CN113881805B - 一种与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记及其应用；与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记的编号为TMc42726和TMt09661，其PCR扩增产物核苷酸序列分别由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记在检测烟草基因组DNA中是否存在Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471中的应用。本发明提供的与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记具有精准、高效、稳定、便捷和低成本的特点，因此该分子标记可以作为烟草高香气品质育种中Ⅲ型蔗糖酯基因qBMVSE471分子标记辅助选择的应用。

Description

一种与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR 分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子遗传育种技术领域，具体涉及一种与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记及其应用。
背景技术
烟草蔗糖酯是其叶片表面化学主要成分之一，也是烟草中重要的潜在致香前体物质，其中，栽培烟草中含量较高的为蔗糖四酯(Severson R F,Arrendale R F,Chortyk OT,Quantitation ofthe major cuticular components from green leaf ofdifferenttobacco types.Journal ofAgricultural and Food Chemistry,1984,(32):566-570.)，其降解可产生小分子挥发性脂肪酸并可极大地提高烟叶的香气品质(Severson R F,Arrendale R F,Chortyk O T,Isolation and characterization ofthe sucrose estersofthe cuticular waxes ofgreen tobacco leaf.Journal ofAgricultural and FoodChemistry,1985,(33):870-875.Leffingwell J C,Chemical constituents of tobaccoleaf and differences among tobacco types.Social Science ElectronicPublishing,2001,1:38-44.)。大量研究表明，普通烟草中的蔗糖四酯依据分子量的大小不同，进一步分为6个类型(组)，即，I型烟草蔗糖酯～VI型烟草蔗糖酯，其中，III型～VI型烟草蔗糖酯中因含有3-甲基戊酰基而被称为BMVSE(Vontimitta V,Danehower D A,SteedeT,Moon H S,Lewis R S,Analysis of a Nicotiana tabacum L.genomic regioncontrolling two leafsurface chemistry traits.Journal ofAgricultural and FoodChemistry,2010,58:294-300.)。不同栽培烟草类型中蔗糖四酯的结构类型和含量存在较大差异，烤烟、白肋烟和马里兰烟中仅含少量的I型和II型烟草蔗糖酯，不含或含有痕量的BMVSE；而香料烟和雪茄烟含有大量的BMVSE(蔡莉莉，谢复炜，刘克建，张映，谢剑平，香料烟中蔗糖酯的气相色谱/质谱分析.烟草科技,2009,3:40-44.王瑞玲，王莹莹，毛多斌，贾春晓，烟草中蔗糖四酯类化合物的GC-MS分析.化学研究与应用,2011,23(8):1030-1035.屈亚芳，许明录，曹建敏，孙惠青，尤祥伟，王国平，蒋彩虹，王元英，常爱霞，不同基因型烟草腺毛主要分泌物差异分析.中国烟草学报,2018,24(1):45-52.陈彪，陈铭，李洋洋，屈亚芳，程立锐，杨爱国，胡日生，刘旦，罗成刚，向世鹏，冯全福，常爱霞，烟草糖酯SSR分子标记筛选及辅助育种应用.中国烟草科学,2019,40(3):8-15.)。BMVSE经硅烷化气相色谱质谱(GC-MS)进一步解析后，依据葡萄糖环部分特征碎片离子大小又可分为BMVSE471(III型烟草蔗糖酯)、BMVSE485(IV型烟草蔗糖酯)和BMVSE499(V型烟草蔗糖酯)，上述3种类型烟草蔗糖酯也是培育含高蔗糖酯而具有高香气品质烤烟新品种的核心关注点。
针对栽培烟草叶片中BMVSE含量的遗传研究表明，雪茄烟Beinhart1000-1中控制BMVSE性状的基因呈显性，被定位于SSR标记PT30354和PT52061、PT61362之间约5.2cM区域内，且与SSR标记PT30209和PT20315呈共分离(Vontimitta V,Danehower D A,Steede T,Moon H S,Lewis R S,Analysis of a Nicotiana tabacum L.genomic regioncontrolling two leafsurface chemistry traits.Journal ofAgricultural and FoodChemistry,2010,58:294-300.)。国内的烟草育种工作者利用上述5个SSR标记对不同遗传背景的烟草材料及192份重组自交系群体进行BMVSE筛选验证，结果表明仅2个标记(PT20135和PT30354)可使用，但标记的基因型与BMVSE表型的一致率约92.165％(陈彪，陈铭，李洋洋，屈亚芳，程立锐，杨爱国，胡日生，刘旦，罗成刚，向世鹏，冯全福，常爱霞，烟草糖酯SSR分子标记筛选及辅助育种应用.中国烟草科学,2019,40(3):8-15.)。造成上述试验验证结果出现远未达到分子标记辅助选择(MAS)精准要求的主要原因为：文献的作者错误的将原本分别属于BMVSE471(III型)、BMVSE485(IV型)和BMVSE499(V型)三个不同独立基因视作一个基因(命名为BMVSE)进行遗传定位研究，故此，获得的定位结果是不准确的。本项目组的研究表明，III～V型BMVSE属于典型的数量性状，且受Beinhart1000-1基因组内不同染色体或同一染色体上不同位置的QTLs控制，这些基因/QTLs被暂时命名为qBMVSE471、qBMVSE485和qBMVSE499。进一步将文献报道的5个与BMVSE紧密连锁SSR标记信息与Beinhart1000-1基因组比对可知，即使与BMVSE呈共分离的PT30329和PT20315标记间仍存在约15Mb的物理距离，也即，文献针对III～V型烟草蔗糖酯作为一个基因(BMVSE)进行定位的结果是不准确的，该定位结果极有可能只是三种类型BMVSE中的一种。故此，在后续的实验验证中出现了5个紧密连锁标记仅有2个可用且无法精准实现标记基因型与BMVSE表型一致的情况。上述错误或不足，严重地制约了利用与III～V型BMVSE基因紧密连锁标记开展高香气烟草新品种的选育进程。
鉴于上述情况，有必要研究一种与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记及其应用以解决上述技术问题。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记，本发明的第二个目的在于提供与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记的应用。旨在利用与III型qBMVSE471基因紧密连锁标记加速选育高香气品质烤烟新品种进程。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是这样实现的，一种与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记，所述与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记的编号为TMc42726和TMt09661，其PCR扩增产物核苷酸序列分别由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
优选地，所述TMc42726和TMt09661对应的引物序列分别为：
TMc42726引物序列为：
TMc42726F：5’-CACTTCTCGCCTTGATAGCC-3’，
TMc42726R：5’-CAATAGCGCGACACGATAAA-3’；
TMt09661引物序列为：
TMt09661F：5’-GACCCTCGATTCAGAGAAGG-3’，
TMt09661R：5’-GTTCGGGCATGTTTAGAGGA-3’。
本发明的第二个目的是这样实现的，与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记的应用，所述与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记在检测烟草基因组DNA中是否存在Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471中的应用。
优选地，以所述TMc42726序列的引物TMc42726F、TMc42726R和TMt09661序列的引物TMt09661F、TMt09661R分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物；
如果PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示序列，则表明该待测烟草植株含有高香气品质的Ⅲ型烟草蔗糖酯的纯合等位基因SE471SE471；
如果PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示序列，则为待测烟草植株不含或含有痕量的Ⅲ型烟草蔗糖酯的纯合等位基因se471se471；
如果PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，或含有如SEQID No.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ ID No.3、SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，即为含有Ⅲ型烟草蔗糖酯的杂合等位基因SE471se471。
综上所述，相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明为了简捷、精准、高效选择具有高香气品质潜力的Ⅲ型烟草蔗糖酯烟草品种，有针对性和特异性的选择含Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471的后代材料，提供了一种用于检测Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471的分子标记TMc42726和TMt09661，该分子标记采用数量性状连锁分析(QTL)法和硅烷化气相色谱质谱(GC-MS)法，在烟草全基因组范围内筛选获得与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471基因连锁的共显性SSR标记，可用于Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及高香气烟草品种选育的效率。
2、本发明以优质多抗雪茄烟品种Beinhart1000-1和烤烟品种红花大金元为亲本，其中，Beinhart1000-1品种叶片中的高香气品质由BMVSE控制，而BMVSE受数量性状Ⅲ型qBMVSE471基因、IV型qBMVSE485基因和V型qBMVSE499基因控制；而烤烟品种红花大金元综合性状优良但不含BMVSE。通过杂交、连续套袋自交，构建的烟草重组自交系(RILs_F7:8)为作图群体，采用数量性状连锁分析(QTL)法和硅烷化气相色谱质谱(GC-MS)法，在烟草全基因组范围内筛选获得与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR标记，以弥补现有技术和已报道文献的不足、加速分子标记辅助选择(MAS)在烟草高香气品种选育中的精准、高效利用。
3、本发明提供的一种用于检测Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471的分子标记，与文献报道的标记检测烟草蔗糖酯含量相比，本发明所述分子标记可精准的确定待测烟草中是否含有Ⅲ型烟草蔗糖酯，且相较于文献报道的标记具有更高的检测准确度，其有效纠正并弥补了文献中将三种不同类型BMVSE视作一个基因的错误与不足；同时也可精准的鉴别具有III型烟草蔗糖酯的基因型；与现有的采用低通量、高成本、耗时费力的GC-MS法检测烟草蔗糖酯含量相比，本发明所述的共显性SSR标记具有高效、稳定、可靠、简捷和低成本的特点，且可在烟草生长的任何时期进行检测，极大的缩短了实验周期，进而加速了选育高香气品质烤烟新品种进程。
4、发明通过采用共显性SSR标记，具有精准、高效、稳定、便捷和低成本的特点，因此该分子标记可以作为烟草高香气品质育种中qBMVSE471基因分子标记辅助选择的应用。
附图说明
图1是本发明基于烟草重组自交系群体(RILs_F7:8；红花大金元×Beinhart1000-1)的雪茄烟SSR标记遗传连锁图谱中的第1～8条连锁群(LG01～LG09)，每条连锁群的左右两侧分别为遗传距离(单位，cM)和SSR标记名称。
图2是本发明基于烟草重组自交系群体(RILs_F7:8；红花大金元×Beinhart1000-1)的雪茄烟SSR标记遗传连锁图谱中的第9～16条连锁群(LG09～LG16)，每条连锁群的左右两侧分别为遗传距离(单位，cM)和SSR标记名称。
图3是本发明基于烟草重组自交系群体(RILs_F7:8；红花大金元×Beinhart1000-1)的雪茄烟SSR标记遗传连锁图谱中的第17～24条连锁群(LG17～LG24)，每条连锁群的左右两侧分别为遗传距离(单位，cM)和SSR标记名称。
图4是本发明基于烟草重组自交系群体(RILs_F7:8；红花大金元×Beinhart1000-1)的第15号连锁群上Ⅲ型烟草蔗糖酯QTL分析曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有开展创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记，所述与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记的编号为TMc42726和TMt09661，其PCR扩增产物核苷酸序列分别由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQID No.3和SEQ ID No.4所示。
所述TMc42726和TMt09661对应的引物序列分别为：
TMc42726引物序列为：
TMc42726F：5’-CACTTCTCGCCTTGATAGCC-3’(SEQ ID No.5)，
TMc42726R：5’-CAATAGCGCGACACGATAAA-3’(SEQ ID No.6)；
TMt09661引物序列为：
TMt09661F：5’-GACCCTCGATTCAGAGAAGG-3’(SEQ ID No.7)，
TMt09661R：5’-GTTCGGGCATGTTTAGAGGA-3’(SEQ ID No.8)。
与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记的应用，所述与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记在检测烟草基因组DNA中是否存在Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471中的应用。
以所述TMc42726序列的引物TMc42726F、TMc42726R和TMt09661序列的引物TMt09661F、TMt09661R分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物；
如果PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示序列，则表明该待测烟草植株含有高香气品质的Ⅲ型烟草蔗糖酯的纯合等位基因SE471SE471；
如果PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示序列，则为待测烟草植株不含或含有痕量的Ⅲ型烟草蔗糖酯的纯合等位基因se471se471；
如果PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，或含有如SEQID No.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ ID No.3、SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，即为含有Ⅲ型烟草蔗糖酯的杂合等位基因SE471se471。
下面以具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
本实施例1采用数量性状连锁分析(QTL)法并结合硅烷化气相色谱质谱(GC-MS)法，在烟草全基因组范围内筛选与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471连锁的共显性SSR标记。
1.1实验材料
以综合性状优良且不含III型烟草蔗糖酯的烤烟品种红花大金元为母本，以含III型、IV型和V型烟草蔗糖酯的雪茄烟品种Beinhart1000-1(其III～V型烟草蔗糖酯分别由qBMVSE471、qBMVSE485、qBMVSE499基因控制)为父本，经杂交、连续自交，获得341份株系的重组自交系(RILs_F7:8)作为遗传作图群体。
1.2亲本及RILs_F7:8群体III型烟草蔗糖酯含量数据获得
试验材料成苗后移栽至大田，待大田烟叶成熟时，每个株系随机选10株，且每株烟草选取3片中部叶片；将上述每个株系的30片中部叶片叠在一起，利用直径1cm的打孔器在叶片中部位置随机打2个孔，获得60个直径1cm的圆形叶片。将获得的60个圆形小叶片按照文献报道的方法(蔡莉莉，谢复炜，刘克建，张映，谢剑平，香料烟中蔗糖酯的气相色谱/质谱分析.烟草科技,2009,3:40-44.王瑞玲，王莹莹，毛多斌，贾春晓，烟草中蔗糖四酯类化合物的GC-MS分析.化学研究与应用,2011,23(8):1030-1035.)进行烟草蔗糖酯含量检测。经GC-MS法检测获得的341份RILs_F7:8III型烟草蔗糖酯含量作为RILs_F7:8群体的表型值，用于下一步的QTL连锁分析。
1.3SSR标记分析
烟草基因组DNA提取：采用常规CTAB法或植物组织DNA提取试剂盒均可，方法可参考已有的文献或试剂盒中的说明书。
PCR扩增及电泳检测：PCR扩增体系为20μL，其中包含2.0μL的10×Buffer(10mmol/L Tris-Cl,PH＝8.4,50mmol/LKCl,1.5mmol/L MgCl2)，200μmol/L的dNTPs(TakaraBiotechnology Co.Ltd.,Dalian,China)，0.5μmol/L的上下游引物(Takara)，0.75U的rTaq聚合酶(Takara)，30～50ng模板DNA，最后用ddH2O补齐20μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min，30个循环(95℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s)，72℃延伸5min，4℃保存。PCR扩增产物检测：PCR扩增产物加1/6体积的6×Loading Buffer，取2.5μL利用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶(non-denaturing PAGE，550V，2.5h)在DYY-6C型电泳仪(北京六一厂)上电泳分离，然后将电泳后的凝胶参照童治军等(童治军.烟草微卫星标记的开发与应用.杭州:浙江大学,2012,pp:35,87-88.)的方法进行固定、银染、漂洗、显色、漂洗等银染检测步骤，最后拍照及胶片数据处理。
利用本实验室分别基于烤烟红花大金元和雪茄烟Beinhart1000-1基因组信息开发的约50000个SSR标记，对RILs_F7:8群体的双亲(红花大金元和Beinhart1000-1)和子一代(F1)进行多态性筛选，最终，筛选获得2001个多态性SSR标记。再利用筛选获得2001个多态SSR标记，对341份RILs_F7:8样品进行基因型分析。其次，利用遗传连锁作图软件JoinMap4.0对341份RILs_F7:8样品的基因型数据进行连锁分析，绘制一张含有24条连锁群且均匀分布1974个SSR标记，覆盖烟草基因组长度为3213.138cM的高质量雪茄烟遗传连锁图谱，作为RILs_F7:8群体的基因型值，用于下一步的QTL连锁分析。基于烟草重组自交系群体(RILs_F7:8；红花大金元×Beinhart1000-1)的雪茄烟SSR标记遗传连锁图谱如图1所示，SSR标记遗传连锁图谱信息如表1所示。
表1
1.4III型烟草蔗糖酯(qBMVSE471)的全基因组QTL定位分析
利用QTL定位分析软件QTL IciMapping v4.2对RILs_F7:8群体的基因型数据(构建获得雪茄烟遗传连锁群图谱)和表型数据(341份RILs_F7:8群体的III型烟草蔗糖酯含量)，对III型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471进行全基因组QTL扫描。其中，相关参数设置为：定位方法选ICIM-ADD：Inclusive Composite Interval Mapping of ADDitive(and dominant)QTL，迭代次数为1000(Permutation times＝1000)，显著性为0.01(Significance＝0.01)，步长为0.5cM(Walk speed＝0.5cM)。最后，在全基因组范围内的LOD＝3.3733条件下，位于第15号连锁群的70.00cM处定位获得III型烟草蔗糖酯性状的1个主效QTL(暂时命名为qBMVSE471_15)。该主效QTL可解释约37.53％的表型变异率，且此时的LOD值约为9.45。基于烟草重组自交系群体(RILs_F7:8；红花大金元×Beinhart1000-1)的第15号连锁群上Ⅲ型烟草蔗糖酯QTL分析曲线图如图2所示，图2中，横坐标为遗传距离(单位：厘摩cM)；纵坐标为LOD值；图2中的横向虚线是在0.01显著性阈值下的LOD值＝3.3733；LOD曲线最高点为主效基因(qBMVSE471_15)。III型烟草蔗糖酯QTL(qBMVSE471_15)信息统计如表2所示。
表2
QTL Chromosome Position/cM LeftMarker RightMarker LOD PVE(％) Add
qBMVSE471_15 15 70.00 TMc42726 TMt09661 9.4521 37.5278 0.3306
注：PVE为QTL的效应值，即，该QTL可解释表型变异百分比；Add为加性效应。
实施例2
本实施方式提供了共显性连锁标记在RILs_F8:9群体单株中的验证。
利用获得的与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471两侧紧密连锁的共显性SSR标记TMc42726和TMt09661，对苗期的RILs_F8:9群体(红花大金元×Beinhart1000-1)单株进行基因型分析，获得RILs_F8:9群体各单株的基因型数据；另一方面，待RILs_F8:9群体的烟叶生长至成熟采烤前，采用GC-MS法对各株系的成熟中部叶片取样，检测叶片中的III型烟草蔗糖酯含量，即，获取RILs_F8:9群体各株系的表型值。最后，分析341份RILs_F8:9群体的基因型数据与Ⅲ型烟草蔗糖酯表型值，发现本发明公布的两个共显性SSR标记TMc42726和TMt09661的基因型值与表型值完全吻合，即，一致率达100％。
具体的分析方法为：通过GC-MS检测获得的各株系III型烟草蔗糖酯含量高于或等于亲本Beinhart1000-1含量时，该株系的基因型中也是同时呈现如SEQ ID NO.1(231bp)和SEQ ID NO.3(265bp)所示序列即为纯合基因型SE471SE471；检测获得的各株系III型烟草蔗糖酯含量等于或低于亲本红花大金元含量时，该株系的基因型中也是同时呈现如IDNO.2(301bp)和SEQ ID NO.4(340bp)所示序列即为纯合基因型se471se471；而当检测获得的各株系III型烟草蔗糖酯含量介于亲本红花大金元与Beinhart1000-1之间，也即与子一代(F1)含量相近时，该株系的基因型中也是同时呈现如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列，或含有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列，或含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示序列，或含有SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列即为杂合基因型SE471se471。
以上结果表明，共显性标记TMc42726和TMt09661分别与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁，且该两个标记位于目的基因(qBMVSE471_15)两侧。利用上述两个共显性紧密连锁SSR标记，不仅可以精准、高效、便捷且低成本的实现烟草任何生育期的III型烟草蔗糖酯含量的检测，而且也可清晰鉴别待测植株中的III型烟草蔗糖酯的基因型状态(即，具有最高含量值且稳定遗传的纯合基因型SE471SE471、具有中等含量值且遗传不稳定的杂合基因型SE471se471、不含或含痕量值且稳定遗传的纯合基因型se471se471)，进而既提高了具有高香气品质烤烟新品种选育的科学性、可预测性，又加速了育种进程。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 云南省烟草农业科学研究院
<120> 一种与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记及其应用
<130> 2021
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 231
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
cacttctcgc cttgatagcc tttgaatctt atgtcttctt atgatcctca ttgactctag 60
gacaattgat acagacatag ttagataacg ataatcggag gataacaacc ttgagtcact 120
ctaatcagat ccacaagcat acaagacaca atacacacac acacacacac acacacacat 180
atatatatat atatatatat atatatatta ttttatcgtg tcgcgctatt g 231
<210> 2
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
cacttctcgc cttgatagcc tttgaatctt atgtcttctt atgatcctca ttgactctag 60
gacaattgat acagacatag ttagataacg ataatcggag gataacaacc ttgagtcact 120
ctaatcagat ccataaggcg ctttagagtc actgcttgca ttgcgcgcgc gcgcgcgcgc 180
acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacat atatatatat 240
atatatatat atatatatat atatatatat atatatatta ttttatcgtg tcgcgctatt 300
g 301
<210> 3
<211> 265
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
gaccctcgat tcagagaagg agaaacattg attcccctgt taggaggtgc gagaggttgt 60
ccatggcggg cttgagaaga ggtcgagata gtccaaagaa gtaatgggga gaggtgatta 120
ggcaggacat ggcgctgctc cacctcactg aggacatgac cctttatagg aaacagtctc 180
tctaccttct tcttcatcat cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc 240
ttctctcctc taaacatgcc cgaac 265
<210> 4
<211> 340
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
gaccctcgat tcagagaagg agaaacattg attcccctgt taggaggtgc gagaggttgt 60
ccatggcggg cttgagaaga ggtcgagata gtccaaagaa gtaatgggga gaggtgatta 120
ggcaggacat ggcgctgctc cacctcactg aggacatgac cctttatagg aaacagtctc 180
tctaccttct tcatcatctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc 240
ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc 300
ttcttcttct tcttcttctc tcctctaaac atgcccgaac 340
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
cacttctcgc cttgatagcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
caatagcgcg acacgataaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
gaccctcgat tcagagaagg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
gttcgggcat gtttagagga 20

Claims (3)

1.一种与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记，其特征在于：所述与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记的编号为TMc42726和TMt09661，其PCR扩增产物核苷酸序列分别由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQID No.3和SEQ ID No.4所示；
所述TMc42726和TMt09661对应的引物序列分别为：
TMc42726引物序列为：
TMc42726F：5’- CACTTCTCGCCTTGATAGCC -3’，
TMc42726R：5’- CAATAGCGCGACACGATAAA -3’；
TMt09661引物序列为：
TMt09661F：5’- GACCCTCGATTCAGAGAAGG -3’，
TMt09661R：5’- GTTCGGGCATGTTTAGAGGA -3’。
2.一种权利要求1所述的与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记的应用，其特征在于，所述与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记在检测烟草基因组DNA中是否存在Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471中的应用。
3.根据权利要求2所述的与Ⅲ型烟草蔗糖酯基因qBMVSE471紧密连锁的共显性SSR分子标记的应用，其特征在于，以所述TMc42726序列的引物TMc42726F、TMc42726R和TMt09661序列的引物TMt09661F、TMt09661R分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物；
如果PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示序列，则表明该待测烟草植株含有高香气品质的Ⅲ型烟草蔗糖酯的纯合等位基因SE471SE471；
如果PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示序列，则为待测烟草植株不含或含有痕量的Ⅲ型烟草蔗糖酯的纯合等位基因se471se471；
如果PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，或含有如SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ ID No.3、SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，即为含有Ⅲ型烟草蔗糖酯的杂合等位基因SE471se471。
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Large-scale development of SSR markers in tobacco and construction of a linkage map in flue-cured tobacco;Tong, Zhijun et al;Breeding science;第66卷(第3期);全文 *

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