemente por lo menos aproximadamente 70 a 80% de identidad, aún más preferentemente por lo menos aproximadamente 80 a 90% de identidad o por lo menos aproximadamente 95 a 99% de identidad con la secuencia nucleotídica de un gen para la biosíntesis del ácido graso que se muestra en una cualquiera o más de las SEC. ID. nº: 1, nº: 3 o nº: 5 o nº: 7, o un fragmento génico de las mismas, o una secuencia nucleotídica complementaria de las mismas.

La referencia en la presente memoria a un porcentaje de identidad o al porcentaje de similitud entre dos o más secuencias de nucleótidos o de aminoácidos aludirá al número de restos idénticos o similares en una alineación de la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos determinada utilizando cualquier algoritmo convencional conocido por los expertos en la materia. En particular, las identidades y similitudes de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos puede calcularse utilizando el programa GAP, que utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) para maximizar el número de emparejamientos de restos y minimizar el número de huecos en la secuencia. El programa GAP es parte del Sequence and Analysis Software Package of the Computer Genetics Group Inc., University Research Park, Madison, Wisconsin, Estados Unidos de América (Devereux et al., 1984). En las comparaciones de la secuencia de nucleótidos y aminoácidos que no contienen huecos, el porcentaje de identidad puede calcularse a partir de una comparación directa del número de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre, como puede ser el caso, los expresados en porcentaje del número total de nucleótidos o aminoácidos en las secuencias.

En una forma de realización alternativa, los genes y fragmentos de genes utilizados en la realización del procedimiento de la invención comprenderán preferentemente una secuencia nucleotídica que es capaz de hibridarse por lo menos en condiciones de baja severidad, más preferentemente por lo menos en condiciones de moderada severidad y aún más preferentemente por lo menos en condiciones de alta severidad, a una cualquiera o más de las SEC. ID. nº: 1, nº: 3, nº: 5 o nº: 7, o un fragmento génico de las mismas, o una secuencia nucleotídica complementaria de las mismas.

Con el fin de definir el nivel se severidad, los expertos en la materia conocerán que pueden utilizarse varias condiciones de hibridación diferentes. Por ejemplo, una baja severidad puede comprender una hibridación y/o un lavado realizado en 6 x tampón SSC, SDS al 0,1% (p/v) a 28ºC o a temperatura ambiente. Una severidad moderada puede comprender una hibridación y/o lavado realizados en 2 x tampón SSC, SDS al 0,1% (p/v) a una temperatura comprendida en el intervalo entre 45ºC y 65ºC. Una alta severidad puede comprender una hibridación y/o lavado realizados en 0,1 x tampón SSC, SDS al 0,1% (p/v)

o tampón Church a una temperatura de por lo menos 65ºC. Variaciones de estas condiciones son conocidas por los expertos en la materia.

Generalmente, la severidad aumenta al reducir la concentración de tampón SSC, y/o al aumentar la concentración de SDS en el tampón de hibridación o tampón de lavado y/o al aumentar la temperatura a la que se realizan la hibridación y/o el lavado. Las condiciones para las hibridaciones y lavados son bien entendidas por un experto en la materia normalmente. A título de clarificación de los parámetros que afectan la hibridación entre las moléculas de ácido nucleico, puede hacerse referencia convenientemente a las páginas 2.10.8 a 2.10.16. de Ausubel et al.(1987), que se incorpora a la presente memoria por alusión.

La introducción de un gen para la biosíntesis del ácido graso, o de un fragmento génico del mismo, en el algodón y la expresión pueden facilitarse proporcionando dicho gen o fragmento génico en relación operable con una secuencia promotora adecuada, en forma de construcción génica o molécula del vector. Por consiguiente, la presente invención se extiende desde luego a la utilización de construcciones y vectores génicos diseñados para facilitar la introducción y/o expresión de los genes introducidos y de los fragmentos génicos en el algodón, y particularmente, en la semilla de algodón.

En el presente contexto, la expresión “una construcción génica” se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico que comprenda una o más moléculas de ácido nucleico extraño que comprende la secuencia nucleotídica del gen para la biosíntesis de ácido graso y/o un fragmento del mismo, en una forma adecuada para introducir en una célula, tejido, órgano vegetal o parte de la planta, incluyendo un plantón, y preferentemente que es capaz de integrarse en el genoma de una planta.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la palabra “vector” aludirá a una secuencia lineal o circular de ADN que incluye una construcción génica como se definió anteriormente en la presente memoria, y que incluye cualquier secuencia nucleotídica adicional para facilitar la replicación en una célula hospedadora y/o la integración y/o el mantenimiento de dicha construcción génica o de una parte del mismo en el genoma de la célula hospedadora.

Los vectores preferidos incluyen plásmidos, cósmidos, vectores víricos vegetales, y similares, tales como, por ejemplo, un plásmido o cósmido que contiene T-ADN para facilitar la integración del ácido nucleico extraño en el genoma de la planta, tal como, por ejemplo, vectores binarios de transformación, vectores de trasformación super-binarios, vectores cointegrados de transformación, vectores de transformación derivados de Ri, adecuados para su utilización en cualquier procedimiento de transformación del algodón.

El término “vector” además se considerará que incluye cualquier partícula o célula de virus recombinante, en particular una célula bacteriana o una célula vegetal que comprende la construcción génica de la invención. Por ejemplo, un virus gemini, entre otros, puede ser modificado genéticamente para que contenga el gen de la biosíntesis del ácido graso o un fragmento génico del mismo, o alternativamente, una construcción génica que contiene el gen para la biosíntesis del ácido graso o el fragmento génico puede introducirse en Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes, para la transferencia posterior al algodón tal como se describió anteriormente en la presente memoria.

En una forma de realización particularmente preferida, la construcción génica contiene el gen para la biosíntesis del ácido graso o el fragmento génico del mismo clonado dentro de un vector de transformación binario, tal como, por ejemplo, el vector de transformación binario pBI121 que es bien conocido por los expertos en la materia por ser adecuado para la transformación mediada por Agrobacterium en virtud de la presencia de las secuencias del extremo izquierdo y derecho del T-ADN, y el gen estructural NPTII colocado operativamente en relación con la secuencia promotora de nopalina sintasa que comunica resistencia a las células vegetales que transportan el plásmido al antibiótico kanamicina.

La referencia en la presente memoria a un “promotor” ha de considerarse en su contexto más amplio e incluye las secuencias reguladoras de la transcripción de un gen genómico eucariótico clásico, que incluye la secuencia TATA que se requiere para la iniciación de la transcripción precisa, con o sin una secuencia CCAAT y los elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias de activación corriente arriba, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta a los estímulos de desarrollo y/o externos, o de manera específica para el tejido, siendo solamente el requisito, que dicha secuencia promotora sea capaz de comunicar expresión en un gen para la biosíntesis de ácido graso o un fragmento génico tal como se describe en la presente memoria, en una planta de algodón, y más particularmente, en la semilla de algodón.

En el presente contexto, el término “promotor” se utiliza también para describir una molécula sintética o de fusión, o un derivado que proporciona, activa o potencia la expresión de dicha molécula transcrita en algodón. Los promotores preferidos pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos, para aumentar más la expresión y/o para alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de una molécula de ácido nucleico a la que está conectada de manera operativa.

Colocar una molécula de ácido nucleico bajo el control regulador de una secuencia promotora significa colocar dicha molécula de modo que la expresión esté controlada por la secuencia promotora. Un promotor esta normalmente, pero no necesariamente, situado corriente arriba de 5’ de una molécula de ácido nucleico que lo regula. Además, los elementos reguladores que comprenden un promotor están normalmente colocados dentro de 2 kb del punto de partida de la transcripción del gen o del fragmento génico cuya expresión regula. En la construcción de combinaciones heterólogas promotor/gen estructural, resulta preferido generalmente situar el promotor a una distancia del punto de partida de la transcripción del gen que es aproximadamente la misma que la distancia entre este promotor y el gen que le controla en su escenario natural, es decir, el gen del que procede el promotor. Como es conocido en la técnica, alguna variación en esta distancia puede acomodarse sin pérdida de la función promotora. Asimismo, la localización preferida de un elemento de la secuencia reguladora con respecto a un gen heterólogo que va a situarse bajo su control está definida por la localización del elemento en su posición natural, de cuyos genes procede. De nuevo, como es conocido en la técnica, puede ocurrir también alguna variación en esta distancia.

Los promotores adecuados para utilización en construcciones genéticas de la presente invención incluyen promotores procedentes de los genes de virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas que son capaces de funcionar en el algodón. El promotor puede proporcionar expresión constitutivamente en toda la planta, o de manera diferenciada con respecto a la semilla de algodón, o de manera diferenciada con respecto a la etapa de desarrollo de la semilla en la que se produce la expresión, o en respuesta a estímulos externos tales como tensiones fisiológicas, patógenos o iones metálicos, entre otros.

Los promotores a título de ejemplo adecuados para su utilización en el procedimiento de la invención están listados en la Tabla 3. Los promotores listados en la Tabla 3 se proporcionan únicamente a título ilustrativo y la presente invención no está limitada por la lista proporcionada en la presente memoria. Los expertos en la materia

5

10

15

20

25

30

35

-29

podrán proporcionar promotores adicionales que son útiles en la puesta en práctica de la presente invención, y en particular, el promotor de cualquier gen para la biosíntesis de ácido graso de una planta, y preferentemente de una planta dicotiledónea. La presente invención contempla particularmente la utilización de promotores procedentes de genes que codifican ácido graso desaturasas, ácido graso hidroxilasas; ácido graso epoxigenasas; ácido graso acetilenasas; ácido graso conjugasas; proteína transportadora de acilo (ACP); acil-ACP tioesterasas, aciltransferasas, acilelongasas; y ácido graso cetoacil sintasas. En una forma de realización particularmente preferida, la secuencia promotora es la región promotora del gen de lectina de soja (Vodkin et al.,1983; Cho et al.,1995; nº de registro K00821 del GenBank) o el promotor del gen de Δ12-desaturasa del algodón (es decir, el promotor del gen ghFAD2-1) mostrado en la SEC. ID. nº: 7, o un fragmento de dicho promotor que es operable en la semilla de algodón.

Además del gen o fragmento génico para la biosíntesis del ácido graso y la secuencia promotora, las construcciones génicas utilizadas en la realización del procedimiento de la invención comprenderán generalmente una secuencia de terminador. El término “terminador” se refiere a una secuencia de ADN y el extremo de una unidad de transcripción que señala la terminación de la transcripción. Los terminadores son secuencias de ADN en 3’ no traducidas que contienen una señal de poliadenilación, que facilita la adición de las secuencias de poliadenilato al extremo 3’ de un transcrito primario. Los terminadores activos en células procedentes de virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas son conocidos y están descritos en la bibliografía. Pueden ser aislados de bacterias, hongos, virus, animales y/o plantas.

Los ejemplos de terminadores particularmente adecuados para su utilización en las construcciones génicas de la presente invención incluyen el terminador del gen nopalina sintasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, el terminador del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el terminador del gen de la lectina de soja, las secuencias del terminador del gen de la subunidad pequeña de Rubisco (SSU) y los terminadores de la secuencia del gen del virus de la atrofia del trébol subterráneo (SCSV), entre otros. En una forma de realización particularmente preferida de la invención, el gen o el fragmento génico del mismo para la biosíntesis de ácido graso se coloca corriente arriba del terminador del gen de la lectina de soja, Los expertos en la materia conocerán las

secuencias

adicionales del terminador que pueden utilizarse fácilmente sin

experimentación indebida.

TABLA 3

PROMOTORES EJEMPLIFICATIVOS PARA UTILIZACION EN LA PUESTA EN PRÁCTICA DE LA PRESENTE INVENCIÓN

I: PROMOTORES ESPECÍFICOS PARA LA CELULA, ESPECÍFICOS PARA EL TEJIDO Y

FUENTE GENICA

MODELO DE EXPRESION REFERENCIA

genes específicos para la semilla

semilla Simon et al., 1985; Scofield et al., 1987; Baszczynski et al.,

albúmina de la nuez de Brasil

semilla Pearson et al., 1992.

(continuación)

legumina

semilla Ellis et al., 1988.

glutelina (arroz)

semilla Takaiwa et al., 1986; Takaiwa et al., 1987.

zeína

semilla Matzke et al, 1990

napA

semilla Stalberg et al, 1996.

glutenina-1 de LMW y HMW de trigo

endospermo Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17: 461-2, 1989

SPA del trigo

semilla Albani et al, 1997

α,β,γ-gliadinas del trigo

endospermo EMBO 3:1409-15, 1984

promotor ltr1 de la cebada

endospermo

B1,C,D, de la cebada, hordeina

endospermo Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250: 750-60, 1996

DOF de la cebada

endospermo Mena et al, 1998

biz1

endospermo EP99106056.7

promotor sintético

endospermo Vicente-Carbajosa et al., 1998.

NRP33 prolamina de arroz

endospermo Wu et al, 1998

α-globulina Glb-1 de arroz

endospermo Wu et al, 1998

OSH1 de arroz

embrión Sato et al,1996

α-globulina REB/OHP-1 de

endospermo Nakase et al.,1997

ADP-glucosa PP de arroz

endospermo Trans Res 6:157-68, 1997

familia génica ESR del maíz

endospermo Plant J 12:235-46, 1997

γ-kafidina del sorgo

endospermo PMB 32:1029-35, 1996

KNOX

embrión Postma-Haarsma et al, 1999

oleosina del arroz

embrión y aleurona Wu et at,1998

oleosina del girasol

semilla (embrión y semilla Cummins et al., 1992

lectina de soja

semilla Vodkin et al.,1983; Cho et al.,1995; GenBank Accession N K00821

oleato Δ12

semilla Broun et al.,1998

promotores de la semilla de lino

semilla Jain et al., 1999

palmitoil-ACP tioesterasa

semilla de algodón Yoder et al., 1999

II: PROMOTORES CONSTITUTIVOS EJEMPLIFICATIVOS

FUENTE DEL GEN

MODELO DE EXPRESION REFERENCIA

Actina

constitutivo McElroy et al, 1990

CaMV 35S

constitutivo Odell et al, 1985

CaMV 19S

constitutivo Nilsson et al., 1997

GOS2

constitutivo de Pater et al,1992

ubiquitina

constitutivo Christensen et al, 1992

ciclofilina del arroz

constitutivo Buchholz et al, 1994

H3 histona del maíz

constitutivo Lepetit et al, 1992

actina2

constitutivo An et al, 1996

Las construcciones génicas de la invención pueden incluir además un origen de la secuencia de replicación requerido para replicación en un tipo de célula específico, por ejemplo una célula bacteriana, cuando dicha construcción génica se necesita para mantenerse como un elemento genético episómico (p. ej., molécula de plásmido o cósmido) en dicha célula.

Los orígenes de la replicación preferidos incluyen, pero no se limitan a, los orígenes de replicación f1-ori y co/E1.

La construcción génica puede comprender además un gen o genes marcador(es) seleccionable(s) que son funcionales en una célula en la que se introduce dicha construcción génica.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “gen marcador seleccionable” incluye cualquier gen que proporcione un fenotipo en una célula en la que se expresa para facilitar la identificación y/o selección de las células que se transfectan o transforman con una construcción génica de la invención o un derivado del mismo.

Los genes marcadores seleccionables adecuados comprendidos en la presente memoria incluyen el gen con resistencia a la ampicilina (Ampr), el gen con resistencia a la tetraciclina (Tc’), el gen bacteriano con resistencia a la kanamicina (Kanr), el gen con resistencia a la fosfinotricina, el gen de neomicin fosfotransferasa (nptII), el gen con resistencia a la higromicina, el gen de β-glucuronidasa (GUS), el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) y el gen de la luciferasa, entre otros.

Para facilitar la introducción mediada por Agrobacterium del gen o fragmento génico para la biosíntesis de ácido graso en el algodón, se prefieren particularmente las secuencias génicas introducidas incluyendo cualesquiera de las secuencias promotoras y terminadoras, y con o sin algunas secuencias del gen marcador seleccionable u orígenes procarióticos de replicación, para ser flanqueados por una o más secuencias de T-ADN. Las secuencias preferidas de T-ADN incluyen una o más secuencias del extremo izquierdo y/o derecho procedentes del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens.

Las construcciones génicas se introducen en una célula de algodón que utiliza procedimientos normalizados, y la célula transfectada o transformada se regenera posteriormente para producir una planta transgénica de algodón. “Planta transgénica” significa una planta que tiene introducida ADN extraño en la misma mediante transfección

o transformación. En el presente contexto, la expresión “planta transgénica” se considerará que incluye una célula, tejido u órgano que procede de una planta transgénica, y/o una célula, tejido u órgano que es capaz de la propagación clonal para producir una planta transgénica.

“Transfección” significa que el procedimiento de introducir una construcción o vector génico o un fragmento activo del mismo que comprende ácido nucleico extraño en una célula, tejido u órgano procedente de una planta, sin integración en el genoma de la célula.

“Transformación” significa el procedimiento de introducción de una construcción o vector génico o de un fragmento activo del mismo que comprende ácido nucleico extraño en una célula, tejido u órgano procedente de una planta, en la que dicho ácido nucleico está integrado de forma estable en el genoma. En el presente contexto, “ácido nucleico extraño” significa cualquier ácido nucleico que no está presente en el genoma de la célula, tejido u órgano en la que se introduce la construcción o vector génico, y, en particular el ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica de un gen para la biosíntesis de ácido graso o un fragmento del mismo en un formato adecuado para modificar el aceite del algodón según el procedimiento de la invención.

Los medios para introducir el ADN recombinante en el tejido o las células del algodón serán conocidos por los expertos en la materia, e incluyen, pero no se limitan a, absorción directa de ADN en protoplastos (Krens et al., 1982; Paszkowski et al., 1984), absorción mediada por PEG a protoplastos (Amstrong et al., 1990), bombardeo de micropartículas (Fromm et al., 1985), microinyección de ADN (Crossway et al., 1986), bombardeo de micropartículas de los explantes o células de tejido (Christou et al., 1988; Sanford, 1988), infiltración al vacío de tejido con ácido nucleico, transferencia mediada por T-ADN de Agrobacterium al tejido de la planta como se describe esencialmente en An et al. (1985), Herrera-Estrella et al. (1983a, 1983b, 1985) o por Cousins et al. (1991).

Para el bombardeo de las células con micropartículas, una micropartícula es impulsada al interior de una célula para producir una célula, tejido u órgano vegetal transformado. Cualquier metodología y aparato de transformación celular balística adecuada puede utilizarse para la realización de la presente invención. Stomp et al., dan a conocer (patente US nº 5.122.466) y Sanford y Wolf (patente US nº 4.945.050) aparatos y procedimientos ilustrativos. Cuando se utilizan procedimientos balísticos de transformación, la construcción génica puede incorporar un plásmido capaz de replicación en la célula que va a transformarse. Ejemplos de micropartículas adecuadas para su utilización en dichos sistemas incluyen esferas de oro de 1 a 5 µm. La construcción de ADN puede ser depositada sobre la micropartícula por cualquier técnica adecuada, tal como la precipitación.

Una planta de algodón completa puede regenerarse a partir de la célula transformada o transfectada, según los procedimientos bien conocidos en la técnica. El tejido vegetal capaz de posterior propagación clonal, ya sea por organogénesis o embriogénesis, puede transformarse y regenerar una planta completa a partir de éste. El tejido específico seleccionado variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles, y los más aconsejables, para las especies específicas que se transforman. Los tejidos diana a título de ejemplo incluyen discos foliares, polen, embriones, cotiledones, hipocótilos, megagametofitos, tejido calloso, tejido meristemático existente (p. ej., meristemo apical, yemas axilares y meristemos radicales) y tejido meristemático inducido (p. ej., meristemo de cotiledón y meristemo de hipocótilo).

El término “organogénesis”, tal como se utiliza en la presente memoria, significa un proceso mediante el cual los brotes y las raíces se desarrollan sucesivamente a partir de los centros meristemáticos.

El término “embriogénesis”, tal como se utiliza en la presente memoria, significa un proceso mediante el cual los brotes y las raíces se desarrollan conjuntamente de modo concertado (no sucesivamente), ya sea a partir de células somáticas o de gametos.

Un procedimiento particularmente preferido de producción de una planta de algodón transgénica es mediante la transformación mediada por Agrobacterium de los cotiledones, seguido de la inducción de la formación de callo, y la posterior inducción de callo embriogénico y la regeneración en las plantas, esencialmente tal como se ilustra en la presente memoria.

Las plantas de algodón transformadas y regeneradas descritas en la presente memoria pueden tener varias formas, tales como, por ejemplo, híbridos de células transformadas y de células no transformadas; o transformados clonales (p. ej., todas las células transformadas que contienen la casete de expresión). Pueden propagarse por varios medios, tales como por propagación clonal o técnicas de cultivo clásicas. Por ejemplo, una planta transformada de primera generación (o T1) puede autopolinizarse para dar un transformado de segunda generación (o T2) homocigótico, y las plantas T2 además propagarse mediante técnicas clásicas de cultivo.

Preferentemente, el gen o fragmento génico introducido para la biosíntesis del ácido graso es capaz de expresarse en la semilla de algodón a fin de modificar (es decir aumentar o disminuir) el nivel de expresión de un gen para la biosíntesis del ácido graso de algodón endógeno hasta un nivel que es suficiente para modificar el contenido y/o la composición del aceite producido en dicha semilla.

La actividad de una enzima para la biosíntesis del ácido graso en el aceite de semilla de algodón puede determinarse utilizando los procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, la actividad enzimática puede calcularse por análisis enzimático directo, o alternativamente, por medios indirectos que implican la determinación de niveles de sustrato y de producto, tales como, por ejemplo, mediante un algoritmo apropiado que calcula la proporción del producto ácido graso de la enzima como proporción del contenido combinado de dichos productos del ácido graso y permaneciendo el sustrato del ácido graso.

En una forma de realización preferida, la actividad de la enzima ácido graso Δ12desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa) en el aceite de semilla de algodón se determina utilizando el algoritmo Oleic Desaturation Proportion (ODP), que determina la proporción de ácidos grasos C18 insaturados poliinsaturados en comparación con los ácidos grasos C18 insaturados totales en el aceite de semilla de algodón, de la manera siguiente:

imagen1

La ODP mide la proporción de ácido graso C18 insaturado total que es desaturado por la enzima ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa).

Alternativamente o además, la actividad de la enzima ácido graso Δ9-desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) en el aceite de semilla de algodón se determina utilizando el algoritmo Stearic Desaturation Proportion (SDP), que determina la proporción de ácidos grasos C18 insaturados en comparación con los ácidos grasos C18 insaturados en el aceite de semilla de algodón, de la manera siguiente:

imagen1

La SDP mide la proporción de ácido graso C18 total que es desaturado por la enzima ácido graso Δ9-desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) .

Es evidente a partir de la exposición anterior que existen varias etapas implicadas en la producción de una planta transgénica, incluyendo la producción de construcciones génicas, la transformación de una célula de algodón con las construcciones génicas, la producción de callo embriogénico a partir de las células transformadas de algodón, la selección de las células transformadas, la regeneración en plantas completas y la propagación de las plantas transgénicas por medios asexuales o sexuales. La presente invención comprende desde luego cualquiera y todas estas etapas colectiva o individualmente, en la expresión “producción de una planta de algodón transgénica”.

El método de la invención descrito en la presente memoria puede incluir además la hibridación sexual de la planta transgénica producida tal como se describe con cualquier otra especie, variedad, cultivo o plasma germinal de algodón transgénico o no transgénico, tales como, por ejemplo, para combinar las características deseables de ambos progenitores en la descendencia de esta hibridación sexual. La presente invención comprende la utilización de la planta de algodón transgénica primaria, o la descendencia de la misma producida por autofertilización o entrecruzamiento, tanto con un precursor de polen como con un precursor de la semilla.

Por consiguiente, la presente invención se extiende desde luego a un procedimiento de modificación del aceite endógeno de una planta de algodón que comprende:

(i)

transformar o transfectar una célula vegetal, tejido u órgano de la planta de algodón con una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen o un fragmento génico del mismo de Δ9 estearoil-ACP desaturasa operativamente en relación con una secuencia promotora capaz de proporcionar la expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de una planta de algodón, y regenerar una planta de algodón a partir de dicha célula, tejido u órgano vegetal, en el que la expresión del gen endógeno de Δ9 estearoil-ACP desaturasa en la semilla de dicha planta se reduce cuando dicha planta se cultiva durante un tiempo y en condiciones suficientes por consiguiente;

(ii)

transformar o transfectar una célula vegetal, tejido u órgano de la planta de algodón con una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen o un fragmento génico del mismo de oleil-PC Δ12desaturasa operativamente en relación con una secuencia promotora capaz de proporcionar la expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de una planta de algodón, y regenerar una planta de algodón a partir de dicha célula, tejido u órgano vegetal, en el que la expresión del gen endógeno de oleil-PC Δ12-desaturasa en la semilla de dicha planta se reduce cuando dicha planta se cultiva durante un tiempo y en condiciones suficientes por consiguiente;

(iii) cruzar la planta de algodón de (i) o una planta de algodón consistente en una descendencia de la planta de (i) en la que dicha descendencia comprende dicha secuencia nucleotídica de un gen o fragmento génico del mismo de Δ9 estearoil-ACP desaturasa, con la planta de algodón de (ii) o con la planta de algodón consistente en una descendencia de la planta de (ii) en la que dicha descendencia comprende dicha secuencia nucleotídica de un gen o fragmento génico del mismo de oleoil-PC Δ12-desaturasa; y

(iv) seleccionar la descendencia de dicho cruzamiento en la que dicha descendencia tiene un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada.

Según esta forma de realización de la invención, la segunda planta de algodón puede ser una planta de algodón transgénica que produce un alto nivel de ácido esteárico en la semilla, en virtud de la presencia y/o expresión de uno o más genes o fragmentos génicos para la biosíntesis del ácido graso introducidos, tales como, por ejemplo, un gen o fragmento génico introducido de ácido graso Δ9-desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) en la orientación antisentido, o alternativamente, una repetición invertida del gen o fragmento génico del la ácido graso Δ9-desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) que es capaz de auto-complementariedad.

En una forma de realización alternativa, la segunda planta de algodón es una planta de algodón transgénica que produce un alto nivel de ácido oleico en la semilla, en virtud de la presencia y/o expresión de uno o más genes o fragmentos génicos de los mismos introducidos para la biosíntesis del ácido graso, tales como, por ejemplo, un gen o fragmento génico introducido de ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa) en la orientación antisentido, o alternativamente, una repetición invertida del gen o fragmento génico del la ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa) que es capaz de auto-complementariedad.

Todavía en otra forma de realización, la segunda planta de algodón es una planta de algodón transgénica que produce un bajo nivel de ácido palmítico en la semilla, en virtud de la presencia y/o la expresión de uno o más genes o fragmentos génicos de los mismos introducidos para la biosíntesis del ácido graso, tales como, por ejemplo:

(i)

un gen o fragmento génico introducido de ácido graso Δ9-desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) en la orientación antisentido; o alternativamente,

(ii)

un gen o fragmento génico introducido de ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa) en la orientación antisentido; o alternativamente,

(iii) una repetición invertida de un gen o fragmento génico de ácido graso Δ9desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) que es capaz de autocomplementariedad; o alternativamente,

(iv) una repetición invertida de un gen o fragmento génico de ácido graso Δ12desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa) que es capaz de autocomplementariedad.

En una forma de realización particularmente preferida de la invención, la hibridación sexual se lleva a cabo entre una primera planta de algodón que tiene aumentado el ácido oleico en la semilla en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada y una segunda planta de algodón que tiene aumentado el ácido esteárico en la semilla en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada. Preferentemente, la descendencia de dicho cruzamiento produce un aceite de semilla que es rico en ácido oleico y ácido esteárico en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada.

En una forma de realización alternativa, la hibridación sexual se lleva a cabo entre una primera planta de algodón que tiene aumentado el ácido esteárico en la semilla en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada y una segunda planta de algodón que tiene disminuido el ácido palmítico en la semilla en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada. Preferentemente, la descendencia de dicho cruzamiento produce un aceite de semilla que es rico en ácido esteárico y pobre en ácido palmítico en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada.

En una forma de realización alternativa adicional, la hibridación sexual se lleva a cabo entre una primera planta de algodón que tiene aumentado el ácido oleico en la semilla en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada y una segunda planta de algodón que tiene disminuido el ácido palmítico en la semilla en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada. Preferentemente, la descendencia de dicho cruzamiento produce un aceite de semilla que es rico en ácido oleico y pobre en ácido palmítico en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada.

Todavía en una forma de realización alternativa adicional, la hibridación sexual se lleva a cabo entre una primera planta de algodón que tiene aumentado el ácido oleico y bajo el ácido palmítico en la semilla en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada y una segunda planta de algodón que tiene aumentado el ácido oleico y disminuido el ácido palmítico en la semilla en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada. Preferentemente, la descendencia de dicho cruzamiento produce un aceite de semilla que es rico en ácido oleico y ácido esteárico y pobre en ácido palmítico, en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada.

Todavía en una forma de realización alternativa adicional, la hibridación sexual se lleva a cabo entre una primera planta de algodón que tiene disminuido el ácido linoleico en la semilla en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada y una segunda planta de algodón que tiene aumentado el ácido esteárico en la semilla en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada. Preferentemente, la descendencia de dicho cruzamiento produce un aceite de semilla que es rico en ácido esteárico y pobre en ácido linoleico, en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada. Más preferentemente, la descendencia es también pobre en ácido palmítico y/o rico en ácido, en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada.

La presente invención se extiende desde luego a la totalidad de dichas alternativas. No están excluidas otras hibridaciones sexuales.

La presente invención contempla desde luego una hibridación sexual entre la planta de algodón transgénica producida según el procedimiento de la invención, y una especie, variedad, cultivo o plasma germinal natural que presenta atributos deseables para la producción de aceite, siendo el único requisito que dicha planta natural sea compatible con la planta transgénica. Por ejemplo, G. arboreum contiene grandes niveles de ácido oleico en la semilla, y ácido linoleico reducido, cuyas características son atributos deseables.

El método de la invención descrito en la presente memoria contempla además la modificación genética de una planta de algodón transgénica primaria o la descendencia de la misma para modificar más el aceite de semilla de algodón. Como en el caso de la utilización de la hibridación sexual, puede utilizarse la modificación genética adicional para introducir características adicionales de modificación de aceite a la planta de algodón, para aumentar más su calidad de aceite en comparación con la planta transgénica primaria. En una forma de realización particularmente preferida, la presente invención contempla un procedimiento de modificación del aceite endógeno de una planta de algodón que comprende:

(i)

producir una primera planta de algodón transgénica que tiene una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un primer gen o fragmento génico del mismo para la biosíntesis de ácido graso, en el que dicho gen o fragmento génico se pone operativamente en conexión con una secuencia promotora capaz de proporcionar la expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de una planta de algodón, y en la que dicho primer gen para la biosíntesis del ácido graso se selecciona de entre el grupo constituido por genes de ácido graso Δ9-desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) y genes de ácido graso Δ12-desaturasa (Δ12 oleoil-PC desaturasa);

(ii)

hibridar sexualmente dicha primera planta de algodón transgénica con una planta de algodón para producir una planta de descendencia; y

(iii) producir una segunda planta de algodón transgénica que tiene una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un segundo gen o fragmento génico del mismo para la biosíntesis de ácido graso, en el que dicho gen o fragmento génico se pone operativamente en conexión con una secuencia promotora capaz de proporcionar la expresión de dicho gen

o fragmento génico en la semilla de una planta de algodón, y en la que dicho segundo para la biosíntesis del ácido graso se selecciona de entre el grupo constituido por genes de ácido graso Δ9-desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) y genes de ácido graso Δ12-desaturasa (oleoil-PC Δ12desaturasa).

Preferentemente, el segundo gen o fragmento génico para la biosíntesis de ácido graso es diferente del primer gen o fragmento génico para la biosíntesis de ácido graso.

Los expertos en la materia, apreciarán que el mismo producto final puede obtenerse cambiando la serie en la que se realiza este procedimiento, o utilizando la segunda planta transgénica, en lugar de la primera planta transgénica como precursor de la semilla o del polen. Por consiguiente, la presente invención comprende desde luego

dichas alternativas.

Otro aspecto de la presente invención proporciona una planta de algodón transgénica que tiene la composición del aceite modificada y más específicamente, el contenido y/o la composición modificado de uno o más ácidos grasos en el órgano de almacenamiento de aceite, tal como, por ejemplo, la semilla de algodón, en la que dicha planta es producida por el método de la invención descrito en la presente memoria anteriormente.

Dichas plantas presentarán una variedad de características del aceite deseables que resultarán evidentes a partir de la exposición anterior.

En una forma de realización preferida, se proporciona una planta de algodón que tiene aumentado el ácido oleico y el ácido esteárico en la semilla en la que dicha planta se produce por hibridación sexual entre una primera planta de algodón que tiene aumentado el ácido oleico en la semilla en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada y una segunda planta de algodón que tiene aumentado el ácido esteárico en la semilla en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada y en la que dicha primera planta de algodón y/o la segunda planta de algodón se produce(n) según el procedimiento de la invención de expresión por disminución de un gen seleccionado de entre el grupo constituido por los genes de ácido graso Δ12-desaturasa (oleoil-PC Δ12-desaturasa).

En una forma de realización preferida, la presente invención proporciona una planta de algodón que tiene disminuido el ácido palmítico en la semilla, en la que dicha planta se produce por hibridación sexual entre una primera planta de algodón y una segunda planta de algodón, y en la que dicha primera planta de algodón y/o dicha segunda planta de algodón se produce(n) según el procedimiento de la invención de expresión por disminución de un gen seleccionado de entre el grupo constituido por los genes de ácido graso Δ12-desaturasa (oleoil-PC Δ12-desaturasa).

Este aspecto de la invención se extiende evidentemente a las plantas de algodón constituidas por la descendencia de las plantas transformadas primarias que comprenden el gen o fragmento génico para la biosíntesis del ácido graso.

Este aspecto de la invención se extiende además a todas las partes de la planta, y en particular, a la semilla procedente de la planta transformada primaria o a su descendencia. Preferentemente, la semilla comprenderá el gen o fragmento del gen introducido para la biosíntesis del ácido graso y, más preferentemente, dicha semilla tendrá un aceite con una composición de ácido graso modificada según la invención (es decir, pobre en ácido palmítico y/o rico en ácido oleico y/o rico en ácido esteárico y/o pobre en ácido linoleico).

Un aspecto adicional de la presente invención se extiende al aceite de una planta de algodón que incluye cualquier planta de algodón transgénica, y a la descendencia y semilla de la misma, producida según el procedimiento de la invención.

Un aspecto adicional de la invención se extiende a las construcciones génicas y a las moléculas de vector esencialmente tal como se describe en la presente memoria que son capaces de utilizar en la realización el procedimiento de la invención. Este aspecto de la invención se extiende evidentemente a la utilización de dichas construcciones génicas para producir algunas plantas o partes de la planta, tal como la semilla, con un contenido en aceite modificado y/o una composición del ácido graso modificada, o para modificar el aceite o el contenido en ácido graso y/o la composición por sí misma.

La presente invención se describe además haciendo referencia a los ejemplos no limitativos siguientes.

EJEMPLO 1

Materiales y procedimientos generales

Reactivos químicos

Todos los productos químicos utilizados para su utilización in vitro fueron por lo menos de calidad analítica normal. La soluciones se prepararon en condiciones estériles utilizando H2O MilliQ, y se esterilizaron en autoclave cuando procedió. Todas las enzimas de restricción utilizadas se adquirieron en New England Biolabs. Todas las reacciones en cadena de la polimerasa (RCP) se realizaron utilizando AmpliTaq® ADN polimerasa (Perkin-Elmer, EE.UU.). El origen de otras enzimas y kits utilizados se indica junto con los nombres de los suministradores en los siguientes apartados de este capítulo y en los capítulos restantes. Los oligonucleótidos sintéticos fueron preparados en un sintetizador de ADN Modelo 377 de Applied Byosistems (EE.UU.) en la División de Plant Industry, CSIRO Australia. El radionucleótido, α32P[dCTP], fue sumunistrado por Besatrec, Australia. Las reacciones de secuenciado del ADN se realizaron utilizando kits ABIPRISM (Perkin-Elmer) y la electroforesis en gel de la secuencia se realizó utilizando un secuenciador de ADN ABI373.

Cultivo de plantas

Las semillas de cuatro especies de Gossypium naturales australianas, que incluían

G. australe, G. bickii, G. robinsonii, G.sturtianum se adquirieron en Nindethana Seed Service, Australia Occidental, Australia. Las semillas de otras especies fueron suministradas gentilmente por Australian Cotton Research Institute en Narrabri, NSW, Australia.

Varias plantas de G. hirsutum cv Siokra fueron adquiridas en un invernadero, utilizando una temperatura de 28/15-17ºC (día/noche), y luz de día natural complementada con iluminación fluorescente para proporcionar un fotoperiodo de 16 horas al día. Se prepararon suelos con abonos por los servicios de cultivo vegetal en la Division of Plant Industry, CSIRO, Australia. A menos que se indique de otro modo, todas las plantas de algodón se cultivaron en una mezcla de suelo consistente en 75% de mezcla Pryor y 25% de mezcla de abono. Las flores se etiquetaron en la antesis y los embriones se recogieron a intervalos de 5 días después de la antesis, hasta que las semillas estaban fisiológicamente maduras.

Técnicas de ADN recombinante

A menos que se especifique de otro modo, las técnicas de ADN recombinantes se realizaron tal como describe Sambrook et al.(1989).

Cultivo de Escherichia coli

Se cultivaron durante la noche a 37ºC cultivos de bacterias E. coli, utilizando medio de cultivo Luria sólido o líquido (LB; 10 g/l Bacto-triptona, 5 g/l de extracto de Bactolevadura, 5 g/l de NaCl, pH 7,0). Cada cultivo líquido se inoculó utilizando una sola colonia bacteriana y se cultivó en un agitador rotativo. Se añadieron al medio de cultivo bacteriano antibióticos apropiados Ampicilina (100 µg/ml) o Kanamicina (50 µg/ml) a la concentración final de 100 µg/ml y 50 µg/ml respectivamente.

Transformación de células competentes con plásmidos

La transformación de células competentes con plásmidos se realizó según las recomendaciones suministradas con el Gene-Pulser (BioRad). Las células competentes (50 µl) se combinaron con 5 µl de H2O desioniozada (dH2O) que contenía 5 ng de ADN plásmido o 60 ng de ADN procedente de una reacción de ligadura. La mezcla se transfirió a una cubeta Pulser Gene-Pulser®/E. coli desechable preenfriada, 0,2 cm (BioRad) y se sometió a electroporación utilizando un Gene-Pulser BioRad, fijado a 1,8 kV, 125 µFD y 200 w. Inmediatamente después de la eletroporación las células se mezclaron con 600 µl de caldo de cultivo LB sin antibiótico, transferido a un nuevo tubo Eppendorf incubado a 37ºC durante media hora. Se colocaron 100 µl de cultivo a continuación en una placa de medio LB sólido enriquecido con antibiótico apropiado y se cultivó a 37ºC durante la noche.

Se transfirió una sola colonia bacteriana en 2 ml de medio LB que contenía el antibiótico apropiado en un tubo de 15 ml tapado sin apretar. El cultivo se incubó durante la noche a 37ºC con agitación intensa. Se vertieron 1,5 ml del cultivo en un tubo Eppendorf y se centrifugó a 12.000 x g durante 1 min a T.A. en una microcentrifugadora. El medio se retiró por aspiración, dejando el sedimento bacteriano tan seco como fue posible. Se añadieron 200 µl de tampón de lisis (NaOH 0,1 M y SDS al 0,5%) y se mezcló pipeteando arriba y abajo. Se añadieron 200 µl de acetato sódico 3 M pH 6,0 y se mezcló invirtiendo muchas veces y se incubó en hielo durante 5 min. Después de la centrifugación durante 10 min. a temperatura ambiente, se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo. Se precipitaron los ácidos nucleicos añadiendo 1 ml de etanol frío, se agitó para mezclar y se centrifugó durante 10 min a 4ºC. Se lavó el sedimento en etanol al 70%, centrifugando durante 5 min. a temperatura ambiente. Después de un breve secado en un concentrador SpeedVac, se volvió a poner en suspensión el sedimento en 30 µl de dH2O.

Preparación de ADN plásmido

Se preparó ADN plásmido mediante una modificación del procedimiento de lisis alcalina descrito por Sambrook et al. (1989), en el que se cultivaron bacterias en Terrific Broth (TB), en lugar de LB, para producir un aumento de cuatro a ocho veces en el número de bacterias por ml del medio, lo que condujo, a su vez, a mayor rendimiento en plásmido. Se preparó un litro de medio TB mezclando 100 ml de una solución esterilizada de KH2PO4 0,17 M, K2HPO4 0,72 M y 900 ml de solución fría y esterilizada que contenía 12 g de Bacto-triptona, 24 g de extracto de Bacto-levadura y 4 ml de glicerol. En este protocolo modificado, se precipitó el ADN plásmido utilizando PEG8000 (polietilenglicol), para proporcionar ADN plásmido superenrollado de alta calidad que está relativamente exento de ADN y ARN cromosómico contaminante.

En resumen, se transfirió una sola colonia a 2 ml de medio TB y se incubó durante la noche a 37ºC, con una cantidad apropiada de antibiótico en tubos de polipropileno de 50 ml. 1,5 ml de alícuotas del cultivo se sedimentaron por centrifugación durante 1 min en una microcentrifugadora. Se eliminó el sobrenadante y se volvió a poner en suspensión el sedimento bacteriano en 200 µl de tampón GTE (glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM, Na2EDTA 10 mM, pH 8,0) pipeteando arriba y abajo. Se añadieron 300 µl de tampón de lisis recién preparado (NaOH 0,2 N y SDS al 0,1%) y se mezclaron por inversión y se incubaron en hielo durante 5 min. Esta solución se neutralizó añadiendo 300 µl de acetato de potasio 3,0 M (pH 4,8) y se mezclaron invirtiendo el tubo, y se incubaron en hielo durante 5 min. El residuo celular se eliminó por centrifugación durante 10 min a temperatura ambiente, y el sobrenadante se transfirió a un tubo limpio. Se añadió RNasaA (Sigma, EE.UU.) hasta una concentración final de 20 µg/ml y se incubó a 37ºC durante 20 min. Se extrajo dos veces el sobrenadante con un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1). Se precipitó el ADN plásmido añadiendo un volumen igual de isopropanol al 100% y se sedimentó por centrifugación durante 10 min a temperatura ambiente. Se lavó el sedimento del ADN con 700 µl de etanol al 70% y a continuación se secó al vacío. Se disolvió el sedimento en 32 µl de dH2O, y a continuación se precipitó añadiendo 8,0 µl de NaCl 4 M y 40 µl de PEG8000 al 13% esterilizado en autoclave. Una vez agitada la mezcla, se incubó en hielo durante 20 min, y a continuación el ADN plásmido se sedimentó por centrifugación durante 15 min a 4ºC. El sobrenadante se eliminó minuciosamente y se enjuagó el sedimento con 700 µl de etanol al 70%. Se secó el sedimento de ADN como anteriormente, y a continuación se volvió a poner en suspensión en 20 µl de dH2O.

Aislamiento del ADN genómico de la planta

Todas las muestras de ADN genómico utilizadas se prepararon según Paterson et al., (1993). En resumen, se molieron en nitrógeno líquido tres gramos de tejido foliar hasta polvo fino y se mantuvieron en un frigorífico a -20ºC hasta que se necesitó. El polvo se transfirió a 20 ml de tampón nuclear frio [glucosa 1,0 M, Tris-HCl 100 mM (pH 7,5), Na2EDTA 5 mM, polividona al 2% (p/v) (P.M. medio 40.000), ácido dietilditiocarbámico al 0,1%, ácido ascórbico al 0,1% mercaptoetanol al 0,2%] y se invirtió para homogeneizar. Después de la centrifugación a 1000 x g durante 20 min a 4ºC, los sedimentos se pusieron en suspensión en 10 ml de tampón de lisis a 65ºC [Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), NaCl 1,4 M, Na2EDTA 20 mM, CTAB al 2% (bromuro de hexadeciltriamonio), polividona al 2% (P.M. 40.000) ácido dietilditiocarbámico al 0,1%, ácido ascórbico al 0,1% mercaptoetanol al 0,2%] y se incubó durante 20 min en un baño de agua a 65ºC. Se añadió un volumen igual de cloroformo/alcohol isoamílico y se mezcló invirtiendo muchas veces. Después de la centrifugación a 4.500 x g durante 10 min, la fase acuosa superior se transfirió a un nuevo tubo. Esta etapa de extracción se repitió una vez más antes de la precipitación del ADN por adición de dos volúmenes de etanol al 100%. El ADN se atrapó con un gancho de vidrio y se enjuagó en etanol al 70%, se secó con aire y se volvió a poner en suspensión en 500 µl de tampón TE, y a continuación se extrajo dos veces con volúmenes iguales de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. El ADN se precipitó añadiendo 1/10 volúmenes de acetato Na 3 M y dos volúmenes de etanol al 100%. Después del enjuague en etanol al 70%, se secó el ADN al aire y se volvió a poner suspensión en 1 ml de CsCl 1 M en tampón TE.

Purificación del ADN genómico por gradiente de CsCl

Para purificar el ADN genómico del algodón utilizando gradientes cloruro de cesio, se añadieron 2,5 ml de CsCl 5,7 M en TE a un tubo Beckman polialomer de 13 x 51 mm (sin sello), utilizando una pipeta desechable. Se añadieron 30 µl de bromuro de etidio (es decir, EtBr; 10 mg/ml) al ADN genómico de la planta en tampón CsCl-TE 1,0 M y se dejaron en la parte superior de la almohadilla de CsCl. Después de la centrifugación a

35.000 x rpm durante 16 horas a 18ºC en un agitador SW50.1, se eliminó la banda de ADN utilizando una jeringuilla de 1 ml y una aguja calibre 18 y se añadió a un nuevo tubo de 10 ml que contenía 5 ml de isopropanol saturado con CsCl. Después de mezclado suave, se descartó la capa superior que contenía EtBr. Se realizaron tres extracciones más con 1 ml de isopropanol saturado con CsCl. El ADN se capturó con una varilla de vidrio después de añadir tres volúmenes de etanol al 70%. Después de volver a poner en suspensión el ADN en 500 µl de TE, se precipitó el ADN añadiendo 50 µl de acetato Na 3 M y 1 ml de etanol al 100% y se enjuagó en etanol al 70% antes de la resuspensión en 300 µl de tampón TE.

Aislamiento del ARN

Se utilizó material de plástico desechable, estéril, que está esencialmente exento de RNasas para la precipitación y almacenamiento del ARN sin pretratamiento. El material de vidrio utilizado para el aislamiento del ARN se calentó a 180ºC durante la noche. Todas las soluciones se trataron con DEPC (pirocarbonato de dietilo) al 0,1% durante por lo menos 12 horas a 37ºC y a continuación se esterilizó en autoclave durante 20 min a 103,4 mPa (15 psi) en ciclo líquido.

Se molieron dos gramos de embriones de algodón o de tejidos foliares en nitrógeno líquido y se machacaron en el mortero hasta un polvo fino que se picó en un vaso de precipitados que contenía 22 ml de tampón de extracción en frío y se agitó constantemente. El tampón de extracción está constituido por Tris-HCl 200 mM (pH 8,5), dodecilsulfato de litio al 1,5%, LiCl 300 mM, Na2EDTA 10 mM, desoxicolato sódico al 1%, Nonidet P-40 al 1%. Esto fue seguido de adición de PVP insoluble al 5%, mercaptoetanol 90 mM, DTT (ditiotreitol) 10 mM, DEPC al 0,1 % y se agitó durante 10 min antes de ser transferido a un tubo Corex. A continuación se añadieron 18,4 ml de acetato amónico 3 M y se mezcló bien. Se centrifugó a 6.000x rpm durante 20 min a 4ºC. Se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo y se precipitó añadiendo 1/10 volúmenes de NaAc 3 M, pH 5,2 y 1/2 volumen final de isopropanol frío y se almacenó a -20ºC durante 1 hora antes de la centrifugación a 6.000x rpm durante 30 min utilizando un agitador oscilante. Se volvió a poner en suspensión el sedimento en 1 ml de dH2O y se transfirió a dos tubos Eppendorf (500 µl en cada tubo). La suspensión se extrajo con un volumen igual de solución fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y se separaron las fases por centrifugación durante 5 min a 4ºC. La capa acuosa superior se transfirió con cuidado a un nuevo tubo Eppendorf y se extrajo de nuevo con cloroformo como anteriormente. Se añadió medio volumen de LiCl 5 M a la muestra acuosa, se mezcló bien y se dejó en hielo durante 3 horas antes de la centrifugación a 12.000x rpm durante 15 min a 4ºC. Se volvió a poner en suspensión el sedimento en 50 µl de dH2O. Por último, se precipitó la muestra de ARN añadiendo 5 µl de NaAc y 138 µl de etanol frío y se incubó en nieve carbónica durante 30 minutos antes de la centrifugación durante 15 min a 4ºC. El sedimento de ARN se secó en un concentrador SpeedVac y a continuación se disolvió en 30 µl de dH2O exenta de RNasa.

Electroforesis de ADN en geles de agarosa

Se fundieron minigeles de agarosa en 50 ml de solución de agarosa fundida al 1% (p/v) que contenía 1 x tampón TAE (Tris-acetato 0,04 M, Na2EDTA 1,0 mM, pH 8,0), utilizando un molde de 5 x 8 cm y un multidosificador de pocillos adecuado para preparar pocillos de 15 µl de volumen. Se mezclaron las muestras de ADN con 0,2 volúmenes de 6 x tampón de carga FLB (ficoll 400 al 15%, azul de bromofenol al 0,25% y xileno cianol al 0,25%) y se cargó en los pocillos. Se cargó un marcador de tamaño de ADN consistente en SPP-1 ADN digerido con EcoRI (Bresatec, Australia) en un pocillo a lo largo de los ADN de muestra. Se realizó la electroforesis a 50-70 V en 1 x tampón TAE hasta que los colorantes se habían separado suficientemente después de cuyo tiempo se agitaron los geles en solución de 0,5 mg/l de bromuro de etidio (EtBr) durante 10 min, destinada al enjuague en agua durante 10 min y se fotografió utilizando luz UV de 302 nm de longitud de onda.

Transferencia de ADN genómico del algodón a membranas de nilón para hibridación

Se digirió ADN genómico del algodón (aproximadamente 10,0 µg de ADN en 5,0 µl de volumen) a 37ºC durante la noche en 20 µl de reacción que contenía 1 x concentración de un tampón apropiado, suministrado generalmente con la enzima de restricción. Un gel de agarosa al 0,7% en 1 x TBE (Tris-borato 0,045 M, Na2EDTA 1,0 mM, pH 8,0) se fundió utilizando un molde de 15 x 20 cm. Los digestos del ADN genómico se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa durante la noche a 20 mA en 1 x tampón TBE, hasta que el azul de bromofenol del colorante de carga había corrido ¾ de la longitud del gel. Cada gel se agitó suavemente en 500 ml de HCl 0,1 M, durante 5 min, seguido de enjuague y agitación en dH2O durante 5 min más para eliminar el ácido. Se transfirió el

N+

ADN del gel a una membrana Hybond (Amersham) por transferencia Southern (Southern,1975) durante 4 horas utilizando NaOH 4 N como solución de transferencia. Después de la transferencia, se enjuagó la membrana en 2 x SSC (NaCl al 1,75%, citrato sódico al 0,88%, pH 7,0) brevemente y se transfirió en seco entre 2 laminas de papel de membrana 3 M a temperatura ambiente.

Transferencia del ARN del algodón a membranas de nilón para hibridación

Para preparar unos 300 ml de gel de agarosa al 1% para electroforesis de ARN, se añadieron 3 gramos de agarosa y 30 ml 10 x tampón MOPS [ácido 3-(N-morfolino)propansulfónico] a 255 ml de dH2O y se disolvió por calentamiento. Se añadió formaldehído (16,2 ml de solución madre al 37%) a la solución de agarosa cuando se hubo enfriado a 50ºC, y se mezcló por agitación intensa. Se mezcló todo el ARN (20 µg) con 20 µl de tampón de carga y a continuación se calentó a 95ºC durante 2 min para desnaturalizar el ARN. Se preparó reciente el tampón de carga mezclando 0,72 ml de formamida, 0,16 µl 10 x tampón MOPS, 0,26 ml de formaldehído (solución madre al 37%), 0,1 ml de glicerol al 80% (v/v), 0,08 ml de azul de bromofenol (solución saturada) y 0,18 ml de dH2O. Se añadió a continuación bromuro de etidio (1 µl) a cada muestra. En las muestras de ARN se realizó la electroforesis en 1 x tampón MOPS hasta que el colorante de azul de bromofenol migró tres cuartos a lo largo de la longitud del gel. El ARN se observó bajo luz UV utilizando un transiluminador y se fotografió. Las dos especies de ARNr abundantes visibles bajo la luz UV, a saber el ARNr de 28S (5 kb) y el ARNr de 18S (2 kb) se utilizaron como patrones de peso molecular. Inmediatamente antes de la transferencia, se enjuagó el gel de ARN durante 20 min cada uno en dos cambios de 500 ml de 10 x SSC para eliminar el formaldehído del gel. Esto fue seguido inmediatamente de la transferencia del ARN a la membrana Hybond N+ utilizando NaOH 0,05 N como tampón de transferencia durante un periodo de 3 horas.

Preparación de sondas de ADN marcadas con 32P

Se sintetizaron sondas marcadas con radioactividad mediante cebado al azar, esencialmente como describen Feinberg y Vogelstein (1983), utilizando un kit de cebado al azar adquirido en Amersham (EE.UU.). La inserción de ADN clonada y purificada (20 ng) se combinó con 6,0 µl de oligonucleótidos aleatorios (Amersham). Esta mezcla se incubó a 95ºC durante 5 minutos para desnaturalizar el ADN y se enfrió rápidamente en hielo durante 5 min. Las reacciones se realizaron 37ºC, durante 1 hora, en un volumen total de 25 µl, comprendiendo 10 µl de tampón para marcado de la sonda (HEPES 0,5 M, Tris-HCl 0,125 M, DTT 12,5 mM, MgCl2 12,0 mM, 1,0 mg/ml de BSA); 2,5 µl de mezcla dNTP (dATP 0,2 mM, dTTP 0,2 mM, dGTP 0,2 mM); 1,0 unidades de fragmento de Klenow; 3,0 µl de [α32P] dCTP (10 µCi/µl) y H2O de MilliQ. Para eliminar los dNTP no incorporados se purificó la sonda pasando la mezcla de reacción a través de una columna Sephadex® G-50 NICK® (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante.

Hibridación y autorradiografía

Las membranas de nilón con ácido nucleico unido a ellas se hibridaron previamente en botellas de hibridación que contenían 5 a 20 ml de la solución de prehibridación esencialmente como escribe Khandjian (1987) (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 1 M, formamida al 50%, 10 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, SDS al 1%, pirofosfato sódico al 0,1%, 0,1 mg/ml de ADN de esperma de arenque). Las botellas se colocaron en una estufa de hibridación equipada con aparato de rodillos durante al menos 4 horas a 42ºC.

Después de la prehibridación, se desnaturalizó la sonda de ADN marcada calentando durante 10 min a 95ºC, y a continuación se colocó en hielo durante 5 min. La sonda desnaturalizada se añadió a la mezcla de prehibridación. La hibridación se realizó a 42ºC durante 16 horas. A menos que se indique de otro modo, las membranas se lavaron a continuación brevemente en 2 x SSC, SDS al 0,1% a 65ºC. Esto fue seguido de dos lavados más en 0,2 x SSC, SDS al 0,1% a 65ºC durante 15 min cada uno. Se realizó la autorradiografía durante uno a cinco días a -80ºC con una película de rayos X de Kodak y un tamiz redoblado.

Construcción de un banco de ADNc de semilla de algodón

Se aisló poli(A)+ ARN de algodón del ARN completo preparado como se describió anteriormente, utilizando un kit de purificación de ARNm (Pharmacia), esencialmente como describe el fabricante. Para preparar el ADNc, se utilizó un kit de síntesis de ADNc (Pharmacia) esencialmente como describe el fabricante, utilizando 1 a 5 µg de poli(A)+ ARN como material de partida. El producto ADNc bicatenario se truncó en el extremo y se ligó a adaptadores EcoRI/NnotI utilizando procedimientos normalizados. Después de la eliminación del exceso de adaptadores no ligados, se clonó el ADNc en el vector bacteriófago Lambda ZAPII (Stratagene, EE.UU.) y se envasó utilizando un sistema de envasado comercializado (Stratagene EE.UU.), según las instrucciones del fabricante.

Valoración de partículas de bacteriófago en bancos de ADNc

Para preparar células hospedadoras, se transfirió una sola colonia del hospedador bacteriano XL1-MRFazul a 50 ml de medio LB enriquecido con maltosa al 0,2% y MgSO4 10 mM en un matraz Erlenmeyer esterilizado y se cultivó durante la noche con agitación a 30ºC. Esta temperatura inferior garantiza que las células no crecen demasiado. Se centrifugaron las células en un tubo cónico esterilizado durante 10 min a 2.000 x rpm. El sedimento se volvió a poner en suspensión suavemente en MgSO4 10 mM hasta la densidad final de las células de D.O.600 = 0,5.

Para valorar el bacteriófago, cada una de las diluciones en serie de la reacción de acondicionamiento (1, 1/10, 1/100) y 200 µl de células hospedadoras se mezclaron e incubaron a 37ºC durante 15 min. A continuación 2 a 3 ml del agar-agar de la parte superior enfriado (48ºC) (NaCl al 0,5%, MgSO4 ·7H2O al 0,2%, extracto de levadura al 0,5%, NZ Amina al 1%, pH 7,5, agarosa al 0,7%), 15 µl de IPTG (isopropiltio-β-Δgalactósido) 0,5 M y 50 µl de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indoil-β-D-galactósido, 250 mg/ml en dimetilformamida) se añadieron y se vertieron en placas NZY (NaCl al 0,5%, MgSO4 ·7H2O al 0,2%, extracto de levadura al 0,5%, NZ Amina al 1%, pH 7,5, 1,5% de agar-agar). Se incubaron las placas durante por lo menos 6 a 8 horas a 37ºC.

Los bancos de ADNc descritos en la presente memoria, generalmente contenían aproximadamente 92% de partículas de bacteriófago recombinantes, en un total de aproximadamente 1,5 x 107 unidades formadoras de placa (UFP) por ml de banco no ampliado.

Ampliación de bancos de ADNc

Veinte alícuotas del banco de ADNc no ampliado concentrado, conteniendo cada una aproximadamente 5 x 104 UFP, se mezclaron con 600 µl de células hospedadoras preparadas como se describió anteriormente, en 2059 tubos Falcon, y las mezclas se incubaron a 37ºC durante 15 min. Cada alícuota de bacterias infectadas se mezcló con 6,5 ml de agar-agar de la parte superior fundido y enfriado (aproximadamente 48ºC) y se extendieron uniformemente en una placa de 150 mm recién vertida de agar-agar del fondo. Las placas se incubaron a 37ºC durante 6 a 8 horas. Cada una de estas placas se cargó a continuación con 8 a 10 ml de tampón SM y se incubó a 4ºC durante la noche con balanceo suave para eluir el bacteriófago. La suspensión de bacteriófago se recuperó de cada placa y se mezcló en un recipiente de polipropileno esterilizado y se añadió cloroformo hasta una concentración final del 5% (v/v). Después de 15 min de incubación a temperatura ambiente el desecho celular se eliminó de la suspensión de bacteriófago por centrifugación a 2000 x g durante 10 min. Se retiró el sobrante y se almacenaron las alícuotas en MSO (sulfóxido de dimetilo) al 7% a -70ºC).

El valor de los bancos de ADNc de semilla de algodón ampliados preparados según este procedimiento fue generalmente de aproximadamente 2 x 109 ufp/ml.

Selección de bancos de ADNc

Los bancos de ADNc de semillas de algodón ampliados se colocaron en 20 placas de Petri (150 mm) que contenían medio MZY, infectando 600 µl de células hospedadoras preparadas como se describió anteriormente (células MRF con XL1-blue de E.coli) con aproximadamente 50.000 ufp, y a continuación añadiendo 6,5 ml de agar-agar de la parte superior de cada placa como se describió anteriormente. Cuando las placas se hicieron visibles, generalmente después de aproximadamente 8 horas de incubación a 37ºC, se enfriaron las placas a 4ºC durante aproximadamente 2 horas.

Las placas se cargaron con membranas Hybond N+ (Amersham) que habían sido numeradas previamente, y se proporionó la clave a la posición de la membrana en cada placa. Cuando las membranas se habían adsorbido completamente a las placas, se separaron suavemente a fin de no eliminar el agar-agar de la parte superior y se colocaron en varias capas de membranas 3 MM saturadas con tampón desnaturalizante (NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M) durante 7 min. Las membranas se neutralizaron a continuación, por agitación en dos cambios de tampón neutralizante (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 7,0, EDTA 0,001 M) durante 3 min cada uno. Se lavaron brevemente las membranas en 5 x SSC y se transfirieron en seco entre dos capas de membranas 3 MM. Las membranas se fijaron a continuación colocando en la parte superior de varias capas de membranas 3 MM saturadas con NaOH 0,4 N durante 10 min y se enjuagaron brevemente en dos cambios de 5 x SSC antes de transferirse en seco entre membranas de 3 MM.

Para las hibridaciones, se agitaron las membranas en 2 x SSC brevemente, se transfirieron a suficiente tampón de prehibridación (descrito en la presente anteriormente) hasta cubrir las membranas completamente, y se incubaron a 42ºC durante por lo menos 4 horas con agitación suave. Después de la prehibridación, la sonda de ADN marcada con [α32P]dCTP (descrita en la presente anteriormente) se desnaturalizó por incubación en un baño de agua a 95ºC durante 5 min, se enfrió rápidamente en hielo, se añadió al tampón de prehibridación y se incubó la reacción a 42ºC durante 16 horas.

La solución de hibridación se eliminó y las membranas se lavaron inmediatamente en 2 x SSC, SDS al 0,1% brevemente a 65ºC, a menos que se indique de otra manera. Esto fue seguido de dos lavados consecutivos en 0,2 x SSC, SDS al 0,1% durante 15 min cada uno. A menos que se indique de otra manera, todos los lavados se realizaron normalmente a 65ºC. Después de este lavado se eliminó exceso de líquido por transferencia sobre papel Whatman 3 MM. Las membranas se colocaron a continuación entre dos hojas de envoltorio de plástico en un casete y se expusieron a película de rayos X (Kodak) durante la noche a -80ºC con un tamiz redoblado. Las placas de hibridación positivas se identificaron y transfirieron desde las placas originales, en 1 ml de tampón SM y 20 µl de cloroformo y se mezclaron.

Las placas de hibridación positivas se purificaron por recribado como anteriormente, utilizando 50 a 100 placas por placa NZY pequeña.

Después de la purificación en placa el sistema ExAssist/SOLR (Stratagene, EE.UU.) se utilizó para escindir el fagómido pBluescript SK(-) del vector ZAPII Lambda, como describe el fabricante.

Análisis de la secuencia nucleotídica

Se realizó el secuenciado del ADN con un sistema ABI 373 (Applied Biosystems) utilizando el colorante terminador y las reacciones del secuenciado del colorante cebador. Las comparaciones de secuencias y las alineaciones se realizaron con programas en el paquete GCG (Devereux et al., 1984).

EJEMPLO 2

Determinación del contenido en aceite y de la composición en ácido graso del desarrollo y semilla de algodón madura

El contenido en lípidos total de la semilla de algodón, o del aceite de la semilla, se extrajo mediante una modificación del procedimiento de Folch et al. (1957). Se molieron semillas secas de algodón en un molinillo de café. Se recogieron los embriones inmaduros inmediatamente antes de la molienda en polvo en nitrógeno líquido con manos de mortero y morteros. Se pesaron aproximadamente 4 gramos de polvo molido de muestras de semillas maduras y se registraron los pesos exactos. Debido a la disponibilidad limitada de embriones inmaduros, solamente se utilizaron 1 a 2 gramos de muestras. Se colocaron en un matraz Erlenmeyer. Los lípidos totales se extrajeron a continuación con 60 ml de reactivo de Folch (solución cloroformo:metanol 2:1 v/v 15 ml por gramo de muestra). Se filtraron los extractos a través de papel de filtro nº 1 de Whatman en una probeta graduada de 100 ml y se completaron hasta 60 ml de volumen. A continuación se lavaron con 12 ml de solución salina (NaCl al 0,88%, 20% de volumen del extracto) y se dejaron separar las fases. La fase superior que contenía agua, metanol y material soluble en agua, se sifonó y se descartó. La fase inferior de cloroformo y lípidos se lavó más con una solución de cloroformo:metanol:solución salina (3:47:48 v/v). Se dejaron separar las fases de nuevo. Se registró el volumen final de cloroformo:lípido inferior y se sifonó la capa superior y se descartó. 10 ml del extracto de cloroformo y 1 ml del patrón interno, ácido heptadecanoico (C17:0, 5,196 mg/ml) se transfirieron a un tubo de cultivo pesado previamente con un tapón de rosca. Se evaporó la muestra a sequedad bajo una corriente de gas nitrógeno en un bloque de calentamiento a 70ºC. Se determinó la cantidad de lípidos brutos por gramo pesando el tubo que contenía la muestra seca.

Cinco mililitros del reactivo de metilación, una mezcla de trifluoruro de boro:metanol:hexano (35:45:20) se añadió al tubo de cultivo que contenía lípido seco y se tapó herméticamente con un tapón de rosca revestido de teflón. A continuación se incubó en un baño de agua a 90ºC durante 45 minutos con agitación frecuente. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadieron 5 ml de agua y 5 ml de hexano a la mezcla. Después de la agitación y de la separación de fases, la capa superior de hexano que contenía los ésteres metílicos del ácido graso se transfirió a un nuevo tubo y se utilizó en el análisis de GLC.

La composición de ácido graso de los lípidos se determinó por GLC, utilizando un aparato Varian de cromatografía de gas líquido (Modelo 3400) equipado con una columna DB624 (J & W Scientific) capilar fusionada. El inyector y el detector de temperatura estaban a 220ºC y 240ºC respectivamente. El caudal de nitrógeno fue de 30 ml/minuto. El programa siguiente se utilizó en el análisis GLC:

(i)

la temperatura de la columna se mantuvo a 70ºC durante 3 min;

(ii)

la temperatura de la columna se aumentó a 160ºC a un ritmo de 30ºC/min, y a continuación se mantuvo a 160ºC durante 10 min,

(iii) la temperatura de la columna se aumentó a 230ºC a un ritmo de 7ºC/min, y a continuación se mantuvo a 230ºC durante 4 min.

Un patrón de ácido graso que contenía ácido láurico (C12:0), ácido mirístico (C14:0), ácido palmítico (C16:0), ácido esteárico (C18:0), ácido oleico (C18:1), ácido linoleico (C18:2), ácido linolénico (C18:3), ácido araquídico (C20:0), ácido behénico (C22:0), ácido eicosadienoico (C20:2) y ácido lignocérico (C24:0), se utilizó para identificar los ácidos grasos presentes en el aceite de semilla de algodón.

Los picos de ácido graso se identificaron comparando los picos del éster metílico del ácido graso y los tiempos de retención de patrones con los picos de la muestra. Se utilizó un integrador electrónico para calcular el área total de los picos y el área de cada pico de ácido graso se expresó como un porcentaje del área total.

EJEMPLO 3

Contenido de aceite y composición del ácido graso de la semilla de algodón procedente de varios cultivos de algodón de élite

Utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, se determinó la composición de aceite de las semillas de algodón procedentes de varios cultivos de élite de algodón australiano, y algunas otras especies de algodón comerciales y no comerciales.

En todos los cultivos probados, el ácido palmítico (C16:0) representa el mayor ácido graso saturado, mientras que el nivel bajo de otros ácidos grasos incluyendo el ácido mirístico (C14:0) y el ácido esteárico (C18:0) se detectaron también. El ácido oleico y el ácido linoleico eran los dos ácidos grasos insaturados mayores, mientras que un nivel muy bajo de ácido palmitoleico (C16:1) fue también detectable. El bajo nivel de ácido esteárico en el aceite de semilla de algodón es probable debido a la fuerte actividad de una enzima Δ9 estearoil-ACP desaturasa que convierte la mayor parte del ácido esteárico en ácido oleico, que a continuación es desaturado más por una ω-6 desaturasa microsómica para formar ácido linoleico. El ácido linoleico totaliza más del 50% de la composición de ácido graso total de la semilla de algodón, lo que indica una fuerte actividad microsómica de ω-6 desaturasa en las semillas de algodón.

El análisis de GLC no diferenció los ácidos grasos ciclopropenoides (CPFA) de otros ácidos grasos insaturados. Los estudios anteriores han demostrado que el aceite de semilla de algodón contiene menos del 1% de ácidos grasos ciclopropenoides (CPFA), principalmente los ácidos estercúlico y malválico, que contienen un doble enlace en la región de un anillo de propeno, ya sea en la posición 9-10 u 8-9 (Phelps et al., 1964; Allan et al., 1967). CPFA es inestable durante el proceso de extracción de lípidos convencional, pero derivados del CPFA se han cuantificado por la técnica de GLC modificada y la cromatografía líquida de alta resolución (Fisher y Schuller, 1981; Fisher y Cherry, 1983; Pandey y Subrahmanyam, 1988).

Los valores medios para el contenido en aceite en porcentaje y los ácidos grasos componentes en los aceites de semilla de algodón procedentes de 20 entradas, se publican en la Tabla 4. La prueba de Student-Newman-Keuls para el contenido en aceite y los ácidos grasos componentes de varias entradas indicaron que las especies o genotipos tienen una influencia significativa sobre el contenido en aceite y la mayoría de composiciones de ácido graso del aceite de semilla de algodón (excepto para C14:0) al nivel de 5 por ciento de probabilidad.

Las cuatro especies Gossypium diploides naturales australianas contenían un contenido en aceite significativamente inferior a las restantes entradas examinadas. Se descubrió también que contenían un nivel significativamente mayor de ácido linoleico, y niveles menores de ácidos palmítico y oleico. En cambio, la única especie diploide de genoma A probada, G. arboreum, se descubrió que contenía nivles significativamente altos de ácido oleico, sin embargo esta especie tenía también ácido linoleico significativamente bajo. Este resultado presenta gran concordancia con los estudios anteriores sobre el estudio químico en el género Gossypium (El-Nockrashy et al., 1969; Khattab et al., 1977).

Los mayores cultivos de algodón de élite australiano Sicala V2, Siokra L22, Siokra L23 y CS50 tenían el mayor contenido de aceite, mientras que Sicala 33 y Sicala 34 se observó que contenían niveles moderados de aceite que no eran significativamente diferentes de las del cultivo americano, Acala R.

Con respecto a la composición en ácido graso de los cultivos de algodón de élite australianos, Siokra L22, Siokra L23, Sicala 33 y Sicala 34, contienen niveles relativamente altos de ácido palmítico y niveles moderados de ácidos grasos insaturados.

El presente estudio indica que existen algunas, pero limitadas variaciones del contenido en aceite y de la composición en ácido graso entre las variedades de algodón de élite australiano.

EJEMPLO 4

Cambios de desarrollo en la composición de ácido graso de la semilla de algodón

La acumulación de aceite y los cambios de composición de ácido graso en el desarrollo de embriones de semilla de algodón de 15 y 65 días de vida después de la antesis (DAA) se ilustra en la Figura 1. En particular, se detectó poco aceite en las

5

10

15

20

25

-50

semillas a los 15 DAA. Entre 15 y 20 DAA, la acumulación de aceite fue también relativamente baja, sin embargo, un rápido aumento en la acumulación de aceite se produjo entre 20 y 35 DAA. Después de 35 DAA, disminuye la velocidad de acumulación de aceite en las semillas, y es esencialmente constante. Estas observaciones son coherentes con los informes anteriores (El-Nockrashy et al., 1975; Kajimoto et al., 1979).

Se han medido también las cantidades de los seis ácidos grasos mayores presentes en la semilla de algodón, ácido mirístico (C14:0), ácido palmítico (C16:0), ácido palmitoleico (C16:1), ácido esteárico (C18:0), ácido oleico (C18:1) y ácido linoleico (C18:2), en el desarrollo del embrión (Figura 1). La velocidad de síntesis del ácido linoleico fue mayor que las velocidades de síntesis que los demás ácidos grasos. Se observó un rápido aumento en la síntesis del ácido linoleico en el periodo de 15 a 30 DAA, simultáneo con el rápido aumento del porcentaje de contenido en aceite, en el que el contenido en ácido linoleico aumentó desde el 22% hasta casi el 50%. Había solamente un ligero aumento después de esto. Se observó también una disminución continua en el porcentaje de ácido palmítico en la semilla, entre 15 y 35 DAA, una disminución que se ralentizó en las etapas del desarrollo posterior. Curiosamente, los niveles en ácido oleico disminuyeron gradualmente durante todo el desarrollo de la semilla de algodón. El contenido en ácido esteárico de la semilla disminuyó desde aproximadamente 9% de lípidos totales a los 15 DAA, a sólo aproximadamente 2,5% a los 30 DAA, y permaneció en este nivel después de esto. El ácido mirístico y el ácido palmitoleico, permanecieron a niveles relativamente bajos durante todo el periodo del desarrollo embrionario.

Tabla 4

Contenido en aceite y composición en ácido graso del aceite de semilla de algunos cultivos de algodón de G. hirsutum y otras especies de Gossypium

Contenido

Ácidos Grasos (%)

Entradas

en aceite 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2

(%)

G. australe

16.2b 0.7a 21.5a 1.6b 1.7a 11.0b 62.1f

G. bickii

14.6a 0.8a 20.6a 0.9a 3.5c 8.6a 64.1g

G. robinsonii

17.5b 0.9a 22.8abc 0.6a 2.7b 10.4ab 60.0e

G. sturtianum

17.3b 1.1a 20.4a 0.5a 2.6b 11.2b 62.5fg

G. arboreum

22.4de 0.7a 21.0a 1.0a 3.6c 27.2e 45.3a

G. barbadense

21.1 cd 0.7a 24.4bcd 0.7a 2.2ab 19.4d 52.0bc

G. hirsutum:

cv Acala R

23.0ef 0.6a 24.4bcd 0.5a 2.3ab 16.9cd 54.4cd

cv BAR7/8

21.1 cd 0.9a 23.9bc 0.6a 2.3ab 15.6c 56.1 d

cv DP90

22.0cde 0.7a 26.9d 0.6a 2.3ab 16.3cd 52.5bc

cv MCU-5

20.6c 0.7a 22.4ab 0.8a 2.1ab 16.4cd 56.1 d

cvLintless 28

23.7efg 0.8a 24.3bc 0.5a 2.6b 18.7cd 52.6bc

cvLintless 53

23.7efg 0.8a 25.5cd 0.5a 3.7c 18.3cd 50.6b

cv Sicala33

23.2ef 0.8a 24.6bcd 0.7a 2.7b 16.7cd 53.4c

cv Sicala34

23.0ef 0.7a 24.6bcd 0.5a 2.5b 16.7cd 54.0cd

5

10

15

20

25

30

35

40

-51

(continuación)

cv CS50

25.0gh 0.6a 24.1bc 0.4a 2.5ab 17.7cd 54.1cd

cv CS65

23.8efg 0.9a 22.6ab 0.6a 2.5ab 16.3cad 56.4d

cv Siokra L22

24.5fgh 0.8a 24.9bcd 0.7a 2.7b 17.2cd 53.1bc

cv Siokra L23

24.7fgh 0.7a 25.1bcd 0.7a 2.5ab 17.5cd 52.7bc

cv Siokra 1-4

25.5h 0.7a 24.4bcd 0.5a 2.4ab 17.5cd 54.2cd

cv Sicala V-2

26.0h 0.7a 23.8bc 0.5a 2.4ab 17.9cd 54.1 cd

* Las diferencias menos significativas se calculan para el nivel 5% de probabilidad. En las columnas los medios que tienen una letra en común no son significativamente diferentes.

Los datos presentados en la Figura 1 sugieren que el contenido en aceite y la composición del ácido graso de la semilla de algodón se determina en una etapa inicial del desarrollo, aproximadamente 20 a 35 DAA. De hecho, la mayoría del aceite total encontrado en la semilla de algodón madura se sintetiza durante los 30 días últimos del desarrollo del embrión, y este parece ser el tiempo crítico en la producción de aceite de semilla de algodón.

EJEMPLO 5

Aislamiento y clonación de los ADNc que codifican ácido graso Δ9-desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) de algodón

Una secuencia nucleotídica que comprende un gen de ácido graso Δ9-desaturasa (Δ9 estearoil-ACP desaturasa) de algodón se aisló esencialmente como describen Liu, Q., et al. (1996).

En resumen, se sintetizó un par de cebadores de degenerados RCP que contenía algunos posibles codones correspondientes a los marcos de lectura abierta (ORF) de las secuencias peptídicas entre los ADNc de Δ9-estearoil-ACP desaturasa de semilla de ricino (Shanklin y Somerville, 1991), pepino (Shanklin et al., 1991) y lino (Singh et al., 1994). Las secuencias de los cebadores son las siguientes (las posiciones degeneradas están entre paréntesis)

D9S (SEC ID nº: 8): 5’-ATGGC-(G/T)CT(C/G)A(A/G)GCT(C/G/T)CAT(C/G)C -3’; y

D9A (SEC ID º: 9): 5’-TCA(G/C)AG(C/T)TT(C/A)AC(T/C)TG-(T/C)CTAT -3’.

Se aisló ARN completo de embriones de semilla de algodón a los 25 a 35 días después de la antesis, y se purificó poli(A)+ ARN de los mismos según los procedimientos descritos en la presente memoria anteriormente.

Se sintetizó la plantilla de ADNc monocatenario para RCP de transcriptasa inversa a 45ºC de poli(A)+ ARN utilizando un kit Superscript (Gibco BRL), según las instrucciones del fabricante. Se realizaron ampliaciones por RT-RCP en 50 µl de volumen de reacción, que contenía 50 pmoles de cada cebador D9S y D9A, y de ADNc monocatenario procedente de 20 ng de poli(A)+ ARN. Se calentó la mezcla a 96ºC durante 5 min antes de comenzar la reacción, y se añadieron 3 unidades de AmpliTaq® ADN polimerasa (Perkin-Elmer Cetus). Se llevó a cabo la ciclación de las mezclas de reacción en un ciclador térmico Corbett FTS960, utilizando 40 ciclos del programa siguiente:

(i)

94ºC durante 30 s;

(ii)

48ºC durante 30 s;

(iii) 72ºC durante 1 min 10 s.

Estos 40 ciclos fueron seguidos de incubación durante 10 min a 72ºC.

En estas condiciones, se obtuvo un fragmento de ADN de aproximadamente 1 kb que comprende una región de codificación de proteínas. La identidad del producto de RCP clonado como Δ9-estearoil-ACP desaturasa que codifica un ADNc parcial, se confirmó por secuenciado del ADN. Este fragmento se clonó en un vector T® (Promega).

El ADN parcial se escindió del ADN plásmido purificado, y se radiomarcó con [α32P]dCTP como se describió en la presente memoria anteriormente. La sonda marcada se utilizó para seleccionar un banco de ADNc de semilla de algodón, preparado utilizando el vector λZAPII (Stratagene) y poli(A)+ ARN aislado de los tejidos embrionarios de desarrollo de la semilla de G. hirsutum cv Deltapine-16 como se describió en la presente memoria anteriormente, en condiciones de hibridación de alta severidad. Diez placas que presentaban fuertes señales positivas en el cribado primario se seleccionaron y se purificaron más mediante cribados secundarios y terciarios. El fagómido que contenía el ADNc de la Δ9-estearoil-ACP desaturasa se escindió in vivo utilizando el sistema ExAssist/SOLR.

Los 10 clones identificados eran idénticos, basándose en la secuencia nucleotídica parcial y en los análisis de la cartografía de restricción. Un clon, denominado ghSAD-1, se secuenció completamente (SEC. ID. nº: 1; Figura 2). La secuencia nucleotídica de ghSAD1 está también disponible al público con el nº de registro X95988 del GenBank.

El clon ghSAD-1 tiene 1553 pb de longitud, y comprende un 5’-UTR de 12 pb, un 3’-UTR de 350 pb y un ORF de 1191 pb que codifica un polipéptido de 397 restos de aminoácidos de longitud (SEC. ID. nº: 2). La secuencia nucleotídica que rodea el supuesto punto de partida ATG tiene 78% de identidad con el consenso para la iniciación de la traducción de la planta propuesta por Lütcke et al. (1987). La densidad de ghSAD-1 como codificador de Δ9 estearoil-ACP desaturasa fue confirmada por análisis de su identidad de secuencia con otros ADNc que codifican a Δ9 estearoil-ACP desaturasa en la base de datos GenBank.

El polipéptido deducido de Δ9 estearoil-ACP desaturasa de G.hirsutum contiene una secuencia peptídica de tránsito del plástido aparente en su terminal N, coherente con su localización en el plástido. Basándose en la homología con el polipéptido de la semilla de ricino (Knutzon, et al., 1991), el resto de aminoácido en la posición 32 del polipéptido codificado por ghSAD-1 es el punto de escisión más probable para el péptido de tránsito al plástido. Los restos que preceden inmediatamente al aminoácido 33 de la SEC. ID. nº: 2 se asemejan mucho al punto de escisión de consenso de los péptidos de transito al plástido propuestos por Gavel y von Heijne (1990). Por consiguiente es posible que el ADNc de ghSAD-1 codifica un polipéptido original que comprende un péptido en tránsito de 32 aminoácidos de longitud, para facilitar la transposición del polipéptido al proplástido. La escisión posterior del péptido en tránsito posiblemente produce una proteína madura de 365 restos de aminoácidos de longitud. Como con otra, caracterizada anteriormente, las Δ9 estearoil-ACP desaturasas vegetales, la secuencia de aminoácidos deducida de ghSAD-1 es muy hidrófila, coherente con la naturaleza soluble de la enzima. No se encontraron hélices transmembranarias en la secuencia de polipéptido completo utilizando el programa de internet SOSUI (http://www.tuat.ac.jp/mitaku /sosui/).

Como se indica en la Tabla 5, existe considerable homología entre ghSAD-1 y entre los ADN de Δ9 estearoil-ACP desaturasa de otras especies vegetales a los niveles de nucleótido y aminoácido. Como es de esperar, las proteínas maduras de Δ9 estearoil-ACP desaturasa están mucho más conservadas, que los péptidos en tránsito de los polipéptidos completos.

Los aminoácido 322 a 342 de SEC.ID. nº: 2 (Figura 2) se asemejan a una firma de la familia II de la ácido graso desaturasa (http://www.genome.ad.jp/SIT/MOTIF/.html). Un motivo de unión al hierro, que contiene dos repeticiones de la secuencia de aminoácidos Glu-Xaa-Xaa-His (es decir EXXH) separado por aproximadamente 100 aminoácidos, se encuentra también en el polipéptido Δ9 estearoil-ACP desaturasa del algodón (en letra negrita en la Figura 2), como con otras proteínas di-hierro de clase II, incluyendo el componente R2 de una ribonucleótido reductasa y las hidrocarburo hidrolasas bacterianas solubles (Fox et al., 1994).

EJEMPLO 6

Expresión del gen ghSAD-1 durante el desarrollo de la semilla de algodón

El ARN completo, precedente del desarrollo de embriones de la semilla de algodón a los 25, 30, 36, 45 DAA, o las hojas, se aisló, se hizo la electroforesis en un gel de agarosa, se transfirió a membranas de nilón y se sondó con un fragmento de ADN marcado procedente del 3’-UTR del clon ghSAD-1, esencialmente como se describió en la presente memoria anteriormente. Debido a la dificultad en la obtención de muestras de ARN desde las etapas iniciales del desarrollo embrionario, la expresión génica antes de la 25 DAA no se examinó.

Como se demuestra en la Figura 3, se detectó alta expresión en las cuatro etapas del desarrollo embrionario examinadas. Sin embargo, no existía ningún transcrito detectable en el tejido foliar. Se observó la expresión específica de la semilla más alta a 30 DAA y 35 DAA. Los autores especulan que la expresión de ghSAD-1 se produce bien antes de 25 DAA.

TABLA 5 Similitudes entre ghSAD-1 y otros ADNc de estearoil-ACP Δ9 desaturasa

Especies vegetales

nº de registro Similitud en % con ghSAD-1 ORF (nt) Identidad global Péptido maduro Referencia

Arabidopsis thaliana

X93461 71,4 84,9 86,3 GenBank X93461

Arachis

AF172728 Tate et al.,1999

hypogaea

Brassica napus

X63364 71,8 86,1 88,5 Slocombe et al.,

1992

Brassica juncea

AF153420 Vageeshbau et al., 1999

Brassica rapa

X60978 73,0 86,9 88,8 Knutzon et al.,1992

Elaeis

U68756 72,4 87,5 89,0 Shah and Rashid,

guineensis

1996

Sesamum indicum

D42086 74,7 88,9 90,4" Yukawa et al.,1994

Carthamus tinctorius

M61109 72,8 89,2 91,2 Thompson et al., 1991

Coriandrum sativum

M93115 63,3 77,8 78,5 Cahoon et al., 1992

Cucumis sativa

M59858 73,8 88,4 89,9 Shanklin et al., 1991

G. hirsutum

AJ132636 Liu et al.2000

G. hirsutum

A1730379 Blewitt et al.,1999

Glycine max

L34346 74,9 88,8 90,4 Chen and Moon, 1995

Helianthus

U70374 70,8 85,4 88,0 GenBank U70374

annuus

Linum usitatissimum

X90762 68,4 80,7 82,5 Singh et al., 1994

Linum usitatissimum

AJ006957 Jain, 1998

Linum usitatissimum

AJ0069578 Jain, 1998

Asclepias syriaca

U60277 59,2 76,3 76,8 Cahoon etal., 1997

Olea europaea

U58141 69,9 84,7 86,3 Baldoni et al., 1996

Pelargonium xhortorum

U40344 62,7 77,9 79,1 Schultz et al., 1996

Persea americana

AF116861 Madi and Pruskey, 1999

Oryza sativa

D38753 67,7 82,1 84,9 Akagi et al., 1995

Ricinus communis

M59857 77,6 89,4 90,7 Shanklin et al.,1991

Sesamum indicum

D42086 Yukawa et al., 2000

5

10

15

20

25

30

35

-55 (continuación)

Solanum commersonii

X78935 71,5 87,6 87,6 GenBank X78935

Simmondsia chinensis

M83199 69,9 86,1 89,0 Sato et al., 1992

Spinacia oleracea

X62898 71,0 86,2 88,2 Nishida et al., 1992

Solanum

M91238 70,8 84,8 86,6 Taylor et al., 1992

tuberosum

T. alata pTAD2

U07597 69,6 86,2 88,5 Cahoon et al., 1994

T. alata pTAD3

U07605 70,5 85,9 87,4 Cahoon et al., 1994

T. alata �6desaturase

U09269 65,0 75,0 77,8 Cahoon et al.,1994

EJEMPLO 7

Organización de la familia del gen de Δ9-estearoil-ACP desaturasa

Se analizó la organización de la familia del gen Δ9-estearoil-ACP desaturasa del algodón por hibridación de inmunotransferencia Southern de las muestras de ADN genómico del algodón, utilizando sondas de ADN marcadas consistentes en el 3’-UTR del clon ghSAD-1, o alternativamente, la región de codificación completa de ghSAD-1, en condiciones de hibridación de alta severidad, esencialmente tal como se describe en la presente anteriormente.

Los ADN genómicos probados precedían de G. barbadense, G. hirsutum (cv Deltapine-16), G. hirsutum (cv Siokra), G. herbaceum, G. raimondii. Los ADN del algodón se digirieron con EcoRI, HindIII o Xbal antes de la electroforesis, porque estas enzimas no tienen puntos en la región cubierta por las secuencias de ADN sonda.

Como se muestra en la Figura 4-A, la sonda específica para ghSAD-1 constituida por el 3’-UTR de ghSAD detectó dos bandas fuertes en cada uno de los alotetraploides, y una sola banda fuerte en cada uno de los dos dipolos, para todos los digestos de la enzima de restricción probados. Estos datos sugieren la presencia de dos copias del gen ghSAD-1 en cada uno de los tetraploides, y solamente una copia de cada uno de los diploides, coherente con la ploidía de cada algodón.

En cambio, la región completa de codificación de ghSAD-1 detectó un modelo complejo en el ADN del algodón, constituido por múltiples fragmentos en cada uno de los tres digestos enzimáticos (Figura 4-B). Estos datos indican desde luego que la Δ9 estearoil-ACP desaturasa está codificada por una familia multigénica que está compuesta por 6 a 8 genes, o copias de gen, en genomas de algodón diploides, y probablemente el doble que muchos en los algodones alotetraploides, G. barbadense, y G. hirsutum.

Además, los algodones tetraploides probados, G. barbadense, y dos cultivos de

G. hirsutum, comparten modelos con longitud de fragmento de restricción muy conservados, con solo diferencias menores. Sin embargo, las dos especies diploides son característicamente diferentes. Se estimó que los genomas A y D del algodón divergían a partir de un ancestro común de hace 6 a 11 millones de años, mientras que la divergencia de los dos tetraploides sucedió mucho más recientemente, aproximadamente hace 1 a 2 millones de años (Endrizzi et al.,1985; Wendel y Albert, 1992). Entre los algodones diploides actualmente existentes, la especie diploide del genoma A de G. herbaceum, y la especie diploide del genoma de G. raimondii, se consideran que están más estrechamente emparentadas con la especie del progenitor del algodón tetraploide moderno (Endrizzi et al.,1985).

A este respecto, de los dos fragmentos de EcoRI en cada uno de los tres tetraploides (Bandas 1 a 3 de la Figura 4-A), el fragmento menor EcoRI parece ser el mismo que en G. herbaceum diploide del genoma A (Banda 4 de la Figura 4-A), lo que sugiere que este gen procede del genoma A. Así mismo, el fragmento de EcoRI superior en cada uno de los tres tetraploides (Bandas 1-3 de la Figura 4-A), corresponde con el fragmento presente en G. raimondii diploide del genoma D (banda 5 de la Figura 4-A), lo que sugiere que este gen procede del genoma D. Aún entre los modelos complejos en la Figura 4-B, algunos fragmentos de hibridación presentes en los algodones tetraploides son idénticos a los de la especie diploide probada, lo que sugiere una asignación de orígenes subgenómicos de los genes tetraploides.

En resumen, los datos presentados en la Figura 4 sugieren que el gen de Δ9 estearoil-ACP desaturasa del algodón, ghSAD-1, es un miembro de la familia multigén muy conservado en algodón tetraploide, que comprende por lo menos 6 a 8 genes, o copias de genes, por genoma diploide, y posiblemente procede de los genomas A y D.

EJEMPLO 8

Aislamiento y clonación de los ADNc que codifican la ácido graso Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa) de algodón

Se aisló una secuencia nucleotídica que comprende un gen de ácido graso Δ12desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa) de algodón, esencialmente como describe Liu, Q., et al. (1999).

En resumen, se utilizó una sonda heteróloga, constituida por la región de codificación completa de la ω-6 desaturasa microsómica de B. juncea, para identificar el banco de ADNc de la semilla de algodón descrito en la presente anteriormente. Se identificaron doce placas positivas a hibridación en una selección primaria de aproximadamente 1 x 106 ufp, once de las cuales se purificaron mediante dos identificaciones consecutivas más, y sus inserciones de ADNc se caracterizaron mediante la determinación de la frecuencia nucleotídica, esencialmente como se describió en la presente memoria anteriormente.

La cartografía del la enzima de restricción, y el análisis parcial de la secuencia de ADN, indicaron que los clones de ADNc recuperados alojaban la misma inserción, denominada ghFAD2-1.

Los análisis de las secuencias nucleotídicas de ghFAD2-1 pusieron de manifiesto que estaba truncada en el extremo 5’. Para obtener el extremo 5’ desaparecido de ghFAD2-1 se empleó un método de RCP utilizando ADN exactos en bruto procedentes del banco de λ ADNc como plantilla de ADN. Una muestra del bacteriófago que contenía el banco de ADNc de semillas de algodón (aproximadamente 1 x 109 ufp) se extrajo mediante fenol/cloroformo y cloroformo, seguido de precipitación en etanol. El sedimento se secó al aire y se disolvió en 20 µl de H2O. El extremo 5’ del ADNc se amplió utilizando un cebador específico para ADNc, denominado Δ12A4, en combinación con el cebador delantero (es decir el cebador que hibrida al punto de cebado delantero en el vector pBluescript) o alternativamente, el cebador inverso (es decir el cebador que hibrida el punto de cebado inverso en el vector pBluescript), que se une en la región próxima a los puntos de clonación 5’ y 3’ de EcoRI de este vector, de la forma siguiente:

Cebador �12A4 (SEC ID nº: 10): 5’-GCATAGGTCATGGACCACGT-3’;

Cebador delantero (SEC ID nº: 11):5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’;

Cebador inverso (SEC ID Nº: 12): 5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’.

Una mezcla de la reacción RCP de 50 µl contenía dNTP 200 µM, 1 x tampón de RCP, 20 pmoles de cada uno de los cebadores, 5 µl del extracto del banco de ADNc y 1 unidad de Taq polimerasa. La RCP se llevó a cabo calentando a 94ºC durante 2 min; seguido de 30 ciclos, a 94ºC durante 45 segundos, 57ºC durante 1 min y 72ºC durante 1 min. Después del último ciclo, se incubaron las reacciones durante 10 min a 72ºC. El producto de la RCP se purificó por el sistema de purificación de ADN Wizard PCR Preps (Promega) y se clonó en el vector T (Promega) según las instrucciones del fabricante.

La secuencia nucleotídica de un clon ampliado se emparejó con la secuencia del terminal 5’ del clon del ADNc original. Las secuencias nucleotídicas del clon original y el producto de ampliación se unieron (SEC. ID. nº: 3) para producir un ADNc completo de 1411 pb de longitud, que codifica un polipéptido de 386 aminoácidos de longitud (SEC. ID. nº: 4; y Figura 5).

Se ha aislado también un segundo ADNc que codifica una ω-6 desaturasa microsómica de algodón, de 1422 nucleótidos de longitud, y se denomina ghFAD2-2 (nº de registro Y10112). La secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos deducida de ghFAD2-2 se presenta en la Figura 6 (SEC. ID. nº: 5). El clon ghFAD2-2 del ADNc es divergente del ghFAD2-1 en cuanto que posee los UTR en 5’ y 3’ únicos, lo que indica que estos genes han evolucionado independientemente dada su divergencia a partir de un gen ancestral común. Las sondas específicas para el gen, basadas en las únicas secuencias 3’-UTR de ghFAD2-1 y ghFAD2-2, se han utilizado en los análisis de transferencia Southern y Northern, para determinar la organización y expresión génica respectivamente.

Como se muestra en la Figura 7, la alineación de las ω-6 desaturasas microsómicas de algodón (ghFAD2-1 y ghFAD2-2), de soja (gmFAD2-1, FAD2-2), A. thaliana (atFAD2) y la ω-3 desaturasa microsómica de B. napus (bnFAD3) y el plástido ω6 desaturasa de la soja (gmFAD6), pone de manifiesto una gran conservación entre las ω6 desaturasas microsómicas. Además, las proteínas del algodón específicas para la semilla (ghFAD2-1) y soja (gmFAD2-1) son las más íntimamente relacionadas entre sí, mientras que ghFAD2-2 del algodón es la más similar a la proteína de soja expresada constitutivamente, gmFAD2-2. La identidad de secuencia significativamente inferior se produce entre la proteína microsómica ω-3 desaturasa de B.napus, bnFAD3, y alguna de las ω-6 desaturasas microsómicas. El plástido ω-6 desaturasa, gmFAD6, sigue siendo la secuencia mínima similar a todas las secuencias de aminoácido de la desaturasa microsómica. Este análisis confirma estudios anteriores (Yadav et al.,1993).

Las tres secuencias con histidina que demostraron ser muy conservadas en todas las desaturasas unidas a la membrana (Schmidt et al.,1994), se observaron también en las ω-6 desaturasas microsómicas de G. hirsutum, ghFAD2-1 y ghFAD2-2, como se muestra en la Figura 7, entre las cinco ω-6 desaturasas microsómicas listadas, los restos de aminoácidos de consenso deducidos para los tres motivos de la secuencia con histidina son los siguientes:

(i)

His-Glu-(Cys/Trp)-Gly-His-His [es decir, HE(C/W)GHH] (SEC ID Nº: 26);

(ii)

His-Arg-Arg-His-His (es decir, HRRHH) (SEC ID Nº: 27); y

(iii) His-Val-Ala-His-His (es decir HVAHH) (SEQ ID NO: 28).

La secuencia general para el motivo de la secuencia con histidina es His-Xaa(2-3)-His-His (SEC. ID. nº: 29 y SEC. ID. nº: 30).

De manera similar a otras ω-6 desaturasas microsómicas, la secuencia de la proteína deducida del clon ghFAD2-1 carece de una secuencia señal reconocible para dirigirse al retículo endoplásmico (RE) y es posible que los productos génicos puedan transponerse en el RE después de la traducción, como en el caso de la Δ9-estearoil-CoA desaturasa del hígado de rata (Thiede et al., 1985). Un motivo del terminal carboxilo rico en lisina, presente en la enzima FAD3 de A. thaliana, que se ha sugerido que representa la señal de retención de las proteínas de la membrana integrales en el RE (Jackson et al., 1990), no está presente en las ω-6 ácido graso desaturasas microsómicas del algodón.

Próximo al del terminal C del ORF de ghFAD2-1 se encuentra un tramo de seis restos de glicina contiguos, que diferencian esta secuencia de aminoácidos de otras ω-6 desaturasas microsómicas (Figura 7).

El análisis del gráfico de la hidroterapia de la secuencia de aminoácidos codificada por ghFAD2-1 pone de manifiesto seis hélices transmembranarias. Curiosamente, las tres secuencias con histidina propuestas para ser secuencias que se unen al hierro durante la catálisis, no están situadas en la región de las hélices transmembranarias.

EJEMPLO 9

Expresión de los genes ghFAD2-1 y ghFAD2-2 durante el desarrollo de la semilla de algodón

Las hibridaciones Northern de una sonda marcada de ghFAD2-1 para el ARN del algodón se realizaron en las mismas condiciones descritas en la presente anteriormente. Como se muestra en la Figura 8B, la expresión de ghFAD2-1 se detectó en los embriones muestreados al principio (es decir, a 25 DDA). El nivel detectable de ARNm aumentó rápidamente durante el desarrollo del embrión, siendo la expresión mayor a 30 DAA. Se detectaron cantidades de transcritos significativamente menores en los embriones más próximos a la madurez, a 45 DAA o más tarde. No se detectaron transcritos del ghFAD2-1 en los tejidos foliares del algodón. El modelo de datos de acumulación de ARNm presentado en la presente memoria, sugiere que el gen ghFAD2-1 se expresa durante el periodo de síntesis y acumulación máximas de lípidos de almacenamiento en el algodón, coherente con el aumento de acumulación de ácido linoleico durante el mismo periodo. Por consiguiente, estos datos indican que el gen ghFAD2-1 posiblemente desempeña una función principal en la desaturación del aceite de semilla de algodón.

En cambio, se detecta expresión muy baja de ghFAD2-2 tanto en los tejidos foliares como en los embrionarios (Figura 8C). Estos datos sugieren que el gen ghFAD2-2 contribuye solamente en una medida menor a la actividad total de ácido graso Δ12-desaturasa en la semilla de algodón, y, como consecuencia, la expresión de este gen es un factor de contribución menor a la desaturación del aceite de la semilla de algodón.

EJEMPLO 10

Organización de la familia del gen de oleil-PC Δ12-desaturasa

Se ha analizado la organización de la familia del gen de oleil-PC Δ12-desaturasa del algodón, por hibridación de inmunotransfrencia Southern de las muestras de ADN genómico del algodón, utilizando sondas de ADN marcadas consistentes en el 3’-UTR de los clones ghFAD2-1 y ghFAD2-2, o alternativamente, las regiones de codificación completas de estos clones de ADNc, en condiciones de hibridación de alta severidad, esencialmente como se describió en la presente memoria anteriormente.

Los ADN genómicos probados procedían de G. barbadense, G. hirsutum (cv Deltapine-16), G. hirsutum (cv Siokra), G. herbaceum, G. raimondii, G. robinsonii. Los ADN del algodón se digerieron con EcoRI y HindIII.

La Figura 9-A representa una inmunotransferencia Southern hibridada a un fragmento específico para ghFad2-1 basado en la secuencia del 3’-UTR de ghFAD2-1. En ambos digestos EcoRI y HindIII, existen dos fragmentos distintos en tetraploides (banda 13), uno de los cuales está presente en cada uno de los diploides (banda 4-6). De los dos fragmentos presentes en la especie tetraploide, el fragmento menor tiene un tamaño similar al fragmento de G. herbaceum (banda 4) mientras que el fragmento mayor es similar al de G. raimondii (banda 5). UN solo fragmento está también presente en

G. robinsonii, la especie diploide del genoma C.

La Figura 9-B representa una inmunotransferencia Southern utilizando como sonda la región de codificación más conservada de ghFAD2-1. Cinco fragmentos de EcoRI y cuatro fragmentos de HindIII son detectables en algodones tetraploides (bandas 1-3) mientras que sólo dos fragmentos son discernibles en los diploides (bandas 4-6). Sin embargo un fragmento HindIII (el tercer fragmento de la parte superior en las bandas 1-4; y el segundo fragmento en la banda 6) parece ser al menos dos veces tan fuerte como los demás fragmentos, y supuestamente contiene múltiples copias del gen. Por consiguiente, los autores sugieren que, existen por lo menos cinco miembros de la familia del gen ω-6 desaturasa microsómica en cada una de las especies de algodón tetraploide. Además, parece que la especie diploide del genoma A, G. herbaceum (banda 4), tiene por lo menos tres genes, y la especie diploide del genoma B, G. raimondii (banda 5), tiene dos genes, en esta familia de genes.

Los modelos con fragmento incoherentes obtenidos para el ADN de G.robinsonii digerido con EcoRI y HindIII (banda 6) puede ser una consecuencia de la digestión incompleta del ADN genómico de G. robinsonii. A este respecto, el modelo de fragmentos HindIII (observado para G. robinsonii), son similares a los observados en las especies diploides del genoma A.

En resumen, el análisis de inmunotransferencia Southern, indica que existen por lo menos cinco genes de ω-6 desaturasa microsómica íntimamente relacionados en cada dos tetraploides, G. barbadense y G. hirsutum. La conservación de los modelos polimórficos con fragmento de restricción en genomas tetraploides y aquellos que representan sus supuestos progenitores, fue suficiente para permitir la asignación de cada uno de los fragmentos en el alotetraploide para sus respetivos subgenomas. Los autores estiman que, para el algodón tetraploide, por lo menos tres genes (copias) procedían del genoma A, y por lo menos dos genes pueden proceder del genoma D. El gen ghFAD2-1 parece ser un gen de una sola copia en las especies de algodón diploide, lo que indica que probablemente no se produjo una duplicación del gen en el algodón.

La secuencia promotora del gen ghFAD2-1 del algodón se proporciona en la SEC. ID. nº: 7. A este respecto la SEC. ID. nº: 7 contiene suficiente secuencia nucleotídica para dotar de expresión a un gen estructural al que está operativamente conectada en la semilla de algodón. En particular, los 5006 nucleótidos de la SEC. ID. nº: 7 incluyen 3784 nucleótidos corriente arriba del punto de partida de la transcripción del gen ghFAD21 (posición 3785), el primer intrón del gen (nucleótidos 3889 a 4998) y la región no traducida en 5’ completa (UTR) del gen ghFAD2-1 (nucleótidos 3785 a 5006).

EJEMPLO 11

Construcciones génicas para silenciar los genes de la biosíntesis de ácido graso

Se produjeron construcciones génicas para facilitar una reducción en la expresión del gen endógeno de ácido graso Δ9-desaturasa (ghSAD-1) del algodón y gen endógeno de ácido graso Δ12-desaturasa (ghFAD-2-1) del algodón. Las construcciones génicas utilizaron las secuencias de ADNc, ghSAD-1 y ghFAD-2-1, en la orientación antisentido, o como secuencias de repetición invertidas con autocomplementariedad.

Construcción del plásmido binario pBI-Lectina

Para dotar de expresión específica para la semilla a fragmentos génicos que comprenden secuencias complementarias e invertidas de estos genes, se utilizó el promotor de la lectina de soja. Una secuencia adaptadora NotI que tiene una secuencia SmaI se produjo al hibridar oligonucleótidos que tienen las secuencias nucleotídicas, 5’-GGCCCGGG-3’ (SEC. ID. nº: 13) y 5’-GGCCCCCG-3’ (SEC. ID. nº: 14) utilizando condiciones normales. Se ligó este adaptador a la secuencia NotI del plásmido pGLe-10 (Cho, 1995) que contenía las secuencias promotora y terminadora de lectina de soja. El plásmido se digirió posteriormente utilizando EcoRI y HindIII, y se aisló un fragmento que comprende tanto las secuencias promotora de lectina como terminadora de lectina, y se ligó en pBT121 que se había digerido utilizando EcoRI y HindIII, sustituyendo de este modo el gen híbrido 35S-GUS-NOS de CaMV del pBI121 con el fragmento que contiene promotor/terminador de lectina de soja. Los componentes de este vector binario pBIlectina modificado se ilustran en la Figura 10.

Se clonaron fragmentos génicos en la secuencia SmaI del vector binario pBIlectina, cuya secuencia estaba presente en el adaptador NotI. Para facilitar dichas etapas de clonación, el vector binario pBI-lectina se digirió previamente con Smal y se fosforiló utilizando la enzima fosfatasa intestinal de vaca (CIP) (Pharmacia).

Construcciones génicas antisentido de ácido graso Δ9-desaturasa

Las construcciones génicas antisentido dirigidas contra el gen de Δ9-desaturasa comprenden el clon ghSAD-1 de ADNc completo, clonado en la orientación antisentido como un fragmento de NotI con extremo truncado en la secuencia SmaI del vector binario de pBI-lectina.

Construcciones génicas con repetición invertida de ácido graso Δ9-desaturasa

Se produjo por ampliación de RCP una repetición invertida de la región 5’-terminal del clon ghSAD-1 del algodón por ampliación por PCR, según la descripción siguiente. Un fragmento de aproximadamente 500 bp de longitud procedente del extremo 5’ del clon de ADNc ghSAD-1 de algodón se amplió utilizando los cebadores siguientes:

(i)

Cebador 9s1 (SEC ID Nº: 15):5’-TTTTAATGCCATCGCCTCG-3’; y

(ii)

Cebador 9a1 (SEC ID Nº: 16): 5’-CTTCAGCAGTCCAAGCCCTG-3’.

El fragmento génico ampliado se clonó en el vector Teasy® (Promega). Un clon que posee el fragmento génico ampliado en una orientación deseada se seleccionó, y el fragmento génico se liberó por digestión del ADN plásmido utilizando SalIy ApaI. Simultáneamente, el clon ghSAD-1 de ADNc completo que tiene la orientación deseada se amplió por RCP, utilizando el presente cebador inverso en el vector pBluescript y el cebador 9a1 anterior, y este clon se linealizó por digestión con las enzimas SalIy ApaI. El fragmento SalI/ApaI de 500 pb, que contenía solamente el extremo 5’ del clon ghSAD-1 de ADNc de algodón, se ligó al ADNc completo linealizado en pBluescript. Esta ligadura produjo una secuencia de repetición invertida parcial que comprende el clon ghSAD-1 completo prolongado en su extremo 3’ por 500 pb de la secuencia nucleotídica del extremo 5’ en la orientación inversa. Por consiguiente, el producto de ligadura contenía una repetición invertida perfecta de la secuencia nucleotídica del extremo 5’ de 500 pb. Para liberar esta secuencia de repetición invertida, el producto de ligadura se digirió utilizando las enzimas de restricción ApaIy XbaI. La secuencia de repetición invertida se completó en el extremo a continuación utilizando fragmento de Klenow, y el fragmento del extremo truncado se ligó en la secuencia SmalI del vector binario pBI-lectina, entre las secuencias promotora de lectina y terminadora de lectina.

Construcciones génicas complementarias de ácido graso Δ12-desaturasa

Se amplió el clon ghFAD2-1 completo de ADNc por RCP, utilizando un par de cebadores de ampliación de algodón forma siguiente:

Cebador 12s1 (SEC ID Nº: 17):5’-CCTGGCGTTAAACTGCTTTC-3’; y

Cebador 12a2 (SEC ID Nº: 18):5’-CCATATAGTTTATTAATATAACAC-3’.

Se clonó el producto de la ampliación en el vector Teasy®, o alternativamente Teasy® (Promega). Se liberó la inserción ghFAD2-1 completa del vector Teasy® por digestión con NotI, se rellenó el extremo utilizando fragmento de Klenow y se ligó en la secuencia SmalI del vector binario pBI-lectina, entre las secuencias promotoras de lectina y el terminadoras de lectina. Se seleccionó un clon que comprende el clon ghFAD2-1 de ADNc en la orientación antisentido por determinación de la secuencia nucleotídica.

Construcciones génicas con repetición invertida de ácido graso Δ12-desaturasa

Una repetición invertida de la región del terminal 5’ del clon ghFAD2-1 del algodón se produjo por ampliación por RCP, según la descripción siguiente.

El ghFAD2-1 completo del ADN en el vector T® con la orientación deseada se seleccionó utilizando el cebador delantero del vector T, y el cebador 12a1 (SEC. ID. nº: 19; 5’-TATGTTGCAAGTAGGTGATC-3’). A continuación se linealizó por digestión del ADN plásmido utilizando NotI (el vector T® contiene solamente una secuencia NotI en la región del polienlazador).

Simultáneamente, un fragmento de aproximadamente 850 bp de longitud procedente del extremo 5’ del clon ghFAD2-1 completo del ADNc de algodón se amplió por RCP, utilizando los cebadores 12s1 y 12a1, y el ADN ampliado se clonó en el vector Teasy®. El fragmento ampliado se digirió utilizando la enzima NotI.

El fragmento de NotI de 850 pb, que contenía sólo el extremo 5’ del ghFAD2-1 del ADNc del algodón, se ligó con la secuencia NotI en el vector T® que contenía el clon ghFAD2-1 del ADNc completo. Esta ligadura produjo una secuencia parcial con repetición invertida que comprende el clon ghFAD2-1 completo ampliado en su extremo 3’ en aproximadamente 850 pb de la secuencia nucleotídica del extremo 5’, en orientación inversa. Por consiguiente, el producto de la ligadura contenía una repetición invertida perfecta de aproximadamente 850 pb de la secuencia nucleotídica del extremo 5’. Para liberar esta secuencia con repetición invertida, se digirió el producto de ligadura utilizando las enzimas de restricción ApaIy SacI. El fragmento de la secuencia repetida invertida, se completó en el extremo a continuación utilizando el fragmento de Klenow, y el fragmento truncado en el extremo se ligó en la secuencia SmaI del vector binario pBI-lectina, entre el promotor de lectina y las secuencias del terminador de lectina.

Se produjo una construcción del silenciado génico de Δ12-desaturasa adicional que comprendía una repetición invertida producida desde aproximadamente 92 pb de la región 5’-UTR del gen ghFAD2-1 genómico (SEC. ID. nº: 7). En esta construcción génica, el 5’UTR del gen ghFAD2-1 se separó mediante la secuencia nucleotídica del primer intrón del gen ghFAD2-1. La secuencia con repetición invertida se colocó operativamente en relación con las secuencias reguladoras del gen ghFAD2-1 (es decir las secuencias procedentes de la SEC. ID. nº: 7). Esta construcción génica se denominará en adelante “construcción génica con repetición invertida de UTR interrumpido por el intrón”.

Para producir la construcción génica con repetición invertida de UTR interrumpido con intron, se amplió el ácido nucleico mediante RCP del G. hirsutum cv ADN genómico Coker 315, utilizando los siguientes cebadores de ampliación:

(i)

PITSal (SEC ID Nº: 20): 5’-ACGCGTCGACGTGTGTTACAAAATGGACCGAA-3’; y

(ii)

PITBam (SEC ID Nº: 21): 5’-CGCGGATCCGCTGGCTGGACACGCAAGAAGCA-3’.

Los restos nucleotídicos del cebador PITSal anteriormente mostrados

en letra

negrita corresponden a los nucleótidos 2569 a 2592 de la SEC. ID. nº: 7. Este cebador tiene una secuencia SmalI localizada en 5’. Los restos nucleotídicos del cebador PITBam anteriormente mostrados en letra negrita son complementarios de los nucleotídicos 4981 a 5003 de la SEC. ID. nº: 7. Este cebador tiene una secuencia BamHI localizada en 5’, que está incorporada en el extremo 3’ del ADN ampliado. Por consiguiente, el ADN ampliado utilizando este par cebador comprende una secuencia SmalI en 5’ y una secuencia BamHI en 3’ para facilitar la subclonación. El fragmento génico ampliado incluyó aproximadamente 1,2 kb de la secuencia nucleotídica corriente arriba de la secuencia de partida de la transcripción del gen ghFAD2-1. Esta es suficiente secuencia para funcionar como promotor en la semilla de algodón. El fragmento de ADN ampliado incluye además el 5’-UTR completo y el primer intrón del gen ghFAD2-1.

El fragmento ampliado de ADN se digirió con SalIy BamHI, y se clonó directamente en las secuencias correspondientes del vector pBI101.2, para dar una construcción intermedia de promotor de ghFAD2-1-intron.

Para producir la repetición invertida en la 5’-UTR, aproximadamente 92 pb de la secuencia 5’-UTR del gen ghFAD2-1 sin la secuencia del intrón, se ampliaron en el ADNc de la semilla de algodón, utilizando los siguientes cebadores de RCP:

(i)

Usac (SEC ID Nº: 22): (5’-CGAGCTCCCCCTCCGCTCCATACCACT-3’); y

(ii)

Ubam (SEC ID Nº: 23) (5’-CGCGGATCCGCTGGCTTTAAAGAAAGCAGTT-3’).

Los restos nucleotídicos del cebador Usac mostrados anteriormente en letra negrita corresponden a los nucleótidos 3796 a 3820 de la SEC. ID. nº: 7. Este cebador tiene una secuencia SmalI localizada en 5’. Los restos nucleotídicos del cebador Ubam mostrados anteriormente en letra negrita son complementarios de los nucleotídicos 3872 a 3888 de la SEC. ID. nº: 7. Este cebador tiene una secuencia BamHI localizada en 5’, que está incorporada en el extremo 3’ del ADN ampliado. Por consiguiente, el ADN ampliado utilizando este par cebador comprende una secuencia SmalI en 5’ y una secuencia BamHI en 3’ para facilitar la subclonación en la construcción promotora de ghFAD2-1-Intrón intermedio.

El fragmento de ADN ampliado se clonó, en la orientación invertida con respecto a su orientación en el gen ghFAD2-1, corriente abajo del intrón en la construcción promotora de ghFAD2-1-intrón intermedio. Por consiguiente, la construcción génica con repetición invertida del UTR interrumpido en el intrón comprendía de este modo las características siguientes:

(i)

los restos de los nucleótidos 2569-3785 de la SEC. ID. nº: 7 que comprenden las secuencias suficientes para proporcionar la expresión en la semilla de algodón y la secuencia de partida de la transcripción del gen ghFAD2-1;

(ii)

una parte de la 5’-UTR del gen ghFAD2-1 correspondiente a los nucleótidos 3785 a 3888 de la SEC. ID. nº: 7;

(iii) el primer intrón del gen ghFAD2-1 correspondiente a los nucleótidos 3889 a 4998 de la SEC. ID. nº: 7 situado corriente debajo de (ii);

(iv)

una parte de la 5’-UTR del gen ghFAD2-1 correspondiente a los nucleótidos 4999 a 5003 de la SEC. ID. nº: 7 situada corriente debajo de (iii);

(v)

una parte de la 5’-UTR del gen ghFAD2-1 correspondiente a los nucleótidos 3796 a 3888 de la SEC. ID. nº: 7 situada corriente debajo de (intervalo) y en orientación invertida con respecto a (ii).

EJEMPLO 12

Transformación de plantas de algodón

Se generaron plantas transgénicas de algodón (G.hirsutum cv. Coker 315) por infección mediada por Agrobacterium, y selección en el medio que contenía sulfato de kanamicina, mediante una modificación del procedimiento descrito por Cousins et al. (1991).

En resumen, plantones de algodón se hicieron germinar asépticamente en medio de Murashige y Skoog (MS) (Murashige y Skoog, 1962), se solidificaron utilizando phytagel (Sigma). Los plantones se mantuvieron en condiciones de poca luz a 28ºC. El callo se inició en los explantes de cotiledón de plantones con 10 a 14 días, en medio de iniciación de callo [elementos MS macro y micro; vitaminas B5 (Gamborg, 1968); 100 mg/l de myo-inositol; 30 g/l de glucosa; 0,2 mg/l de ácido 2,4-diclofenooxiacético (2,4-D); 0,1 mg/l de cinetina; y 0,93 g/l de cloruro de magnesio], se solidificó utilizando 2 g/l de phytagel.

Los explantes procedentes de aproximadamente 20 plantones se infectaron con la cepa AGL1 de A. tumefaciens que se había transformado con la construcción génica oportuno (anteriormente) por electroporación normal. Después de 2 días de cultivo conjunto en presencia de A. tumefaciens, los explantes de algodón se transfirieron a medio MS que contenía 0,1 mg/l de 2,4-D, 0,1 mg/l de cinetina, 50 mg/l de sulfato de kanamicina y 250 mg/l de cefotaxima, y se incubaron a 28ºC durante seis semanas.

Los callos sanos se transfirieron a continuación a un medio MS que contenía 5 mg/l de 6-(γ,γ-dimetilalilamino)-purina (2ip), 0,1 mg/l de ácido naftalenacético (ANA), 25 mg/l de kanamicina y 250 mg/l de cefotaxima, durante un segundo periodo de selección de seis semanas a 28ºC.

Los embriones en desarrollo se mantuvieron y germinaron en los plantones como describen Cousins et al. (1991). En resumen, después del segundo periodo de selección, las partes blandas centrales de los callos se transfirieron a un medio MS solidificado sin añadir fitohormona o antibiótico, para iniciar la embriogénesis. Los callos embrionarios se formaron después de aproximadamente seis a diez semanas de incubación a 28ºC. Los callos embrionarios se transfirieron a un medio de desarrollo de embriones que comprende medio MS que contiene 1,9 g/l más de nitrato potásico. Los embriones continúan desarrollándose en este medio, y pueden separarse y germinar en medio SH (Stewart, 1977), solidificado con phytagel para producir plantones transgénicos de algodón.

Los plantones transgénicos de algodón (generación T1) se transfirieron al suelo, y se mantuvieron en un invernadero, una vez desarrolladas las hojas y las raíces.

EJEMPLO 13

Caracterización de plantas transgénicas de algodón

No se observaron diferencias fenotípicas obvias entre las estirpes transgénicas y las plantas de referencia isogénicas no transformadas. Se preparó ADN genómico de hojas tiernas de plantas de algodón regeneradas (T1), esencialmente como se describió anteriormente en la presente memoria.

La presencia del transgén de silenciado génico respectivo en cada planta de algodón se determinó por RCP, utilizando ADN genómico como plantilla, y los cebadores siguientes:

Cebador 3Lec-s1 (SEC ID Nº: 24): 5’-CATGTGACAGATCGAAGGAA-3’; y

Cebador3Lec-a1 (SEC ID Nº: 25): 5’-ATCTAATTATTCTATTCAGAC-3’.

Este procedimiento amplía un fragmento de ADN de aproximadamente 300 pb que comprende el terminador de la transcripción del gen de lectina de soja. Consecuentemente, la ampliación se produce solamente en la planta de ADN que contiene los genes híbridos introducidos. La confirmación adicional de que el fragmento ampliado era realmente el terminador de lectina de soja se obtuvo realizando el análisis de hibridación por inmunotransferencia Southern, utilizando el terminador de lectina de soja aislado como sonda, como se describió anteriormente en la presente memoria.

5 Para confirmar la presencia de la secuencia complementaria y con repetición invertida de la biosíntesis del ácido graso en las plantas de algodón transgénicas, el ADN genómico procedente de cada supuesta planta transgénica se digirió con HindIII, se separó en un gel de agarosa al 0,7% (pv), se transfirió a una membrana de nilón Hybond, y se sondó con un fragmento de ADN específico para el gen marcado con [α-32P]dCTP.

10 Las condiciones de hibridación y el lavado posterior fueron las mismas que las descritas anteriormente en la presente memoria. Los datos presentados en la Tabla 6 indican el número de copia de los transgenes en algunas estirpes representativas que se analizaron.

TABLA 6

15

Número de copia de los transgenes en plantas de algodón T1

Número de copia del transgén

Estirpe vegetal Estirpe vegetal

Construcción con repetición invertida de Δ9-desaturasa

Construcción antisentido de Δ9-desaturasa Construcción con repetición invertida de Δ12desaturasa Construcción antisentido de Δ12-desaturasa

1

95-6 9A-17 125-21 12A-4

95-37

9A-38 125-23 12A-11

95-40

9A-148 125-26 12A-43

95-43

9A-163 125-27 12A-45

95-49

9A-183 125-31 12A-48

95-55

125-33 12A-59

95-70

125-50 12A-73

95-72

125-60 12A-74

95-75

125-62 12A-130

95-79

125-82

95-87

125-92

95-146

125-103

125-117

125-128

2

95-31 9A-89 125-2 12A-41

95-91

9A-127 125-54 12A-111

95-112

125-58

95-120

125-81

95-136

125-96

3

95-21 95-22 95-51 95-61 95-80 95-96 9A-192 125-12 125-32 125-79 125-114 125-125 12A-60 12A-82 12A-124

4

95-65 9A-118 125-10 12A-117

5

95-23 95-57 95-150 9A-119 9A-189 125-83

6

9A-57 125-87

7

12A-68

8

125-121

9

125-120

10

12A-34

12

12A-56

EJEMPLO 14

5 Caracterización de aceites en semillas transgénicas de T2 que contienen repeticiones invertidas de un gen de ácido graso de Δ9-desaturasa (estearoil-ACP Δ9-desaturasa)

En las semillas producidas por plantas transgénicas (T1) independientes que contienen repeticiones invertidas del gen ácido graso Δ9-desaturasa de algodón, y un 10 algodón G. hirsutum Coker isogénico no transformado, se analizó su composición en ácido graso. Las muestras consistentes en tres semillas T2 mezcladas procedían de numerosas plantas T1 individuales. Se prepararon ésteres metílicos de ácido graso tal como describen Bligh y Dyer (1959). Los ésteres metílicos se separaron por cromatografía de gases (CG), utilizando cromatógrafo de gases Hewlett-Packard 5890 equipado con una

15 columna capilar de sílice fundida (HP-FFAP, 0,53 mm x 30 m). Se identificaron los ácidos grasos por referencia a los patrones químicos descritos en la presente memoria anteriormente.

Los datos se presentan en la Tabla 7. Debido a que las plantas T1 eran

20 generalmente hemicigóticas para el transgén introducido, las semillas T2 se segregaron de este transgén. Consecuentemente, los datos para las muestras de semilla T2 mezcladas presentadas en la Tabla 7 son un promedio de los niveles de ácido graso para las semillas que son homocigóticas o hemicigóticas para el transgén o que carecen del transgén por completo.

25

Aumento de ácido esteárico

La expresión de la repetición invertida del extremo 5’ de ghSAD-1 en el algodón pareció disminuir el nivel de actividad de la enzima estearoil-ACP Δ9-desaturasa en el 30 algodón, como sugiere el nivel elevado de ácido esteárico en la semilla T2 transgénica.

Como se resume en la Tabla 7, por lo menos la mitad de las plantas transgénicas T1 de 22 individuos totales produjeron semilla con elevados niveles de ácido esteárico en comparación con la semilla natural isogénica. Se aumentó el ácido esteárico hasta aproximadamente el 38% del lípido de la semilla total (estirpe 95-92) que representa aproximadamente un aumento de 15 veces en el nivel de este ácido graso.

Disminución de ácido oleico

Sin estar vinculado a ninguna teoría o modo de actuación, el aumento de la producción de ácido esteárico en las estirpes transgénicas, que da como resultado la expresión disminuída del gen endógeno de la ácido graso Δ9-desaturasa (estearoil-ACP Δ9-desaturasa), es a expensas de la producción de ácido oleico y ácido linoleico, porque estos ácidos grasos son todos producto de la actividad de la enzima ácido graso Δ9-desaturasa (estearoil-ACP Δ9-desaturasa). A este respecto, el ácido oleico se redujo, desde el 15% de lípido total de la semilla en el algodón no transgénico, a solamente 5,1% en la estirpe 95-62, lo que representa una disminución en el contenido en ácido oleico de hasta aproximadamente 65% en las estirpes transgénicas.

Disminución de ácido linoleico

El ácido linoleico se redujo también, desde el 57,4% de lípido total en la semilla en el no transgénico, hasta 37,8% en la estirpe 95-62, lo que representa una disminución en el contenido de ácido linoleico de hasta aproximadamente 33% en las estirpes transgénicas.

Disminución de ácido palmítico

Inesperadamente, y favorablemente, el ácido palmítico se redujo significativamente en la semilla T2 del algodón transgénico que contenía la repetición invertida del extremo 5’ de ghSAD-1, particularmente en las estirpes que tienen aumentado el ácido esteárico. En particular, el nivel de ácido palmítico en la semilla de plantas transgénicas se redujo a solamente el 14,7% del lípido total en la semilla en la estirpe 95-62, en comparación con el 24,4% del lípido total en la semilla para las plantas isogénicas no transformadas. Esto representa una disminución en el contenido de ácido palmítico de hasta aproximadamente el 45% en las estirpes transgénicas.

TABLA 7

Contenidos en ácido graso de algodón transgénico T1 que comprende una repetición invertida del extremo 5’ del clon ghSAD-1

Estirpe de la planta

Composición en ácido graso (%) SDP

Palmítico

Esteárico Oleico Linoleico Linolénico

Referencia Coker

24,4 2,7 15,0 57,4 0,2 0,97

95-70

26,1 2,4 14,5 56,6 0,2 0,97

95-33

25,4 2,5 15,4 56,3 0,2 0,97

95-128

22,5 2,6 14,2 60,3 0,2 0,97

95-146

25,1 2,5 15,2 56,8 0,2 0,97

95-112

26,4 2,5 15,2 55,5 0,2 0,97

95-78

24,6 2,6 14,7 57,6 0,2 0,97

98-92

24,3 2,6 16,3 56,4 0,2 0,97

95-43

25,6 2,7 16,5 54,7 0,2 0,96

95-13

22,9 2,7 12,9 61,2 0,1 0,96

95-95

24,3 2,9 15,6 56,8 0,2 0,96

95-65

25,4 2,9 14,7 56,5 0,2 0,96

95-120

24,9 3,0 15,8 55,8 0,2 0,96

95-90

20,6 3,4 13,7 61,8 0,2 0,96

95-21

23,1 4,0 13,4 58,9 0,2 0,95

95-61

24,1 4,2 13,5 57,8 0,2 0,94

95-72

26,0 4,7 14,0 54,6 0,2 0,94

95-51

24,5 5,0 13,6 56,3 0,2 0,93

95-136

24,3 6,6 13,3 55,2 0,2 0,91

95-40

22,7 8,8 12,0 55,8 0,1 0,88

95-98

19,6 10,9 11,6 57,1 0,2 0,86

95-78

22,2 13,0 10,6 53,3 0,2 0,83

95-99

20,5 14,1 9,6 55,0 0,1 0,82

95-6

23,6 14,1 10,1 51,1 0,2 0,81

95-125

21,3 15,2 11,1 51,3 0,2 0,80

95-55

20,1 20,2 8,0 51,6 0,0 0,75

95-37

18,8 23,4 7,9 48,4 0,4 0,71

95-150

19,0 28,0 5,8 45,4 0,3 0,65

95-62

14,7 38,2 5,1 37,8 1,6 0,54

EJEMPLO 15

Caracterización de aceites en la semilla transgénica que es homocigótica para el transgén que contiene una repetición invertida de un gen de ácido graso Δ9-desaturasa

Las estirpes T2 que son homocigóticas para la repetición invertida introducida del gen de ácido graso Δ9-desaturasa de algodón se identificaron por selección. Las composiciones en ácido graso de las semillas individuales T2 (15 en total) procedentes de varias plantas T1 representativas que se diferencian extensamente en su contenido en ácido esteárico, se analizaron como se describe en el ejemplo anterior. Los datos están representados en la Tabla 8.

Resulta evidente que diferentes episodios transgénicos están asociados a diferentes niveles de reducción en la actividad de Δ9-desaturasa (como se indica mediante SDP) y que corresponden a diferentes niveles de acumulación del sustrato de ácido esteárico. Esta variación se puede explicar por diferentes números de copia de transgén y diferentes posiciones de integración genómica de los transgenes. Al producir un número suficiente de transgénicos independientes, puede obtenerse por consiguiente cualquier contenido específico en ácido esteárico deseado entre el límite superior normal para el algodón (3%) y aproximadamente el 35% (véase la Figura 11).

Para confirmar que el silenciado génico observado en Δ9-desaturasa era hereditario, se obtuvieron semillas T2 adicionales y semillas T3 de plantas que presentan fenotipo de silenciado más severo, en particular, las plantas T1 independientes que tienen las mayores niveles de ácido esteárico en su semilla y se denominaron 95-62 y 95-150 (Tabla7). Las composiciones en ácido graso de 15 semillas T2 individuales y 12 semillas T3 individuales procedentes de estas estirpes se determinaron como se describe en el ejemplo anterior. Los modelos de segregación de T2 eran coherentes con una inserción transgénica individual. Los datos presentados en la Tabla 9 demuestran que el elevado nivel de silenciado observado en la semilla T2 como se muestra en la Tabla 8 se hereda en la generación T3, como se demuestra por la herencia de los fenotipos alto en ácido esteárico y bajo en ácido oleico y bajo en ácido oleico y bajo en ácido palmítico.

TABLA 8

Composición del ácido graso (% de ácidos grasos totales) de 15 semillas T2 individuales de cuatro plantas T1 de algodón transformadas con la construcción de silenciado génica con repetición invertida de Δ9-desaturasa y de plantas de referencia Coker no transformadas

Número de la

Número de semilla T2 Palmítico ComposiEsteárico Oleico ción de ácid Linoleico o graso (%) Linolénico SDP

planta T1

Referencia

1 25,1 2,6 15,2 56,6 0,2 0,97

Coker

2 25,1 2,6 14,9 57,0 0,2 0,97

3

24,3 2,2 14,7 58,3 0,2 0,97

4

25,2 2,5 14,4 57,4 0,2 0,97

5

24,9 2,3 15,0 57,4 0,2 0,97

6

25,2 2,6 14,8 56,9 0,2 0,97

7

25,4 2,8 15,7 55,6 0,2 0,96

8

23,9 2,7 15,1 58,0 0,2 0,96

9

24,0 2,9 16,2 56,4 0,2 0,96

10

24,4 2,8 15,0 57,3 0,2 0,96

11

23,3 3,0 14,7 58,5 0,2 0,96

12

23,1 3,2 14,9 58,2 0,2 0,96

13

23,9 2,9 14,9 57,8 0,2 0,96

14

22,9 2,9 14,4 59,3 0,2 0,96

15

25,0 2,7 15,5 56,3 0,2 0,96

Media

24,4 2,7 15,0 57,4 0,2 0,96

95-6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 25,9 25,4 24,7 28,5 25,9 24,5 25,8 25,4 23,6 23,3 23,6 24,8 23,6 22,7 23,6 2,5 3,1 3,3 2,6 3,1 8,4 8,5 9,3 11,6 12,1 12,1 12,9 12,5 14,5 16,0 15,0 13,4 14,7 14,3 13,0 11,9 12,3 11,4 11,8 11,2 10,6 10,0 11,2 10,4 9,9 56,1 57,6 56,7 54,2 57,5 54,5 52,7 53,1 52,1 52,6 52,8 51,4 51,8 51,4 49,4 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,97 0,96 0,96 0,96 0,96 0,89 0,88 0,87 0,85 0,84 0,84 0,83 0,83 0,81 0,79

Media

24,8 8,8 12,1 53,6 0,2 0,88

95-37

1 2 3 4 5 6 23,9 23,9 23,7 23,4 23,9 19,0 2,6 3,0 2,7 2,9 2,8 21,6 13,9 14,7 14,7 16,0 14,6 8,0 59,0 58,0 58,5 57,4 58,2 50,0 0,3 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,97 0,96 0,96 0,96 0,96 0,73

7

19,4 21,1 8,5 49,7 0,3 0,73

8

19,2 22,4 8,8 48,3 0,2 0,72

9

18,4 22,2 10,0 47,9 0,3 0,72

10

18,1 23,7 7,5 49,2 0,3 0,71

11

18,2 24,8 7,4 48,1 0,3 0,69

12

18,0 24,9 7,6 47,9 0,3 0,69

13

17,5 25,1 8,1 47,7 0,3 0,69

14

18,6 25,1 7,3 47,3 0,4 0,69

15

17,9 27,8 7,2 45,5 0,3 0,66

Media

20,2 16,8 10,3 51,5 0,3 0,79

95-62

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Media 24,2 24,0 22,6 21,6 22,4 20,3 18,4 20,2 19,6 18,3 19,0 18,6 18,2 17,0 14,7 19,9 3,4 11,1 12,8 14,4 14,2 16,8 20,5 19,8 20,6 23,7 24,0 24,4 26,3 30,8 34,3 19,8 32,7 19,8 16,6 11,4 16,8 12,5 12,5 8,8 10,9 9,1 8,4 8,4 9,4 6,5 7,3 12,7 39,1 43,8 47,0 51,5 45,5 49,3 47,4 49,9 47,5 47,4 46,9 47,1 44,3 43,8 41,4 46,1 0,2 0,3 0,2 0,3 0,2 0,3 0,2 0,3 0,3 0,3 0,3 0,2 0,3 0,3 0,4 0,3 0,95 0,85 0,83 0,81 0,81 0,79 0,75 0,75 0,74 0,71 0,70 0,70 0,67 0,62 0,59 0,75

95-150

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Media 26,2 25,0 25,0 23,5 22,4 22,5 22,2 21,6 22,6 20,5 21,0 20,8 20,8 19,9 19,5 22,2 22,2 2,3 3,0 3,0 10,5 14,6 14,7 15,8 16,0 16,6 20,7 20,6 21,2 20,9 23,8 24,8 15,2 15,2 16,3 13,3 14,0 14,1 11,8 10,3 9,8 10,2 9,9 8,2 8,2 7,0 7,9 6,8 7,7 10,4 10,4 54,8 58,2 57,5 51,1 50,2 51,5 51,3 51,2 49,7 49,3 48,8 49,8 49,1 48,1 46,5 51,1 51,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,97 0,96 0,96 0,86 0,81 0,81 0,80 0,79 0,78 0,74 0,74 0,73 0,73 0,70 0,69 0,80 0,80

TABLA 9

Composición del ácido graso (% de ácidos grasos totales) de 12 semillas T3 individuales de dos plantas T2 derivadas independientemente de algodón transformadas con la construcción de silenciado génica con repetición invertida de Δ9-desaturasa

Estirpe

Número de Composición de ácido graso (%) SDP

T1

semilla T3 Palmítico Esteárico Oleico Linoleico Linolénico

95-62

1 16,6 32,9 7,3 41,2 0,3 0,60

2

13,5 37,0 6,6 37,9 2,4 0,56

3

17,6 32,2 7,3 41,1 0,1 0,60

4

15,2 36,1 9,5 36,6 0,5 0,56

5

15,8 37,3 7,9 36,4 0,4 0,54

6

16,1 35,3 6,4 39,9 0,4 0,57

7

16,8 29,2 8,5 42,3 1,3 0,64

8

15,7 35,8 6,6 39,5 0,4 0,57

9

15,8 35,6 7,9 38,3 0,4 0,57

10

16,6 33,4 8,6 39,1 0,4 0,59

11

16,5 33,6 7,5 40,1 0,4 0,59

12

15,7 36,4 6,8 38,6 0,4 0,56

Media

16,0 34,6 7,6 39,3 0,6 0,58

95-150

1 17,7 26,5 7,5 46,7 0,2 0,67

2

18,5 24,6 7,4 47,8 0,3 0,69

3

16,1 31,3 6,5 44,2 0,2 0,62

4

20,7 17,8 9,1 51,0 0,2 0,77

5

16,3 31,1 6,6 44,4 0,2 0,62

6

18,2 27,1 7,1 46,7 0,1 0,67

7

19,3 21,9 7,4 49,6 0,7 0,73

8

17,6 27,7 7,8 45,9 0,2 0,66

9

15,8 32,0 7,1 43,1 0,2 0,61

10

17,6 29,0 6,8 44,9 0,2 0,64

11

15,7 33,8 5,7 42,9 0,2 0,59

12

18,0 25,4 7,2 47,8 0,2 0,69

Media

17,6 27,3 7,2 46, 3 0,2 0,66

10 EJEMPLO 16

Contenido en ácido graso de aceites de semillas de plantas transgénicas T1 de algodón que llevan la construcción génica con repetición invertida de ghFAD2-1

15 En las semillas producidas por plantas transgénicas (T1) independientes que contienen repeticiones invertidas del gen ácido graso Δ12-desaturasa de algodón, y un algodón G. hirsutum Coker isogénico no transformado, se analizo su composición en ácido graso. Las muestras consistentes en tres semillas T2 mezcladas procedían de numerosas plantas T1 individuales. Se prepararon ésteres metílicos de ácido graso tal como describen Bligh y Dyer (1959). Los ésteres metílicos se separaron por cromatografía de gases (CG), utilizando cromatógrafo de gases Hewlett-Packard 5890 equipado con una columna capilar de sílice fundida (HP-FFAP, 0,53 mm x 30 m). Se identificaron los ácidos grasos por referencia a los patrones químicos descritos en la presente memoria anteriormente.

Los datos se presentan en la Tabla 10. Debido a que las plantas T1 eran generalmente hemicigóticas para el transgén introducido, las semillas T2 se segregaron de este transgén. Consecuentemente, los datos para las muestras de semilla T2 mezcladas presentadas en la Tabla 10 son un promedio de los niveles de ácido graso para las semillas que son homocigóticas o hemicigóticas para el transgén o que carecen del transgén por completo.

Aumento de ácido oleico

La expresión de la repetición invertida del extremo 5’ de ghFAD2-1 en el algodón parecía disminuir el nivel de actividad de la enzima oleoil-PC Δ12-desaturasa en el algodón, como sugiere el nivel elevado de ácido oleico en la semilla T2 transgénica. Como se resume en la Tabla 10, varias estirpes transgénicas independientes contenido aumentado en ácido oleiico en comparación con las plantas no transformadas. El contenido en ácido oleico aumentó desde el 15% para el algodón Coker no transformado, hasta el 77% la estirpe transgénica 125-23, que representa un aumento de hasta aproximadamente 5 veces a 5,5 veces para este ácido graso en el algodón.

Disminución de ácido linoleico

El ácido linoleico se redujo en las estirpes transgénicas de algodón, desde el 57,4% de lípido total en la semilla en el algodón de Coker no transgénico, hasta solamente el 3,5% en la estirpe 125-50, lo que representa una disminución en el contenido de ácido linoleico de hasta aproximadamente el 95% en las estirpes transgénicas.

Disminución de ácido palmítico

Inesperadamente, y favorablemente, el ácido palmítico se redujo significativamente en la semilla T2 de algodón transgénico que contenía la repetición invertida del extremo 5’ de ghFAD2-1. El nivel de ácido palmítico en la semilla de plantas transgénicas se redujo a solamente el 16,8% del lípido total en la semilla en la estirpe 125-23, en comparación con el 24,4% del lípido total en la semilla para las plantas isogénicas no transformadas. Esto representa una disminución en el contenido de ácido palmítico de hasta aproximadamente 35% a 37% en las estirpes transgénicas.

TABLA 10

Contenidos en ácido graso de algodón transgénico con disminución de ghFAD2-1

Estirpe de la planta

Composición en ácido graso (%) ODP

Palmítico

Esteárico Oleico Linoleico Linolénico

Coker

24,4 2,7 15,0 57,4 0,2 0,79

125-26

23,8 2,6 13,2 60,0 0,1 0,82

125-54

24,5 2,5 13,2 59,6 0,0 0,82

125-8

24,0 2,6 13,7 59,3 0,2 0,81

125-83

25,0 2,7 13,7 58,2 0,2 0,81

125-60

25,3 2,4 13,8 58,0 0,2 0,81

125-51

23,4 2,5 14,0 59,7 0,2 0,81

125-127

24,0 2,7 14,1 58,8 0,2 0,81

125-82

24,9 2,2 14,6 58,1 0,0 0,80

125-125

25,6 2,6 14,2 57,5 0,2 0,80

125-10

23,2 2,9 14,3 59,2 0,2 0,81

125-13

24,4 2,6 14,6 58,0 0,2 0,80

125-129

24,1 2,4 15,2 57,9 0,2 0,79

125-84

23,9 2,9 15,3 57,5 0,2 0,79

125-117

23,8 2,4 15,5 57,8 0,2 0,79

125-12

23,9 2,8 16,4 56,4 0,2 0,78

125-131

23,9 1,9 24,3 49,6 0,1 0,67

125-79

22,2 2,7 32,2 42,4 0,2 0,57

125-120

23,5 2,4 32,6 40,9 0,2 0,56

125-130

20,7 2,7 47,3 28,8 0,2 0,39

125-33

18,7 3,1 51,2 26,4 0,2 0,34

125-121

21,7 2,2 58,5 17,1 0,2 0,23

125-62

17,6 2,3 66,0 13,5 0,3 0,17

125-7

16,0 2,6 73,7 7,2 0,2 0,09

125-81

20,9 2,6 68,9 7,0 0,2 0,09

125-85

20,8 2,7 71,5 4,4 0,2 0,06

125-124

18,7 1,8 72,5 6,4 0,2 0,08

125-128

18,5 2,4 74,3 4,3 0,1 0,06

125-1

18,1 2,7 73,7 44,9 0,2 0,06

125-96

19,4 2,2 74,1 3,8 0,2 0,05

(continuación)

125-50

18,9 2,3 74,7 3,5 0,2 0,05

125-114

17,8 2,2 75,1 4,4 0,1 0,06

125-23

16,8 1,4 77,0 4,4 0,2 0,06

Está bien demostrado en la especie vegetal de la semilla aceitosa que la

5 composición de ácido graso de un embrioide somático refleja la composición en ácido graso del embrión sexual. Por ejemplo, en la soja, la composición en ácido graso de embrioides somáticos de madurez media es pronóstico de la composición en aceite final de la semilla procedentes de plantas que han sido regeneradas a partir de estos embrioides. Procediendo sobre esta base, los embrioides somáticos generados a partir de

10 callos de soja transgénica se han utilizado anteriormente como indicador de la composición en ácido graso de la semilla procedente de los mismos (Cahoon et al., 1999; Cahoon et al., 2000). Este método facilita la detección precoz y la selección rápida de estirpes transgénicas que tienen la composición deseada en aceite de semilla.

15 Para demostrar la eficacia de la construcción génica con repetición invertida de UTR interrumpida por el intrón (Ejemplo 11) en la expresión que tiene disminuido el gen de Δ12-desaturasa, se determinaron las composiciones en ácido graso de embrioides somáticos que se regeneran a partir de 18 callos transformados primarios independientes de algodón de Coker. Los datos presentados en la Tabla 11 apoyan la conclusión de que

20 el gen ghFAD2-1 que codifica la ácido graso Δ12-desaturasa ha sido silenciado en las estirpes que expresan la construcción génica con repetición invertida de la UTR interrumpida por el intrón.

En particular, el nivel de ácido oleico ha aumentado en los embriones somáticos

25 que llevan la construcción génica con repetición invertida de UTR interrumpida por el intrón, en comparación con los niveles típicos de embriones somáticos procedentes de plantas no transformadas. El ácido oleico constituye como mucho el 66% de los ácidos grasos totales en los embrioides transformados (Tabla 11), en comparación con sólo aproximadamente 15% para los embrioides somáticos precedentes de plantas de algodón

30 Coker no transformadas (Tabla 7 y 8). Por término medio, esto representa aproximadamente el triple de aumento en contenido de ácido oleico.

Además, el nivel de ácido linoleico se reduce en los embrioides somáticos, que llevan la construcción génica con la repetición invertida de la UTR interrumpida por el 35 intrón, en comparación con los niveles típicos para los embrioides somáticos procedentes de plantas no transformadas. El ácido linoleico constituye aproximadamente del 10 al 31% (promedio del 23%) de los ácidos grasos totales en embrioides somáticos transformados (Tabla 11), en comparación con aproximadamente el 57,4% para los embrioides somáticos procedentes de plantas de algodón Coker transformadas (Tablas 7 y 8). Por

40 término medio esto representa más del 50% de reducción en el contenido de ácido linoleico.

Además, el nivel de ácido palmítico se reduce en los embrioides somáticos, que llevan la construcción génica con la repetición invertida de UTR interrumpida por el intrón, 45 en comparación con los embrioides somáticos procedentes de plantas no transformadas.

El ácido linoleico constituye por término medio aproximadamente el 20% de los ácidos grasos totales en embrioides somáticos transformados (Tabla 11), en comparación con aproximadamente el 24,4% para los embrioides somáticos procedentes de plantas de algodón Coker no transformadas (Tablas 7 y 8). Por término medio, esto representa

5 aproximadamente el 25% de reducción en el contenido de ácido linoleico.

Dado que se obtuvieron resultados similares utilizando diferentes construcciones

génicas con repetición invertida, la modulación del contenido en ácido graso obtenida

utilizando secuencias con repetición invertidas no depende de la naturaleza exacta de la

10 repetición invertida en la construcción génica. Sin embargo, la frecuencia del silenciado génico que los autores detectaron aumentó en los transformados que llevan la construcción génica con repetición invertida de UTR interrumpida por el intrón en comparación con los transformados que llevan la repetición invertida de la región de codificación o de los transformados que llevan construcciones antisentido.

15

TABLA 11

Contenido en ácido graso de embrioides que llevan la construcción con repetición invertida UTR interrumpida por el intrón ghFAD2-1

20

Embrioide Composición en ácido grado (%) ODP nº Palmítico Esteárico Oleico Linoleico Linolénico

1 19,9 6,4 45,1 23,4 3,8 0,38 2 19,3 4,5 46,5 27,9 1,4 0,39 3 19,5 3,3 63,6 10,8 2,2 0,17 4 22,1 5,5 48,9 20,1 3,4 0,32 5 20,8 5,8 56,0 15,0 1,7 0,23 6 20,3 7,7 49,7 18,2 2,8 0,30 7 22,0 4,4 45,0 24,4 4,2 0,39 8 15,7 3,2 26,3 28,6 26,3 0,68 9 23,1 6,1 42,9 22,9 3,9 0,38 10 18,5 2,1 55,2 24,0 0,1 0,30 11 21,6 5,1 45,5 25,5 1,5 0,37 12 23,2 5,4 41,2 27,6 1,8 0,42 13 19,9 2,3 49,6 28,0 0,0 0,36 14 19,0 2,1 47,5 31,2 0,1 0,40 15 19,5 2,3 65,6 10,8 1,7 0,16 16 18,1 3,6 57,7 20,7 1,9 0,28 17 22,0 4,4 45,0 26,4 2,4 0,39 18 21,4 4,6 43,1 28,6 1,7 0,41 Media 20,3 4,4 48,6 23,0 3,4 0,35

Una proporción de los embrioides somáticos portadores de la ocnstrucción con repetición invertida de UTR interrumpida por el intrón se dejó para regenerar en plantas T1. Se determinaron las composiciones en ácido graso de la semilla T2 procedente de estas plantas regeneradas. Los datos presentados en la Tabla 12 muestran la composición en ácido graso de 15 semillas T2 individuales. Estos datos indican que, como en los casos de los embrioides somáticos de los que preceden las plantas, el nivel de ácido oleico aumenta, y los niveles de ácido palmítico y ácido linoleico se reducen, en las semillas T2 de plantas T1 procedentes de embrioides.

Estos datos demuestran que, las distintas construcciones de silenciado génica que comprenden repeticiones invertidas de genes de ácido graso desaturasa son eficaces en

5 modular de forma predecible la composición en ácido graso de la semilla de algodón. La expresión de dichas construcción génicas puede situarse de manera operativa bajo el control de distintas secuencias promotoras operables por la semilla.

TABLA 12

10 Contenidos en ácido graso de 15 semillas de T2 individuales de un embrioide de algodón que llevan la construcción con repetición invertida UTR interrumpida por el intrón ghFAD2-1

Planta Planta Composición en ácido grado T1 T2 (%) ODP nº nº Palmítico Esteárico Oleico Linoleico Linolénico

10 1 24,1 2,1 57,8 15,8 0,1 0,22 2 22,5 2,1 68,0 7,0 0,1 0,10 3 23,0 2,3 67,5 6,9 0,2 0,09 4 25,4 2,1 54,8 17,4 0,1 0,24 5 22,8 2,6 27,9 46,3 0,2 0,63 6 19,5 2,3 69,3 8,5 0,2 0,11 7 19,9 2,2 70,6 6,9 0,1 0,09 8 18,8 2,3 71,6 6,9 0,2 0,09 9 20,2 2,1 70,1 7,2 0,1 0,10 10 19,3 2,5 68,1 9,6 0,2 0,13 11 19,0 2,0 68,8 9,7 0,1 0,13 12 20,2 2,4 47,1 29,9 0,2 0,39 13 18,3 2,1 70,4 8,6 0,2 0,11 14 20,3 2,2 63,9 13,2 0,2 0,17 15 18,5 2,5 68,7 9,8 0,1 0,13

Media 20,8 2,3 63,0 13,6 0,2 0,18 15

EJEMPLO 17

Caracterización de aceites en la semilla transgénica que es homocigótica para el 20 transgén que contiene una repetición invertida de un gen de ácido graso Δ12-desaturasa

Se identificaron por selección las estirpes T2 que son homocigóticas para la repetición invertida introducida del gen de ácido graso Δ12-desaturasa del algodón. Se

25 analizaron las composiciones en ácido graso de semillas T2 individuales (15 en total), procedentes de varias plantas T1 representativas que difieren ampliamente en su contenido en ácido esteárico, como se describe en el ejemplo anterior. Los datos se presentan en la Tabla 13.

Es evidente que diferentes episodios transgénicos están asociados a diferentes niveles de reducción en la actividad de Δ12-desaturasa (tal como se indica por ODP) y que corresponden a diferentes niveles de acumulación del sustrato de ácido oleico. Esta variación es explicable por los diferentes números de copias de transgén y las diferentes

5 posiciones de integración genómica de los transgenes. Al producir un número suficiente de transgénicos independientes, cualquier contenido específico de ácido oleico deseado entre el límite superior normal para el algodón (aproximadamente 16%) y aproximadamente el 75% puede obtenerse por consiguiente (véase Figura 12).

10 Para confirmar que el silenciado génico observado de Δ12-desaturasa era hereditario, la semilla T2 adicional, y la semilla T3, se obtuvieron de plantas que presentan el fenotipo de silenciado más severo, en particular, las plantas T1 independientes que tienen los niveles mayores de ácido oleico en su semilla y se denominaron 125-124 y 12523 (Tabla 10). Se determinaron las composiciones en ácido graso de 15 semillas T2

15 individuales y 12 semillas T3 individuales de estas estirpes como se describe en el ejemplo anterior. Los modelos de segregación de T2 eran coherentes con una sola inserción transgénica (Tabla 13). Los datos presentados en la Tabla 14 demuestran que el alto nivel de silenciado observado en las semillas T2 mezcladas de ambas estirpes tal como se presenta en la Tabla 10, o las semillas T2 individuales de la estirpe 125-23 como

20 se muestra en la Tabla 13, se hereda en la generación T3, como se demuestra por la capacidad hereditaria de los fenotipos ricos en ácido oleico y pobres en ácido oleico y pobre en ácido palmítico.

TABLA 13

25 Composición de ácido graso (% de ácidos grasos totales) de 15 semillas de T2 individuales de 5 plantas T1 de algodón transformadas con la construcción de silenciado génica con repetición invertida de Δ12-desaturasa y de plantas Coker de referencia no transformadas

30

Planta T1 Planta Composición en ácido grado (%) ODP nº T2 Palmítico

Esteárico Oleico Linoleico Linolénico nº

Referenci 1 25,1 2,6 15,2 56,6 0,2 0,79

a Coker 2 25,4 2,8 15,7 55,6 0,2 0,78 3 25,1 2,6 14,9 57,0 0,2 0,79 4 23,9 2,7 15,1 58,0 0,2 0,79 5 24,3 2,2 14,7 58,3 0,2 0,80 6 25,2 2,5 14,4 57,4 0,2 0,80 7 24,0 2,9 16,2 56,4 0,2 0,78 8 24,9 2,3 15,0 57,4 0,2 0,79 9 24,4 2,8 15,0 57,3 0,2 0,79 10 23,3 3,0 14,7 58,5 0,2 0,80 11 23,1 3,2 14,9 58,2 0,2 0,80 12 23,9 2,9 14,9 57,8 0,2 0,80 13 25,2 2,6 14,8 56,9 0,2 0,79

-80

(continuación)

14

22,9 2,9 14,4 59,3 0,2 0,80

15

25,0 2,7 15,5 56,3 0,2 0,78

Media

24,4 2,7 15,0 57,4 0,2 0,79

125-120

1 26,9 2,1 13,5 57,1 0,2 0,81

2

25,0 2,7 19,7 52,1 0,2 0,73

3

24,9 2,1 19,8 52,8 0,2 0,73

4

22,9 2,2 25,7 48,8 0,2 0,66

5

24,4 2,5 25,3 47,3 0,2 0,65

6

24,0 2,3 27,2 46,0 0,2 0,63

7

24,2 2,0 28,4 45,0 0,2 0,61

8

24,6 2,3 31,2 41,5 0,1 0,57

9

22,9 2,2 33,8 40,7 0,2 0,55

10

25,2 2,2 34,6 37,6 0,2 0,52

11

21,7 2,5 42,6 32,8 0,2 0,44

12

22,6 2,7 44,4 29,8 0,2 0,40

13

22,6 2,2 46,1 28,6 0,2 0,38

14

23,0 2,0 46,4 28,1 0,2 0,38

15

22,5 2,3 51,6 23,1 0,2 0,31

Media

23,8 2,3 32,7 40,8 0,2 0,56

125-130

1 24,9 2,7 14,6 57,3 0,2 0,80

2

18,8 2,5 71,6 6,5 0,2 0,09

3

17,4 2,4 73,8 5,8 0,2 0,08

4

19,7 2,3 71,5 6,0 0,2 0,08

5

19,6 2,3 72,2 5,5 0,2 0,07

6

18,9 2,5 72,4 5,6 0,2 0,07

7

17,6 2,7 73,6 5,5 0,2 0,07

8

20,5 2,3 71,8 5,1 0,2 0,07

9

19,4 2,7 72,1 5,5 0,1 0,07

10

19,8 2,4 72,6 5,3 0,0 0,07

11

18,0 2,3 74,8 4,4 0,2 0,06

12

18,1 2,5 74,4 4,5 0,2 0,06

13

16,7 2,6 75,3 4,9 0,2 0,06

14

18,3 2,6 73,7 4,9 0,2 0,06

15

23,6 1,9 69,4 4,7 0,1 0,06

Media

19,4 2,4 68,9 8,8 0,2 0,12

125-121

1 24,9 2,6 17,4 54,7 0,2 0,76

2

24,7 2,5 17,3 55,1 0,2 0,76

3

23,8 3,0 18,2 54,6 0,2 0,75

4

26,1 2,9 22,1 48,4 0,3 0,69

5

26,0 2,1 22,0 49,5 0,2 0,69

6

25,0 2,8 25,0 46,7 0,2 0,65

7

25,2 2,6 29,0 42,7 0,1 0,60

8

23,2 2,5 34,0 40,0 0,2 0,54

9

25,0 2,3 38,7 33,6 0,2 0,47

(continuación)

125-81 125-23

10 11 12 13 14 15 Media 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Media 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Media 21,3 23,8 21,0 20,1 20,0 19,9 23,3 25,0 26,6 25,4 21,2 19,3 19,8 20,8 21,5 19,7 19,7 20,0 21,0 20,8 19,5 19,5 21,3 23,5 24,2 23,9 23,9 25,9 17,8 17,2 18,0 20,7 21,1 18,5 18,1 17,8 17,1 17,6 20,4 2,9 2,4 2,6 2,4 2,3 2,3 2,5 3,0 2,7 2,8 2,8 2,5 2,7 2,5 2,6 2,7 2,7 2,7 2,5 2,6 2,7 2,9 2,7 2,4 2,5 2,5 2,4 2,4 2,3 2,5 2,0 2,3 2,3 2,5 2,5 2,4 2,7 2,4 2,4 45,6 45,8 51,2 65,5 70,0 71,6 38,2 14,6 15,7 16,2 68,2 70,9 70,0 69,9 69,3 70,9 71,1 70,3 70,1 70,7 72,2 72,1 59,5 13,7 14,1 14,4 15,2 15,5 72,1 73,5 73,8 70,8 70,2 72,1 73,8 74,2 74,6 74,7 53,5 29,7 27,6 24,8 11,5 7,3 5,7 35,4 56,8 54,5 55,2 7,2 6,7 7,0 6,2 6,0 6,2 6,0 6,3 5,9 5,3 5,0 4,8 15,9 60,1 58,8 58,9 58,1 55,9 7,4 6,5 5,9 5,8 6,0 6,5 5,1 5,2 5,0 4,9 23,3 0,1 0,1 0,2 0,2 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,40 0,38 0,33 0,15 0,10 0,08 0,49 0,80 0,78 0,77 0,10 0,09 0,09 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,07 0,07 0,06 0,22 0,81 0,81 0,80 0,79 0,78 0,09 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,07 0,07 0,06 0,06 0,32

5

TABLA 14

Composición de ácido graso (% de ácidos grasos totales) de 12 semillas de T3 individuales de dos plantas T2 de procedentes independientemente plantas T2 de algodón transformadas con la construcción de silenciado génica con repetición invertida de Δ12-desaturasa

Planta T1

Semilla T3 Composición en ácido grado (%) ODP

Palmítico

Esteárico Oleico Linoleico Linolénico

125-23

1 15,8 2,3 77,1 4,2 0,2 0,05

2

15,9 2,6 76,5 4,3 0,2 0,05

3

15,4 2,6 77,2 4,1 0,2 0,05

4

15,3 2,5 77,3 4,3 0,2 0,05

5

15,7 2,7 77,0 3,9 0,2 0,05

6

15,5 2,6 77,0 4,3 0,2 0,05

7

15,3 2,7 77,1 4,3 0,2 0,05

8

15,5 2,8 76,9 4,2 0,2 0,05

9

17,0 2,5 75,7 4,1 0,2 0,05

10

16,7 2,7 76,0 4,1 0,2 0,05

11

17,0 2,7 75,6 4,1 0,2 0,05

12

17,4 2,6 75,3 4,1 0,2 0,05

Media

16,0 2,6 76,6 4,2 0,2 0,05

125-124

1 18,0 2,1 73,5 6,0 0,3 0,08

2

20,8 2,1 71,1 5,5 0,3 0,07

3

18,7 2,2 73,0 5,7 0,2 0,07

4

18,2 2,2 72,4 6,9 0,2 0,09

5

18,9 2,2 72,7 5,6 0,3 0,07

6

17,8 2,2 72,7 6,8 0,3 0,09

7

17,5 2,5 73,6 5,9 0,4 0,08

8

21,1 2,1 70,8 5,7 0,2 0,08

9

18,5 2,3 73,6 5,4 0,2 0,07

10

18,5 2,2 2,3 72,4 6,5 0,3 0,08

11

18,3 72,7 6,4 0,2 0,08

12

18,5 2,3 73,1 5,7 0,3 0,07

Media

18,7 2,2 72,6 6,0 0,3 0,08

5 EJEMPLO 18

Hibridación sexual de estirpes transgénicas de élite para aumentar las características del aceite de semilla de algodón

10 Para producir un aceite de semilla de algodón que es rico tanto en ácido oleico como en ácido esteárico, y preferentemente bajo en ácido palmítico, se realizaron cruzamientos preliminares entre algunas de las estirpes de la planta T1 transgénica que producen grandes niveles de ácido esteárico y ácido oleico, como se expuso en los ejemplos anteriores. En particular, la estirpe 95-150, que produce mucho ácido esteárico y

15 ha reducido el ácido palmítico, el ácido oleico y el ácido linoleico, se cruzó con la estirpe 125-23, la estirpe 125-96 o la estirpe 125-62, todas las cuales producen grandes niveles de ácido oleico, y presentan bajos contenidos en ácido palmítico y de ácido linoleico. Se analizaron la composición en ácido graso de la semilla F1 producida a partir de estas hibridaciones sexuales. Algunas de las nuevas características del ácido graso detectadas en la semilla F1 se resumen en la Tabla 15.

Aumento de ácido esteárico

En las semillas F1 de tres cruzamientos diferentes mostrados en la Tabla 15, el contenido en ácido esteárico oscilaba entre 7,1 y 14,9% del lípido total de la semilla, en comparación con solamente el 2,0% del algodón Coker sin transformar. Consecuentemente, estos datos indican que es posible aumentar los niveles de ácido esteárico en el algodón tanto como aproximadamente 3,5 veces a aproximadamente 7,5 veces, expresando repeticiones invertidas en el algodón que dirigen independientemente los genes endógenos de ácido graso de Δ9-desaturasa y Δ12-desaturasa del algodón, y a continuación cruzando las plantas transgénicas.

Aumento de ácido oleico

En la semilla F1 el contenido en ácido oleico oscilaba entre 59,9% y 67,1% del lípido total de la semilla, en comparación con solamente el 19,6% del algodón Coker sin transformar. Consecuentemente, estos datos indican que es posible aumentar el nivel de ácido oleico en el algodón hasta aproximadamente 3,5 veces, expresando repeticiones invertidas en el algodón que dirigen independientemente los genes endógenos de ácido graso Δ9-desaturasa y Δ12-desaturasa del algodón, y a continuación cruzando las plantas transgénicas.

Reducción de ácido linoleico

En la semilla F1 el contenido en ácido linoleico oscilaba entre solamente el 4,8% y el 6,6% del lípido total de la semilla, en comparación con el 54,4% del algodón Coker sin transformar. Consecuentemente, estos datos indican que es posible disminuir el nivel de ácido linoleico en el algodón hasta aproximadamente el 91,1%, expresando repeticiones invertidas en el algodón que dirigen independientemente los genes endógenos de ácido graso Δ9-desaturasa y Δ12-desaturasa del algodón, y a continuación cruzando las plantas transgénicas.

Reducción de ácido palmítico

En la semilla F1 el contenido en ácido palmítico oscilaba entre solamente el 17,6% y el 19,5% del lípido total de la semilla, en comparación con el 23,6% del algodón Coker sin transformar. Consecuentemente, estos datos indican que es posible disminuir el nivel de ácido palmítico en el algodón hasta aproximadamente el 25,4%, expresando repeticiones invertidas en el algodón que dirigen independientemente los genes endógenos de ácido graso Δ9-desaturasa y Δ12-desaturasa del algodón, y a continuación cruzando las plantas transgénicas.

TABLA 15

Composiciones medias en ácido graso de la semilla F1 procedente de la hibridación sexual de estirpes transgénicas de algodón

Estirpe de algodón

Composición media en ácido graso (%) SDP ODP

Palmítico

Esteárico Oleico Linoleico Linolénic o

Coker

23,6 2,0 19,6 54,4 0,1 0,97 0,74

Estirpes precursoras transgénicas

125-23 125-62 125-96 95-150

16,8 1,4 77,0 4,4 0,2 0,98 0,06

17,6

2,3 66,1 13,5 0,3 0,97 0,17

19,4

2,2 74,1 3,8 0,2 0,97 0,05

19,0

28,0 5,8 45,4 0,3 0,65 0,89

Descendencia de F1 del cruzamiento 125-23 x 95-150

F1 #1 F1 #2 F1 #3 F1 #4

18,5 8,6 65,8 6,0 0,1 0,89 0,09

17,9

12,1 62,1 6,6 0,2 0,85 0,10

17,6

12,5 63,0 5,7 0,1 0,85 0,08

17,9

10,0 65,5 5,5 0,1 0,88 0,08

Descendencia de F1 del cruzamiento 125-96 x 95-150

F1 #1 F1 #2

19,5 7,1 67,6 4,8 0,1 0,91 0,07

19,2

7,1 66,9 5,9 0,1 0,91 0,08

Descendencia de F1 del cruzamiento 125-62 x 95-150

F1#1

17,6 14,9 59,9 6,1 0,1 0,81 0,09

5 En una población de 86 semillas de F2 individuales procedentes del cruzamiento 125-23 x 95-150 se analizó la composición en ácido graso tal como se describe en los ejemplos anteriores, para determinar el intervalo de las composiciones de ácido graso obtenidas por recombinación entre los fenotipos originales. Como se muestra en la Figura 13, las composiciones en ácido esteárico y ácido oleico de la semilla de algodón pueden

10 manipularse para producir niveles de estos ácidos grasos que oscilan donde quiera entre el nivel normal (natural) para el algodón Coker no transformado y las mayores niveles presentes en la semilla de las estirpes originales transformadas. Además, la semilla F2 comprende nuevos aceites de semilla de algodón que tienen diferentes combinaciones de contenido en ácido esteárico y ácido oleico en comparación con las estirpes originales de

15 aceite de semilla de algodón no transformadas o individuales transformadas.

Estos resultados demostraron claramente que los fenotipos observados para las

líneas originales transgénicas son transmisibles entre generaciones, y pueden combinarse

en las plantas de la descendencia. Por consiguiente, seleccionando plantas de la

20 descendencia que son homocigóticas para los transgenes introducidos, y cruzando estas plantas, se obtienen estirpes de élite que contenían niveles elevados ácido esteárico y ácido oleico, y que tienen niveles reducidos de ácido palmítico y ácido oleico. Además, los cruzamientos entre las estirpes de élite que presentan los niveles mayores de ácido esteárico y/o ácido oleico, y los niveles menores de ácido palmítico y/o de ácido linoleico,

25 producen estirpes de élite con las características más deseables. Significativamente, el intercruzamiento a gran escala que utiliza estirpes originales producidas como se describe en la presente memoria, y con niveles específicos de ácidos grasos individuales en su semilla, se utiliza para producir semilla de algodón con algún nivel deseado de ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico o ácido linoleico, o una combinación de los mismos, dentro de los márgenes observados en las líneas originales. Por consiguiente, la presente invención desde luego proporciona medios mediante los cuales se produce la semilla de algodón con las características deseables del ácido graso POS, proporcionando de este modo un aceite de semilla de algodón sustituto de la manteca de cacao.

EJEMPLO 19

Caracterización de aceites en la semilla T2 transgénica que contiene el complementario de un gen de ácido graso Δ9 desaturasa (estearoil-ACP Δ9-desaturasa)

En el algodón transgénico que tiene la construcción génica complementaria de ácido graso Δ9-desaturasa (Ejemplo 11), se analizó la composición en ácido graso tal como se describe en los ejemplos anteriores. Los datos se presentan en la Tabla 16.

Aumento de ácido esteárico

La expresión del ADNc de ghSAD-1 en la orientación antisentido en el algodón parecía disminuir el nivel de la actividad de la enzima estearoil-ACP Δ9-desaturasa en el algodón, tal como sugiere el elevado nivel de ácido esteárico en la semilla T2 transgénica, particularmente en la estirpe 9A-90. Tal como se resume en la Tabla 16, solamente una estirpe de las 25 estirpes transgénicas totales generadas produjeron semilla con ácido esteárico elevado en comparación con la semilla isogénica natural. El ácido esteárico aumentó hasta el 28,2% del lípido total en la semilla en la estirpe 9A-90 (Tabla 16).

Disminución del ácido oleico

El ácido oleico se redujo en la estirpe 9A-90, desde aproximadamente 14,5% de lípido total en la semilla en el algodón no transgénico, a solamente el 6,3 de lípido total en la semilla.

Disminución del ácido linoleico

El ácido linoleico se redujo también, desde aproximadamente 55% de lípido total en la estirpe no transgénica, hasta el 46,2 en la estirpe 9A-90.

Disminución de ácido palmítico

Inesperadamente, y favorablemente, el ácido palmítico se redujo significativamente en la semilla T2 del algodón transgénico, particularmente en la estirpe 9A-90. En particular, el nivel de ácido palmítico en la semilla de la estirpe 9A-90 se redujo a solamente el 17,7% del lípido total de la semilla en la estirpe 9A-90, en comparación con aproximadamente el 26% del lípido total de la semilla para las plantas isogénicas no transformadas.

TABLA 16

Contenidos en ácido graso de algodón transgénico que comprende un complementario de un gen de Δ9-desaturasa (estearoil-ACP Δ9-desaturasa)

Composición en ácido grado (%)

Estirpe vegetal Palmítico Esteárico Oleico Linoleico Linolénico SDP

9A-118 26,7 2,0 15,8 55,2 0,1 0,97 9A-163 26,0 2,0 14,2 56,5 0,2 0,97 9A-38 27,0 2,2 14,0 56,4 0,3 0,97 9A-92 26,2 2,3 13,6 57,5 0,2 0,97 9A-9 25,2 2,3 13,6 58,5 0,1 0,97 9A-57 23,9 2,3 18,1 55,3 0,2 0,97 9A-127 24,2 2,4 15,2 57,8 0,2 0,97 9A-107 24,6 2,4 16,1 56,5 0,2 0,97 9A-148 24,2 2,4 15,1 57,9 0,1 0,97 9A-189 23,8 2,5 15,2 58,2 0,1 0,97 9A-89 23,8 2,5 15,7 57,5 0,2 0,97 9A-192 26,2 2,5 14,0 57,0 0,1 0,97 9A-14 28,5 2,4 14,9 53,9 0,1 0,97 9A-6 21,9 2,7 14,0 60,9 0,2 0,97 95-7 23,4 2,7 15,1 58,4 0,2 0,97 9A-2 23,6 2,5 14,0 59,6 0,1 0,97 9A-49 25,6 2,8 14,8 56,5 0,0 0,96 9A-81 24,2 2,8 14,4 58,1 0,2 0,96 9A-80 25,9 2,8 14,4 56,5 0,2 0,96 9A-150 22,9 3,2 15,4 58,1 0,1 0,96 9A-95 23,2 3,4 12,7 60,4 0,1 0,96 9A-183 24,3 3,4 14,2 57,6 0,2 0,96 9A-74 25,6 3,7 15,0 55,3 0,1 0,95 9A-28 21,8 5,4 12,4 60,0 0,1 0,93 9A-90 17,7 28,2 6,3 46,2 0,2 0,65

5

EJEMPLO 20

Caracterización de aceites en la semilla T2 transgénica que contiene el complementario de un gen de ácido graso Δ12 desaturasa (oleil-PC Δ12-desaturasa)

10 En el algodón transgénico que tiene construcción génica complementaria de ácido graso Δ12-desaturasa (Ejemplo 11), se analizó la composición en ácido graso tal como se describe en los ejemplos anteriores. Los datos se presentan en la Tabla 17.

5

10

15

20

25 -87

Aumento de ácido oleico

En cinco (5) de las veinticinco (25) estirpes transgénicas totales que llevan el ADNc de ghFAD2-1 en la orientación antisentido, el nivel de ácido oleico aumentó hasta más del 30% del lípido total en la semilla (Tabla 17). El contenido en ácido oleico aumentó desde aproximadamente el 14% para el algodón Coker no transformado, hasta tanto como el 74,4% del lípido total de la semilla para la estirpe transgénica 12A-87.

Disminución del ácido linoleico

El ácido linoleico se redujo en las estirpes transgénicas, de algodón desde aproximadamente 60% de lípido total de semilla en el algodón Coker no transgénica, hasta sólo aproximadamente 5,0 en la estirpe 12A-87.

Disminución de ácido palmítico

Inesperadamente, y favorablemente, el ácido palmítico se redujo significativamente en la semilla T2 del algodón transgénico que contiene la construcción génica antisentido. El nivel de ácido palmítico en la semilla de las plantas transgénicas se redujo a solamente el 18,3% del lípido total de la semilla en la estirpe 12A-87, en comparación con aproximadamente el 26% del lípido total de la semilla para las plantas isogénicas no transformadas.

TABLA 17

Contenidos en ácido graso de algodón transgénico T1 que comprende un complementario de un gen de Δ12-desaturasa (oleil-PC Δ12desaturasa)

Estirpe vegetal Composición en ácido grado (%) ODP Palmítico Esteárico Oleico Linoleico Linolénico

12A-30 23,4 2,6 13,2 60,3 0,2 0,82 12A-73 24,5 2,6 13,3 59,2 0,1 0,82 12A-124 24,7 2,8 13,7 58,4 0,2 0,81 12A-41 25,2 2,5 13,8 58,1 0,2 0,81 12A-60 22,9 2,6 14,4 59,6 0,2 0,81 12A-33 25,3 2,1 14,4 57,9 0,2 0,80 12A-111 26,1 2,5 14,2 56,7 0,2 0,80 12A-74 23,7 2,4 14,8 58,7 0,1 0,80 12A-84 24,0 2,6 14,9 58,0 0,2 0,80 12A-130 24,4 3,0 14,9 57,3 0,2 0,79 12A-59 24,6 2,2 15,1 57,7 0,2 0,79 12A-68 25,4 2,8 15,4 56,1 0,1 0,79 12A-85 27,8 2,4 16,2 53,1 0,2 0,77 12A-81 26,2 2,0 16,9 54,9 0,0 0,76 12A-48 22,2 2,5 17,8 57,3 0,1 0,76

-88

(continuación)

12A-32

25,7 2,1 17,1 54,8 0,2 0,76

12A-132

24,7 2,2 21,4 51,3 0,1 0,71

12A-126

25,6 2,0 28,2 43,7 0,2 0,61

12A-1

21,1 3,5 29,7 45,2 0,2 0,60

12A-83

23,0 2,5 30,5 43,8 0,1 0,59

12A-118

23,9 2,0 34,5 39,6 0,0 0,53

12A-86

22,1 2,0 42,6 32,8 0,2 0,44

12A-14

19,7 2,1 72,4 5,4 0,1 0,07

12A-87

18,3 1,9 74,4 5,0 0,1 0,06

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation

<120> Procedimiento de modificación del contenido de aceite de semilla de algodón

<130> p:\oper\mro\specifications\cottonseed oil US

<140> US

<141> 2001-04-18

<150> US 60/198,124

<151> 2000-04-18

<160> 35

<170> Patente en versión 3.0

<210> 1 <211>. 1493

<212> ADN

<213> algodón

<220>

<221> CDS

<222> (13)..(1200)

<400> 1

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<210> 2

<211> 396

<212> PRT

<213> algodón

<400> 2

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<210> 3

<211> 1411

<212> ADN

<213> algodón

<220>

<221> CDS

<222> (79)..(1233)

<400> 3

imagen1

imagen1

<210> 4

<211> 385

<212> PRT

<213> algodón

<400> 4

imagen2

imagen1

<210> 5

<211> 1422 5 <212> ADN

<213> algodón

<220>

<221> CDS 10 <222> (98)..(1246)

<400> 5

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 6

<211> 383

<212> PRT

<213> algodón

<400> 6

imagen1

imagen1

<210> 7

<211> 5006

<212> ADN

<213> algodón 5

<220>

<221> 5’UTR

<222> (3785) .. (5006)

10 <220>

<221> Intrón

<222> (3889)..(4998)

<400> 7

imagen3

imagen1

imagen1

<210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 8 atggckctsa rgctbcatsc

20

<210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 9 tcasagyttm acytgyctat

20

<210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 10 gcataggtca tggaccacgt

20

<210> 11 <211> 17 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 11 gtaaaacgac ggccagt

17

<210> 12 <211> 19 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 12 ggaaacagct atgaccatg

19

<210> 13 <211> 8 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 13 ggcccggg

8

<210> 14 <211> 8 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 14 ggcccccg

8

<210> 15 <211> 19 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 15 ttttaatgcc atcgcctcg

19

<210> 16 <211> 20 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 16 cttcagcagt ccaagccctg

20

<210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 17 cctggcgtta aactgctttc

20

<210> 18 <211> 24 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 18 ccatatagtt tattaatata acac

24

<210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 19 tatgttgcaa gtaggtgatc

20

<210> 20

<211> 32 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 20 acgcgtcgac gtgtgttaca aaatggaccg aa

32

<210> 21 <211> 32 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 21 cgcggatccg ctggctggac acgcaagaag ca

32

<210> 22 <211> 27 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 22 cgagctcccc ctccgctcca taccact

27

<210> 23 <211> 31 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 23 cgcggatccg ctggctttaa agaaagcagt t

31

<210> 24 <211> 20 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 24 catgtgacag atcgaaggaa

20

<210> 25 <211> 21 <212> ADN <213> cebador sintético

<400> 25 atctaattat tctattcaga c

21

<210> 26 <211> 6

<212> PRT

<213> peptido sintético

<220>

<221> misc feature

<222> () .. ()

<223> Xaa a posición 3 es o bien Trp o Cys

<400> 26

imagen1

<210> 27

<211> 5

<212> PRT

<213> peptido sintético

<400> 27

<210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> peptido sintético

<400> 28

imagen1

imagen1

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> peptido sintético

<220>

<221> misc_feature

<222> ()..()

<223> Xaa a posición 2 és cualquier aminoácido; Xaa a posición 3 es cualquier aminoácido

<400> 29

imagen1

<210> 30

<211> 6

<212> PRT

<213> peptido sintético

<220> <221> misc_feature

<222> () .. ()

<223> Xaa a posición 2 es cualquier aminoácido; Xaa a posición 3 es cualquier aminoácido; Xaa a posición 4 es cualquier aminoácido

<400> 30

imagen1

<210> 31

<211> 383

<212> PRT

<213> Glycine maxFAD2-2

<400> 31

imagen3

imagen1

<210> 32

<211> 383

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana FAD2

<400> 32

imagen1

imagen1

<210> 33

<211> 387

<212> PRT

<213> Glycine max FAD2-1

<400> 33

imagen1

<210> 34

<211> 377

<212> PRT

<213> Brassica napus FAD3

<400> 34

imagen1

imagen1

<210> 35

<211> 424

<212> PRT

<213> Glycinemax FAD6

<400> 35

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imagen1

Claims (37)

1. Reivindicaciones

   1. Procedimiento de producción de una planta de algodón transgénica que presenta un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla, que comprende:

   (i)

   producir mediante transformación plantas transgénicas de algodón que presentan una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12-desaturasa o un fragmento génico del mismo operativamente en conexión con una secuencia promotora que puede proporcionar la expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de una planta de algodón; y

   (ii)

   cultivar dichas plantas durante un tiempo y en condiciones suficientes para que la expresión del gen endógeno de oleil-PC Δ12-desaturasa correspondiente se reduzca en la semilla en virtud de la presencia de dicha secuencia nucleotídica en su genoma,

   (iii) seleccionar una planta de algodón transgénica que presenta un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla en comparación con una planta isogénica no transformada.

2. 2.

   Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el aceite de semilla de la planta de algodón transgénica presenta un nivel reducido de ácido palmítico que comprende una reducción de 25% en el contenido de ácido palmítico en comparación con el aceite de semilla de plantas de algodón Coker no transformadas.

3. 3.

   Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el nivel de ácido palmítico en el aceite de semilla se reduce a aproximadamente 50% del nivel de ácido palmítico en el aceite de semilla de plantas de algodón no transformadas.

4. 4.

   Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia nucleotídica se selecciona de entre el grupo constituido por:

   (i)

   la secuencia nucleotídica expuesta en la SEC. ID. nº: 3 o la SEC. ID. nº: 7 o en un fragmento de la misma;

   (ii)

   una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC. ID. nº: 4 o en un fragmento de la misma;

   (iii) una secuencia nucleotídica que es complementaria de (i) o (ii); y

   (iv) una secuencia de repetición invertida que presenta autocomplementariedad y constituida por una secuencia nucleotídica seleccionado de entre el grupo constituido por:

   (a)

   la secuencia nucleotídica de (i) unida a la secuencia nucleotídica de (iii);

   y

   (b)

   la secuencia nucleotídica de (ii) unida a la secuencia nucleotídica de (iii).

5. 5.

   Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la construcción génica comprende la región de codificación de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEC. ID. nº: 3 o en un fragmento de la misma en la orientación antisentido.

6. 6.

   Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la construcción génica comprende una secuencia de repetición invertida del extremo terminal en 5' de la SEC. ID. nº: 3 que presenta autocomplementariedad o una repetición invertida de la construcción 5' no traducida del gen ghFAD2-1 expuesto en la SEC. ID. nº: 7 que presenta autocomplementariedad.

7. 7.

   Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además transformar la planta de algodón transgénica o una célula de dicha planta con una segunda construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen de Δ9-estearoil-ACP desaturasa o fragmento génico del mismo dispuesta operativamente en conexión con una secuencia promotora que puede proporcionar la expresión de dicho gen

   o fragmento génico en la semilla de una planta de algodón durante un tiempo y en condiciones suficientes para disminuir la expresión del gen endógeno de Δ9-estearoil-ACP desaturasa correspondiente en la semilla de dicha plante de algodón.
8. 8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la segunda construcción génica comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por:

   (i)

   la secuencia nucleotídica expuesta en la SEC. ID. nº: 1 o un fragmento de la misma;

   (ii)

   una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC. ID. nº: 2 o un fragmento de la misma;

   (iii) una secuencia nucleotídica que es complementaria de (i) o (ii); y

   (iv) una secuencia de repetición invertida que presenta autocomplementariedad y que está constituida por una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por:

   (a)

   la secuencia nucleotídica de (i) unida a la secuencia nucleotídica de (iii); y

   (b)

   la secuencia nucleotídica de (ii) unida a la secuencia nucleotídica de (iii).

9. 9.

   Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la construcción génica comprende la región de codificación de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEC. ID. nº: 1 o en un fragmento de la misma en la orientación antisentido.

10. 10.

    Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la construcción génica comprende una secuencia de repetición invertida del extremo terminal en 5' de la SEC. ID. nº: 1 que presenta autocomplementariedad.

11. 11.

    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en el que la repetición invertida está interrumpida por una secuencia interviniente.

12. 12.

    Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la secuencia interviniente es una secuencia de intrón.

13. 13.

    Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el intrón escindible es el primer intrón del gen ghFAD2-1.

14. 14.

    Procedimiento de modificación del aceite endógeno de una planta de algodón que comprende:

    (i)

    transformar o transfectar una célula, tejido u órgano de la planta de algodón con una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen de Δ9 estearoil-ACP desaturasa o un fragmento génico del mismo operativamente en conexión con una secuencia promotora que puede proporcionar la expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de una planta de algodón, y regenerar una planta de algodón a partir de dicha célula, tejido u órgano vegetal, en el que la expresión del gen endógeno de Δ9 estearoil-ACP desaturasa en la semilla de dicha planta se reduce cuando dicha planta se cultiva durante un tiempo y en condiciones suficientes por lo tanto;

    (ii)

    transformar o transfectar una célula, tejido u órgano de la planta de algodón con una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12-desaturasa o un fragmento génico del mismo operativamente en conexión con una secuencia promotora que puede proporcionar la expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de una planta de algodón, y regenerar una planta de algodón a partir de dicha célula, tejido u órgano vegetal, en el que la expresión del gen endógeno de oleil-PC Δ12-desaturasa en la semilla de dicha planta se reduce cuando dicha planta se cultiva durante un tiempo y en condiciones suficientes por lo tanto;

    (iii) cruzar la planta de algodón de (i) o una planta de algodón constituida por una descendencia de la planta de (i) en el que dicha descendencia comprende dicha secuencia nucleotídica de un gen de Δ9 estearoil-ACP desaturasa o fragmento génico del mismo, con la planta de algodón de (ii) o con una planta de algodón constituida por una descendencia de la planta de (ii) en el que dicha descendencia comprende dicha secuencia nucleotídica de un gen de oleoil-PC Δ12-desaturasa o fragmento génico del mismo; y

    (iv) seleccionar la descendencia de dicho cruzamiento en el que dicha descendencia presenta un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada.
15. 15. Planta de algodón transgénica

    (i)

    que comprende en su genoma una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12-desaturasa, o un fragmento génico del mismo, operativamente en conexión con una secuencia promotora que puede proporcionar la expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de dicha planta de algodón; y

    (ii)

    en la que la expresión del gen endógeno de oleil-PC Δ12-desaturasa correspondiente se reduce en la semilla en virtud de la presencia de dicha construcción génica en su genoma, y

    (iii) que presenta un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla en comparación con una planta isogénica no transformada.
16. 16. Planta de algodón según la reivindicación 15, en la que dicha secuencia nucleotídica comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por:

    (i)

    la secuencia nucleotídica expuesta en la SEC. ID. nº: 3 o la SEC. ID. nº: 7 o en un fragmento de la misma;

    (ii)

    una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC. ID. nº: 4 o en un fragmento de la misma;

    (iii) una secuencia nucleotídica que es complementaria de (i) o (ii); y

    (iv) una secuencia de repetición invertida que presenta autocomplementariedad y constituida por una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por:

    (a)

    la secuencia nucleotídica de (i) unida a la secuencia nucleotídica de (iii); y

    (b)

    la secuencia nucleotídica de (ii) unida a la secuencia nucleotídica de (iii).

17. 17. Planta de algodón constituida por una descendencia de la planta según la reivindicación 15, en la que dicha descendencia presenta el nivel de ácido palmítico disminuido en la semilla y comprende dicha construcción génica.

18. 18.

    Planta de algodón según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 que comprende además en su genoma una segunda construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen de Δ9-estearoil-ACP desaturasa o fragmento génico del mismo, operativamente en conexión con una secuencia promotora que puede proporcionar la expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de dicha planta de algodón, y que presenta un nivel aumentado de ácido esteárico en la semilla en comparación con una planta isogénica no transformada.

19. 19.

    Planta de algodón según la reivindicación 18, en la que dicha segunda construcción génica comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por:

    (i)

    la secuencia nucleotídica expuesta en la SEC. ID. nº: 1 o un fragmento de la misma;

    (ii)

    una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC. ID. nº: 2 o un fragmento de la misma;

    (iii) una secuencia nucleotídica que es complementaria de (i) o (ii); y

    (iv) una secuencia de repetición invertida que presenta autocomplementariedad y constituida por una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por:

20. 20.

    Planta de algodón constituida por descendencia de la planta según la reivindicación 18 ó 19, en la que dicha descendencia presenta el nivel disminuido de ácido palmítico y el nivel aumentado de ácido esteárico en la semilla, y en la que dicha descendencia comprende dicha construcción génica que comprende la secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12-desaturasa o fragmento génico del mismo, y dicha segunda construcción génica que comprende la secuencia nucleotídica de un gen de Δ9estearoil-ACP desaturasa o fragmento génico del mismo.

21. 21.

    Planta de algodón según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20 y que presenta además un nivel disminuido de ácido linoleico en la semilla en comparación con una planta isogénica no transformada.

22. 22.

    Planta de algodón constituida por una descendencia de la planta según la reivindicación 21, en la que dicha descendencia presenta además un nivel disminuido de ácido linoleico en la semilla y comprende dicha construcción génica que comprende la secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12-desaturasa o fragmento génico del mismo.

23. 23.

    Semilla de la planta de algodón según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, en la que dicha semilla presenta el nivel disminuido de ácido palmítico y comprende dicha construcción génica que comprende la secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12-desaturasa o fragmento génico del mismo.

24. 24.

    Semilla según la reivindicación 23, en la que dicha semilla presenta además un nivel aumentado de ácido esteárico.

25. 25.

    Semilla de la planta según la reivindicación 23, en la que dicha semilla presenta además un nivel disminuido de ácido linoleico.

26. 26.

    Utilización de una planta según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22 o de una semilla según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 para producir aceite de semilla de algodón, en la que dicho aceite presenta un contenido en ácido palmítico reducido que comprende una reducción de 25% en ácido palmítico en comparación con el aceite de semilla de plantas de algodón Coker no transformadas.

27. 27.

    Utilización según la reivindicación 26, en la que dicho aceite presenta una característica adicional seleccionada de entre el grupo constituido por:

    (i)

    un alto contenido en ácido oleico;

    (ii)

    un alto contenido en ácido esteárico;

    (iii) un alto contenido en ácido esteárico y un alto contenido en ácido oleico; y

    (iv) un contenido reducido en ácido linoleico.

28. 28.

    Utilización según la reivindicación 26 ó 27, en la que dicho aceite comprende 80% de ácido oleico.

29. 29.

    Utilización según la reivindicación 27, en la que dicho aceite presenta un contenido reducido en ácido linoleico que representa más de un 50% de reducción en el contenido de ácido linoleico en comparación con el aceite de semilla de plantas de algodón Coker no transformadas.

30. 30.

    Utilización según la reivindicación 27, en la que los ácidos grasos totales del aceite comprenden 10 a 31% de ácido linoleico.

31. 31.

    Construcción génica para reducir el contenido en ácido palmítico del aceite de semilla de algodón, que comprende la secuencia con repetición invertida que presenta autocomplementariedad, dispuesta operativamente en conexión con una secuencia promotora que es operable en semillas de algodón, en el que dicha secuencia con repetición invertida comprende:

    (i)

    la secuencia nucleotídica expuesta en la SEC. ID. nº: 3 o la SEC. ID. nº: 7 o un fragmento de la misma; o

    (ii)

    una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC. ID. nº: 4 o un fragmento de la misma,

    (a)

    la secuencia nucleotídica de (i) unida a la secuencia nucleotídica de (iii);

    y

    (b)

    la secuencia nucleotídica de (ii) unida a la secuencia nucleotídica de (iii).

    unida a una secuencia nucleotídica que es complementaria de las mismas.
32. 32. Construcción génica según la reivindicación 31, en la que la secuencia con repetición invertida se selecciona de entre el grupo constituido por:

    (i)

    el extremo del terminal 5' de la SEC. ID. nº: 3 que presenta autocomplementariedad; y

    (ii)

    la región no traducida en 5' del gen ghFAD2-1 expuesto en la SEC. ID. nº: 7 que presenta autocomplementariedad.

33. 33.

    Construcción génica según la reivindicación 31 ó 32, en la que la secuencia promotora es una secuencia promotora del gen de lectina de soja del promotor del gen ghFAD2-1.

34. 34.

    Planta de algodón según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22 y que presenta además un nivel aumentado de ácido oleico en la semilla en comparación con una planta isogénica no transformada.

35. 35.

    Planta de algodón constituida por una descendencia de la planta según la reivindicación 34, en la que dicha descendencia presenta además un nivel aumentado de ácido oleico en la semilla y comprende dicha construcción génica que comprende la secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12-desaturasa o fragmento génico del mismo.

36. 36.

    Semilla según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en la que dicha semilla presenta además un nivel aumentado de ácido oleico y comprende dicha construcción génica que comprende la secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12

37. 37.

    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicho gen endógeno de oleil-PC Δ12-desaturasa es un gen de ghFAD2-1.