KR20100068713A - 배추 뿌리혹병 저항성 연관 분자표지 및 이의 용도 - Google Patents

배추 뿌리혹병 저항성 연관 분자표지 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배추과 작물에서의 뿌리혹병 저항성 연관 분자표지 및 저항성 품종 육성방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 배추과 작물에서의 뿌리혹병 저항성 계통과 이병성 배추계통을 이용하여 분리집단 F2를 육성 및 병 검정하여 뿌리혹병 저항성과 연관된 유전자 단편(분자표지)을 분리하고, 상기 유전자 단편들의 염기서열을 분석하여, 뿌리혹병 저항성과 이병성에 차이를 보이는 3종류의 프라이머 조합을 선발함으로써 뿌리혹병 저항성 연관표지에 특이적인 프라이머를 합성하여 고안된 분자표지에 관한 것이다. 또한, 더욱 유용성이 높은 공우성 분자표지를 개발하고자 DNA 워킹법을 수행하여 기존 영역보다 넓은 염기서열을 분석하고, 새로운 프라이머를 합성하여 고안된 공우성 분자표지에 관한 것이다. 본 발명은 상기의 분자표지를 이용하여 뿌리혹병 저항성 유전자형을 탐색하여 저항성 품종을 외부의 선발 조건에 영향을 받지 않고 안정적으로 선발하고 육성하는 방법과, 이들 뿌리혹병 저항성에 연관된 분자표지에 의해 육성된 뿌리혹병 저항성 배추과 작물에 관한 것이다.
배추과 작물, 뿌리혹병, 저항성, 품종육성, 분자표지, 프라이머 쌍

Description

배추 뿌리혹병 저항성 연관 분자표지 및 이의 용도{DNA marker associated with resistance of cabbage clubroot disease and uses thereof}
본 발명은 배추 뿌리혹병 저항성 연관 분자표지를 선발표지로 이용한 저항성 F1 품종 육성 방법 및 이를 이용하여 육성한 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 식물체에 관한 것이다.
뿌리혹병(clubroot disease)은 무사마귀병 또는 근류병이라고도 불리는 토양 전염병으로서, 반드시 살아있는 식물체내에서만 증식이 가능한 절대 기생균의 일종인 플라스모디오포라 브라시케 워론(Plasmodioophora brasicae WORON.)에 의해 발병된다. 1887년 워런인(Woronin)에 의해서 최초로 보고된 이래, 영국, 프랑스 등 유럽 및 캐나다, 미국 등 미주대륙에서 발생하여 많은 피해를 주고 있으며, 발생생태, 방제방법 그리고 저항성 품종 육성에 대한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 우리나라의 경우, 1928년 수원과 서울에서 최초로 발병했다는 기록이 보고 된 이후 크게 문제시되지 않았으나, 최근 경기와 강원 등 배추 주산단지에서 발생이 급증하고 있지만 발생생태, 품종 저항성검정, 방제체계에 대해서는 일부 보고만 있을 뿐이다.
배추과 작물에서의 뿌리혹병 저항성 품종 육성은 초기에는 교배에 의해 저항성을 도입하고 저항성이 도입된 후대를 선발, 세대진전하여 계통이나 품종을 육성하는 방법을 주로 이용해왔다. 또한 저항성 인자가 동일 작물에는 없거나 저항성 정도가 낮을 경우 종간잡종에 의해 종이 다른 작물에서 안정적인 저항성을 도입하려는 경우가 종종 있는데, 순무(Brassica rapa L.)에서 저항성을 도입하여 저항성 품종을 육성한 사례가 보고되고 있다. 그러나 뿌리혹병은 변이가 심하여 포장에서 발병 정도를 보고 저항성을 검정할 경우 선발기준이 명확하지 않고 세대진전에 많은 시간을 소요하게 되므로 보통 저항성 품종 육성 기간이 10년 이상 소요되는 것이 보통이다. 그러나 많은 시간과 경비를 들여 육성한 저항성 품종의 저항성이 안정적으로 유지되는 경우는 그리 많지 않아 병원균의 변이나 지역에 따라 저항성이 붕괴되는 현상이 자주 발생한다.
이에, 분자표지를 이용하여 저항성 품종을 육성할 경우, 환경 요인의 영향이나 관여하는 유전자의 유전양식에 대한 제한이 없어 정확한 표현형 선발이 가능하고, 유묘기에 선발이 가능하기 때문에 뿌리혹병 검정 시 보통 두 달 정도의 기간이 소요됨을 감안한다면 그 경제적인 효과가 굉장히 높다. 또한 뿌리혹병과 같이 저항성 유전자를 붕괴시킬 수 있는 병원균의 변이가 많이 발생하는 경우, 다양한 균에 대해 저항성을 나타내는 유전자와 연관된 분자표지의 개발과 이를 이용한 저항성 품종 육성이 필수요건으로 보고되고 있으므로 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 품종을 육성하기 위해 저항성과 연관된 분자표지의 개발이 요구되고 있다.
뿌리혹병 저항성 유전자에 관한 연구가 많이 이루어졌으나, 저항성 유전자의 정확한 위치가 알려지지 않았다. 그 중 최근에는 Suwabe 등이 Brassica rapa L. 의 두 개의 뿌리혹병 저항성 유전자 Crr1 및 Crr2와 그 표지에 대하여 보고하였고(Suwabe,K. et al., 2003, Theor Appl Genet 107:997-1002), Hirai 등은 뿌리혹병 저항성 유전자 Crr3에 대한 표지에 대하여 보고하였다(Hirai, M. et al., 2003, Theor Appl Genet). 또한 Matsumoto 등이 Brassica rapa L.의 두 개의 뿌리혹병 저항성 유전자 CRk 및 CRc와 그 표지에 대하여 보고하였다(Matsumoto et al.. 2008, Theor. Appl. Genet.). 한국특허 제10-490483호에는 무사마귀병 내성 식물의 효과적 선발을 위한 유전자 마커,프라이머 키트 및 무사마귀병 내성 식물의 선발 방법이 개시되어 있다.
그러나 본 발명에 따른 뿌리혹병 병원균 race4 에 대해서 저항성을 보이는 유럽 순무계통 'ECD4'에 존재하는 뿌리혹병 저항성 유전자에 대한 분자표지는 보고된 적이 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명은 상기의 문제점을 극복하기 위하여 새로운 뿌리혹병 저항성 유전자에 연관된 분자표지를 선발하는 단계에서, 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성을 보이는 'ECD4' 유래 계통과 이병성을 보이는 일반 육성계통을 교배하여 얻은 F1 식물체를 자가 수정하여 F2를 육성하고, 분리집단 F2에서 완전한 저항으로 나온 15개체, 완전한 이병으로 나온 15개체의 DNA를 각각 풀링(pooling)한 후, DNA 지문(fingerprinting) 방법을 응용한 일괄분리분석(bulked segregant analysis, BSA) 기술을 이용하여 뿌리혹병 저항성과 연관된 분자표지를 탐색하였다. 다수의 개체 분석 시 재현성과 신뢰도가 높은 SCAR(Sequence Characterized Amplified Region) 표지 혹은 CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) 표지로 변환하는 단계에서, DNA 워킹(DNA Walking) 방법을 이용하여 상기 SCAR 표지 혹은 CAPS 표지를 개발하여 이를 활용한 선발의 유용성을 검정하였다. 이러한 연구 전략을 수행하여 뿌리혹병 저항성 배추과 작물을 육성하고, 잡종 종자를 생산하는데 유용한 뿌리혹병 저항성 유전자에 대한 분자표지를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 배추과 작물의 뿌리혹병에 대한 저항성 유전자와 연관된 유전자 단편(분자 표지)를 제공한다.
본 발명은 또한, 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 선발용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 단편 또는 상기 프라이머 쌍을 포함하는 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 계통 선발용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 단편 또는 상기 프라이머 쌍을 이용하여 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 계통을 선발하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 단편 또는 상기 프라이머 쌍을 이용하여 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 품종을 육성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 단편을 함유하는 뿌리혹병 저항성 배추과 작물을 제공한다.
본 발명은 또한, 배추과 작물에서 뿌리혹병에 대한 저항성 계통과 이병성 계통을 교배하여 얻은 F1 세대를 자가 수정하여 F2 세대를 얻고, 그 개체를 육성하여 뿌리혹병을 검정하는 단계 등을 포함하는 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 품종을 육성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 육성된 뿌리혹병 저항성 배추과 작물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명은 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성에 연관된 유전자 단편을 분리하고, 뿌리혹병 저항성 검출용 분자표지를 개발하였다. 본 발명의 뿌리혹병 저항성 분자표지를 이용하여, 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 품종을 육성 단계에서 저항성 유전자의 도입 여부를 확인함으로써 효과적인 선발로 인하여 경제적일 뿐만 아니라, 뿌리혹병 저항성 형질을 여러 조합에서 분리와 선발 과정을 거쳐 새로운 품종을 개발하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 뿌리혹병 저항성 분자표지는 뿌리혹병 저항성을 보이지 않는 배추과 작물로 뿌리혹병 저항성을 도입하여 육성하고 잡종 종자를 생산함에 있어서도 매우 유용하게 이용될 수 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 배추과 작물에서 뿌리혹병에 대한 저항성 유전자와 연관된 유전자 단편 (분자표지)를 제공한다. 더욱 구체적으로, 상기 유전자 단편은 서열번호 1 내지 3, 10 및 11의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 가질 수 있다. 상기 유전자 단편은 RNA, DNA 및 cDNA를 모두 포함하며, 바람직하게는 DNA를 말한다. 본 발명의 분자 표지는 배추과 작물에서 뿌리혹병에 대한 저항성 형질과 밀접하게 관련된 염기서열로서, 뿌리혹병에 대한 저항성 유전자와 상당히 근접하여 위치하므로, 상기 염기서열들이 나타내는 어떠한 다형성을 사용하더라도 뿌리혹병에 대한 저항성 유무를 파악할 수 있다. 상기 유전자 단편은 일반적으로 공시 식물로부터 추출한 게놈 DNA 존재하에 연쇄중합반응을 시켜 증폭시킨 다음, 전기영동 기술에 의해 밴드 형태로 검출할 수 있으며, 이들 밴드의 존재를 확인함으로써, 공시 식물 재료로부터 추출한 DNA 시료 상에 뿌리혹병에 대한 저항성 유전자가 존재 또는 부존재함을 확인할 수 있다.
또한, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자 단편은 서열번호 1 내지 3, 10 및 11의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에서는 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성을 보이는 계통과 이병성을 보이는 계통을 교배하여 얻은 F1 식물체를 자가 수정하여 분리집단 F2를 육성하고, 분리집단 F2에서 완전한 저항으로 나온 개체들과 완전한 이병으로 나온 개체들의 DNA를 풀링(pooling)한 후, 무작위로 증폭된 다형성 프라이머 (random amplified polymorphic DNA: RAPD) 혹은 다범위 핵산 프라이머 (universal rice primer: URP)를 이용한 BSA-RAPD 방법으로 DNA pool을 탐색하여 뿌리혹병 저항성 연관 분자표지를 선발하고, 상기 표지를 육성에 효율적으로 이용하기 편리한 SCAR 혹은 CAPS 표지로 전환한 후, 저항성 계통, 이병성 계통과 분리집단 F2에서 상기 표지의 저항성 형질과의 상관관계를 분석하고, 분자표지를 이용한 선발(Marker-Assisted Selection; MAS)에 대한 유용성을 검정하는 단계로 이루어진다.
본 발명의 실시예에서는 뿌리혹병에 저항성을 보이는 계통과 이병성을 보이 는 계통을 교배하여 얻은 F1 식물체를 자가 수정하여 분리집단 F2를 육성하여 뿌리혹병 저항성을 검정하였다. 그 결과, 발병지수를 통해 얻은 비율이 저항성과 이병성 개체가 394:91로 나타났다.
본 발명의 다른 실시예에서는 분리집단 F2에서 완전한 저항으로 나온 15개체, 완전한 이병으로 나온 15개체의 DNA를 풀링(pooling)한 후, DNA 지문(fingerprinting) 방법을 응용한 일괄분리분석(bulked segregant analysis, BSA) 기술을 이용하여 뿌리혹병 저항성과 연관된 분자표지를 탐색하였다. 이 결과, 저항성 bulk DNA와 이병성 bulk DNA에서 차이를 보이는 18개의 프라이머 조합을 선발하였고, 2차적으로 확인하여 재현성이 있는 것으로 확인되었으며, 이후 이들은 ECD2, ECD10, ECD12, ECD14, ECD15, ECD19, ECD20, ECD22, ECD25, ECD29, ECR31, ECR36, ECR37, ECR996, ECRq14, NCRY06, NCRU04, 및 CL3ms92로 명명하였다. 하기 내용에서는 NCRY06, NCRU04, CL3ms92 에 대한 정보만을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 무작위 프라이머(random primer)를 이용하여 선발한 분자표지를 분석이 간편한 DNA 표지로 전환하고자 저항성과 연관된 것으로 추정되는 DNA 단편을 클로닝하여 염기서열을 분석한 후, 그 표지에 특이적인 프라이머를 다시 합성하여 분석이 간편하고 재현성과 신뢰도가 높은 SCAR(sequence characterized amplified region) 표지 혹은 CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) 표지로 전환하고자 하였다. 저항성 혹은 이병성 계통에서 분석한 염기서열을 바탕으로 하여 새롭게 프라이머를 작성하였으며, 저항성과 이병성 계통에서 PCR을 수행한 결과, NCRY06의 경우는 이병 계통에서만 증폭산물을, NCRU04의 경우는 저항 계통에서만 증폭산물을, 그리고 CL3ms9R 경우는 저항 계통과 이병계통에서 동일한 크기의 증폭산물 확인 후, 제한효소 처리결과 저항 계통과 이병계통에서 서로 다른 크기의 산물을 확인할 수 있었다.
또한, 저항성 유전자와 연관된 것으로 추정되는 NCRY06, NCRU04, 및 CL3ms92 분자표지를 뿌리혹병 발병조사를 한 F2 분리집단에서 검정 후, 저항성 QTL을 동정함으로써 실제로 이들 분자표지가 저항성 유전자와 얼마나 관련이 있는지를 알아보았다. SCRA 표지와 CAPS 표지를 이용하여 뿌리혹병 발병 정도를 검정한 분리집단 F2 개체를 분석한 결과, 저항성 유전자와 가장 밀접한 연관을 보이는 것은 NCRU04, 및 CL3ms92으로 나타났다. 또한, NCRY06과 NCRU04의 경우는 DNA 워킹(Walking) 방법을 통하여 얻어진 부가 염기서열을 획득하였고, 이를 바탕으로 공우성 표지로 전환하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명에서 개발된 분자표지의 활용 선발에 대한 유용성을 검정하기 위하여 국내에서 판매중인 F1 품종에 뿌리혹병 병원균 연천균주(race 4)와 평창균주(race 11)을 접종하여 품종의 발병여부와 PCR 분석방법을 이용한 분자표지와의 유용성을 검정하였다.
본 발명은 또한, 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 선발용 프라이머 쌍을 제공한다. 상기 프라이머 쌍은 더욱 구체적으로, 서열번호 1 내지 3, 10 및 11의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자 단편 중에서 선택되는 연속 적인 염기서열, 바람직하게는 10개 이상, 보다 바람직하게는 10~24개의 연속적인 염기서열로 이루어질 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 제공하는 프라이머 쌍은 서열번호 4와 5, 서열번호 6과 7, 서열번호 8과 9, 서열번호 12와 13, 및 서열번호 14와 15로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 조합으로 이루어질 수 있다. 상기 프라이머 쌍에서, 서열번호 4 및 5는 이병 특이적이며, 서열번호 6과 7는 저항성 특이적이며, 서열번호 8과 9는 공우성의 특성을 가진다. 또한, 본 발명의 프라이머는 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 선발에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예: 부가, 결실, 치환)될 수 있다.
본 발명의 프라이머는 RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism) 등과 같이 당업계에 공지된 다양한 DNA 다형성 분석에 적합하도록 디자인될 수 있다. DAF 분석을 위해서는 5-8개의 염기로 이루어진 프라이머를 디자인하여 사용할 수 있다. 예컨대, STS 분석을 위한 프라이머는 RFLP 표지의 말단 염기서열과 일치하게 디자인할 수 있으며, SCAR 분석을 위한 프라이머는 RAPD 표지의 말단 염기서열에 입각하여 디자인할 수 있다. 또한 CAPS 분석을 위한 프라이머는 적절한 제한효소 자리가 포함되도록 디자인할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 뿌리혹병 저항성에 연관된 유전자 단편 및 상기 뿌리혹병 저항성 선발용 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 계통 선발용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 상기 유전자 단편 또는 프라이머를 이용하여 배추 뿌리혹병 저항성 식물체를 선발하는데 필요한 실험과정(예: PCR, 서던 블럿 등) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 반응 혼합물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및/또는 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하 는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 뿌리혹병 저항성에 연관된 유전자 단편 및 상기 뿌리혹병 저항성 선발용 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 이용하여 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 계통을 선발하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism) 등과 같이 당업계에 공지된 다양한 DNA 다형성 분석을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 뿌리혹병 저항성에 연관된 유전자 단편 및 상기 뿌리혹병 저항성 선발용 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 이용하여 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 품종을 육성하는 방법을 제공한다. 상기 배추과 작물은 배추, 양배추, 브로콜리, 꽃양배추, 방울양배추, 녹색꽃양배추, 갓, 유채, 무, 백람, 케일 및 이들의 조직이나 종자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 3, 10 및 11의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 함유하는 뿌리혹병 저항성 배추과 작물을 제공한다. 상기 뿌리혹병 저항성 식물체는 뿌리혹병에 대하여 저항성의 형질을 나타내는 식물체를 말하며, 배추, 양배추, 브로콜리, 꽃양배추, 방울양배추, 녹색꽃양배추, 갓, 유채, 무, 백람, 케일 및 이들의 조직이나 종자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한,
(a) 배추과 작물에서 뿌리혹병에 대한 저항성 계통과 이병성 계통을 교배하여 얻은 F1 세대를 자가 수정하여 F2 세대를 얻고, 그 개체를 육성하여 뿌리혹병을 검정하는 단계;
(b) 상기 검정 결과, 완전 저항성으로 나온 개체와 이병성으로 나온 개체의 DNA를 추출하여 PCR의 주형 DNA로 사용하고, 무작위 프라이머와 다범위핵산 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, 전기영동하여 저항성 DNA와 이병성 DNA에서 차이를 보이는 유전자 표지를 선발하는 단계;
(c) 상기 선발된 유전자 표지를 클로닝하고, 염기서열을 분석하여, 그 서열을 이용하여 표지에 특이적인 프라이머를 제작하여 PCR 반응과 제한효소 처리를 수행한 후, 전기영동하여 저항 계통과 이병 계통에서 서로 다른 크기의 산물을 확인하여, 확인된 유전자 표지의 사용 가능성과 저항성 유전자와의 상관관계를 분석하는 단계; 및
(d) 상기 확인된 특이적인 프라이머로 이루어지는 분자표지로 선발되는 뿌리혹병 저항성 품종을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 품종 육성 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 상기 (a)단계의 저항성 계통은 뿌리혹병 병원균 연천균주(race 4) 또는 평창균주(race 11)에 저항성을 보이는 유럽 순무 'ECD4' 계통일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 배추과 작물은 배추, 양배추, 브로콜리, 꽃양배추, 방울양배추, 녹색꽃양배추, 갓, 유채, 무, 백람, 케일 및 이들의 조직이나 종자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 본 발명의 뿌리혹병 저항성 품종 육성 방법에 의해 육성된 뿌리혹병 저항성 배추과 작물을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야 및 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 뿌리혹병 병원균의 race 분류
본 발명에 사용한 뿌리혹병 균주는 강원도 연천지역과 평창지역에서 수집한 균주를 이용하였다. 이들 균주의 race를 동정하기 위해 Williams법에 의해 균을 동정하였고, 결과는 하기 표 1과 같다. 이러한 결과로 보아 연천균주는 race 4, 평창 균주는 race 11인 것으로 확인이 되었다. 발병정도는 5단계의 발병지수(Disease Index, D.I)로 나누었는데, D.I 1은 병징이 전혀 나타나지 않는 개체, 병징의 진전 정도에 따라 D.I 2에서 D.I 5까지 구분하여 조사하였다.
표 1. 뿌리혹병 판별기주를 이용한 병원균의 race 동정
품종명 연천균주 평창균주
발병정도(D.I) 접종
주수		 저항성
여부		 Race
판별		 발병정도(D.I) 접종
주수		 저항성
여부		 Race
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
CR 하계 0 0 0 0 16 16 이병성

4		 16 0 0 0 0 16 저항성

11
Laurentian 0 0 3 4 9 16 이병성 0 0 2 4 10 16 이병성
Wilhelmsburger 0 1 1 3 11 16 이병성 0 1 2 2 11 16 이병성
Jersey Queen 0 1 3 5 7 16 이병성 12 4 0 0 0 16 이병성
Badger Shipper 0 1 2 7 6 16 이병성 0 2 2 6 6 16 이병성
NWCR1 15 1 0 0 0 16 저항성 16 0 0 0 0 16 저항성
실시예 2. 저항성 계통과 이병성 계통을 이용한 분리집단 F 2 육성 및 병 검정
뿌리혹병 병원균 평창균주(race 11, 강원도 평창지역에서 수집한 균주)와 연천균주(race 4, 강원도 연천지역에서 수집한 균주)에 대해서 저항성을 보이는 유럽 순무계통 'ECD4'에서 유래된 'NWCR1'과 위의 두 균에 대해 이병성을 보이는 계통 'NRB'를 교배한 F1 식물체를 자가 수정하여 분리집단 F2를 육성하였고, 이들 계통과 F2 집단에서 뿌리혹병 저항성을 검정하였다(표 2). 양친과 F1, F2 식물체를 비닐하우스의 32공 pot에서 본엽 3~4매 시기에 토양 관주법을 이용하여 뿌리혹병 병원균 race4를 접종하였고, 30일 후 발병 정도를 다섯 단계로 나누어 검정하였다.
즉, 저항성 계통, 이병성 계통, F1 그리고 F2 분리집단에서 발병정도는 5단 계의 발병지수(Disease Index, D.I)로 나누었는데, D.I 1은 병징이 전혀 나타나지 않는 개체, 병징의 진전 정도에 따라 D.I 2에서 D.I 5까지 구분하여 조사하였다.
표 2. 포장의 토양오염발병 조건에서 배추 F2 분리집단의 뿌리혹병 발병조사
발병지수 NWCR1 NRB F1 F2
D.I 1 30 0 60 394
D.I 2 0 0 0 45
D.I 3 0 0 0 11
D.I 4 0 0 0 3
D.I 5 0 30 0 32
합계 30 30 60 485
표 2에서와 같이 F1에서 병징이 전혀 나타나지 않는 것으로 보아 저항성 유전자가 우성으로 작용하는 것으로 추측할 수 있다. F2 분리집단에서는 병징이 전혀 나타나지 않은 저항성 개체와 병징이 조금이라도 나타난 이병성 개체의 비율이 394:91로 나타났다.
실시예 3. BSA 기술을 이용한 저항성 연관 분자표지 개발
분리집단 F2에서 완전한 저항(D.I 1)으로 나온 15개체, 완전한 이병(D.I 5)으로 나온 15개체의 잎에서 DNA를 각각 추출하여 저항성 및 이병성으로 대비되는 DNA의 풀(pool)을 만든 후, DNA 지문(fingerprinting)방법을 응용한 BSA(bulked segregant analysis) 기술을 이용하여 뿌리혹병 저항성과 연관된 분자표지를 탐색하였다.
전체 유전자를 분리하기 위해서 1.5㎖ 마이크로튜브(microtube)에 손톱 크기 정도의 샘플(약 0.5g)과 텅스텐 비드(tungsten bead), DNA 추출 버퍼(0.5M NaCl, 0.5% SDS, 50mM EDTA, 0.1M Tris-Cl) 400㎕와 2-머캅토에탄올 4㎕를 넣고, 퀴아젠(Qiagen)사의 분쇄기계(grinding machine)를 이용하여 곱게 갈아준 후, 10분에 한번씩 샘플을 흔들어 주면서 65℃에서 1시간동안 식물세포를 용해시켰다. 자석을 이용해 튜브에서 텅스텐 비드를 제거한 후, 5M 초산칼륨(KOAc) 130㎕를 넣고 가볍게 섞어준 다음 4℃에 10분간 방치하였다. 클로로포름:아이소아밀알콜 (Chloroform:isoamylalchol=24:1)용액을 400㎕ 첨가한 다음 실온에서 10분 동안 흔들어 준 뒤, 13,000rpm으로 10분간 원심분리 후, 상층액 100㎕를 새로운 마이크로튜브(microtube)로 옮겼다. 이소프로판올(isopropanol) 100㎕를 넣고 섞어주고 실온에 10분 정도 방치한 후, 13,000rpm에서 2분 원심분리 하였다. 침전물만 남기고 상층액을 모두 버린 후 70% 에탄올(ethanol) 1㎖를 넣고 잘 흔들어준 후, 에탄올을 제거하고 침전물을 건조시켰다. 이렇게 분리한 DNA는 리보핵산분해효소(RNase)가 들어있는 3차 증류수 200㎕에 잘 녹인 후, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 주형 DNA로 이용하였다.
저항성과 연관된 표지를 선발하기 위해, 오페론 테크놀러지(Operon Technology)사에서 구입한 10-mer 랜덤 프라이머(random primer) 720 조합, 다범위핵산 프라이머(universal rice primer, URP) 12 조합을 이용하여 BSA-RAPD 방법으로 실험을 수행하였다. RAPD 분석을 위한 중합효소 연쇄반응 조건은 제넷바이오사의 DNA 중합효소 Prime Taq Polymerase 0.5U에 10ng의 DNA를 주형, 25pmol 프라이머를 첨가하여 최종 부피를 20㎕로 하였다. 이 반응용액을 94℃에서 5분간 가열하여 변성시킨 다음, 94℃에서 30초, 37℃에서 30초, 72℃에서 2분간 45회 반복 수행 한 후, 72℃에서 10분간 최종 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 증폭된 산물을 1.5% 아가로오스 겔(agarose gel)에 전기영동하여 반응산물을 확인하였다.
다범위핵산 프라이머 조합을 이용한 반응의 경우, 모든 조건은 RAPD 분석 조건과 동일하지만, PCR 반응의 온도 조건만 변형하여 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분으로 35회 반복 수행하였다.
실험 결과 PCR 증폭산물 중에 저항성 bulk DNA와 이병성 bulk DNA에서 차이를 보이는 18개의 프라이머 조합을 선발하였고, 이들 프라이머가 재현성 있게 차이를 나타내는지를 확인하기 위해 저항성 친 NWCR1, 이병성 친 NRB, 저항성 bulk와 이병성 bulk 내에 속한 각각 15 개체를 선택하여 2차적으로 확인한 결과 재현성이 있는 것으로 나타났다. 이후 이들은 ECD2, ECD10, ECD12, ECD14, ECD15, ECD19, ECD20, ECD22, ECD25, ECD29, ECR31, ECR36, ECR37, ECR996, ECRq14, NCRY06, NCRU04, 그리고 CL3ms92으로 명명하였다. 하기 내용에서는 NCR06, NCRU04, CL3ms92 에 대한 정보만을 제공하며 3개의 프라이머 조합은 아래와 같다.
OPY06: 5'-AAGGCTCACC-3' (서열번호 1의 1~10번째 서열)
OPU04: 5'-ACCTTCGGAC-3' (서열번호 2의 1~10번째 서열)
CL3ms92-1: 5'-GCATTAACTT-3' (서열번호 3의 1~10번째 서열)
실시예 4. 저항성과 연관된 것으로 추정되는 DNA 단편의 SCAR 혹은 CAPS 표지로 전환
병 저항성과 연관된 것으로 판명된 세 개의 RAPD 표지는 PCR 조건에 따라 안 정적으로 나타나지 않을 수 있어 품종 육성을 위한 선발표지로 바로 이용하는데 있어 어려움이 발생한다. 이를 극복하기 위해 분석이 간편한 DNA 표지로 전환하고자 저항성 혹은 이병성과 연관된 것으로 추정되는 DNA 단편을 클로닝하여 염기서열을 분석한 후, 그 표지에 특이적인 프라이머를 다시 합성하여 분석이 간편하고 재현성과 신뢰도가 높은 SCAR(sequence characterized amplified region) 표지 혹은 CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) 표지로 전환하고자 하였다. 저항성 유전자와 비교적 가까이 연관된 것으로 추정되는 세 개의 DNA 단편, NCRY06, NCRU04, 그리고 CL3ms92을 아가로오스 겔에서 회수하여 pGEM-T 벡터(Promega사)에 라이게이션(ligation) 하였고, 대장균(DH5α)에 형질전환 하였다. 형질전환된 대장균을 엠피실린(ampicillin), X-gal 각각 50㎍/㎖ 함유된 배지에서 12시간 배양하여 형질전환체를 선발하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리된 플라스미드를 EcoRⅠ으로 절단하고 1.4% 아가로오스 겔에서 전기영동을 실시하여 예상되는 크기의 DNA단편이 클로닝된 재조합 클론을 확보하였고, 이들을 마크로젠사에 의뢰하여 염기서열을 분석하였으며, 뿌리혹병 저항성과 연관된 것으로 추정되는 DNA 단편의 염기서열은 하기와 같다.
A) NCRY06 DNA 단편의 염기서열 분석 결과 (서열번호 1)
Figure 112008086034418-PAT00001
B) NCRU04 DNA 단편의 염기서열 분석 결과 (서열번호 2)
Figure 112008086034418-PAT00002
C) CL3ms92 DNA 단편의 염기서열 분석 결과 (서열번호 3)
Figure 112008086034418-PAT00003
분석한 염기서열을 기초로 하여 양 말단에 해당하는 염기서열을 근간으로 하는 SCAR 표지의 프라이머를 합성하였다. NCRY06, NCRU04, 그리고 CL2ms92에서 저항 혹은 이병 계통에서 분석한 염기서열을 바탕으로 하여 새롭게 프라이머를 작성하였 고, 저항과 이병 계통에서 PCR을 수행한 결과, NCRY06의 경우는 이병 계통에서만 증폭산물을, NCRU04의 경우는 저항 계통에서만 증폭산물을 나타내었다. 그리고 CL3ms92 경우는 저항 계통과 이병계통에서 동일한 크기의 증폭산물을 확인할 수 있었으며, 제한 효소 Hinf I 처리결과 저항계통과 이병계통에서 서로 다른 크기의 산물을 확인할 수 있었다. 이렇게 새롭게 작성한 프라이머의 염기서열은 하기와 같다.
A) NCRY06의 이병 특이적인 프라이머 염기서열
Y06F1 : 5'-AAGGCTCACCAAATAACACTTC-3' (서열번호 4)
Y06R2 : 5'-AAGGCTCACCACGAAACATG-3' (서열번호 5)
B) NCRU04의 저항 특이적인 프라이머 염기서열
U04F1 : 5'-ACCTTCGGACGATCGGTATT-3' (서열번호 6)
U04R1 : 5'-ACCTTCGGACCTACTAGAAAAT-3' (서열번호 7)
C) CL3ms92의 공우성 프라이머 염기서열
CL3ms92_F3 : 5'-GCATTAACTTGCGTAACTGTGCC-3' (서열번호 8)
CL3ms92_R1 : 5'-GGTTCTTCTCTCCACCAGATTGTT-3' (서열번호 9)
SCAR 혹은 CAPS 표지로 전환하기 위해 새롭게 작성한 프라이머를 이용하여 저항계통, 이병계통, 분리집단 F2에서 검정하여 분자표지의 사용 가능성을 알아보았다. 전환된 SCAR 혹은 CAPS 표지를 검정하기 위한 중합효소 연쇄반응의 조건은 전체 20㎕ 반응용액에 주형 DNA 2㎕(약 30ng), 프라이머 10pmol, 0.125mM dNTP, 1Χ PCR 버퍼, 0.5U Prime Taq DNA 폴리머라제(GenetBio사)를 사용하여 95℃에서 5분간 preheating 시킨 후 94℃에서 30초, 52℃(NCRU04의 경우) 혹은 58℃에서 30초, 72℃에서 45초로 32회 반응하였고, 반응이 끝난 후, 증폭된 산물을 1.0% 아가로오스 겔에 전기영동하여 반응산물을 확인하였다. CL3ms92 표지의 경우는 PCR 반응을 마친 후, 제한효소 Hinf I 1U(Roche 사), 1X 반응버퍼를 사용하여 37℃에서 4시간동안 반응하였고, 반응이 끝난 후 3% 아가로스 겔에 전기영동하여 반응산물을 확인하였다.
실시예 5. 저항성과 연관된 것으로 추정되는 DNA 단편의 공우성 CAPS 표지로 전환
NCRY06의 경우 NWCR1과 NRB의 분리집단에서 NRB의 이병성에 특이적으로 증폭되어지는 표지인자이기 때문에 저항성 형질을 보이지 않는 다른 계통, 즉 NRB가 아닌 다른 이병계통을 이용한 분리집단에서 선발표지로 이용할 경우, 중합효소 연쇄반응의 증폭양상 확인 여부가 문제시 될 수 있다. 또한 NCRU04의 경우는 NWCR1과 NRB의 분리집단에서 NWCR1의 저항성에 특이적으로 증폭되어지는 표지인자로, 저항성 유전자형과 이병성 유전자형을 함께 지니는 이형접합(heterozygote) 개체와 저항성 유전자형만을 지니는 동형접합(homozygote) 개체와의 구별이 불가능하다. 이를 보완하기 위하여 DNA Walking SpeedUp TM Premix Kit(Seegene사)를 이용하여 DNA 워킹(Walking)을 하였다. DNA 워킹 방법을 이용하기 위하여 이미 알고 있는 NCRY06 혹은 NCRU04의 염기서열에서 약 100bp 이상의 간격을 두어 5'과 3' 방향으로 각각 세 가지 프라이머 (목적 특이 프라이머 1, 2, 3: TSP1, TSP2, TSP3; 제시하지 않음)를 제작하였다. 일차적으로 워킹 키트 내에 온도 조절 프라이머(Annealing Control Primer: ACPTM)와 목적유전자 특이 프라이머1(TSP1)을 이용하여 DNA walking 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라함) 증폭산물을 얻은 다음, 일차 PCR 반응액 소량을 가지고 두 번째 목적 특이 프라이머2(TSP2)로 이차 특이 증폭 산물을 얻었다. 또다시 이차 PCR 반응액을 100배 희석한 후 소량을 취하여 키트 내의 다범위 프라이머(Universal primer)와 목적 특이 프라이머 (TSP3)를 이용하여 삼차 PCR 반응을 수행하였다. 구체적인 실험방법은 Seegene사에서 제공하는 실험프로토콜에 따라 수행하였다. 이렇게 얻어진 증폭산물을 클로닝 후 염기서열을 분석하였다. 그 결과, NCRY06 경우 기존 영역보다 표지 유전자단편의 5'부위에서 1kb 남짓한 영역을, 3'부위에서 4kb 남짓한 영역의 염기서열을 분석할 수 있었다. 이들 영역에서 다양한 프라이머를 작성한 뒤 저항성, 이병성 계통에서 PCR 반응을 수행한 결과, 각각 PCR 증폭이 되면서 저항성과 이병성계통에서도 동일한 증폭산물을 나타내는 프라이머 조합을 선정할 수 있었으며, 저항에서 증폭된 PCR 증폭산물 또한 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. 이렇게 DNA walking 기술을 이용하여 분석된 이병성 계통의 염기서열과 저항친의 PCR 증폭 산물의 염기서열을 비교한 결과를 바탕으로 새로운 NCRY06 프라이머를 작성하고, 저항성과 이병성계통에서 다형성(polymorphism)을 나타낼 수 있는 제한효소 (Alu I)를 선택하였다. NCRU04 경우 는 기존 영역보다 표지 유전자단편의 3'부위에서 1kb 남짓한 영역의 염기서열을 분석할 수 있었다. 이렇게 DNA walking 기술을 이용하여 분석된 염기서열을 이용하여 NCBI에서 nucleotide blast 결과 NCRU04와 유사성을 보이는 Arabidopsis의 유전자 정보를 획득하였다. DNA walking 기술을 통하여 얻은 염기서열(약 1kb 남짓)과 Arabidopsis 유전자 정보를 통하여 분석되어진 약 2.7kb 남짓한 영역의 염기서열을 바탕으로 이들 영역에서 다양한 NCRU04 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 작성하였다. 이들 조합 중 저항성과 이병성계통의 DNA로 PCR 반응을 수행한 결과, 각각 PCR 반응이 되면서 저항성과 이병성에서 동일한 증폭산물을 나타내는 프라이머 조합을 선정하였으며, 저항성과 이병성계통에서 다형성(polymorphism)을 나타낼 수 있는 제한효소(Alu I)를 선택하였다. NCRY06과 NCRU04에 대하여 새롭게 작성된 프라이머를 이용하여 저항친, 이병친, bulk에 사용된 저항성 15개체와 이병성 15개체를 검정하였다. 이렇게 새롭게 분석한 뿌리혹병 저항성과 연관된 것으로 추정되는 DNA 단편의 염기서열과 새롭게 작성한 프라이머의 염기서열과 하기와 같다.
1) NCRY06의 DNA 단편의 염기서열 (서열번호 10)
Figure 112008086034418-PAT00004
2) NCRU04의 DNA 단편의 염기서열 (서열번호 11)
Figure 112008086034418-PAT00005
3) NCRY06의 공우성 프라이머 염기서열
NCRY06F : 5'-GAGGTCGTGGAGATACTCAC-3' (서열번호 12)
NCRY06R : 5'-CAACCACTGTTTATGTCTCTGG-3' (서열번호 13)
4)NCRU04의 공우성 프라이머 염기서열
NCRU04F : 5'-GTCGTTCATAGAGATCTCAAGCC-3' (서열번호 14)
NCRU04R : 5'-AGCGACCAGGTTTGCTCACAT-3' (서열번호 15)
새롭게 전환된 CAPS 표지 NCRY06과 NCRU04를 이용하여 저항친, 이병친, 분리집단 F2에서 검정하였다. 전환된 CAPS 표지를 검정하기 위한 PCR 반응의 조건은 전체 20㎕ 반응용액에 주형 DNA 1㎕(약 30ng), 프라이머 10pmol, 0.125mM dNTP, 1Χ PCR 버퍼, 0.5U Prime Taq DNA 폴리머라제(GenetBio 사)를 사용하여 95℃에서 5분간 preheating 시킨 후 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 45초로 32회 반응하였다. 반응이 끝난 후, 증폭된 산물을 각각 제한효소 Alu I 1U(NEB 사), 1X 반응버퍼를 사용하여 37℃에서 4시간동안 반응하였고, 반응이 끝난 후 3% 아가로스 겔에 전기영동하여 반응산물을 확인하였다.
실시예 6. 공우성 표지로 전환된 CAPS 표지의 저항성 형질과 상관관계 분석
저항성 유전자와 연관된 것으로 추정되는 ECD2, ECD10, ECD12, ECD14, ECD15, ECD19, ECD20, ECD22, ECD25, ECD29, ECR31, ECR36, ECR37, ECR996, ECRq14, NCRY06, NCRU04, 그리고 CL3ms92 CAPS 표지를 뿌리혹병을 검정한 F2 분리집단 485개체에서 검정함으로서 실제로 이들 분자표지가 저항성 형질과 얼마나 관련 있는지를 알아보았다.
18 종류의 표지와 뿌리혹병 저항성 유전자와의 연관 분석을 위하여 F2 분리집단과 양친을 분석한 후 전기영동하여 각 개체의 유전형을 조사하였다. 18 종류의 표지들을 수치화하여 컴퓨터 프로그램 MAPMAKER/EXP ver.3.0b (Whitehead Institute)을 이용하여 DNA 표지 인자에 대한 배추 뿌리혹병 상호간의 연관 관계를 분석하였다. 그 결과 18 종류의 표지 사이의 총 길이는 26.3 cM으로 매우 세밀하게 분포되었고, 이를 바탕으로 MAPMAKER/QTL ver 1.1b (Whiteheat Institute)로 QTL을 분석한 결과 CL3ms92 표지와 NCRU04 사이의 LOD 값 31.35로 매우 놓게 나타남으로써 본 연구에서 동정된 QTL은 뿌리혹병 저항성 주동유전자 내지는 주동 QTL로 추정된다.
세 종류(NCRY06, NCRU04, 그리고 CL3ms92)의 CAPS 표지를 이용하여 F2 분리집단에서 검정되어진 결과를 하기 표 3, 4, 5에 표시하였는데, 이 결과를 기초로 저항성 연관 표지를 이용하여 저항성 수준을 판단할 수 있는 정확성을 계산하였다. 즉, 저항성 계통 NWCR1에서 유래한 대립인자를 R, 이병성 계통 NRB에서 유래한 대 립인자를 r로 표현하여 각 연관 표지의 유전자형에 대한 발병지수를 알아보았다. NCRY06 표지의 유전자형이 RR인 F2 122개체의 평균 발병지수는 1.03으로 나타났고, 유전자형인 Rr인 F2 244개체의 평균 발병지수는 1.17, 유전자형이 rr인 F2 119개체의 평균 발병지수는 2.34로 나타났다. NCRU04 표지의 경우 유전자형이 RR인 F2 122개체의 평균 발병지수는 1.03으로 나타났고, 유전자형인 Rr인 F2 244 개체의 평균 발병지수는 1.17, 유전자형이 rr인 F2 119개체의 평균 발병지수는 2.34로 나타났으며, CL3ms92 표지는 유전자형이 RR인 F2 122개체의 평균 발병지수는 1.03으로 나타났고, 유전자형이 Rr인 F2 243 개체의 평균 발병지수는 1.15, 유전자형이 rr인 F2 120개체의 평균 발병지수는 2.36로 나타났다. 따라서 뿌리혹병 저항성 계통 선발에 NCRY06, NCRU04과 그리고 CL3ms92 표지를 선발표지로 이용할 경우, 저항성 유전자형 RR 과 Rr의 평균 발병지수가 1.2 이내에서 나타남으로 뿌리혹병 저항성 배추의 선발 표지로 아주 유효하다는 것을 나타내고 있으며, 어느 하나의 표지로도 저항성 배추 선발에 이용하는 것이 가능한 것으로 나타났다.
표 3. 분리집단 F2 485개체에 대한 공우성 표지 NCRY06 검정 결과
발병지수(D.I) RR Rr rr Total
1 119 216 59 394
2 2 22 21 45
3 1 2 8 11
4 0 1 2 3
5 0 3 29 32
Total 122 244 119 485
표 4. 분리집단 F2 485개체에 대한 이병성 표지 NCRU04 검정 결과
발병지수(D.I) RR Rr rr Total
1 119 216 59 394
2 2 22 21 45
3 1 2 8 11
4 0 1 2 3
5 0 3 29 32
Total 122 244 119 485
표 5. 분리집단 F2 485개체에 대한 공우성 표지 CL3ms92 검정 결과
발병지수(D.I) RR Rr rr Total
1 119 216 59 394
2 2 22 21 45
3 1 2 8 11
4 0 1 2 3
5 0 2 30 32
Total 122 243 120 485
실시예 7. CAPS 표지의 활용에 대한 유용성 검정
상기 실시예 4, 5와 6에서 획득된 CAPS 표지의 활용선발에 대한 유용성 평가를 위하여, 국내에서 판매되는 뿌리혹병 저항성 품종을 포함한 34종의 F1 배추 품종과 'NWCR1'에 대하여 뿌리혹병 병원균 연천균주(race 4) 혹은 평창균주(race 11)로 접종한 후, 실시예 4, 5와 6에서 획득된 CAPS 표지로 검정하였다. 배추품종으로는 기존에 뿌리혹병균 race 11에 저항성인 것으로 알려진 F1 품종 34종을 이용하였다. 상기 34종의 배추 품종과 ECD4, NRB와 NWCR1 은 표 6에 나타내었다.
표 6. 국내 판매용 34종의 F1 배추 품종의 뿌리혹병검정 및 마커검정 결과
품 종 발병여부 NCRY06 NCRU04 CL3ms92
race 11 race 04
1. NWCR1 저항성 저항성 RR RR RR
2. NRB 이병성 이병성 rr rr rr
3. CR으뜸 저항성 이병성 rr rr rr
4. CR맛 저항성 이병성 rr rr rr
5. 맞춤 저항성 이병성 rr rr rr
6. CR여름맛 저항성 이병성 rr rr rr
7. 쌈이랑 저항성 이병성 rr rr rr
8. CR입춘 저항성 이병성 rr rr rr
9. 대통 저항성 이병성 rr rr rr
10. 산울림 저항성 이병성 rr rr rr
11. 여름맛엇갈이 저항성 이병성 rr rr rr
12. 우리 저항성 이병성 rr rr rr
13. 겨울맛 저항성 이병성 rr rr rr
14. 추월 저항성 이병성 rr rr rr
15. 신동풍 저항성 이병성 rr rr rr
16. 겨울811 저항성 이병성 rr rr rr
17. 썬그린 저항성 이병성 rr rr rr
18. 진청 저항성 이병성 rr rr rr
19. CR동풍 저항성 이병성 rr rr rr
20. 불암플러스 저항성 이병성 Rr rr rr
21. CR청록 저항성 이병성 rr rr rr
22. 겨울강풍 저항성 이병성 Rr rr rr
23. 겨울노랑 저항성 이병성 rr rr rr
24. CR명품 저항성 이병성 rr rr rr
25. 영웅맛자랑 저항성 이병성 rr rr r1r1
26. 우황CR 저항성 이병성 rr rr rr
27. 하대장군 저항성 이병성 rr rr rr
28. CR미락쌈 저항성 이병성 rr rr rr
29. CR새신록엇갈이 저항성 이병성 rr rr rr
30. 상장군 저항성 이병성 rr rr rr
31. 영광 저항성 이병성 rr rr rr
32. 겨울진영 저항성 이병성 rr rr rr
33. CR장군 저항성 이병성 rr rr rr
34. CR농심 저항성 이병성 rr rr rr
35. 겨울여왕 저항성 이병성 rr rr r1r1
36. 동미 저항성 이병성 rr rr r1r1l
37. ECD4 저항성 저항성 RR RR RR
(R : 저항성, r: 이병성)
상기 34 종의 배추 시판 품종과 'NWCR1' 등 기타 품종에 연천균주(race 4) 혹은 평창균주(race 11)로 접종하여 발병여부를 확인하였고, 균주의 접종은 상기 실시예 2에서 기술된 것과 같이 하우스 내에서 실시하였다. 그 결과, 연천균주(race 4)와 평창균주(race 11)의 접종 결과가 달리 나타났다. 평창균주(race 11) 의 접종 결과, NRB는 이병성을 보였고, F1 저항성 배추 품종으로 알려진 34품종과 NWCR1, ECD4는 저항성으로 나타났으나, 연천균주(race 4)를 접종한 결과에서는 'NWCR1'과 ECD4를 제외하고는 모두 이병으로 나타났다. 이는 유럽순무계통 ECD4에서 유래된 'NWCR1'의 저항성 형질은 기존에 알려진 뿌리혹병 저항성으로 알려진 CR 배추 품종의 저항성과는 다른 저항성 유전자에서 유래되었으며, 기존 뿌리혹병 저항성 배추 품종보다 강한 저항성 형질임을 말해준다.
상기 37종의 식물체 DNA를 상기 실시예 3에서 기술된 것과 같이 추출하였으며 각 식물체의 DNA를 주형으로 하여 실시예 4, 5와 6에서 획득된 CAPS 표지를 이용하여 PCR 반응시켰다 (도 2).
NCRU04 표지의 검정 결과, 연천균주(race 4)를 접종하였을 경우, 병 검정 결과와 동일하게 저항성을 나타낸 'NWCR1'과 'ECD4' 계통은 저항성 동형접합 유전자형(RR)을 나타내었고, 이병성을 나타낸 시판중인 F1 배추 품종에서는 이병성 동형접합 유전자형(rr)을 나타내었다. CL3ms92 표지는 연천균주(race 4)를 접종하였을 경우, 병 검정 결과와 동일하게 저항성을 나타낸 'NWCR1'과 'ECD4' 계통은 저항성 동형접합 유전자형(RR)을 나타내었고, 이병성을 나타낸 시판중인 F1 배추 31품종에서는 이병성 동형접합 유전자형(rr)을 나타내었다. 그러나 세 품종에 대해서 증폭산물을 나타내지 않아 또 다른 형태의 이병성 동형접합의 유전자형(r1r1)을 가지는 것이 확인되었다. 즉, PCR 반응에서 증폭산물을 나타내지 않은 세 품종에 대해서도 PCR 산물을 나타내는 'NWCR1'의 저항과는 구분되어지는 것을 알 수 있다. NCRY06 표지는 연천균주(race 4)를 접종하였을 경우, 'NWCR1'과 'ECD4' 계통은 저항성 동형접합 유전자형(RR)을 나타내었고, 이병성을 나타낸 시판중인 F1 배추 품종 중에서 32품종은 이병성 동형접합 유전자형(rr)을 나타내었고, 나머지 두 품종에서는 이형접합 유전자형(Rr)을 나타내었다.
상기의 결과를 종합하면 NCRY06, NCRU04 및 CL3ms92 표지는 NWCR1의 뿌리혹병 저항성 형질을 기타 다양한 품종의 이병성 형질과 명확하게 구별할 수 있으므로 뿌리혹병 저항성 개체의 선발을 위한 분자표지로 사용하는데 매우 적합하다는 것을 알 수 있다.
실시예 8. 뿌리혹병 저항성 연관 CAPS 표지를 이용한 저항성 배추품종 육성
뿌리혹병 병원균 연천균주(race 4) 혹은 평창균주(race 11)에 저항성을 보이는 유럽 순무 계통인 'ECD4' 유래 계통인 'NWCR1'을 이용하여 뿌리혹병 저항성 품종을 육성하기 위하여 상기 실시예 4, 5와 6에서 획득된 CAPS 표지를 이용하였고, 이러한 방법으로 배추 F1 8조합을 육성하였고, 최종적으로 품종화하기 이전에 실제 저항성여부를 판단하기 위해 병 검정과 뿌리혹병 저항성 연관 CAPS 표지를 이용하여 분석하였다 (표 7). 이 결과 모든 조합에서 뿌리혹병에 대해 저항성이면서 CAPS 표지에서는 저항성 이형접합 유전자형(Rr)을 가지는 것이 확인되었다.
표 7. 배추 육성품종에서 뿌리혹병 저항성 및 CAPS 표지 검정
조합명 병 검정 CAPS 표지 검정
연천균주(race 4) 평창균주(race 11) NCRY06 NCRU04 CL3ms92
6085 저항성 저항성 Rr Rr Rr
6086 저항성 저항성 Rr Rr Rr
6087 저항성 저항성 Rr Rr Rr
6088 저항성 저항성 Rr Rr Rr
6091 저항성 저항성 Rr Rr Rr
6092 저항성 저항성 Rr Rr Rr
6093 저항성 저항성 Rr Rr Rr
6094 저항성 저항성 Rr Rr Rr
도 1은 배추의 뿌리혹병균 연천균주(race4)에 대한 저항성 유전자와 연관된 분자표지들의 연관지도와 QTL 분석결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 CAPS 표지 NCRY06, NCRU04 및 CL3ms92을 이용하여 국내에서 시판되고 있는 뿌리혹병 저항성 배추 F1 잡종 품종들에 대하여 검정한 결과로서, NCRY06(위), NCRU04(중간) 및 CL3ms92(아래) 표지의 전기영동 사진이다. 각 레인에 대한 설명은 하기와 같다: 1. NWCR1, 2. NRB, 3. CR으뜸, 4. CR맛, 5. 맞춤, 6. CR여름맛, 7. 쌈이랑, 8. CR입춘, 9. 대통, 10. 산울림, 11. 여름맛엇갈이, 12. 우리, 13. 겨울맛, 14. 추월, 15. 신동풍, 16. 겨울811, 17. 썬그린, 18. 진청, 19. 겨울여왕, 20. CR동풍, 21. 불암플러스, 22. CR청록, 23. 겨울강풍, 24. 겨울노랑, 25. CR명품, 26. 영웅맛자랑, 27. 우황CR, 28. 하대장군, 29. CR미락쌈, 30. CR새신록엇갈이, 31. 상장군, 32. 영광, 33. 겨울진영, 34. CR장군, 35．CR농심, 36. 동미
<110> NONG WOO BIO CO., LTD <120> DNA marker associated with resistance of cabbage clubroot disease and uses thereof <130> PN08245 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 626 <212> DNA <213> Brassica rapa <220> <221> gene <222> (1)..(626) <223> NCRY06 marker <400> 1 aaggctcacc aaataacact tctatggcaa aggttgcttg ggctgatgtg tgttgtccat 60 ttgaagaagg tggcttcggt ctgcgctggg ttcaggaagt aagtacagtg ttcatcctga 120 aacttatctg tcgactttct gctcactcta gctctctgtg gagaacttgg gtgaaacaat 180 atctccttcg tggtgagact ttatgggatg tgagggatat tggactaggt tcatgggttt 240 ggcgtaagat tctgaagttt cggaacctag caaagcagtt tatgcgtata gacattggag 300 atttcgggta tgtcgggatc aacagttaca gagattggtg catgtgattc atcagttccc 360 aatagaccta actgttgttg ctgctgatgg gactatgtgg taaaatggac ctgatgatta 420 tggggataag ttcttagctt cgagtatttg gcaccaggtc agacagcgta aggacaatct 480 gcaatggagt aagcttgtgt ggttctcgca gggagttccc cgctatgctt tcattacctg 540 gttagcgttt cgtgacagac tggctacagg ccatcgaact agtcgatggg gccagccaca 600 atgttgcatg tttcgtggtg agcctt 626 <210> 2 <211> 620 <212> DNA <213> Brassica rapa <220> <221> gene <222> (1)..(620) <223> NCRU04 marker <400> 2 accttcggac gatcggtatt tagtggttcg attgagattt gatcaagatt ttaccgcaag 60 gctcttcgta aaaatttttt tacgaagatt acttttcgta aaaacgttca tgctaaccta 120 attgaatttt ttctcttttt atataaaaaa aatttacaca ttctatctgt ttatctcgaa 180 agctctcatt tcagtcataa ttgatcagtc atttgacata attgggtcag tggacatgta 240 tttccaatta aatgttcgcc tgcataactt gcctgcaaca tgtgggggaa tggatgctaa 300 tatggggttc atggaaggga ttatagccga gggatatgaa ttgggtgaga acacagtgtg 360 atctgaattg gtgggagtga tgaagaagca atatgtgggg atatgctgat gactgaagct 420 tttcaactct ggtggttacc atatgttgtg atgacaacga aaatgaatcc cctacattta 480 acgacatatg tactatctta gctgagaatt tatgatcacc tgatgggttc gttgtttata 540 agctatatgt catattaaaa ccattggttt cgaagattga tgtcaatgaa gagcctatat 600 tttctagtag gtccgaaggt 620 <210> 3 <211> 739 <212> DNA <213> Brassica rapa <220> <221> gene <222> (1)..(739) <223> CL3ms92 marker <400> 3 gcattaactt gcgtaactgt gccgataaat gtgaaggaaa ttttattggc atgaagagcc 60 acgattttca tgtaatgatg tagcaactcc ttccgtttgg cttttctaga ctactaccac 120 aaaatgttta tgaagcaatt acatgtatct gttatgttag tcaattgaat taattatcat 180 tttaaatata gtatgcttat atacatacat atcttttttt tctatattta tgtaagggta 240 agtgatttct tccatgattg aagaacgaga ttactcacag tagatggtat ttaaaatttg 300 tagactaaca tatatgtgat cgtttgcaac ctcgagaaga tatttcctcc atcactttct 360 gatgttatgg aacatattct tattcatctt gcaagaaagg cctcacctcc gatgagaaaa 420 cttagaggga agagaaaata ggagtggaga agaaatacag agaaaccaaa ggtcttgcct 480 ctgatgaaca ctagtggata acagttctga ttatttgcga cttgatggac tgggtgtcaa 540 aaccagcctg atgatcgtct acacttcaca gttagagata acaccaccgc cagaggagtc 600 cccgcggcca caaacaccaa aatcgataag gaacatactc ctgcaatcct aagtcgccgc 660 aaattgtgtt gtatccccgc cgtctcacag gtccgagcac cacacataga tccgcaacaa 720 tctggtggag agaagaacc 739 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y06F1 primer <400> 4 aaggctcacc aaataacact tc 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y06R2 primer <400> 5 aaggctcacc acgaaacatg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U04F1 primer <400> 6 accttcggac gatcggtatt 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U04R1 primer <400> 7 accttcggac ctactagaaa at 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL3ms92_F3 primer <400> 8 gcattaactt gcgtaactgt gcc 23 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL3ms92_R1 primer <400> 9 ggttcttctc tccaccagat tgtt 24 <210> 10 <211> 212 <212> DNA <213> Brassica rapa <220> <221> gene <222> (1)..(212) <223> NCRY06 marker <400> 10 gaggtcgtgg agatactcac ctaaaacgtg tgtagctttt ctatcttgca cgtgtttgtc 60 attttctttg ttcttgctta gggaaatttt aattggcttt atcatactct agttactacg 120 taggttctgt gagctctctc atgttttatt atttttgcac atcacaggcc ctttcaagca 180 aatctgcttt ccagagacat aaacagtggt tg 212 <210> 11 <211> 465 <212> DNA <213> Brassica rapa <220> <221> gene <222> (1)..(465) <223> NCRU04 marker <400> 11 gtcgttcata gagatctcaa gcctgagaat ttcttgctct ccagtaaaga ggagaatgct 60 atgcttaagg caactgactt cgggttgtct gtcttcattg aagaaggtga gattctcttt 120 tcttcatctc tacgagtttt ggtaatggta aatgcatata gatagctgag ctttttagta 180 cattgatctt tgagtgaatc acttagagtc tgaaagattc atctttaata gttatgaatt 240 tggtatgtca tgttttgaat ctttaataag acttatcctt ttcttcacga gtatcatcta 300 tgttccagtg catataaaga ttaccttttt agacatcttt cttagtatat tggatcacta 360 agagtcttaa ggtatttgat agctttggta ttccaatgtt tggatgttta taagattgtc 420 atgaatgttt ttgttttgct tcatatgtga gcaaacctgg tcgct 465 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCRY06F primer <400> 12 gaggtcgtgg agatactcac 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCRY06R primer <400> 13 caaccactgt ttatgtctct gg 22 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCRU04F primer <400> 14 gtcgttcata gagatctcaa gcc 23 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCRU04R primer <400> 15 agcgaccagg tttgctcaca t 21

Claims (12)

  1. 서열번호 1 내지 3, 10 및 11의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 가지는 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성에 연관된 유전자 단편.
  2. 서열번호 1 내지 3, 10 및 11의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자 단편 중에서 선택되는 10~24개의 연속적인 염기서열로 이루어진 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 선발용 프라이머 쌍.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 4와 5, 서열번호 6과 7, 서열번호 8과 9, 서열번호 12와 13, 및 서열번호 14와 15로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 조합으로 이루어진 것을 특징으로 하는 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 선발용 프라이머 쌍.
  4. 제1항의 유전자 단편, 제2항의 프라이머 쌍 및 제3항의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 계통 선발용 키트.
  5. 제1항의 유전자 단편, 제2항의 프라이머 쌍 및 제3항의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 이용하여 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 계 통을 선발하는 방법.
  6. 제1항의 유전자 단편, 제2항의 프라이머 쌍 및 제3항의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 이용하여 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 품종을 육성하는 방법.
  7. 서열번호 1 내지 3, 10 및 11의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 함유하는 뿌리혹병 저항성 배추과 작물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 배추과 작물은 배추, 양배추, 브로콜리, 꽃양배추, 방울양배추, 녹색꽃양배추, 갓, 유채, 무, 백람, 케일 및 이들의 조직이나 종자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뿌리혹병 저항성 배추과 작물.
  9. (a) 배추과 작물에서 뿌리혹병에 대한 저항성 계통과 이병성 계통을 교배하여 얻은 F1 세대를 자가 수정하여 F2 세대를 얻고, 그 개체를 육성하여 뿌리혹병을 검정하는 단계;
    (b) 상기 검정 결과, 완전 저항성으로 나온 개체와 이병성으로 나온 개체의 DNA를 추출하여 PCR의 주형 DNA로 사용하고, 무작위 프라이머와 다범위핵산 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, 전기영동하여 저항성 DNA와 이병성 DNA에서 차이 를 보이는 유전자 표지를 선발하는 단계;
    (c) 상기 선발된 유전자 표지를 클로닝하고, 염기서열을 분석하여, 그 서열을 이용하여 표지에 특이적인 프라이머를 제작하여 PCR 반응과 제한효소 처리를 수행한 후, 전기영동하여 저항 계통과 이병 계통에서 서로 다른 크기의 산물을 확인하여, 확인된 유전자 표지의 사용 가능성과 저항성 유전자와의 상관관계를 분석하는 단계; 및
    (d) 상기 확인된 특이적인 프라이머로 이루어지는 분자표지로 선발되는 뿌리혹병 저항성 품종을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 품종 육성 방법.
  10. 제9항에 있어서, (a)단계의 저항성 계통은 뿌리혹병 병원균 연천균주(race 4) 또는 평창균주(race 11)에 저항성을 보이는 유럽 순무 'ECD4' 계통인 것을 특징으로 하는 육성 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 배추과 작물은 배추, 양배추, 브로콜리, 꽃양배추, 방울양배추, 녹색꽃양배추, 갓, 유채, 무, 백람, 케일 및 이들의 조직이나 종자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 육성 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의해 육성된 뿌리혹병 저항성 배추과 작물.
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