CN111424111A - 一种萝卜根肿病抗性鉴定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种萝卜根肿病抗性鉴定的方法。萝卜根肿病抗性功能标记RsNBS135C,由上游引物RsNBS135C‑F和下游引物RsNBS135C‑R扩增萝卜基因组DNA得到。该标记在萝卜基因组DNA中扩增所得的核苷酸序列于琼脂糖凝胶电泳后呈现特异性带型，能够快速、直接鉴定萝卜种质中目标抗性基因位点，有利于高效可靠地利用抗根肿病目标基因、加快根肿病抗性遗传改良进程。

Description

一种萝卜根肿病抗性鉴定的方法

技术领域

本发明属于蔬菜作物遗传育种领域，涉及一种萝卜根肿病抗性鉴定的方法。

背景技术

萝卜(Raphanus sativus L.)是原产于我国的重要十字花科根菜类蔬菜作物，营养丰富，耐储运、食疗价值高，深受人们喜爱。萝卜在我国栽培历史悠久(贾思勰(北魏)，齐民要术今释[M].中华书局2007)，种植面积广。

根肿病(Clubroot)主要发生在十字花科植物中，是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)引起的土传病害。病原体侵染感病植株致使根部异常膨大，造成蔬菜产品质量和商业价值下降，严重制约了十字花科作物产业化发展。由于根肿病病原物芸薹根肿菌的强生命力和高变异速度，近年来萝卜产量品质遭受这种土传病害危害的风险剧增。选育高抗品种是防治萝卜根肿病的最有效方法之一。然而，关于萝卜根肿病抗性鉴定评价工作报道较少，尚未有抗性相关基因被分离鉴定。

迄今已分离鉴定到80多个抗病基因(Sekhwal M K et al.Disease resistancegene analogs(RGAs)in plants.International journal of molecular sciences,2015,16(8):19248-19290)。已克隆的功能性抗病基因中，含有核苷酸结合位点(NBS)和富含亮氨酸重复(LRR)结构域的基因是数量最多的一类。NBS结构域因高度保守，被广泛应用于植物抗病基因的分类和识别(Lozano R et al.Identification and distribution of theNBS-LRR gene family in the Cassava genome.BMC genomics,2015,16(1):360.)。LRR结构域是一段亮氨酸重复序列，具有病原菌识别作用并参与蛋白-蛋白之间的相互作用(Martin G B,Bogdanove A J,Sessa G.Understanding the functions of plantdisease resistance proteins[J].Annual review of plant biology,2003,54(1):23-61.)。

随着萝卜全基因组测序工作的完善(Kitashiba et al.Draft sequences of theradish(Raphanus sativus L.)genome.DNA Research,2014,21(5):481-490.)，可以从萝卜全基因组水平进行NBS-LRR类抗病候选基因序列鉴定，使得从抗病候选基因中分离鉴定出根肿病抗性相关基因成为可能。开发萝卜根肿病抗性基因相应功能标记，进而运用标记辅助选择技术可有效提高高抗性品种遗传改良效率。

发明内容

本发明的主要目的在于筛选获得萝卜根肿病抗性基因位点有效功能标记；并高效应用于种质材料根肿病抗性鉴定，以提高抗性选择与抗性遗传改良效率。

本发明的另一目的是提供萝卜根肿病抗性功能标记RsNBS135C的特异性引物。

本发明的又一目的是提供萝卜根肿病抗性功能标记RsNBS135C的特异性引物的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案。

萝卜根肿病抗性功能标记RsNBS135C,由上游引物RsNBS135C-F和下游引物RsNBS135C-R扩增萝卜基因组DNA得到；所述的上游引物RsNBS135C-F的核苷酸序列如SEQID NO.1所示,下游引物RsNBS135C-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的萝卜根肿病抗性功能标记RsNBS135C在鉴别萝卜根肿病抗性中的应用。

本发明所述的萝卜根肿病抗性功能标记RsNBS135C的特异性引物，上游引物RsNBS135C-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,下游引物RsNBS135C-R的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明所述的特异性引物在鉴别萝卜根肿病抗性中的应用。

一种萝卜根肿病抗性鉴定的方法，包含以下步骤：

(1)采用改良的CTAB-氯仿-异戊醇法提取待测材料的嫩叶的基因组DNA；

(2)用本发明所述的特异性引物对步骤(1)提取的基因组DNA进行PCR扩增；

(3)扩增产物进行电泳：3％琼脂糖凝胶电泳检测，140V电泳35min，紫外凝胶成像仪下照相，并观察扩增结果；

(4)判断：扩增结果中若检测到453bp的单条带，则待鉴定萝卜植株为抗根肿病；若检测到421bp的单条带或453bp、421bp双条带，则待鉴定萝卜植株为不抗根肿病；所述的抗根肿病由芸薹根肿病菌4号生理小种所致。

所述的PCR反应体系优选：10μL体系，包括10×PCR Buffer(含Mg²⁺)1.0μL，dNTPs(10μmol/L)0.2μL，RsNBS135C-F、RsNBS135C-R(10μmol/L)各0.5μL，Taq酶(5U/μL，TaKaRa)0.1μL，模板DNA(10ng/μL)1.0μL，ddH₂O补足至10μL，混匀，离心。

所述的PCR扩增程序优选：94℃预变性3min；94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。

本发明与现有技术相比较具有以下有益效果：

本发明是基于萝卜根肿病抗性显著差异种质间4号染色体上RsNBS135基因序列编译所开发的基因特异性功能标记；

本发明提供的萝卜根肿病抗性主效位点分子标记在实际应用中检测方式简单便捷，对仪器设备和技术要求较低，扩增产物带型清晰简单，其稳定性和产物分离效果较好；

抗病育种是防治根肿病最经济、最高效的方法。本发明适用于萝卜种质对根肿病4号生理小种抗性鉴定，可利用本发明所述标记提高该抗性基因在抗性品种选育中的利用效率。

附图说明

图1是本发明使用的萝卜根肿病苗期鉴定分级标准。

图2是萝卜根肿病抗性显著差异种质间RsNBS135基因部分碱基序列比对结果。黑框内分别是RsNBS135C的上游引物(RsNBS135C-F)和下游引物(RsNBS135C-R)。

图3是本发明RsNBS135C标记在萝卜根肿病抗性显著差异种质间的PCR扩增，R1～R5泳道：高抗种质，电泳条带大小453bp；S1～S5泳道：高感种质，电泳单条带大小421bp，S3泳道双条带大小分别为453bp与421bp。

图4是本发明RsNBS135C标记应用于55份萝卜种质根肿病抗性鉴定中的PCR扩增结果。

具体实施方式

下面结合实施例和试验对本发明作进一步说明。

本发明实施例中所用的55份萝卜种质资源均来自南京农业大学萝卜遗传育种研究室。

供试的芸薹根肿病菌是由河南省农业科学院园艺所提供的4号生理小种‘XY-2’(原玉香等.河南省大白菜根肿病菌生理小种鉴定[J].河南农业科学,2017,46(7):71-76.)；接种和苗期管理在大棚内进行。

实施例1：萝卜种质根肿病抗性鉴定

萝卜种质种子经消毒、冲洗和催芽后，播于装有蛭石:草炭＝1:1灭菌基质的穴盘中。每份种质播6粒种子，每穴1粒，重复3次，并在受试材料的周围种上保护行防止边际效应。

播种后每穴注射2mL‘XY-2’芸薹根肿菌菌液进行接种(孢子浓度1×10⁷个mL^-1)。

接菌40天后，对供试各植株根部的发病情况进行调查鉴定分析，逐一鉴定和分级。

参照如图1中所示萝卜根肿病苗期鉴定分级标准：0级，各根系正常生长，无瘿瘤肿块；1级，主根不膨大，须根上有较小瘿瘤鼓起；3级，主根膨大，瘿瘤直径小于茎基部2倍；5级，主根膨大，瘿瘤直径在茎基部的2到4倍之间；7级，主根或须根瘿瘤聚集，异常膨大，瘿瘤直径大于茎基部的4倍。

计算各品种每个重复的病情指数(DI)。

注：Ai——各病级株数；i＝0,1,3,5,7；M——调查总株数。最后根据表1抗性评价标准判断种质对根肿病的抗性。

表1萝卜苗期的根肿病抗性评价标准

萝卜苗期的根肿病抗性评价结果如表2所示。

实施例2：基于RsNBS135基因的萝卜根肿病抗性标记开发与应用

从萝卜基因组数据库(http://radish.kazusa.or.or.jp/)下载萝卜全基因组核苷酸序列、已注释的CDS序列和氨基酸序列。根据NBS蛋白结构域(NB-ACR，PF00931)(http://pfam.xfam.org/family/PF00931)使用马尔可夫模型(HMM，Hidden MarkovModel)搜索萝卜基因组蛋白序列，E-value设定为0.01。所有序列均提交到Pfam、NCBI和SMART验证序列可靠性，去除不含NBS结构域和不完整的序列后，鉴定到的188个含NBS结构的抗病候选基因分别命名为RsNBS001-RsNBS188。通过根肿病抗感种质的序列差异分析TIR-NBS-LRR类基因RsNBS135与根肿病(4号生理小种)抗性紧密关联。使用RT-qPCR实验对RsNBS基因在不同抗、感萝卜材料中的表达情况进行分析，结果表明RsNBS135基因可能在萝卜抗根肿病(4号生理小种)机制防御信号途径中起重要作用。

因RsNBS135 gDNA较长，利用Primer Premier 5.0软件工具设计出如下所示的3对引物，便于分段克隆：1F-1R；2F-2R；3F-3R。1F:5’-AGCATTCAACTTTAGGCACA-3’，1R:5’-CTTCCAGGACCAAACCAG-3’(58℃)；2F:5’-TTTAGGAGTTGCGCCAGAC-3’，2R:5’-GCATCCCGTGAGATTCAG-3’(52℃)；3F:5’-TTGGAAATGTTCTCAGTC-3’，3R:5’-GTCATCATGTGGAAAAGTA-3’(56℃)。

采用改良的CTAB-氯仿-异戊醇法(Liu et al.Inheritance and fine mappingof fertility restoration for cytoplasmic male sterility in Gossypium hirsutumL.Theoretical and Applied Genetics,2003,106(3):461-469.)提取实施例1中已经过抗性鉴定的55份种质的叶片DNA。各选择5份高抗(DI≤10)和高感(DI≥50)种质材料(高抗种质：R1～R5，高感种质：S1～S5)，采用上述3对引物进行分离RsNBS135基因的gDNA序列。

序列测序结果使用DNAMAN进行拼接并进行NCBI基因组数据库中序列比对，确认为RsNBS135基因。

序列分析表明根肿病抗性显著差异的种质间在RsNBS135第一内含子和第三内含子处分别有9处和3处InDel位点以及在CDS部分有72处SNP位点，部分存在显著规律性序列差异，推测RsNBS135与根肿病抗性相关；序列对比分析表明RsNBS135基因与白菜中根肿病抗性基因CRa高度同源。

根据根肿病抗性显著差异种质间的序列差异，利用Primer Premier 5.0软件工具，在图2所示序列InDel差异区域设计RsNBS135C-F/-R引物，引物碱基序列如下：

RsNBS135C-F：5’-TGTGGGAAGGAAATAAAG-3’(SEQ ID NO.1)

RsNBS135C-R：5’-CATTCCCAGAAGAAGATG-3’(SEQ ID NO.2)

以高抗种质R1～R5和高感种质S1～S5为材料，利用引物RsNBS135C-F/-R进行PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳检测结果建立根肿病抗性标记分析体系(图3)。

以实施例1中所述提取的55份种质的基因组DNA为模板，利用标记引物RsNBS135C-F/-R，进行功能标记分析和抗性鉴定。

反应体系总体积10μL，包括10×PCR Buffer(含Mg²⁺)1.0μL，dNTPs(10μmol/L)0.2μL，RsNBS135C-F、RsNBS135C-R(10μmol/L)各0.5μL，Taq酶(5U/μL，TaKaRa)0.2μL，模板DNA(10ng/μL)1.0μL，ddH₂O补齐10μL，混匀，离心。

扩增反应程序为94℃预变性3min；94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。

3％琼脂糖凝胶电泳检测，140V电泳35min，紫外凝胶成像仪成像。

图3结果表明标记RsNBS135C，在高抗种质R1～R5中扩增出453bp单条带，高感种质S1、S2、S4、S5中扩增出421bp单条带，S3扩出453bp、421bp双条带。

表2结果表明，55份种质中45份的标记分析结果与苗期鉴定结果相一致，因此可以认为RsNBS135为萝卜根肿病(4号生理小种)抗性基因主效位点主效基因；RsNBS135C为萝卜根肿病抗性功能标记。

表2 55份萝卜种质根肿病抗性评定和标记分析结果

标记分析结果和表型符合率达81.82％。但有10份种质的抗性表型鉴定与分子标记分析结果不一致。可能因为这些材料的根肿病抗性可能不受InDel标记内的基因RsNBS135位点控制，而是受基因组范围内的其他位点所控制。

以上发明实施例结果表明RsNBS135C标记扩增效率高且条带清晰，可以简单、高效地从不同的萝卜种质中鉴定材料是否携有根肿病抗性。

序列表

<110> 南京农业大学

南京莱福佳农业科技有限公司

<120> 一种萝卜根肿病抗性鉴定的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtgggaagg aaataaag 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cattcccaga agaagatg 18

Claims (7)

1.萝卜根肿病抗性功能标记RsNBS135C,其特征在于由上游引物RsNBS135C-F和下游引物RsNBS135C-R扩增萝卜基因组DNA得到；所述的上游引物RsNBS135C-F的核苷酸序列如SEQID NO.1所示,下游引物RsNBS135C-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的萝卜根肿病抗性功能标记RsNBS135C在鉴别萝卜根肿病抗性中的应用。

3.权利要求1所述的萝卜根肿病抗性功能标记RsNBS135C的特异性引物，其特征在于上游引物RsNBS135C-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,下游引物RsNBS135C-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.权利要求3所述的特异性引物在鉴别萝卜根肿病抗性中的应用。

5.一种萝卜根肿病抗性鉴定的方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)提取萝卜待测材料的嫩叶的基因组DNA；

(2)用权利要求3所述的特异性引物对步骤(1)提取的基因组DNA进行PCR扩增；

(3)扩增产物进行电泳：3％琼脂糖凝胶电泳检测，140V电泳35min，紫外凝胶成像仪下照相，并观察扩增结果；

(4)判断：扩增结果中若检测到453bp的单条带，则待鉴定萝卜植株为抗根肿病；若检测到421bp的单条带或453bp、421bp双条带，则待鉴定萝卜植株为不抗根肿病；所述的抗根肿病由芸薹根肿病菌4号生理小种所致。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的PCR反应体系：10μL体系，包括10×PCR Buffer(含Mg²⁺)1.0μL，dNTPs(10μmol/L)0.2μL，RsNBS135C-F、RsNBS135C-R(10μmol/L)各0.5μL，Taq酶(5U/μL，TaKaRa)0.1μL，模板DNA(10ng/μL)1.0μL，ddH₂O补足至10μL，混匀，离心。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。

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