CN108728436B - 一种分子标记及其在苹果果实苹果酸含量筛选中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分子标记及其在苹果果实苹果酸含量筛选中的应用。本发明首先保护一种分子标记，为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列1所示的DNA分子；(a2)苹果基因组中MdPP2C‑H磷酸酶基因第2901‑3084位核苷酸；(a3)来源于苹果的与序列1的同源性大于95％、98％或99％的DNA分子。本发明还保护分子标记在预测苹果的酸含量性状中的应用。本发明还保护一种预测苹果的酸含量性状的方法，包括如下步骤：检测待测苹果基于分子标记的基因型，Q8Q8基因型苹果的酸含量>Q8q8基因型苹果的酸含量>q8q8基因型苹果的酸含量。鉴于苹果的童期长、遗传背景复杂等特点，本发明将会在很大程度上提高苹果育种的筛选效率，缩短育种年限。

Description

一种分子标记及其在苹果果实苹果酸含量筛选中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分子标记及其在苹果果实苹果酸含量筛选中的应用。
背景技术
苹果因其营养丰富，经济价值高，是世界重要的栽培树种之一。同时，苹果因其肉质细脆、多汁，风味甜酸可口、气味芳香浓郁等而倍受人们青睐。苹果果实中有机酸主要为苹果酸，有机酸是决定果实风味品质的重要因素之一，有机酸在果实自身代谢中参与了光合作用、呼吸作用，以及合成酚类、氨基酸、酯类和芳香物质的代谢过程。因此，研究苹果果实中的有机酸积累机制对提高和改善果实品质具有重要的意义。同时，果实品质直接决定了果实的商品品质和市场需求，而苹果的酸度是影响果实口感品质的重要因素，对鲜食品质、果汁加工品质、市场消费等具有重要的影响。
苹果因其遗传背景复杂、童期长、自交不亲和等特点严重制约了苹果遗传育种及新品种的选育。因此通过开发与表型性状相关的标记，应用分子标记辅助育种，弥补常规杂交育种的缺陷，有利于定向选择育种，缩短育种年限，为苹果育种的早期选择做铺垫。
发明内容
本发明的目的是提供一种分子标记及其在苹果果实苹果酸含量筛选中的应用。
本发明首先保护一种分子标记，为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)序列表的序列1所示的DNA分子；
(a2)苹果基因组中MdPP2C-H磷酸酶基因自起始密码子开始计的第2901-3084位核苷酸；
(a3)来源于苹果的与序列表的序列1的同源性大于95％、98％或99％的DNA分子。
本发明还保护所述分子标记的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)：
(c1)鉴定苹果的酸含量性状；
(c2)预测苹果的酸含量性状；
(c3)选育具有不同酸含量性状的苹果。
本发明还保护一种预测苹果的酸含量性状的方法，包括如下步骤：检测待测苹果基于所述分子标记的基因型，Q8Q8基因型苹果的酸含量>Q8q8基因型苹果的酸含量>q8q8基因型苹果的酸含量；
如果待测苹果的两条染色体均缺失所述分子标记，待测苹果的基因型为Q8Q8基因型；如果待测苹果的两条染色体均具有所述分子标记，待测苹果的基因型为q8q8基因型；如果待测苹果的一条染色体缺失所述分子标记，另一条染色体具有所述分子标记，待测苹果的基因型为Q8q8基因型。
本发明还保护一种选育具有不同酸含量性状的苹果的方法，包括如下步骤：检测待测苹果基于所述分子标记的基因型，Q8Q8基因型苹果的酸含量>Q8q8基因型苹果的酸含量>q8q8基因型苹果的酸含量；
如果待测苹果的两条染色体均缺失所述分子标记，待测苹果的基因型为Q8Q8基因型；如果待测苹果的两条染色体均具有所述分子标记，待测苹果的基因型为q8q8基因型；如果待测苹果的一条染色体缺失所述分子标记，另一条染色体具有所述分子标记，待测苹果的基因型为Q8q8基因型。
所述酸含量为有机酸含量或苹果酸含量。
所述酸含量为果实酸含量。
本发明还保护一个特异引物对，是基于所述分子标记设计的，由引物F和引物R组成；
所述引物F为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物R为如下(b3)或(b4)：
(b3)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(b4)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。
本发明还保护所述特异引物对的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)：
(c1)鉴定苹果的酸含量性状；
(c2)预测苹果的酸含量性状；
(c3)选育具有不同酸含量性状的苹果。
本发明还保护一种预测苹果的酸含量性状的方法，包括如下步骤：
以待测苹果的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为638bp，该植株为Q8Q8基因型；如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为822bp，该植株为q8q8基因型；如果PCR扩增产物为两种DNA分子，一种大小为638bp，另一种大小822bp，该植株为Q8q8基因型；
Q8Q8基因型苹果的酸含量>Q8q8基因型苹果的酸含量>q8q8基因型苹果的酸含量。
本发明还保护一种选育具有不同酸含量性状的苹果的方法，包括如下步骤：
以待测苹果的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为638bp，该植株为Q8Q8基因型；如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为822bp，该植株为q8q8基因型；如果PCR扩增产物为两种DNA分子，一种大小为638bp，另一种大小822bp，该植株为Q8q8基因型；
Q8Q8基因型苹果的酸含量>Q8q8基因型苹果的酸含量>q8q8基因型苹果的酸含量。
所述酸含量为有机酸含量或苹果酸含量。
所述酸含量为果实酸含量。
本发明还保护一种选育极端高酸苹果或极端低酸苹果的方法，包括如下步骤：检测待测苹果基于所述分子标记的基因型，Q8Q8基因型苹果为候选的极端高酸苹果，q8q8基因型苹果为候选的极端低酸苹果；
如果待测苹果的两条染色体均缺失所述分子标记，待测苹果的基因型为Q8Q8基因型；如果待测苹果的两条染色体均具有所述分子标记，待测苹果的基因型为q8q8基因型；如果待测苹果的一条染色体缺失所述分子标记，另一条染色体具有所述分子标记，待测苹果的基因型为Q8q8基因型。
本发明还保护一种选育极端高酸苹果或极端低酸苹果的方法，包括如下步骤：
以待测苹果的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为638bp，该植株为Q8Q8基因型；如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为822bp，该植株为q8q8基因型；如果PCR扩增产物为两种DNA分子，一种大小为638bp，另一种大小822bp，该植株为Q8q8基因型；
Q8Q8基因型苹果为候选的极端高酸苹果，q8q8基因型苹果为候选的极端低酸苹果。
所述极端高酸苹果为果实苹果酸含量为8mg/g以上的苹果。
所述极端低酸苹果为果实苹果酸含量为4mg/g以下的苹果。
以上任一所述PCR扩增的反应体系组成如下(10μL)：2×PCR Mix 5μL，MdPP2C-F溶液0.5μL，MdPP2C-R溶液0.5μL，模板溶液0.5μL，ddH2O 3.5μL。MdPP2C-F溶液中，MdPP2C-F的浓度为10μM。MdPP2C-R溶液中，MdPP2C-R的浓度为10μM。模板溶液中，DNA浓度为500ng/μL。
以上任一所述PCR扩增的反应程序具体可为：94℃5min；94℃30s、57℃30s、72℃50s，36个循环；72℃7min。
以上任一所述苹果为“金冠”苹果和“红玉”苹果的杂交后代。
以上任一所述苹果为用“金冠”苹果的花粉对去雄后的“红玉”苹果进行授粉得到的杂交后代。
以上任一所述苹果可为现有品种。
以上任一所述苹果为苹果植株。
以上任一所述分子标记、特异引物对或方法，均可用于苹果育种。
本发明的发明人通过QTL定位获得与苹果果实有机酸含量相关的候选基因MdPP2C-H，开发了基于一个184bp的缺失多态，可作为分子标记。进一步的，本发明的发明人并在后代极端表型(高酸、低酸)及种质资源中进行了验证，证实该分子标记可用于苹果果实高酸性状的分子辅助育种。
本发明仅通过PCR扩增条带大小就能鉴定苹果各品种的基因型并通过基因型预判将来果实的酸含量，简单快速方便，经济有效。本发明在幼苗初期既能预判果实的酸含量，可以用于高酸苹果的早期筛选，在杂交育种初期就能筛选后代的酸度表型，达到各种需求(科研、鲜食、果汁加工)的要求，同时鉴于苹果的童期长、遗传背景复杂等特点，本发明将会在很大程度上提高苹果育种的筛选效率，缩短育种年限。
附图说明
图1为39株极端高酸植株中的部分植株进行步骤二得到的电泳图。
图2为37株极端低酸植株中的部分植株进行步骤二得到的电泳图。
图3为不同基因型群体的果实苹果酸含量平均值(246株杂交后代植株)。
图4为部分品种检测果实苹果酸含量时的色谱图。
图5为不同基因型群体的果实苹果酸含量平均值(92个现有苹果品种)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。苹果果肉的主要有机酸是苹果酸，通常情况下，苹果果肉中，苹果酸占有机酸含量的90％(质量百分含量)以上。
实施例1、分子标记的发现
通过高效液相色谱(HPLC)确定作图群体的成熟苹果果肉中苹果酸的含量，依据该苹果酸含量数据并应用高密度遗传图谱进行QTL定位，将酸性状定位于第8号染色体0.6M的区间。根据重测序的SNP标记，通过遗传学方法，缩短QTL区段，结合基因功能，最终克隆获得一个与苹果果肉苹果酸含量相关的基因，即MdPP2C-H磷酸酶基因。
进一步研究发现，MdPP2C-H磷酸酶基因存在一个184bp的缺失多态，该缺失位于基因组中MdPP2C-H磷酸酶基因自起始密码子开始计的第2901-3084位核苷酸(起始密码子ATG中的A计为第1位)，如序列表的序列1所示。将缺失该184bp核酸的单倍体定义为Q8,将具有该184bp核酸的单倍体定义为q8。苹果为2倍体，基于该缺失多态，为Q8Q8基因型、Q8q8基因型或q8q8基因型。
基于该184bp的缺失多态设计一对引物如下：
MdPP2C-F(序列表的序列2)：5′-TGATTCCCTCTTGGATGTTGG-3′；
MdPP2C-R(序列表的序列3)：5′-CTCCTTTTCCGTGCCTCTTTG-3′。
实施例2、应用分子标记鉴定高酸亲本与低酸亲本的后代的有机酸含量性状
一、制备杂交群体
1、取“金冠”苹果的花粉，对去雄后的“红玉”苹果进行授粉，收获杂交种子。
2、培育杂交种子，得到苹果实生苗。
种植地点为北京市昌平区，得到1600株苹果实生苗。
二、果实苹果酸含量的测定
在实生苗开始结果时采成熟的果实进行鉴定。
1、苹果植株上的果实成熟后，去除果皮和果核，取果肉。
2、称取5g(鲜重)步骤1得到的果肉，加入10ml双蒸水，研磨成匀浆，然后75℃水浴30min，然后12000rpm离心10min，收集上清液，残留沉淀。
3、向步骤2的沉淀中加入8ml双蒸水，然后75℃水浴30min，然后12000rpm离心10min，收集上清液。
4、将步骤2得到的上清液和步骤3得到的上清液合并，然后用双蒸水定容至25ml，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。
5、取步骤4得到的滤液，采用Waters 600色谱仪和Waters 2487紫外灯检测仪检测苹果酸含量。
色谱柱采用反向的C18柱，规格为4.6mm×150mm。
流动相为0.01M的K2HPO4水溶液，用磷酸调pH值至2.6。
柱温为30℃。流动相流速为0.5ml/min。
苹果酸标准品：DL-Malicacid(240176-50G,Sigma-ALDRICH,USA)。
苹果酸标准品的出峰位置为：保留时间6.5-7.0min。
标准曲线方程为：y＝2132881.2915x-10004.2136；R2＝0.9988；
X代表浓度(mg/mL)、Y代表峰面积。
计算果肉的苹果酸含量，单位为mg/g，mg为苹果酸含量的单位，g为果肉鲜重的单位。
每个苹果植株对随机抽样的5个成熟果实进行检测，结果取平均值，作为该苹果植株的果实苹果酸含量。
三、基因型鉴定
1、提取苹果植株的叶片的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用MdPP2C-F和MdPP2C-R组成的引物对进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系(10μL)：2×PCR Mix 5μL，MdPP2C-F溶液0.5μL，MdPP2C-R溶液0.5μL，模板溶液0.5μL，ddH2O 3.5μL。MdPP2C-F溶液中，MdPP2C-F的浓度为10μM。MdPP2C-R溶液中，MdPP2C-R的浓度为10μM。模板溶液中，DNA浓度为500ng/μL。
PCR扩增的反应程序：94℃5min；94℃30s、57℃30s、72℃50s，36个循环；72℃7min。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。
如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为638bp，该植株为Q8Q8基因型；如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为822bp，该植株为q8q8基因型；如果PCR扩增产物为两种DNA分子，一种大小为638bp，另一种大小822bp，该植株为Q8q8基因型。
四、极端高酸植株与极端低酸植株的基因型
如果某一苹果植株的果实苹果酸含量为8mg/g以上，该苹果植株为极端高酸植株；如果某一苹果植株的果实苹果酸含量为4mg/g以下，该苹果植株为极端低酸植株。
从1600株苹果实生苗挑取连续三年均鉴定为极端高酸植株的39株植株和均鉴定为极端低酸植株的37株植株。
39株极端高酸植株中，21株为Q8Q8基因型，0株为q8q8基因型，18株为Q8q8基因型。37株植株极端低酸植株中，0株为Q8Q8基因型，31株为q8q8基因型，6株为Q8q8基因型。该76株植株群体中，Q8Q8基因型只存在于极端高酸植株中，而q8q8基因型只存在于极端低酸植株中。
39株极端高酸植株中的部分植株进行步骤二得到的电泳图见图1，不同泳道对应不同植株。37株极端低酸植株中的部分植株进行步骤二得到的电泳图见图2，不同泳道对应不同植株。
五、不同基因型群体的果实苹果酸含量平均值
从1600株苹果实生苗中随机取246株植株。
246株植株根据基因型分成三组，统计各组的果实苹果酸含量平均值，结果如下：
Q8Q8基因型的植株，67株，果实苹果酸含量为10.46±3.3mg/g。
Q8q8基因型的植株，97株，果实苹果酸含量为7.66±2.80mg/g。
q8q8基因型的植株，82株，果实苹果酸含量为3.20±1.11mg/g。
结果见图3。246株植株群体中，p-value值为1.4288E-43，小于0.01，说明实施例1发现的184bp的缺失多态的基因型与果实苹果酸含量表现为极显著相关。
综合以上结果，Q8Q8基因型与果实高酸性状完全关联、q8q8基因型与果实低酸性状完全关联；对于果实苹果酸含量性状来说，Q8Q8基因型>Q8q8基因型>q8q8基因型。实施例1发现的184bp的缺失多态可用于苹果杂交育种中果实酸度的早期筛选。
步骤四和步骤五的植株均进行了测序验证：Q8Q8基因型的植株的PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为638bp，q8q8基因型的植株的PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为822bp，Q8q8基因型的植株的PCR扩增产物为两种DNA分子(一种大小为638bp，另一种大小822bp)；q8q8基因型的植株的PCR扩增产物中具有特异分子标记，Q8Q8基因型的植株的PCR扩增产物缺失了特异分子标记，所述特异分子标记如序列表的序列1所示。
实施例3、应用分子标记鉴定现有品种
对92个现有苹果品种(自然群体)分别进行如下操作：
检测果实苹果酸含量，方法同实施例2的步骤二。部分品种检测果实苹果酸含量时的色谱图见图4。
进行基因型鉴定，方法同实施例2的步骤三。
根据基因型将92个品种分成三组，统计各组的果实苹果酸含量平均值，结果如下：
Q8Q8基因型的品种，30个，果实苹果酸含量为7.12±2.20mg/g。
Q8q8基因型的品种，40个，果实苹果酸含量为5.19±1.91mg/g。
q8q8基因型的品种，22个，果实苹果酸含量为2.55±0.64mg/g。
结果见图5。在92个苹果自然群体中，p-value值为1.1597E-13，小于0.01，说明实施例1发现的184bp的缺失多态的基因型与果实苹果酸含量表现为极显著相关。
部分结果见表1。
表1
Figure BDA0001470682470000071
Figure BDA0001470682470000081
92个品种均进行了测序验证：Q8Q8基因型的植株的PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为638bp，q8q8基因型的植株的PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为822bp，Q8q8基因型的植株的PCR扩增产物为两种DNA分子(一种大小为638bp，另一种大小822bp)；q8q8基因型的植株的PCR扩增产物中具有特异分子标记，Q8Q8基因型的植株的PCR扩增产物缺失了特异分子标记，所述特异分子标记如序列表的序列1所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业大学
<120> 一种分子标记及其在苹果果实苹果酸含量筛选中的应用
<130> GNCYX171752
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 184
<212> DNA
<213> Malus Mill
<400> 1
tatttatata tatttatata taggtcacac ttggtgcgat ggcaagtgcc ttcgaccatg 60
agcggtaggt ctcgggttcg aaacatgcga gcatcctcac cataaatggg ggtaatgcta 120
tccgacattc acctctccga caccctgcgt aaagcgggac ccttgtacac tgggtacgac 180
cttt 184
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
tgattccctc ttggatgttg g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
ctccttttcc gtgcctcttt g 21

Claims (9)

1.一种分子标记，为序列表的序列1所示的DNA分子。
2.权利要求1所述分子标记的应用，为如下（c1）或（c2）或（c3）：
（c1）鉴定苹果的酸含量性状；
（c2）预测苹果的酸含量性状；
（c3）选育具有不同酸含量性状的苹果。
3.一种预测苹果的酸含量性状的方法，包括如下步骤：
检测待测苹果基于权利要求1所述分子标记的基因型，Q8Q8基因型苹果的酸含量>Q8q8基因型苹果的酸含量>q8q8基因型苹果的酸含量；
如果待测苹果的两条染色体均缺失所述分子标记，待测苹果的基因型为Q8Q8基因型；如果待测苹果的两条染色体均具有所述分子标记，待测苹果的基因型为q8q8基因型；如果待测苹果的一条染色体缺失所述分子标记，另一条染色体具有所述分子标记，待测苹果的基因型为Q8q8基因型。
4.一种选育具有不同酸含量性状的苹果的方法，包括如下步骤：
检测待测苹果基于权利要求1所述分子标记的基因型，Q8Q8基因型苹果的酸含量>Q8q8基因型苹果的酸含量>q8q8基因型苹果的酸含量；
如果待测苹果的两条染色体均缺失所述分子标记，待测苹果的基因型为Q8Q8基因型；如果待测苹果的两条染色体均具有所述分子标记，待测苹果的基因型为q8q8基因型；如果待测苹果的一条染色体缺失所述分子标记，另一条染色体具有所述分子标记，待测苹果的基因型为Q8q8基因型。
5.特异引物对的应用，为如下（c1）或（c2）或（c3）：
（c1）鉴定苹果的酸含量性状；
（c2）预测苹果的酸含量性状；
（c3）选育具有不同酸含量性状的苹果；
所述特异引物对由引物F和引物R组成；所述引物F为序列表的序列2所示的单链DNA分子；所述引物R为序列表的序列3所示的单链DNA分子。
6.一种预测苹果的酸含量性状的方法，包括如下步骤：
以待测苹果的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为638bp，该待测苹果为Q8Q8基因型；如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为822bp，该待测苹果为q8q8基因型；如果PCR扩增产物为两种DNA分子，一种大小为638bp，另一种大小822bp，该待测苹果为Q8q8基因型；
Q8Q8基因型苹果的酸含量> Q8q8基因型苹果的酸含量>q8q8基因型苹果的酸含量；
所述特异引物对由引物F和引物R组成；所述引物F为序列表的序列2所示的单链DNA分子；所述引物R为序列表的序列3所示的单链DNA分子。
7.一种选育具有不同酸含量性状的苹果的方法，包括如下步骤：
以待测苹果的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为638bp，该待测苹果为Q8Q8基因型；如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为822bp，该待测苹果为q8q8基因型；如果PCR扩增产物为两种DNA分子，一种大小为638bp，另一种大小822bp，该待测苹果为Q8q8基因型；
Q8Q8基因型苹果的酸含量> Q8q8基因型苹果的酸含量>q8q8基因型苹果的酸含量；
所述特异引物对由引物F和引物R组成；所述引物F为序列表的序列2所示的单链DNA分子；所述引物R为序列表的序列3所示的单链DNA分子。
8.一种选育极端高酸苹果或极端低酸苹果的方法，包括如下步骤：检测待测苹果基于权利要求1所述分子标记的基因型，Q8Q8基因型苹果为候选的极端高酸苹果，q8q8基因型苹果为候选的极端低酸苹果；
如果待测苹果的两条染色体均缺失所述分子标记，待测苹果的基因型为Q8Q8基因型；如果待测苹果的两条染色体均具有所述分子标记，待测苹果的基因型为q8q8基因型；
所述极端高酸苹果为果实苹果酸含量为8mg/g以上的苹果；所述极端低酸苹果为果实苹果酸含量为4mg/g以下的苹果。
9.一种选育极端高酸苹果或极端低酸苹果的方法，包括如下步骤：
以待测苹果的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为638bp，该待测苹果为Q8Q8基因型；如果PCR扩增产物仅为一种DNA分子且大小为822bp，该待测苹果为q8q8基因型；
Q8Q8基因型苹果为候选的极端高酸苹果，q8q8基因型苹果为候选的极端低酸苹果；
所述极端高酸苹果为果实苹果酸含量为8mg/g以上的苹果；所述极端低酸苹果为果实苹果酸含量为4mg/g以下的苹果；
所述特异引物对由引物F和引物R组成；所述引物F为序列表的序列2所示的单链DNA分子；所述引物R为序列表的序列3所示的单链DNA分子。
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