CN103409438B - 大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a的等位基因及其编码蛋白 - Google Patents
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Abstract
大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a的等位基因及其编码蛋白，它涉及大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a的等位基因。本发明提供了大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a的等位基因及其编码蛋白。大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a的新等位基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明通过品种的相关的遗传及分子功能验证，大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a的新等位基因与FAD2-1A基因（Glyma 10g42470）相比，本发明中fad2-1a基因的突变，能显著的提高大豆油酸含量，具有本发明中fad2-1a基因型大豆品种的油酸含量达49.2%。
Description
技术领域
本发明涉及大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a基因新的等位基因的序列及其编码蛋白序列，在大豆中，此基因突变与高油酸含量相关。
背景技术
大豆是人类植物蛋白质和油分的主要来源，也是我国重要的油料和经济作物，在国民经济中有着不可替代的位置，大豆产业的发展与国家的粮食安全和国民经济可持续性发展紧密相关。大豆的油分及有利组分含量的提高是全世界大豆育种中亟待解决的实际问题，改良大豆脂肪酸比例成为最主要的育种目标之一。
大豆油的重要营养是由5种脂肪酸组成，其含量占大豆种子油的90%；它们分别是棕榈酸（16:0）、硬脂酸（18:0）、油酸（18:1）、亚油酸（18:2）与亚麻酸（18:3），其中棕榈酸和硬脂酸为饱和脂肪酸，油酸、亚油酸和亚麻酸为不饱和脂肪酸。饱和脂肪酸可导致心脏病等疾病；油酸和亚油酸可降低血清中胆固醇，防止动脉硬化；亚麻酸易于氧化使豆油变质，导致香味丧失以及产生危害健康的有害物质。因此，改良大豆油脂肪酸的组成主要是降低棕榈酸和亚麻酸的比例，提高油酸和亚油酸的比例，从而提高豆油的营养价值和氧化稳定性。
在大豆中，脂肪酸脱氢酶基因（FAD2）是控制油酸向亚油酸转化的关键基因，直接决定了大豆中多不饱和脂肪酸的含量与比例。FAD2-1A和FAD2-1B是调控油酸含量的两个主要基因。其中任何一个突变都能导致油酸含量提高，如大豆品种KK21的中FAD2-1A突变，导致油酸含量达37.3%；大豆品种吊死鬼（PI603452）的中FAD2-1A突变，导致油酸含量达36.7%。当两个同时突变能使油酸含量达80%以上(Hoshino et al.2010;Pham et al.2010)。因此，鉴定大豆品种FAD2-1A和FAD2-1B的基因型，开发出分子标志进行分子辅助育种，不但可加速高油酸大豆育种进程，提高育种效率，而且能够更加准确地跟踪目标性状基因，对于提高大豆产业竞争力，增加农民收入是十分关键的。
发明内容
本发明的目的是提供大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a的等位基因及其编码蛋白。
本发明的大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a等位基因的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。
本发明的大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a等位基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。
本发明的大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a基因是大豆脂肪酸脱氢酶FAD2-1A（Glyma10g42470）的突变型基因。
本发明的有益效果：
本发明对不同大豆品种及近等基因系中FAD2-1A基因序列进行了研究，并确定了本发明中fad2-1a基因，其对大豆高油酸含量关系密切。
本发明中fad2-1a基因是在大豆脂肪酸脱氢酶FAD2-1A（Glyma 10g42470）CDS的核苷酸序列762bp处发生了单碱基突变，由G变成A（见序列表Seq ID No：1），从而形成了终止子（见序列表Seq ID No：2），导致氨基酸序列提前终止，缺少134个AA。具有本发明fad2-1a基因的大豆品种表现为高油酸含量（油酸含量达49.2%），说明具有本发明中fad2-1a品种大豆脂肪酸脱氢酶功能减弱。兴化麻十子乙及其衍生品种是具有本发明中fad2-1a基因型的典型品种。
附图说明
图1为大豆脂肪酸脱氢酶FAD2-1A的基因型鉴定图；其中，M为DNA Marker，1以Williams82为模板扩增的PCR产物电泳图，2以Williams82为模板扩增的PCR产物经BbvI酶切后的产物电泳图，3以Harosoy为模板扩增的PCR产物电泳图，4以Harosoy为模板扩增的PCR产物经BbvI酶切后的电泳图，5以兴化麻十子乙为模板扩增的PCR产物电泳图，6以兴化麻十子乙为模板扩增的PCR产物经BbvI酶切后的电泳图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。下述实施方式中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
具体实施方式一：本实施方式大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a等位基因的核苷酸序列如SEQID No：1所示。
具体实施方式二：本实施方式大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a等位基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
1、大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a等位基因的序列的获得方法如下：
一、以大豆品种兴化麻十子乙（购买自中国农业科学院大豆种子库）的叶片为材料，用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒提取叶片总RNA；
二、采用DNase Ⅰ处理步骤一提取的总RNA；
三、取1μg步骤二处理后的总RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照购买自BD Biosciences Clontech公司的BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒的使用手册进行，获得cDNA；
四、以获得的cDNA为模板通过F1与R1引物扩增fad2-1a基因，PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸50s，共35循环，再72℃延伸10min，将PCR产物在ABI3130测序仪（ABI公司）上进行测序；
其中，引物F1的核苷酸序列为5′ ATGGGTCTAGCAAAGGAAAC 3′；引物R1的核苷酸序列为5′ TCAATACTTGTTCCTGTACC 3′。
测序结果表明大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a的基因为序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID No：1由1164个碱基组成。本发明中fad2-1a基因是在大豆脂肪酸脱氢酶FAD2-1A（Glyma 10g42470）CDS的核苷酸序列762bp处发生了单碱基突变，即由G变成A（见序列表Seq ID No：1），从而形成了TGA终止子（见序列表Seq ID No：2），导致氨基酸序列提前终止，与大豆脂肪酸脱氢酶FAD2-1A（Glyma 10g42470）的AA相比较，缺少后半部分的134个AA。
2、fad2-1a基因的鉴定
一、取长至三叶真叶期的待测品种叶片，采用CTAB法提取叶片基因组DNA；二、以步骤一提取的50ng基因组DNA为模板，以F2和R2为引物采用购买自TOYOBO公司的KOD酶进行扩增，PCR反应条件如下：94℃预变性2min；98℃变性10s，68℃延伸30s，共35个循环；三、取经步骤二PCR的产物约8μL(浓度为300ng/μL)，用灭菌水稀释1倍后，经BbvI限制性内切酶（购买自NEB公司），在37℃温度下，消化3h；四、然后将步骤三酶切后的产物，采用13%非变性PAGE胶电泳进行检测；其中，步骤一所述的待测品种分别为Williams82、Harosoy和兴化麻十子乙。
其中，引物F2的核苷酸序列为5′GCTGTAATGCCGCAGTAGAGGAC3′；引物R2的核苷酸序列为5′ATACATGACAAAACTTCCATAACTCCC3′。
电泳结果如图1所示，由图1可知，图1中三个品种都能被BbvI切成多条带，但是在1000bp处，兴化麻十子乙的带型特殊，比其它两个品种的都高，即兴化麻十子乙的基因型与Williams82和Harosoy不一样，为大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a基因。
3、油酸含量分析
油酸测定采用脂肪酸甲酯的气相色谱法；将粉碎过筛的样品0.5g于试管中，加入5ml%甲醇钠溶液，振荡使样品与溶液充分混匀，静止30min，滴入5滴10%乙酸，再加入5ml正庚烷，轻轻振荡后静止片刻，待萃取后，吸取上层脂肪酸甲酯的正庚烷溶液待测；色谱图结果计算按峰面积归一化法由仪器微处理机完成；仪器为日本产岛津GC-14A型气相色谱仪；
结果表明具有本发明中fad2-1a基因的大豆品种表现为高油酸含量（油酸含量达49.2%），说明具有本发明中fad2-1a品种大豆脂肪酸脱氢酶功能减弱。兴化麻十子乙及其衍生品种是具有本发明中fad2-1a基因型的典型品种。
Claims (2)
1.大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a的等位基因，其特征在于大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a的等位基因序列如序列表Seq ID No：1所示。
2.如权利要求1所述的大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a的等位基因编码的蛋白，其特征在于大豆脂肪酸脱氢酶fad2-1a的等位基因编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。
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