CN117568502A - 一种筛选油菜铝毒敏感品种的引物对及其应用和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程和作物遗传育种技术领域，具体涉及一种鉴定油菜铝毒敏感品种的引物对及其应用和方法。本发明提供的引物对，能够快速扩增油菜基因组DNA，具有灵敏度高、特异性强的特点。对利用本发明引物对扩增到的扩增产物进行酶切和电泳检测，可以快速鉴定出铝毒敏感油菜品种。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和作物遗传育种技术领域，具体涉及一种筛选油菜铝毒敏感品种的引物对及其应用和方法。
背景技术
油菜是国产食用植物油的第一大来源，2020年我国植物油自给率仅为三成，国产油料难以满足消费需求。长江流域油菜是我国乃至世界最大的油菜生产区，对保障我国食用油安全作用重大，但该区域油菜大部分生长在pH5.04～5.37的酸性红壤区，铝毒胁迫严重，仅江西省全区域酸性耕地(pH为4.5～5.5之间，平均仅为5.2)面积达237.48万hm2，占耕地总面积的84.22％。铝毒胁迫显著抑制了油菜根系生长，降低了油菜单株角果数、角果粒数等产量性状，最终造成油菜产量显著下降。过去多以施用石灰来减轻铝毒，但此方法增加了农业生产投入，对底层土壤改良效果差，长期施用还会破坏农业生态环境。当前利用不同基因型油菜对铝毒的耐性差异，通过传统育种手段或分子生物学技术培育出耐铝毒的优良品种是一条经济高效的途径。
如何快速有效筛选不同耐铝毒性油菜种质资源是利用不同基因型油菜对铝毒的耐性差异先决条件。前人的研究和实践中常以水培或盆栽试验，鉴定形态或生理指标筛选耐铝毒毒油菜，油菜萌发期鉴定其根长、芽长、鲜重、发芽率和发芽势等，油菜苗期鉴定其总根长、总根表面积、总根体积、总根尖数、主根长、根茎粗、株高、地上干质量、根干质量等，油菜成熟期鉴定其株高、根长、根茎粗、地下部干重、地上部干重；生理指标主要有叶和根中可溶性糖含量、叶和根中脯氨酸含量、SPAD等。通过形态指标和生理指标虽然能一定程度上反应不同基因型油菜的耐铝毒性，但鉴定周期长、特异性不高，而且易受环境条件影响。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种筛选油菜铝毒敏感品种的引物对及其应用和方法，鉴定油菜铝毒敏感品种。
本发明提供了一种筛选油菜铝毒敏感品种的引物对，包括正向引物和反向引物；
所述正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
本发明还提供了上述技术方案所述的引物对在鉴定油菜铝毒敏感品种中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的引物对在辅助选择铝毒敏感油菜品种中的应用。
本发明还提供了一种筛选油菜铝毒敏感品种的方法，包括下述步骤：
利用上述技术方案所述的引物对对油菜的基因组DNA进行PCR扩增，得扩增产物；
利用内切酶Cla I对所述扩增产物进行酶切，得到酶切产物；
如果酶切产物大小仅为404bp的片段，则该待测油菜样品为铝毒敏感品种。
优选的，所述PCR扩增的反应体系以25μL计，包括：1.5μL油菜基因组DNA、12.5μLPCR通用预混液、1μL正向引物、1μL反向引物和余量的水。
优选的，所述油菜基因组DNA的独立浓度为1.0ng/μL，正向引物的独立浓度为0.5μmol/L，反向引物的独立浓度为0.5μmol/L。
优选的，所述PCR扩增的扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸45s，循环32次；终72℃延伸5min；4℃保温。
优选的，所述酶切的反应体系以15μL计，由1.0μL内切酶Cla I，1.5μL 10×Buffer和12.5μL扩增产物组成。
优选的，所述内切酶Cla I的酶活为10U/μL。
优选的，所述酶切的温度为37℃，时间为150min。
本发明提供的引物对能够扩增油菜A03染色体上DNA片段，对扩增片段进行酶切，并选择琼脂糖凝胶电泳进行检测。根据酶切产物的片段大小可以鉴定油菜耐铝毒品种和铝毒敏感品种。实施例结果表明，利用本发明所述引物对扩增后酶切，若酶切产物大小仅为404bp的片段，则该待测油菜品种属于铝毒敏感品种。本发明引物对可以用于鉴定油菜鉴定铝毒敏感品种，并且辅助选择铝毒敏感油菜品种。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例2利用引物对1对18份油菜种质进行PCR扩增和酶切后的电泳检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种筛选油菜铝毒敏感品种的引物对，包括正向引物和反向引物；所述正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
在本发明中，所述正向引物的独立浓度优选为0.5μmol/L，反向引物的独立浓度优选为0.5μmol/L。
本发明SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列具体如下：
SEQ ID No.1：5’-GGAGACAAGCACCTCGGATT-3’；
SEQ ID No.2：5’-TTCGCCGCAATAGGAGAGAC-3’。
本发明前期研究发现油菜A03染色体上，在等位基因16212704处存在突变位点等位基因T/A(记为SNP-chrA03-16212704)，以SNP-chrA03-16212704前后各300bp作为靶序列，设计引物时选择序列的前200bp(1bp-200bp)和后200bp(401bp-600bp)设计引物，且引物起始位点和终止位点距突变位点相差50bp以上，即扩增片段单酶切后2片段相差50bp以上，此外，要求上述引物能够快速扩增油菜基因组DNA，具有灵敏度高、特异性强的特点。
本发明还提供了上述技术方案所述的引物对在鉴定油菜铝毒敏感品种中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的引物对在辅助选择铝毒敏感油菜品种中的应用。
本发明还提供了一种筛选油菜铝毒敏感品种的方法，包括下述步骤：
利用上述技术方案所述的引物对对油菜的基因组DNA进行PCR扩增，得扩增产物；
利用内切酶Cla I对所述扩增产物进行酶切，得到酶切产物；
如果酶切产物大小仅为404bp的片段，则该待测油菜样品为铝毒敏感品种。
本发明优选提取待检测油菜样本的基因组DNA。在本发明中，所述提取得到的基因组DNA的浓度优选为1.0ng/μL。本发明对所述提取的方法没有严格要求，采用本领域常规的基因组DNA提取方法即可。
得到所述基因组DNA后，本发明利用上述引物对对提取的基因组DNA进行PCR扩增，得扩增产物。在本发明中，所述PCR扩增的反应体系以25μL计，优选包括：1.5μL油菜基因组DNA、12.5μLPCR通用预混液、1μL正向引物、1μL反向引物和余量的水；所述PCR扩增的扩增程序优选为：95℃预变性5min；95℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸45s，循环32次；终72℃延伸5min；4℃保温。
得到所述扩增产物后，本发明利用内切酶Cla I对所述扩增产物进行酶切，得到酶切产物。在本发明中，所述所述酶切的反应体系以15μL计，优选由1.0μL内切酶Cla I，1.5μL10×Buffer和12.5μL扩增产物组成。本发明所述内切酶Cla I的酶活优选为10U/μL；所述酶切的温度优选为37℃，时间优选为150min。
得到所述酶切产物后，根据酶切产物的大小确定油菜样品的品种：如果酶切产物大小仅为404bp的片段，则该待测油菜样品为铝毒敏感品种。本发明优选对所述酶切产物进行电泳，根据电泳结果判断所述酶切产物的大小。本发明所述电泳优选包括3.0％琼脂糖凝胶。本发明对所述电泳的方式没有严格要求，采用本领域熟知的方式即可。由于在油菜A03染色体上存在多处等位基因，油菜性状受多对等位基因控制，因此在具体实施过程中，利用该引物对进行鉴定时，如果酶切产物大小仅为404bp的片段，则该待测油菜样品必然是铝毒敏感品种，但是当酶切产物大小出现275bp和129bp的片段，也不能认为该品种并非不是铝毒敏感品种，通常需要借助其他方式进行辅助鉴定。本发明提供的技术方案起到辅助鉴定的作用。
本发明根据SNP-chrA03-16212704标记对待测油菜的基因组DNA进行PCR扩增，利用Cla I对PCR扩增产物进行酶切，采用电泳对酶切产物进行检测，能够准确的区分油菜的铝毒敏感特性，可以鉴定预测油菜的耐铝毒性。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种筛选油菜铝毒敏感品种的引物对及其应用和方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
SNP-chrA03-16212704标记的开发
分别取254份甘蓝型油菜种质材料的种子，进行铝毒处理，采用根系图像分析软件WinRHIZO STD4800 LA2400等分别计算总根长(cm)、根表面积(cm2)、根平均直径(mm)、根体积(cm3)、根尖数、地上部鲜重(g)、地下部鲜重(g)和根长(cm)等，同时利用Excel和DPS对铝处理下各性状结果与对照的相对值(比值)进行统计分析，筛选不同耐铝毒性的油菜种质。提取254份材料的幼嫩叶片中的基因组DNA，利用SLAF-seq，对所有材料基因组DNA进行测序分析。基于SLAF-seq测序开发200510个SNP标记，利用TASSEL软件的一般线性模型(generallinearmodel，GLM)和混合线性模型(mix linearmodel，MLM)计算SNP标记与8个性状的关联值。本研究以1/SNP总数目的负对数(约为5.3)作为显著关联SNP的阈值。根据序列信息将与8个性状紧密连锁的SNP位点定位到油菜基因组参考物理图谱上。对每个显著SNP位点两侧各100kb区域内进行基因搜寻，并将关联区域内基因序列分别与GO、COG、KEGG、NR和SwissProt等数据库比对，获得关联区域内基因的注释信息。
结果在19个显著性相关SNP位点附近确定了30个与铝胁迫相关的候选基因，分别位于A01、A02、A03、A04、A06、A08、A09、C03和C04这9条染色体上。其中，位于A03染色体上的SNP位点如表1所示。利用http://www.Genome Resources.cns.fr/Brassicanapus/网站，提取SNP位点前后30bp的序列，将SNP及其侧翼序列不超过60bp输入软件CAPS/dCAPS标记的批量开发工具CAPS/dCAPS Designer(dCAPS(wustl.edu))。
表1油菜A03染色体上的SNP位点信息
| 染色体 | 位置 | P值 | 贡献率/％ | 等位基因 | 功能注释 |
| chrA03 | 16212704 | 3.81E-06 | 11.07％ | T/A | Inorganiciontransportandmetabolism |
由表1可以看出，油菜A03染色体上的SNP位点在16212704位置存在等位基因T/A突变，基因功能预测是无机离子运输与代谢，将该SNP位点记为SNP-chrA03-16212704。
实施例2
SNP-chrA03-16212704标记功能验证
1.基于SNP-chrA03-16212704标记的引物设计
以SNP-chrA03-16212704前后各300bp作为靶基因，设计得到如SEQ ID No.1所示的正向引物和如SEQ ID No.2所示的反向引物。
2.利用步骤1引物对18份不同耐铝毒毒和铝毒敏感油菜(具体信息如表2)的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系为25.0μL，包括1.0ng/μL的DNA模板1.5μL，0.5μmol/L的正向引物1.0μL，0.5μmol/L的反向引物1.0μL，直接PCR通用预混液12.5μL，其余用超纯水补足；PCR扩增程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸,45s，循环32次；终延伸72℃5min；4℃结束反应。
表2 18份油菜的种质信息
3.对步骤2的PCR扩增产物进行酶切，酶切体系为15.0μL，由1.0μL内切酶Cla I，1.5μL 10×Buffer(缓冲液)和12.5μLPCR扩增产物组成；酶切程序为37℃酶切150min，4℃结束反应。
4.将步骤2中18份油菜得到的PCR扩增产物混合，得到PCR扩增产物混合样，作为对照，采用3.0％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物和酶切产物进行检测，程序为U＝112V，I＝110A，F＝12W，T＝45min，电泳结果如图1所示，其中M为DNAladdermarker；CK为PCR扩增产物混合样。
根据图1可以看出，编号为5和10的铝毒敏感油菜品种的酶切产物与CK对照(PCR扩增产物混合样)的大小完全一致，仅为404bp；其余编号油菜品种的酶切产物与CK对照(PCR扩增产物混合样)的大小不同，出现275bp和129bp大小的条带。本发明SNP-chrA03-16212704与耐铝毒性呈负相关，当油菜A03染色体上16212704等位基存在T/A突变，并且为杂合突变时，油菜品种为铝毒敏感油菜品种。
根据上述实施例可以看出，本发明提供的引物对可以对含有SNP-chrA03-16212704的油菜基因组DNA进行特异性扩增，对扩增产物进行密切和电泳验证可以区分油菜耐铝毒和铝毒敏感品种。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种筛选油菜铝毒敏感品种的引物对，其特征在于，包括正向引物和反向引物；
所述正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQID No.2所示。
2.权利要求1所述的引物对在鉴定油菜铝毒敏感品种中的应用。
3.权利要求1所述的引物对在辅助选择铝毒敏感油菜品种中的应用。
4.一种筛选油菜铝毒敏感品种的方法，其特征在于，包括下述步骤：
利用权利要求1所述的引物对对油菜的基因组DNA进行PCR扩增，得扩增产物；
利用内切酶ClaI对所述扩增产物进行酶切，得到酶切产物；
如果酶切产物大小仅为404bp的片段，则该待测油菜样品为铝毒敏感品种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系以25μL计，包括：1.5μL油菜基因组DNA、12.5μLPCR通用预混液、1μL正向引物、1μL反向引物和余量的水。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述油菜基因组DNA的独立浓度为1.0ng/μL，正向引物的独立浓度为0.5μmol/L，反向引物的独立浓度为0.5μmol/L。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸45s，循环32次；终72℃延伸5min；4℃保温。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶切的反应体系以15μL计，由1.0μL内切酶ClaI，1.5μL10×Buffer和12.5μL扩增产物组成。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述内切酶ClaI的酶活为10U/μL。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酶切的温度为37℃，时间为150min。
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