CN114032332B - 一种用于快速检测南瓜裸仁性状的分子标记cm17-16及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于南瓜分子育种技术领域，具体涉及一种用于快速检测南瓜裸仁性状的分子标记cm17‑16及其应用，该分子标记cm17‑16位于南瓜基因组17号染色体上；检测时，先提取待鉴定南瓜的DNA，然后以提取的DNA为模板，利用用于扩增分子标记cm17‑16的引物对进行PCR扩增，之后对PCR产物进行电泳、染色、显影，最后读带分析待鉴定南瓜是有种皮南瓜还是裸仁南瓜。本发明首次用InDel分子标记对南瓜裸仁或有种皮性状进行鉴定，同时公开了与南瓜裸仁性状连锁的17号染色体上InDel分子标记的引物序列；本发明的分子标记cm17‑16可以在育种早期快速、准确对南瓜裸仁或有种皮性状进行鉴定，为下一步加快南瓜与重要农艺性状连锁基因的利用及南瓜分子遗传育种提供有力的支持。

Description

一种用于快速检测南瓜裸仁性状的分子标记cm17-16及其 应用

技术领域

本发明属于南瓜分子育种技术领域，具体涉及一种用于快速检测南瓜裸仁性状的分子标记cm17-16及其应用。

背景技术

南瓜(Cucurbita moschata Duchesne)属于葫芦科南瓜属一年生草本植物，与笋瓜、西葫芦同为南瓜属主要三个栽培种。三者不仅在肉用生产上发展迅速，而且在籽用生产和利用上也颇具规模。在西葫芦、笋瓜、南瓜等南瓜属的籽用种植方面，我国的南瓜属籽用生产约占世界市场份额的70%。国内南瓜属籽用（包括籽仁）年消费量约20万t，国内外对南瓜属籽仁的需求量年增长率达17%。籽用南瓜属作为重要的功能食品之一，推动产业向中高端发展具有重要的理论和现实意义。

南瓜籽味甘、性温，是中国传统的加工食品。特色南瓜裸仁性状发现于20世纪80年代，其表现为没有坚硬的种皮，在食用和加工过程中无需普通种子的脱壳程序，且富含人体所需的多种氨基酸和微量元素，具有良好的籽、油两用商业开发价值，自发现以来受到研究人员及市场的广泛关注。遗传规律研究结果表明，其受一对等位基因控制，可以独立遗传，以N代表显性有种皮，n代表隐性裸仁，当这一对基因为NN和Nn时，种子为有种皮，当这一对基因型为nn时表现为裸仁，其后选育出65-1-8号裸仁南瓜新品种。然而，由于南瓜籽用生产中，蔓生和半蔓生有种皮南瓜生长期长，矮生有种皮南瓜相对籽粒小，而裸仁南瓜在生产中也存在这些问题。尽管南瓜及其中的特色南瓜裸仁种子市场需求旺盛，但由于在生产中南瓜裸仁品种单产低，其供应量远远不能满足市场需求。

随着植物基因组测序技术和仪器的不断进步，南瓜的遗传和基因组资源逐渐丰富。利用高通量测序技术对南瓜基因组进行测序，共3470个SNPs被分配到20个连锁群（LGs），总遗传距离为3087.03 cM，平均遗传距离为0.89 cM，利用南瓜、笋瓜及杂交砧木品种“Shintosa”进行测序，获得3487个SNPs，总遗传距离为3376.1cM，平均遗传距离为0.97cM。 这些研究为南瓜分子标记开发和基因克隆提供了有力的工具。

InDel标记是两个亲本在全基因组某些位点存在片段缺失的差异，根据两者插入缺失位点的差异，在这些位点设计并扩增PCR引物，最终获得可视化，可读性的差异。InDel标记具有检测容易、变异稳定、多态性强等优点。目前，InDel标记已经广泛应用于玉米、水稻、大白菜、黄瓜等作物，但用于检测南瓜裸仁性状的研究还未见报道。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种用于快速检测南瓜裸仁性状的分子标记cm17-16及其应用，在南瓜苗期就可以通过简易的实验手段快速实现对南瓜裸仁性状的判断，大大缩短了裸仁南瓜的育种年限。

为实现上述目的，本发明的目的之一是提供一种快速检测南瓜裸仁性状的分子标记cm17-16，所述分子标记cm17-16位于南瓜基因组17号染色体上。

进一步地，用于检测所述分子标记cm17-16的引物对的核苷酸序列为：

正向引物：5’-CCCATTCCATTGCTTCGTTATCC-3’（SEQ ID NO：1）；

反向引物：5’-TCATGCATTGAA AACACCATGCT-3’（SEQ ID NO：2）。

本发明的又一目的是提供上述的分子标记cm17-16在鉴定或辅助鉴定南瓜裸仁性状中的应用。

本发明的另一目的是提供上述的分子标记cm17-16在南瓜育种中的应用。

本发明的另一目的是提供一种快速检测南瓜裸仁性状的方法，该方法包括以下步骤：

1）提取待鉴定南瓜的DNA；

2）以提取的DNA为模板，利用权利要求2所述的引物对进行PCR扩增；

3）对PCR产物进行电泳、染色、显影；

4）读带，若在100-200bp能扩增一条特异性条带，说明待鉴定南瓜为有种皮南瓜；若在100-200bp能扩增两条特异性条带，说明待鉴定南瓜为裸仁南瓜。

进一步地，所述步骤2）中，PCR扩增的反应体系为：模板DNA 1μL、正向引物 1μL、反向引物 1μL、2xTaq PCR Mastermix 5μL，ddH₂O 2μL。

进一步地，所述步骤2）中，PCR扩增的反应程序为：①预变性94℃ 3min；②变性94℃ 30s；③退火55℃ 40s；④延伸72℃ 1min；以上②-④循环35次；⑤延伸72℃ 10min；⑥4℃保存。

进一步地，所述步骤3）中，采用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明针对的南瓜裸仁种子无需脱壳，种仁质量高，富含脂肪与蛋白质等特点，是不可多得的籽、油两用资源；

（2）本发明在国内外首次报道了利用InDel分子标记对裸仁南瓜这一特异资源进行早期鉴定，同时也公布了裸仁南瓜17号染色体上连锁的InDel分子标记的引物序列；

（3）本发明提供的InDel分子标记是共分离标记，可以快速、准确对南瓜裸仁性状进行鉴定，解决了限制裸仁南瓜育种发展的一大瓶颈问题；

（4）本发明为下一步加快裸仁南瓜与重要农艺性状连锁基因的利用及南瓜分子遗传育种提供有力的支撑。

附图说明

图1为有种皮南瓜和裸仁南瓜的PCR扩增结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1

本实施例提供一种快速检测南瓜裸仁性状的分子标记cm17-16，其特征在于：所述分子标记cm17-16位于南瓜基因组17号染色体上，其具体信息如下：

。

本实施例通过利用南瓜裸仁（母本）和南瓜有种皮（父本）杂交获得F-8代重组自交系(RIL)分离群体，采用BSA技术，开发出共分离来的InDel分子标记。

上述的分子标记cm17-16与南瓜薄种皮基因位点紧密连锁，可以用于南瓜裸仁性状的鉴定，通过在南瓜植株发育早期快速、准确对南瓜裸仁或有种皮性状进行鉴定，进行育种后代筛选，辅助选择南瓜裸仁性状，目标明确，成本低廉。

实施例2

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的耗材、试剂及仪器等，如无特殊说明，均可从通过正常的商业渠道购买到。

1、实验材料的种植及调查

（1）实验材料种植、管理及采样

实验材料：196份南瓜F-8代重组自交系(RIL)群体单株；

种植场地：山西农业大学东阳实训基地；

种植方法：每份材料定植2株，株行距0.5m×1m；吊蔓栽培，花期人工辅助自交授粉，田间常规栽培管理，每株留一个根瓜，成熟期对其种皮性状进行调查；

采样方法：植株营养生长阶段，取植株顶端最幼嫩处叶片置于加入磁珠的2mL离心管中，-80℃冷冻备用，用于提取DNA和PCR扩增反应。

（2）实验材料种子性状调查

在成熟期，按照自交日期，一般授粉后60-70d南瓜就可以正常采收集每个瓜的种子，并调查南瓜种子的种皮裸仁/有皮性状，并记录。196份材料，100份有种皮，96份裸仁。

2、快速检测南瓜裸仁性状的方法包括以下步骤：

（1）采用简易CTAB法提取南瓜DNA：将上面提前准备好的装有单株嫩叶的备用离心管取出，将离心管放在浸于液氮中的离心管架上，置于高通量组织研磨机中，震动3min，使叶片组织震碎为白色粉末；然后装入2mL离心管中，加入800μL的CTAB分离缓冲液，轻轻转动混匀(CTAB在65℃水浴预热30min)后置于65℃水浴锅，60min后加入800μL的氯仿:异戊醇（24:1）的溶液，轻轻混匀，4℃，12000r/min，离心15min；小心吸取上清液于新的2mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，置于-20℃冰箱沉淀60min后，12000 r/min，离心10 min；弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；室温干燥后于-20℃或者-70℃下保存备用；使用时ddH₂O调节DNA浓度约500-600μg/mL；

（2）以提取的DNA为模板，利用权利要求2所述的引物对进行PCR扩增；

PCR总反应体系10μL：模板DNA 1μL、正向引物 1μL、反向引物 1μL、2xTaq PCRMastermix 5μL，ddH₂O 2μL；

用于扩增分子标记cm17-16的引物对的核苷酸序列为：

正向引物：5’-CCCATTCCATTGCTTCGTTATCC-3’（SEQ ID NO：1）；

反向引物：5’-TCATGCATTGAA AACACCATGCT-3’（SEQ ID NO：2）。

Cm17-16引物由上海生工合成；

PCR程序：

预变性94℃ 3min；

变性94℃ 30s；

退火55℃ 40s；

延伸72℃ 1min；

变性、退火、延伸三步 循环35次；

延伸72℃ 10min；

4℃保存备用；

（3）利用使用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行检测：5×TBE缓冲液包括Tris-base5.4%、硼酸2.75%、0.5mol/L EDTA 2%，4℃保存；8%非变性聚丙烯酰胺凝胶液包括丙烯酰胺7.71%、5×TBE 20%、甲叉双丙烯酰胺0.266%，4℃保存；封好底胶，待胶液凝固后，组装好电泳槽；将35mL8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶液加入175μL 10%APS和36.5μL TEMED混匀后轻轻地摇匀，然后使用5mL的枪迅速灌胶，待胶凝固后，加入1×TBE作为缓冲液，缓冲液要高过矮板；根据不同引物的扩增量，点样量在1-1.5μL 之间，恒定电压180V，100mA，80min；

电泳结束后，利用快速银染法进行染色，首先将胶轻轻取下，放入染色液（300mL蒸馏水，0.3g硝酸银）中，染色15min，然后取出，在含有蒸馏水的容器中漂洗2次，最后放入显影液（300mL蒸馏水，7.5g氢氧化钠，0.12g无水碳酸钠，1mL甲醛）中，直至显示出清晰的条带，然后进行拍照并记录；

（4）读带：待测材料在100-200bp能扩增一条特异性条带，说明待测材料为有种皮材料，若待测材料在100-200bp能扩增两条特异性条带，说明待测材料为裸仁材料。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 山西农业大学

<120> 一种用于快速检测南瓜裸仁性状的分子标记cm17-16及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> (人工序列)

<400> 1

cccattccat tgcttcgtta tcc 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> (人工序列)

<400> 2

tcatgcattg aaaacaccat gct 23

Claims (7)

1.一种用于快速检测南瓜裸仁性状的分子标记cm17-16，其特征在于：所述分子标记cm17-16位于南瓜基因组17号染色体上，其中，利用南瓜裸仁的母本和南瓜有种皮的父本杂交获得F-8代重组自交系RIL分离群体，从中分离来的InDel分子标记，即分子标记cm17-16；

其中，用于检测所述分子标记cm17-16的引物对的核苷酸序列为：

正向引物：5’-CCCATTCCATTGCTTCGTTATCC-3’；

反向引物：5’-TCATGCATTGAA AACACCATGCT-3’，17号染色体上起始位置第3322957位碱基，InDel碱基数位35bp。

2.权利要求1所述的分子标记cm17-16在鉴定或辅助鉴定南瓜裸仁性状中的应用。

3.权利要求1所述的分子标记cm17-16在南瓜育种中的应用。

4.一种利用如权利要求1所述的分子标记cm17-16快速检测南瓜裸仁性状的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)提取待鉴定南瓜的DNA；

2)以提取的DNA为模板，利用如权利要求1中的所述引物对进行PCR扩增；

3)对PCR产物进行电泳、染色、显影；

4)读带，若在100-200bp能扩增一条特异性条带，说明待鉴定南瓜为有种皮南瓜；若在100-200bp能扩增两条特异性条带，说明待鉴定南瓜为裸仁南瓜。

5.如权利要求4所述的快速检测南瓜裸仁性状的方法，其特征在于：所述步骤2)中，PCR扩增的反应体系为：模板DNA 1μL、正向引物1μL、反向引物1μL、2xTaq PCR Mastermix 5μL，ddH₂O 2μL。

6.如权利要求4所述的快速检测南瓜裸仁性状的方法，其特征在于：所述步骤2)中，PCR扩增的反应程序为：①预变性94℃3min；②变性94℃30s；③退火55℃

40s；④延伸72℃1min；以上②-④循环35次；⑤延伸72℃10min；⑥4℃保存。

7.如权利要求4所述的快速检测南瓜裸仁性状的方法，其特征在于：所述步骤3)中，采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。

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