CN114731949A - 高油酸大豆突变体及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及高油酸大豆突变体的检测方法。本发明所使用的分子标记技术提供了一段新的标记序列，且通过诱变为传统育种提供了一个高油酸大豆亲本的应用，不但可以缩短育种年限，节约成本，而且精确到了FAD2‑1A/FAD2‑1B两个基因上，为分子育种提供了一个新的依据。还提供了该突变体的分子标记鉴定方法及其在育种制种中的应用，在大豆种质资源的遗传改良育种中作用重大。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及高油酸大豆突变体及其检测方法。
背景技术
大豆(Glycine max L.Merrill)起源于中国,是我国乃至世界上重要的油料和经济作物,也是人类植物油和植物性蛋白的主要来源。大豆油脂中含有人体必需的脂肪酸，具有重要的营养和保健价值。大豆油脂品质的优劣，取决于主要脂肪酸的组成及其配比，主要包括5种脂肪酸成分，即饱和脂肪酸，包括棕榈酸与硬脂酸，不饱和脂肪酸，包括油酸、亚油酸与亚麻酸。我国大豆品种中它们的平均含量分别是10％、4％、18％、55％和13％。其中具有功能性保健作用的主要是不饱和脂肪酸。摄入过多饱和脂肪酸可增加患脑血管疾病的危险。而亚油酸、亚麻酸是多不饱和脂肪酸，稳定性差，而油酸作为一种单不饱和脂肪酸，性质稳定、抗氧化作用强。在人体的脂类代谢中能降低有害胆固醇，保持有益胆固醇，从而减缓动脉粥样硬化，有效预防脑血管疾病发生的几率。因此，提高油酸的相对含量，已成为大豆品质改良育种的重要目标之一。
通过自然突变体鉴定和人工诱变比如物理诱变，化学诱变，生物诱变等方法获得了多种新的大豆突变体。科学家们通过对大豆愈伤组织进行EMS诱变获得了大豆耐盐突变体，通过60Coγ射线辐射获得了高油分的大豆突变体。科学家还利用60Co-γ射线诱变出了具有早熟、秆强、等优良品质的大豆品种。在γ射线辐照的条件下，选育出两个高产品种。有的科学家通过生物诱变获得了高油酸大豆突变体。物理诱变在保持原有亲本特性、改良单一性状上尤为优越。辐射诱变为物理诱变的主要诱变方式。辐射处理的大豆细胞可以诱发大豆多种类型的变异，如产量、品质方面，蛋白质、脂肪的变异等。而这种突变的多数为隐性突变，一般在M1不明显，到M2代后才会表现出来。因此，研究者往往把M2作为筛选突变体的重要世代。普通筛选方法往往时间长，如组织离体诱变，离体诱变中突变体的常规鉴定，从诱变开始到可进行变异鉴定需要2～3年，并且各个阶段工作量大，需耗费大量人力物力财力。随着生物技术的发展，分子标记技术也开始被运用于大豆某些性状的筛选，但是大豆基因组庞大，许多分子机制和调控机理尚不明朗，这可能也是限制了高品质大豆培育的理论瓶颈。
大豆中存在2个FAD2基因，分别为FAD2-1和FAD2-2是2个非等位基因。通过自然突变体鉴定和人工诱变比如物理辐射，化学处理等方法所获得的大豆突变体类型多种多样，若能从中筛选出某些具有优良性状的品系，对大豆育种意义重大。普通筛选方法往往周期很长，并且各个阶段工作量大，需耗费大量人力物力财力。现阶段，分子标记技术也开始被运用于大豆某些性状的筛选，但是大豆基因组庞大，许多分子机制和调控位点尚未被发现。利用与油分相关QTL连锁的标记对大豆种质进行辅助选择，这种方法在一定的程度上提高了选择的速度，但是这些标记都是大豆油分基因的连锁标记，准确性一般较低。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供提高油酸含量的大豆突变体及其检测方法。具体的，提供一种与大豆油酸相关的FAD2-1A/FAD2-1B基因突变体TL2021及其分子鉴定方法和应用。
本发明提供了如下I～IV中的至少一种在提高大豆油酸含量中的应用；
I、如SEQ ID NO:23所示的FAD2-1A基因片段中第288～466位碱基间缺失179bp的突变体；
II、如SEQ ID NO:24所示的FAD2-1B基因片段中第285～479位碱基间缺失194bp的突变体；
III、敲除大豆中如SEQ ID NO:23所示的FAD2-1A基因片段中第288～466位碱基的物质；
IV、敲除大豆中如SEQ ID NO:24所示的FAD2-1B基因片段中第285～479位碱基的物质。
本发明所述大豆FAD2-1A/FAD2-1B双基因突变体TL2021核酸为大豆FAD2-1A/FAD2-1B两个基因存在大片段缺失，分别为FAD2-1A基因序列起始密码子起第288～466位碱基间缺失179bp，缺失序列如SEQ ID No:1，该突变位于FAD2-1A基因第2外显子上；FAD2-1B基因序列起始密码子起第285-479位碱基间缺失194bp，缺失序列如SEQ ID No:2，该突变位于FAD2-1B基因第5外显子上。
本发明所述大豆为“天隆一号”大豆。
本发明所述提高大豆油酸含量包括提高大豆中油酸含量，或提高大豆中油酸在脂肪酸中的百分比。
本发明中，所述油酸包括丁酸、己酸、辛酸、癸酸、十一碳酸、十二碳酸、十三碳酸、十四碳酸、顺-9-十四碳一烯酸、十五碳酸、顺-10-十五碳一烯酸、十六碳酸、顺-9-十六碳一烯酸、十七碳酸、顺-10-十七碳一烯酸、十八碳酸、顺-9-十八碳一烯酸、反-9-十八碳一烯酸、顺，顺-9,12-十八碳二烯酸、反，反-9,12-十八碳二烯酸、顺，顺，顺-6,9,12-十八碳三烯酸、顺，顺，顺-9,12,15-十八碳三烯酸、二十碳酸、顺-11-二十碳一烯酸、顺，顺-11,14-二十碳二烯酸、顺，顺，顺-8,11,14-二十碳三烯酸、二十一碳酸、顺-5,8,11,14-二十碳四烯酸、顺-11,14,17-二十碳三烯酸、顺-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、二十二碳酸、顺-13-二十二碳一烯酸、顺-13,16-二十二碳二烯酸、二十三碳酸、二十四碳酸、顺-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、顺-15-二十四碳一烯酸。
本发明还提供了一种提高大豆油酸含量的制剂，其特征在于，包括如下i～ii中的至少一种：
i、敲除大豆中如SEQ ID NO:23所示的FAD2-1A基因片段中第288～466位碱基的物质；
ii、敲除大豆中如SEQ ID NO:24所示的FAD2-1B基因片段中第285～479位碱基的物质。
本发明还提供了所述的制剂在提高作物油酸含量中的应用。
本发明还提供了一种提高大豆油酸含量的育种方法，其包括以所述的提高大豆油酸含量的制剂处理大豆幼苗或种子；或包括经辐射诱变使大豆如SEQ ID NO:23所示的FAD2-1A基因片段中第288～466位碱基间缺失和/或经辐射诱变使大豆SEQ ID NO:24所示的FAD2-1B基因片段中第285～479位碱基间缺失。
本发明提供了一种预测大豆油酸含量的制剂，其包括预测大豆中如SEQ ID NO:23所示的FAD2-1A基因片段中第288～466位碱基间缺失179bp的突变体的制剂，以及预测和/或检测大豆中如SEQ ID NO:24所示的FAD2-1B基因片段中第285～479位碱基间缺失194bp的突变体的制剂。
本发明还提供了一种筛选高油酸作物的制剂，其包括：
检测大豆FAD2-1A/FAD2-1B双基因突变体TL2021基因转录水平的制剂；
和/或检测大豆FAD2-1A/FAD2-1B蛋白的表达水平或活性制剂。
本发明还提供了所述的制剂在筛选高油酸作物中的应用。
本发明又提供了一种筛选高油酸作物的方法，使用所述的制剂检测作物的FAD2-1A/FAD2-1B基因转录水平或检测FAD2-1A/FAD2-1B蛋白的表达水平或活性。
本发明所述SEQ ID NO:23所示的FAD2-1A基因片段中第288～466位碱基间缺失179bp的突变体的制剂包括：如SEQ ID NO:3～7中任一种所示核酸序列的上游引物，和如SEQ ID NO:8～12中任一种所示核酸序列的下游引物。
一些实施例中，所述检测SEQ ID NO:23所示FAD2-1A基因片段中第288～466位碱基间缺失179bp的突变体的制剂包括：
如SEQ ID NO:3所示上游引物和SEQ ID NO:8所示下游引物的引物对；
或者如SEQ ID NO:4所示上游引物和SEQ ID NO:9所示下游引物的引物对；
或者如SEQ ID NO:5所示上游引物和SEQ ID NO:10所示下游引物的引物对；
或者如SEQ ID NO:6所示上游引物和SEQ ID NO:11所示下游引物的引物对；或者如SEQ ID NO:7所示上游引物和SEQ ID NO:12所示下游引物的引物对。
本发明所述SEQ ID NO:24所示的FAD2-1B基因片段中第285～479位碱基间缺失194bp的突变体的制剂如SEQ ID NO:13～17中任一种所示核酸序列的上游引物，和如SEQID NO:18～22中任一种所示核酸序列的下游引物。
一些实施例中，所述检测SEQ ID NO:24所示的FAD2-1B基因片段中第285～479位碱基间缺失194bp的突变体的制剂包括：
如SEQ ID NO:13所示上游引物和SEQ ID NO:18所示下游引物的引物对；
或者如SEQ ID NO:14所示上游引物和SEQ ID NO:19所示下游引物的引物对；
或者如SEQ ID NO:15所示上游引物和SEQ ID NO:20所示下游引物的引物对；
或者如SEQ ID NO:16所示上游引物和SEQ ID NO:21所示下游引物的引物对；
或者如SEQ ID NO:17所示上游引物和SEQ ID NO:22所示下游引物的引物对。
本发明还提供了一种预测和/或检测大豆油酸含量的方法，其包括：以所述的制剂对大豆种质进行检测。
本发明所述的方法，其中所述检测采用PCR法，所述大豆种质包括大豆种子、大豆植株或大豆制品。
所述大豆植株包括：幼嫩植株、成熟植株；植株包括根、子叶、茎、叶、花、豆荚、果实、种子。
本发明所述的方法，其中所述判断标准为：
对FAD2-1A基因进行扩增，相对于野生型种质，高油酸产量大豆种质的PCR产物缺失179bp；
对FAD2-1B基因进行扩增，相对于野生型种质，高油酸产量大豆种质的PCR产物缺失194bp。
例如：用SEQ ID NO:3所示上游引物和SEQ ID NO:8所示下游引物的引物对能够扩增出产物长136bp的片段，则该大豆种质存在FAD2-1A基因突变，扩增产物长315bp则不存在FAD2-1A基因突变；
用SEQ ID NO:4所示上游引物和SEQ ID NO:9所示下游引物的引物对能够扩增出产物长143bp的片段，则该大豆种质存在FAD2-1A基因突变，扩增产物长322bp则不存在FAD2-1A基因突变；
用SEQ ID NO:5所示上游引物和SEQ ID NO:10所示下游引物的引物对能够扩增出产物长143bp的片段，则该大豆种质存在FAD2-1A基因突变，扩增产物长322bp则不存在FAD2-1A基因突变；
用SEQ ID NO:6所示上游引物和SEQ ID NO:11所示下游引物的引物对能够扩增出产物长151bp的片段，则该大豆种质存在FAD2-1A基因突变，扩增产物长330bp则不存在FAD2-1A基因突变；
用SEQ ID NO:7所示上游引物和SEQ ID NO:12所示下游引物的引物对能够扩增出产物长148bp的片段，则该大豆种质存在FAD2-1A基因突变，扩增产物长327bp则不存在FAD2-1A基因突变；
用SEQ ID NO:13所示上游引物和SEQ ID NO:18所示下游引物的引物对能够扩增出产物长208bp的片段，则该大豆种质存在FAD2-1B基因突变，扩增产物长402bp则不存在FAD2-1B基因突变；
用SEQ ID NO:14所示上游引物和SEQ ID NO:19所示下游引物的引物对能够扩增出产物长213bp的片段，则该大豆种质存在FAD2-1B基因突变，扩增产物长407bp则不存在FAD2-1B基因突变；
用SEQ ID NO:15所示上游引物和SEQ ID NO:20所示下游引物的引物对能够扩增出产物长237bp的片段，则该大豆种质存在FAD2-1B基因突变，扩增产物长431bp则不存在FAD2-1B基因突变；
用SEQ ID NO:16所示上游引物和SEQ ID NO:21所示下游引物的引物对能够扩增出产物长241bp的片段，则该大豆种质存在FAD2-1B基因突变，扩增产物长435bp则不存在FAD2-1B基因突变；
用SEQ ID NO:17所示上游引物和SEQ ID NO:22所示下游引物的引物对能够扩增出产物长268bp的片段，则该大豆种质存在FAD2-1B基因突变，扩增产物长462bp则不存在FAD2-1B基因突变。
本发明首先对天隆一号大豆种子(M0代)进行钴60辐射诱变处理，种植处理的种子获M1代植株；M1代植株自交产生种子(为M2代)，种植M2代植株，对M2代植株进行油酸含量鉴定，筛选高油酸植株；然后对不育植株进行基因测序和DNA序列分析，在分子水平上进行验证。最后获得纯合高油酸单株，并用于杂交育种和生物技术研究。本发明所使用的分子标记技术提供了一段新的标记序列，且通过诱变为传统育种提供了一个高油酸大豆亲本的应用，不但可以缩短育种年限，节约成本，而且精确到了FAD2-1A/FAD2-1B两个基因上，为传统育种提供了一个亲本，且为分子育种提供了一个新的思路，还提供了该突变体的分子标记鉴定方法及其在育种制种中的应用，在大豆种质资源的遗传改良育种中作用重大。
附图说明
图1示突变体植株脂肪酸组分含量测定；
图2示实施例6的杂交转育的技术路线图；
图3示TL2021突变体大豆和对照品种天隆一号大豆进行检测脂肪酸各组分的含量。
具体实施方式
本发明提供了高油酸大豆突变体的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：60Co-γ辐射诱变突变体库
2016年，于杭州钴60Co-γ辐射天隆一号大豆种子(M0代)10公斤，4月种植处理的种子获M1代植株，共收获约7600份种子，选取M1代植株自交产生种子(为M2代)，选取M1代种子3000份，种植于田间。在苗期、花芽分化期、开花结荚期、鼓粒期和成熟期等经过仔细观察田间性状，筛查株型、育性、产量等各种类型突变体，对各类型突变体单株收种保存作为特殊突变体。每个株系收6个单株，共18000个单株作为突变体库资源保存。
选取M1代种子1000个株系，进行油酸含量检测，测定方法：气相色谱仪为美国Thermo-Trace GC，色谱柱为Agilent毛细管柱122-3232DB-FFAP(30m×0.25mm×0.25μm)；检测器为氢火焰离子检测器(FID)，检测器温度恒温250℃；进样口温度为220℃；柱温为200℃；进样量为1μL，分流进样方式，分流比25∶1；载气为氮气，氮气流速为30.0ml·min-1；氢气流速为35.0ml·min-1；空气流速为350.0ml·min-1；升温程序为：200℃保持1min，然后以8℃·min-1的速率升至210℃保持5min，再以5℃·min-1的速率升至220℃保持5min。用脂肪酸标准品作对照物质，配制一系列浓度梯度的标准品溶液测定相应的峰值，求出斜率、截距绘制标准曲线。运用毛细管气相色谱分离经过甲酯化的脂肪酸组份，通过色谱数据软件Chrom-Card Trace-Focus GC，利用峰面积百分比法测得各组份相对百分含量；利用标准曲线，计算材料中各脂肪酸百分含量。发现编号2021突变体油酸含量明显高于其余突变体。
选取的FAD2-1A、FAD2-1B双基因突变体大豆和对照大豆品种天隆一号进行检测脂肪酸各组分的含量(图3)。结果显示FAD2-1A、FAD2-1B双基因突变体的油酸含量为83.05％，极显著高于对照品种天隆一号26.62％，而亚油酸含量极显著降低。
表1FAD2-1A、FAD2-1B双基因突变体大豆和对照大豆品种天隆一号脂肪酸组成
实施例2：叶片采样与DNA提取
采用CTAB法提取2021大豆突变体叶片DNA，具体方法如下：称取约0.1g叶片，放入离心管，加入600μL CTAB提取缓冲液，5μL RNaseA，震荡分散，65℃水浴0.5hr，其间轻摇2～3次；加入等体积氯仿/Tris-饱和酚(1:1，v/v)，混匀，轻摇10min；4℃10000rpm离心20min；转移上清至新管，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH值5.2)、0.6～1倍体积的冷异丙醇；轻摇混匀，至絮状沉淀出现；4℃10000rpm离心10min；弃去上清，用体积百分含量70％乙醇洗沉淀2次；风干，加入50μL 1×TE溶解沉淀，-20℃保存。用Nanodrop2000检测DNA浓度，稀释至10ng/L用作PCR模板。
实施例3：大豆FAD2-1A、FAD2-1B基因的突变核酸序列克隆及测序
1、确定获得高油酸大豆性状的候选基因
前人研究表明，大豆中存在2个FAD2基因,分别为FAD2-1和FAD2-2,是2个非等位基因。其中，FAD2-1基因在种子中特异性表达，是决定种子油酸含量的主要基因。基于稳定性及磷酸化作用不同，FAD2-1基因又分为FAD2-1A和FAD2-1B两种。通过抑制或过表达FAD2-1A和FAD2-1B基因,可以显著改变油酸/亚油酸比例。无论是FAD2-1A突变体与FAD2-1B突变体,以及FAD2-1A/FAD2-1B双突变体材料,并发现无论是单突变还是双突变体中,大豆的油酸含量均可显著提高。因此，可以认为大豆FAD2-1A、FAD2-1B基因是控制油酸含量的重要候选基因之一。根据已有报道，大多高油酸突变体的突变位置在FAD2-1A、FAD2-1B上。因此，设计试验克隆突变受体大豆品种(天隆一号)和上述发现的2021高油酸大豆单株中的FAD2-1A、FAD2-1B基因来探明普通大豆和突变体在FAD2-1A、FAD2-1B基因序列上可能存在的差异位点。
2、高油酸大豆FAD2-1A、FAD2-1B基因克隆
登陆NCBI(National Center For Biotechnology Information)网站，获取大豆FAD2-1A、FAD2-1B的全长基因序列，利用PCR技术，以测序引物对突变体2021和突变受体品种(天隆一号)的基因组DNA分别进行PCR扩增，得到目的片段。PCR扩增反应体系为：2×TSINGKE Master Mix(blue)，10μl；ddH2O，7μl；上游引物，1μl；下游引物，1μl；DNA模板，1μl。
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min30s，共35个循环；72℃充分延伸10min。配置1.5％琼脂糖凝胶，在5V/cm电场下电泳30min；采用市面DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。用于扩增的引物对序列见下表：
表2用于扩增FAD2-1A的引物对序列
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| FAD2-1A-F1 | CCTTTTCCCTCATTGCATGGC(SEQ ID NO:3) |
| FAD2-1A-R1 | TGACGAGAAGAGAAACAGCCC(SEQ ID NO:8) |
| FAD2-1A-F2 | CTTCCACCTCCTTCCTCAACC(SEQ ID NO:4) |
| FAD2-1A-R2 | AACAGCCCTTCCTAGAGGGT(SEQ ID NO:9) |
| FAD2-1A-F3 | TTCCACCTCCTTCCTCAACC(SEQ ID NO:5) |
| FAD2-1A-R3 | AAACAGCCCTTCCTAGAGGGT(SEQ ID NO:10) |
| FAD2-1A-F4 | GCCACCACCTACTTCCACC(SEQ ID NO:6) |
| FAD2-1A-R4 | AGCCCTTCCTAGAGGGTTGTT(SEQ ID NO:11) |
| FAD2-1A-F5 | CACCACCTACTTCCACCTCC(SEQ ID NO:7) |
| FAD2-1A-R5 | GCCCTTCCTAGAGGGTTGTT(SEQ ID NO:12) |
表3用于扩增FAD2-1B的引物对序列
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| FAD2-1B-F1 | TTTCAGCGTTCCCTCCTCAC(SEQ ID NO:13) |
| FAD2-1B-R1 | AGCCCTTCCTAGAGGGTTGT(SEQ ID NO:18) |
| FAD2-1B-F2 | TCAGCGTTCCCTCCTCACTT(SEQ ID NO:14) |
| FAD2-1B-R2 | GAGAAGCAGCCCTTCCTAGAG(SEQ ID NO:19) |
| FAD2-1B-F3 | GCGTTCCCTCCTCACTTCAT(SEQ ID NO:15) |
| FAD2-1B-R3 | GCCACCCTATTGTGAGTGTGA(SEQ ID NO:20) |
| FAD2-1B-F4 | AGCGTTCCCTCCTCACTTCA(SEQ ID NO:16) |
| FAD2-1B-R4 | AAGGCCACCCTATTGTGAGT(SEQ ID NO:21) |
| FAD2-1B-F5 | CAAGAAAGCCATTCCACCGC(SEQ ID NO:17) |
| FAD2-1B-R5 | GGCCACCCTATTGTGAGTGT(SEQ ID NO:22) |
实施例4：DNA序列分析
将回收所得野生型与突变体的PCR产物DNA采用ABI3730测序仪进行测序，测序引物分别使用正向引物与反向引物。使用常见DNA序列分析软件BIOX对双向测序结果进行拼接。对野生型和突变体序列进行比对发现，以筛选出的阳性植株DNA为模板，用FAD2-1A-F/R、FAD2-1B-F/R靶点鉴定引物分别进行PCR扩增，PCR产物送样测序，测序结果显示FAD2-1A基因缺失1
实施例5：突变位点分子标记设计与基因型鉴定
根据实施例4中得到的突变位点两侧的序列设计特异引物：正向引物和反向引物如下表所示：任意选用FAD2-1A、FAD2-1B下表所示的引物对，如果引物对扩增出的产物如果分别为野生型一列所示长度，则标志着该待检植物基因型为野生型；如果扩增产物为突变体一列扩增长度，则标志着该待检植物基因型为TL2021突变体；如果采用FAD2-1A、FAD2-1B引物对扩增产物，寄出现野生型扩增长度也出现突变体扩增长度，则标志着该待检植物基因型为野生型和TL2021突变体的杂合基因型。例如采用FAD2-1A-F1、FAD2-1A-R1和FAD2-1B-F1、FAD2-1B-R1，这两对引物扩增，产物长度分别为315bp、402bp则表明是野生型；如果产物长度分别为136bp、208bp则表明是突变体，如果产物长度为136bp、402bp或者315bp、208bp则表明为野生型和TL2021突变体的杂合基因型。
表4用于扩增FAD2-1A的引物对序列及扩增长度
表5用于扩增FAD2-1B的引物对序列及扩增长度
在实施例1中获得的TL2021突变体群体中，随机选取野生型和突变体表型的植株，提取叶片DNA，与天隆一号基因组DNA一起，分别用上述引物对进行扩增。PCR反应体系为：10×反应缓冲液1μL，dNTP 0.25μL，引物F1、R1各0.25μL，Taq酶0.5U，10ng/μL模板DNA 1μL，加超纯水将总体积补至10μL。PCR反应程序为：95℃变性3min，然后执行以下循环：95℃变性20s，53℃～58℃复性20s，72℃延伸30s，35个循环。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中，5V/cm电场下电泳30min，在凝胶成像系统中记录电泳图像。
结果见图2，选用例如采用FAD2-1A-F1、FAD2-1A-R1和FAD2-1B-F1、FAD2-1B-R1，这两对引物扩增，野生型对照产物长度分别为315bp、402bp；如果产物长度扩增产物为136bp、208bp则表明是纯合突变体，这一结果结合该突变体的突变位点，可推断2021突变体的油酸含量提高是由实施例4中所述的碱基插入造成的。我们将2021突变体命名为TL2021。
实施例6：突变基因的杂交转育
可按图2的步骤将TL2021的等位基因通过杂交转育到其它大豆遗传背景中：
(1)杂交：以TL2021为亲本，与常规材料杂交获得F1种子；
(2)第一轮回交：F1播种后获得F1植株，将F1植株与轮回亲本常规材料进行杂交，获得BC1种子；
(3)BC1高油酸大豆选择(前景选择)；
(4)播种BC1种子，获得不少于500株幼苗，在幼苗期采集各单株叶片，以实施例2中所述方法提取DNA，以实施例5中所列的引物组合进行扩增，选取基因型为杂合的单株继续种植，弃去纯合野生型的单株；
(5)BC1背景选择：采用一组(例如100个，或200个等)在TL2021和轮回亲本之间存在多态的，且在基因组上均匀分布的分子标记(可以是但不限于SSR、SNP、INDEL、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等类型标记)，对步骤(3)中选出的单株进行鉴定，选取与轮回亲本相似度高(例如大于88％相似度，或2％中选率等)的材料；
(6)第二轮回交：用步骤(4)中选出的单株为，为轮回亲本授粉，获得BC2种子；
(7)BC2的前景与背景选择：对选出的材料重复步骤(3)至步骤(4)的操作，选出与轮回亲本相似度高于选择标准(如相似度大于98％，或2％中选率等)的BC2代植株；
(8)自交获得BC2F2种子：对步骤(6)中选出的BC2植株进行自交，获得BC2F2种子；
(9)BC2F2的前景选择：将步骤(7)中获得的BC2F2种子播种，获得100株以上幼苗，在幼苗期采集叶片，以实施例4中所述方法提取DNA，以实施例4中所列的引物组合进行扩增和电泳，选出带型为纯合突变体和杂合型的单株继续栽培，丢弃纯合野生型的单株；
(10)BC2F2的背景选择及应用：将步骤(8)中选出的单株按照步骤(4)的方法进行背景筛选，选出100％背景纯合的单株。如果中选单株的引物组合扩增后带型为纯合突变体，则该单株为最终目标材料，可进一步与轮回亲本杂交保存材料，或与其它大豆材料进行杂交。如果中选单株是杂合带型，可直接用于保存种质，或通过自交获得高油酸大豆植株用于杂交育种或制种。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江新安化工集团股份有限公司
<120> 高油酸大豆突变体及其检测方法
<130> MP21035741
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccaaggttgc cttctcactg gtgtgtgggt gattgctcac gagtgtggtc accatgcctt 60
cagcaagtac caatgggttg atgatgttgt gggtttgacc cttcactcaa cacttttagt 120
cccttatttc tcatggaaaa taagccatcg ccgccatcac tccaacacag gttcccttg 179
<210> 2
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctccaaggtt gcattcttac tggcgtgtgg gtgattgctc acgagtgtgg tcaccatgcc 60
ttcagcaagt acccatgggt tgatgatgtt atgggtttga ccgttcactc agcactttta 120
gtcccttatt tctcatggaa aataagccat cgccgccacc actccaacac gggttccctt 180
gaccgtgatg aagt 194
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccttttccct cattgcatgg c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cttccacctc cttcctcaac c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttccacctcc ttcctcaacc 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccaccacct acttccacc 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caccacctac ttccacctcc 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgacgagaag agaaacagcc c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aacagccctt cctagagggt 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaacagccct tcctagaggg t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agcccttcct agagggttgt t 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcccttccta gagggttgtt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tttcagcgtt ccctcctcac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcagcgttcc ctcctcactt 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcgttccctc ctcacttcat 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agcgttccct cctcacttca 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
caagaaagcc attccaccgc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agcccttcct agagggttgt 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gagaagcagc ccttcctaga g 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gccaccctat tgtgagtgtg a 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aaggccaccc tattgtgagt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggccacccta ttgtgagtgt 20
<210> 23
<211> 982
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atgggtctag caaaggaaac aacaatggga ggtagaggtc gtgtggccaa agtggaagtt 60
caagggaaga agcctctctc aagggttcca aacacaaagc caccattcac tgttggccaa 120
ctcaagaaag caattccacc acactgcttt cagcgctccc tcctcacttc attctcctat 180
gttgtttatg acctttcatt tgccttcatt ttctacattg ccaccaccta cttccacctc 240
cttcctcaac ccttttccct cattgcatgg ccaatctatt gggttctacc gtgatgaagt 300
gtttgtccca aaaccaaaat ccaaagttgc atggttttcc aagtacttaa acaaccctct 360
aggaagggct gtttctcttc tcgtcacact cacaataggg tggcctatgt atttagcctt 420
caatgtctct ggtagaccct atgatagttt tgcaagccac taccaccctt atgctcccat 480
atattctaac cgtgagaggc ttctgatcta tgtctctgat gttgctttgt tttctgtgac 540
ttactctctc taccgtgttg caaccctgaa agggttggtt tggctgctat gtgtttatgg 600
ggtgcctttg ctcattgtga acggttttct tgtgactatc acatatttgc agcacacaca 660
ctttgccttg cctcattacg attcatcaga atgggactgg ctgaagggag ctttggcaac 720
tatggacaga gattatggga ttctgaacaa ggtgtttcat cacataactg atactcatgt 780
ggctcaccat ctcttctcta caatgccaca ttaccatgca atggaggcaa ccaatgcaat 840
caagccaata ttgggtgagt actaccaatt tgatgacaca ccattttaca aggcactgtg 900
gagagaagcg agagagtgcc tctatgtgga gccagatgaa ggaacatccg agaagggcgt 960
gtattggtac aggaacaagt at 982
<210> 24
<211> 964
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atgggtctag caaaggaaac aataatggga ggtggaggcc gtgtggccaa agttgaaatt 60
cagcagaaga agcctctctc aagggttcca aacacaaagc caccgttcac tgttggccaa 120
ctcaagaaag ccattccacc gcactgcttt cagcgttccc tcctcacttc attgtcctat 180
gttgtttatg acctttcatt ggctttcatt ttctacattg ccaccaccta cttccacctc 240
ctccctcacc ccttttccct cattgcatgg ccaatctatt gggttgtttg tcccaaaacc 300
aaaatccaaa gttgcatggt acaccaagta cctgaacaac cctctaggaa gggctgcttc 360
tcttctcatc acactcacaa tagggtggcc tttgtattta gccttcaatg tctctggcag 420
accctatgat ggttttgcta gccactacca cccttatgct cccatatatt caaatcgtga 480
gaggcttttg atctatgtct ctgatgttgc tttgttttct gtgacttact tgctctaccg 540
tgttgcaact atgaaagggt tggtttggct gctatgtgtt tatggggtgc cattgctcat 600
tgtgaacggt tttcttgtga ccatcacata tctgcagcac acacactatg ccttgcctca 660
ctatgattca tcagaatggg attggctgag gggtgctttg gcaactatgg acagagatta 720
tgggattctg aacaaggtgt ttcaccacat aactgatact catgtggctc accatctttt 780
ctctacaatg ccacattacc atgcaacgga ggcaaccaat gcaatgaagc caatattggg 840
tgagtactac cgatttgatg acacaccatt ttacaaggca ctgtggagag aagcaagaga 900
gtgcctctat gtggagccag atgaaggaac atccgagaag ggcgtgtatt ggtacaggaa 960
caag 964
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccttttccct cattgcatgg c 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgacgagaag agaaacagcc c 21
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tttcagcgtt ccctcctcac 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agcccttcct agagggttgt 20
Claims (10)
1.如下I～IV中的至少一种在提高大豆油酸含量中的应用；
I、如SEQ ID NO:23所示的FAD2-1A基因片段中第288～466位碱基间缺失179bp的突变体；
II、如SEQ ID NO:24所示的FAD2-1B基因片段中第285～479位碱基间缺失194bp的突变体；
III、敲除大豆中如SEQ ID NO:23所示的FAD2-1A基因片段中第288～466位碱基的物质；
IV、敲除大豆中如SEQ ID NO:24所示的FAD2-1B基因片段中第285～479位碱基的物质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高大豆油酸含量包括提高大豆中油酸含量，或提高大豆中油酸在脂肪酸中的百分比。
3.提高大豆油酸含量的制剂，其特征在于，包括如下i～ii中的至少一种：
i、敲除大豆中如SEQ ID NO:23所示的FAD2-1A基因片段中第288～466位碱基的物质；
ii、敲除大豆中如SEQ ID NO:24所示的FAD2-1B基因片段中第285～479位碱基的物质。
4.一种提高大豆油酸含量的育种方法，其特征在于，包括以权利要求3所述的制剂处理大豆幼苗或种子；或包括经辐射诱变使大豆如SEQ ID NO:23所示的FAD2-1A基因片段中第288～466位碱基间缺失和/或经辐射诱变使大豆SEQ ID NO:24所示的FAD2-1B基因片段中第285～479位碱基间缺失。
5.一种预测大豆油酸含量的制剂，其特征在于，包括：检测大豆中如SEQ ID NO:23所示的FAD2-1A基因片段中第288～466位碱基间缺失179bp的突变体的制剂，和/或检测大豆中如SEQ ID NO:24所示的FAD2-1B基因片段中第285～479位碱基间缺失194bp的突变体的制剂。
6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述SEQ ID NO:23所示的FAD2-1A基因片段中第288～466位碱基间缺失179bp的突变体的制剂包括：
如SEQ ID NO:3～7中任一种所示核酸序列的上游引物，和如SEQ ID NO:8～12中任一种所示核酸序列的下游引物。
7.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述SEQ ID NO:24所示的FAD2-1B基因片段中第285～479位碱基间缺失194bp的突变体的制剂如SEQ ID NO:13～17中任一种所示核酸序列的上游引物，和如SEQ ID NO:18～22中任一种所示核酸序列的下游引物。
8.一种预测大豆油酸含量的方法，其特征在于，包括：以权利要求5～7任一项所述的制剂对大豆种质进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述大豆种质包括大豆种子、大豆植株或大豆制品。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述检测采用PCR法，所述判断标准为：
对FAD2-1A基因进行扩增，相对于野生型种质，高油酸产量大豆种质的PCR产物缺失179bp；
对FAD2-1B基因进行扩增，相对于野生型种质，高油酸产量大豆种质的PCR产物缺失194bp。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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