CN104561046A

CN104561046A - 控制苹果果肉有机酸含量的苹果酸转运体基因及其应用

Info

Publication number: CN104561046A
Application number: CN201510061891.6A
Authority: CN
Inventors: 韩月彭; 马百全; 王鲁; 谷超
Original assignee: Wuhan Botanical Garden of CAS
Current assignee: Wuhan Botanical Garden of CAS
Priority date: 2015-02-06
Filing date: 2015-02-06
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2035-02-06
Also published as: CN104561046B

Abstract

本发明公开了一种控制苹果果肉有机酸含量的苹果酸转运体基因及其应用，涉及苹果分子遗传育种领域。基因序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。其应用是：①根据其序列设计分子标记，用于育种中的标记筛选；②根据该基因的表达量或转录的序列亚型检测筛选酸度相关表型，或通过转基因方法提高或降低该基因表达量以获取期望的果肉酸度性状。发明获得了一个决定果肉酸度的有机酸转运体基因；发明利用了RNA-Seq拼接结果，配合全基因组框架图的注释结果，得到的基因更加准确；在苹果培育的早期就能进行筛选，可以节约育种工作的时间，同时会提高筛选的效率。

Description

控制苹果果肉有机酸含量的苹果酸转运体基因及其应用

技术领域

本发明涉及苹果分子遗传育种领域，尤其涉及一种控制苹果果肉有机酸含量

的苹果酸转运体基因及其应用。

背景技术

苹果是世界上种植与消费量最大的水果，具有高度杂合、自交不亲和以及幼年期较长等特点。这些特点尤其是童期长严重制约着苹果遗传育种及新品种的培育工作。果实品质直接决定果实的商业价值，并影响消费市场上的份额。果实中的酸、糖及香气物质等组分的含量是决定果实品质的主要因素。苹果的有机酸含量是其中影响口感品质的重要因素，对消费市场份额、果汁加工品质等方面具有重要的影响。

成熟果实中含有的主要有机酸是苹果酸，约占总酸含量的90%以上。至今，人们采用正向和反向遗传学方法对决定苹果果实酸度的基因开展了许多研究。利用cDNA芯片对高酸、低酸等品种果实表达谱差异进行了分析，结果发现NADP-ME和NAD-MDH可能是苹果酸代谢途径中的关键基因；也有研究认为NADP-ME是苹果酸降解的关键基因，而PEPC是苹果酸合成关键基因。但PEPC 、 NAD-MDH 、 NADP-ME等有机酸代谢相关基因的酶活在低酸苹果品种‘Usterapfel’和其高酸突变体之间没有差异；此外，利用番茄单片段渐渗系进行基因定位研究，鉴定的果实酸度QTLs区域都不包含酸代谢结构基因，故可推断苹果酸代谢途径中的结构基因对果实酸度不起决定作用。

液泡是苹果酸和柠檬酸主要贮藏场所。有机酸向液泡中转运，需要多种转运体和质子泵之间的协同作用。在拟南芥中，液泡膜二羧酸转运体（AttDT）和铝诱导苹果酸转运体（AtALMT6和AtALMT9）都位于液泡膜上，分别起着苹果酸转运体和苹果酸通道的功能，将它们敲除和过量表达后会造成叶片中苹果酸的积累减少。苹果等果树中也包含这两种转运体基因。我们发现其中苹果MdALMT9的转录本在果实酸度性状有分离的群体中存在着表达量和序列的差异，可能与果实的酸度具有重要的联系。

目前已经有报道说存在着可能控制苹果果实中苹果酸含量的候选基因，但未能证实其功能机制。而且在本发明报道之前尚未有利用分子标记对自然群体中苹果酸含量进行分析的报道。为了在苹果果树育种中克服具有高度杂合、自交不亲和以及较长的幼年期的特点，本发明通过关联分析获得与果实中苹果酸含量相关的候选基因，发展候选基因内部的CAPS及下游的SSR标记，进行单倍体型与苹果酸含量的相关分析，提出通过植株不同的单倍体型进行苹果果树的标记辅助选择遗传育种。同时本发明通过将该基因转化到酵母中，验证了该基因的存在能使液泡的pH值发生显著变化，从而间接证明了其调节果肉酸度的功能。

分子遗传学理论与技术应用于农作物育种的实践并没有很长时间，但已经显示了强大的技术潜力与广阔的应用前景。在早期发展中得到应用的分子遗传学技术主要是分子标记，育种研究通过尚不完善的分子标记技术构建了很多遗传连锁图谱，获得了部分重要农艺性状的基因定位。随着基因组学的理论和技术获得提升，积累了越来越多的基因组序列和变异的数据，作物育种正在呈现全新的面貌。在果树育种中，基于全基因组关联分析和分子标记辅助选择的强大技术平台，使得育种者可以用之前难以想象的速度深入挖掘重要基因，并完成分子育种和分子设计，标记辅助选择大大加快了果树的育种进程。

本发明就是基于这些新技术的果树分子育种的实践，获得了之前从未能得到的果肉酸度控制基因。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种控制苹果果

肉有机酸含量的苹果酸转运体基因及其应用。

本发明的目的是这样实现的：

一、控制苹果果肉有机酸含量的苹果酸转运体基因（MdAlMT9）

苹果果肉的主要有机酸是苹果酸，本发明参考以前的育种研究者对苹果果肉酸含量进行QTL（数量性状遗传）定位的结果，通过遗传学方法，借助本申请人之前构建的BAC（细菌人工染色体）文库，用染色体步进的方法逼近该基因，最终克隆获得了一个能决定苹果果肉酸含量的基因，即前述的MdAlMT9苹果酸转运体基因，其序列见SEQ ID NO.1和NO.2。

具体的说：

通过HPLC（高效液相色谱）确定作图群体的成熟苹果果肉中有机酸的含量与组分；通过Q-PCR（荧光定量实时PCR）和race（RNA末端快速克隆）等方法确定有机酸代谢和转运过程的关键基因的序列全长以及在苹果果实成熟过程中的表达模式。

依据上述数据对苹果的作图群体以及其他群体进行QTL定位；成功将高酸性状定位于第16号染色体顶端约1200kb的区间；通过RNA-seq数据辅助，找到最有可能的候选基因，根据注释命名为MdAlMT9基因；根据该基因座下游的简单重复序列SSR分子标记，设计引物进行聚丙烯酰胺凝胶PAGE条带分析，将此标记命名为WBG90；根据该基因内部存在的一个多态性位点设计CAPS标记引物，将该标记命名为CAPS-9；同时发现CAPS-9的基因型中一种能导致该基因的翻译提前终止；在后代群体中分析发现WBG90与CAPS-9和高酸/低酸性状完全关联，表现为：根据分子标记的多态性，对群体中苹果酸含量分析得到：GG> AG > AA（CAPS-9的分型结果）与(TC)17(TC)17> (TC)20(TC)17 > (TC)20(TC)20（WBG90的分型结果）；对这两个标记组成的单倍体型与酸含量分析得：HapA与HapD对果实中酸含量影响最大。因此该组分析标记可被用于苹果的杂交育种中。

二、苹果酸转运体基因的应用

根据苹果酸转运体基因的特点和功能，其应用是：

1、根据其序列设计分子标记（其引物序列见附表1），用于育种中的标记辅助筛选，在幼苗初期即能推断将来的果实酸含量，同时也能应用于优秀农艺性状的富集筛选；

标记的选择见前述。

2、其表达蛋白序列及基因功能的应用，根据该基因的表达量或转录本的序列亚型检测筛选酸度相关表型，或通过转基因方法提高或降低该基因表达量以获取期望的果肉酸度性状。

本应用的实现是根据MdAlMT9基因的序列并借助苹果的全基因组序列，以及MdAlMT9的基因结构设计引物，PCR扩增MdAlMT9全长，连接到克隆载体测序。构建MdAlMT9的全长真核超表达载体，转化酵母，通过对酵母的液泡进行提取，测定其pH值，证明MdAlMT9的全长类型能降低pH值；这证实MdAlMT9对苹果果肉酸度性状形成的重要性。

与现有技术相比，本发明具有下列优点和积极效果：

①本发明阐述了一个酸度调节的基因，在以前的研究中，酸度基因多数是代谢合成中的关键酶基因，而这次我们发现，苹果果肉的酸度性状形成，主要起作用的并非关键酶基因（也称结构基因），而是其向液泡内转运的转运体基因；这对理解植物有机酸储存代谢以及酸度性状的形成具有深远的意义；

②本发明利用高通量RNA-Seq拼接结果配合基因注释得到基因全长，与传统的简并引物PCR或RACE方法比更快速且可靠，结果更加准确。

③本发明找到的控制果肉酸度的关键基因MdAlMT9不仅可以在未来通过转基因技术或者杂交育种的方法调控其不同亚型的表达量，从而改良苹果品种，而且也能提前通过标记辅助选择，在苹果的杂交育种之初就筛选后代的酸度表型；鉴于苹果的童期相对较长（5到7年），将会巨大地提高育种的筛选效率。

附图说明

图1 是作图群体中部分品种的果肉有机酸性状含量图，

其中：

6.0-7.0min保留时间的峰型为苹果酸；

图2 是MdAlMT9基因的结构与根据它发展的两个标记的分型实验结果示意图，其中：

A表示利用关联分析得到候选基因的结构，及显著性相关的CAPS-9及WBG90标记的位置，CAPS-9表示GGCC/GACC，WBG90是（TC）为单元重复的SSR标记；

B表示CAPS-9及WBG90在群体中基因型的检测结果，上面表示的WBG90 代表的是聚丙烯酰胺凝胶电泳图，下面代表的是CAPS1的PCR产物经HaeIII酶切后琼脂糖电泳图；

图3是 CAPS-9和WBG90分型结果与苹果酸含量在群体中分布的关联性示意图，表示不同基因型对应的成熟苹果中苹果酸的含量，（TC）n表示SSR标记WBG90的检测结果，

A/G表示的CAPS-9中的SNP位点分析结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明：

实施例1：苹果酸的提取和测定

果实成熟后，去果皮及果核，果肉经液氮速冻后放置于-80℃；取-80℃下保存的样品，经研钵研磨成粉末状，取1g研磨后的样品加6mL的ddH₂O混匀，4℃下15000rpm 转离心15 min；上清液先后经Waters C₁₈ 柱和0.22µm Sep-Pak 微孔滤膜过；滤液置于-80ºC下保存用于糖酸的测定。

糖和有机酸的测定使用高效液相色谱法；糖测定的色谱条件为：Sugar-Pak I, 流动相双蒸水，流速为0.8mL/min，检测器为示差检测器；有机酸测定的色谱条件为：Shodex KC-811柱，流动相为0.02mol/L K₂HPO₄，pH=2.4，流速为0.8 mL/min，检测波长为210nm，检测器为紫外可见检测器；糖含量用mg/g FW表示。

实施例2：CAPS和SSR分子标记的分型检测

取50-100mg的苹果叶片用于苹果基因组DNA提取，苹果基因组DNA 提取利用植物基因组DNA提取试剂盒（天根）。分子标记PCR反应采用10µL的反应体系，如下：40μM dNTPs 0.6μL，10×PCR Buffer 1.0μL，10μM Primer Pair 0.4 μL，rTaq 0.1μL，ddH₂0 5.4μL，DNA（20 ng/µL）2.5 μL；反应程序为：95℃，5 min；[95℃，30s；58℃，30s；72℃，45s]35个循环；最后72℃延伸10 min。

聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：变性好的PCR产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳上检测；电泳条件为80w恒功率，电泳缓冲液为1×TBE；首先，预电泳30 min，直到玻璃板发热；预热后插入梳子，移除气泡，上样1μL，电泳时间为1-1.5 h。

银染显色：将电泳后的玻璃板分开；将带胶的玻璃板泡在定影液（2 g AgNO₃加入2 L ddH₂O中，溶解混匀）中10 min，捞出玻璃板，用清水迅速冲洗后放入显影液（35 g NaOH和0.8 g无水碳酸钠加入2 L水中溶解混匀，放玻璃板之前加入6-8 mL甲醛）中，直至出现清晰可见的DNA条带（约10 min）；将玻璃板在再来水中冲洗后，放在玻璃板上架晾干，稍后读带，记录扩增清晰，有多态性的引物，并拍照保存。

基因名	引物名	正向引物(5’-3’)	反向引物 (5’-3’)
				MdAlMT9	CAPS-9	AGAGTTGGTGTGGAATGTGC	TTGCCTTCTCACTCAGCTCT
	WBG90	GCCCACTAATGCTTTCTGTA	CTCCAACAGATTGTCGAATC

表2：表示不同单倍体型与成熟苹果中苹果酸含量之间的关系

表3 MdAlMT9基因在酵母中表达对pH的影响

*表示MdAlMT9载体不含有提前终止突变。

实施例3：酵母表达系统检测MdAlMT9对液泡的酸化能力

将MdAlMT9基因的CDS区连接到pRS406构建成pRS406-Ma酵母表达载体,利用 LiAc/PEG介导的方法将pRS406空载体及pRS406-Ma化到酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中；转化酵母分别在含有0.02g/mL的YPDA培养基上陪养至OD_600NM=0.6，收集菌体，溶解于1mL的ddH₂O中，机械破碎酵母细胞壁，12 000rpm 5min 离心取上清，利用pH计测定pH值。

序列表

<110> 中国科学院武汉植物园

<120> 控制苹果果肉有机酸含量的苹果酸转运体基因及其应用

<140>

<141>

<160> 6

<210> 1

<211> 1707

<212> MdAlMT9 DNA

<400>

ATGGCGGCCAAAATCGGGTCCTTCCGCCACAGCTTCGCCGAGAGAAGCAAGGAACGGCTGCTGTCGCGAAAAGGGTACTCCGACTTGGGCTTCAACAGCTCCGAGGCCGGCGACGAGMACGTCAAATGCGGCTGCTTCCGAAGAATCTCCGATGGGTTCAAMAACTTCTGCAACAATTTCCAGGGCACTTTCATCAAGTTATATCAAATGGGTCATTCGGATCCTCGAAAAGCCATCTTTGCTATCAAGATGGGGTTGACGTTGGCGCTCGTGTCGCTGCTAATATTTTTCAAAGTGCCGCTCAAAGATGTCAGCCAGTATTCTATCTGGGCAATTCTCACTGTCGTCGTCGTCTTTGAATTCAGCGTAGGTGCAACCTTGAACAAGGGTTTTAATCGTGCTTTGGGGACGTTATCAGCGGGCGGGCTTTCTCTTGGGATTGCAGAGTTATCCGTATTGGCCGGAGATCTGCAGGAAGTTATAATTGTAATTAGTGTGTTTATAGCAGGATTTTGTGCTAGTTACGCCAAGCTTTATCCGTCAATGAAGCCATATGAATACGGATTTCGGGTATTCTTGTTGACATATTGTATCGTCATGGTGTCTGGAACATCATTATTCTTTCAGACAGCAATTTATCGATTGCTGCTTATTGCTGTCGGTGCCGCCACTAGTTTGATTGTAAATATATTTATATACCCTATCTGGTCAGGGGAAGATCTCCATAAGCTGGTGGTGAAAAATTTCAGGGGTGTTGCTGCTTCTTTGGAAGGTGTTGTTAATCAGTATCTGCAATGTGTTGAATACGAGAGAATTCCTTCCAAAATTCTCACKTACCAAGCTTCTGATGACCCGTTGTATAGTGGCTATAGATCAGCTGTACAATCTTCAAGCGAAGAGGAAACTCTGTTAGGCTTTGCTGTATGGGAGCCACCCCATGGCCCATATAAGTCATTCAATTATCCCTGGGTACACTATGTCAAAGTTGCCGGTTCACTGAGGCATTGTGCWTTCATGGTCATGGCGATGCACGGATGCATACTTTCAGAAATCCAGGCACCAGCCGAAAAGAGACAGGTTTTTGCCATGGAGCTCCAGAGAGTTGGTGTGGAATGTGCTAAAATATTACGTGAGCTAGGAAGCAAAGTAGAAAAGATGGAAAAGTTAAGTCCCAAAGACGTACTTTTCGATGTGCATGAAGCAGCAGAAGAGTTGCAGATGAAAATAGACAAATATTCTTACCTTCTTGTCAATTCAGAGAGCTGGGGACCTGCAGTACGTCCCARGGAATACGAAGATCATGKGCATTTTGTCGATAAAGACAACGAAAATAAACAGGTGGTGATCGATTCTCTCAGTGAATATTGGGATTCTCAGAATCCAAGCACGACTGCTGATCCTTCCAATCAACAATGGATATCTACAGAAAGTCTTTTAAAACGACCAATATCATGRCCACGCCTCTCATTCAACGCGCACGCTGTGCAGCAGGAACCTGAAGAATCAAAAGTTTACGAAAGCGCCAGCTCCTTATCTTTGGCAACATTTGCATCGCTTCTGATTGAGTTTGTGGCTCGGCTTCAAAATCTGGTGGATGAATTCGAAGAGCTGAGTGAGAAGGCAAATTTTAAGGATCCTGTTGAACCCAAGGAGGAGGTTGTCGGGTTCTGGACCAAACTATTTAGGAGTTTGCGGTTGAAGAACTAA；

<210> 2

<211> 568

<212> MdAlMT9蛋白质

<400>

Met Ala Ala Lys Ile Gly Ser Phe Arg His Ser Phe Ala Glu Arg Ser Lys Glu Arg Leu Leu Ser Arg Lys Gly Tyr Ser Asp Leu Gly Phe Asn Ser Ser Glu Ala Gly Asp Glu Asn Val Lys Cys Gly Cys Phe Arg Arg Ile Ser Asp Gly Phe Asn Asn Phe Cys Asn Asn Phe Gln Gly Thr Phe Ile Lys Leu Tyr Gln Met Gly His Ser Asp Pro Arg Lys Ala Ile Phe Ala Ile Lys Met Gly Leu Thr Leu Ala Leu Val Ser Leu Leu Ile Phe Phe Lys Val Pro Leu Lys Asp Val Ser Gln Tyr Ser Ile Trp Ala Ile Leu Thr Val Val Val Val Phe Glu Phe Ser Val Gly Ala Thr Leu Asn Lys Gly Phe Asn Arg Ala Leu Gly Thr Leu Ser Ala Gly Gly Leu Ser Leu Gly Ile Ala Glu Leu Ser Val Leu Ala Gly Asp Leu Gln Glu Val Ile Ile Val Ile Ser Val Phe Ile Ala Gly Phe Cys Ala Ser Tyr Ala Lys Leu Tyr Pro Ser Met Lys Pro Tyr Glu Tyr Gly Phe Arg Val Phe Leu Leu Thr Tyr Cys Ile Val Met Val Ser Gly Thr Ser Leu Phe Phe Gln Thr Ala Ile Tyr Arg Leu Leu Leu Ile Ala Val Gly Ala Ala Thr Ser Leu Ile Val Asn Ile Phe Ile Tyr Pro Ile Trp Ser Gly Glu Asp Leu His Lys Leu Val Val Lys Asn Phe Arg Gly Val Ala Ala Ser Leu Glu Gly Val Val Asn Gln Tyr Leu Gln Cys Val Glu Tyr Glu Arg Ile Pro Ser Lys Ile Leu Thr Tyr Gln Ala Ser Asp Asp Pro Leu Tyr Ser Gly Tyr Arg Ser Ala Val Gln Ser Ser Ser Glu Glu Glu Thr Leu Val Cys Phe Ala Val Trp Glu Pro Pro His Gly Pro Tyr Lys Ser Phe Asn Tyr Pro Trp Val His Tyr Val Lys Val Ala Gly Ser Leu Arg His Cys Ala Phe Met Val Met Ala Met His Gly Cys Ile Leu Ser Glu Ile Gln Ala Pro Ala Glu Lys Arg Gln Val Phe Ala Met Glu Leu Gln Arg Val Gly Val Glu Cys Ala Lys Ile Leu Arg Glu Leu Gly Ser Lys Val Glu Lys Met Glu Lys Leu Ser Pro Lys Asp Val Leu Phe Asp Val His Glu Ala Ala Glu Glu Leu Gln Met Lys Ile Asp Lys Tyr Ser Tyr Leu Leu Val Asn Ser Glu Ser Trp Gly Pro Ala Val Arg Pro Lys Glu Tyr Glu Asp His Val His Phe Val Asp Lys Asp Asn Glu Asn Lys Gln Val Val Ile Asp Ser Leu Ser Glu Tyr Trp Asp Ser Gln Asn Pro Ser Thr Thr Ala Asp Pro Ser Asn Gln Gln Trp Ile Ser Thr Glu Ser Leu Leu Lys Arg Pro Ile Ser Trp Pro Arg Leu Ser Phe Asn Ala His Ala Val Gln Gln Glu Pro Glu Glu Ser Lys Val Tyr Glu Ser Ala Ser Ser Leu Ser Leu Ala Thr Phe Ala Ser Leu Leu Ile Glu Phe Val Ala Arg Leu Gln Asn Leu Val Asp Glu Phe Glu Glu Leu Ser Glu Lys Ala Asn Phe Lys Asp Pro Val Glu Ala Lys Glu Glu Val Val Gly Phe Trp Thr Lys Leu Phe Arg Ser Leu Arg Leu Lys Asn；

<210> 3

<211> 20

<212> DNA（CAPS-9的正向引物）

<400> AGAGTTGGTGTGGAATGTGC；

<210> 4

<211> 20

<212> DNA（CAPS-9的反向引物）

<400> TTGCCTTCTCACTCAGCTCT；

<210> 5

<211> 20

<212> DNA（WBG90的正向引物）

<400> GCCCACTAATGCTTTCTGTA；

<210> 6

<211> 20

<212> DNA（WBG90的反向引物）

<400> CTCCAACAGATTGTCGAATC。

Claims

1.一种控制苹果果肉有机酸含量的苹果酸转运体基因，其特征在于：

序列如SEQ ID NO.1所示，及其所编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

2.按权利要求1所述苹果酸转运体基因在调控苹果果肉酸含量中的应用，其特征在于：

①根据其序列设计分子标记，用于育种中的标记辅助筛选，在幼苗初期即能推断将来的果实酸含量，同时也能应用于优秀农艺性状的富集筛选；

所述的分子标记其引物序列如SEQ ID NO.3-6所示；

②其表达蛋白序列及基因功能的应用，根据该基因的表达量或转录本的序列亚型检测筛选酸度相关表型，或通过转基因方法提高或降低该基因表达量以获取期望的果肉酸度性状。