CN117248054A - 结球甘蓝的kasp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了结球甘蓝的KASP分子标记及其应用，所述KASP分子标记至少包括66个分子标记中的一个，其基于结球甘蓝基因组和重测序KASP技术，开发了一组结球甘蓝的KASP引物，根据所开发的SNP位点以及设计的引物可以构建所选群体的DNA指纹图谱、品种鉴定及种子纯度鉴定等实验，实现对结球甘蓝种质资源和种子纯度的快速、准确、有效地鉴定。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种结球甘蓝的KASP分子标记及其应用。
背景技术
结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)简称甘蓝，又名卷心菜、包菜、圆白菜等，是十字花科芸薹属植物。结球甘蓝在产量、抗病性、抗逆性等性状上具有明显的杂种优势，其适应性广、容易栽培。结球甘蓝先天具备防外界污染生长特性(叶片从里面充实形成叶球，食用部分不接触PM2.5和农药等)，而且富含萝卜硫素及维生素，成为安全保健蔬菜的新宠。随着市场需求不断地扩大，国内育种学家也培育出了大量结球甘蓝优良品种，但是伴随着栽培面积的不断扩大，市场上同名异物及同物异名的情况时有发生，甚至一些不合格种子混入市场造成重大经济损失，因此对结球甘蓝品种进行快速准确鉴定对于假种辨别和解决产权纠纷具有重要作用。
近年来，随着分子标记技术的迅速发展，使品种鉴定以及种子纯度鉴定进入了DNA水平，因其具有较高的准确性、稳定性和重复性，为作物品种纯度分析提供了更为准确、可靠的结果。RFLP标记在于呈现共显性，能够区分纯合型和杂合型，在基因组中应用范围广泛但其DNA模板量需求过大，操作过程技术难度较高，多态性的灵敏程度不高且检测时必须用到放射性元素对环境造成污染。SSR标记是共显性标记可鉴别纯合型和杂合型，所需的DNA样品量少，对DNA的要求不高，操作简单，可靠性强，具有大量的等位差异性，无需使用放射性同位素，但必须明确重复基序两端的DNA序列，如果不能直接在DNA数据库中查找到则需要再次进行测序，成本高。KASP-SNP标记是由KASP技术转化后用于植物遗传育种的一种SNP标记，具有数量丰富、密度高、遗传相对稳定、精确性和效率更高、在基因组中分布范围广以及易于实行自动化、规模化的分析等优势。KASP技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels插入和缺失，采用2个荧光探针、2个通用淬灭探针再加多个位点特异探针来检测多个SNP位点，采用全自动荧光定量PCR平台，读取数据，进行基因分型。准确性KASP的特异性引物片段长度通常为24～26bp，相比较一般采取8～12bp长度的Taqman探针会有更高的特异性，SNP的准确性也会更高。在进行配制KASP反应体系时，只需要加入非常少量的样本DNA，100ng/μL的样本DNA在配制10μL的反应体系时只需要加入1μL，通过减少试剂的消耗进而极大的减少成本，而且反应不需要进行常规的凝胶电泳，在试验结束时就可以观察到基因的分型情况。KASP检测平台也可以同时检测大量位点少量样本或者少量位点大量样本等低、中、高通量研究以及单个实验。
发明内容
解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种结球甘蓝的KASP分子标记及其应用，能够实现对结球甘蓝种质资源和种子纯度快速、准确、有效地鉴定。
技术方案：第一方面，本发明提供结球甘蓝的KASP分子标记，至少包括以下分子标记中的一个：A01_3506256C/T、A01_4478950G/A、A01_13487469C/T、A01_45480665C/T、A01_45480754G/A、A01_47782860G/A、A01_49602601G/A、A02_1646465 T/C、A02_2701397A/G、A02_3588799 T/C、A02_5472884 T/C、A02_6754191 T/C、A02_8170488 C/T、A02_8577597A/G、A02_25765112 C/T、A02_27723784 A/G、A02_54382820 G/A、A02_60887873 T/C、A02_62939305 T/C、A03_658792 A/G、A03_3674009G/T、A03_7523159A/G、A03_13206072G/T、A03_23182211G/A、A03_23661296T/G、A03_26267190A/C、A03_37245547A/C、A03_39934962G/A、A03_40171446T/C、A03_56848398A/C、A03_59695342C/T、A03_70680880A/G、A03_71281875G/C、A03_73943203A/G、A03_74166647C/A、A04_13574311T/A、A04_14532614T/C、A04_14736752C/G、A04_20364491G/A、A04_41986068C/T、A04_44208668A/G、A04_51845506A/G、A04_61656529A/T、A05_77862A/C、A05_623182A/G、A05_1289306T/C、A05_1462172G/A、A05_1694631G/A、A05_2305280G/A、A05_2440106C/A、A06_3486253T/G、A06_17690070C/T、A06_42103611G/A、A06_46343090C/G、A07_6620428C/A、A07_32454643C/T、A07_41016927A/G、A07_51533735G/A、A08_7407835T/A、A08_29623285T/C、A08_33137814C/G、A08_46221340A/G、A09_10486561C/T、A09_22374163G/A、A09_54887251C/A和A09_63174459G/T。
第二方面，一种用于检测第一方面所述的结球甘蓝的KASP分子标记的引物对，至少包括一下引物对中的一个：
所述A01_3506256 C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.1所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.2所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.3所示；所述A01_4478950 G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.4所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.5所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.6所示；所述A01_13487469C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.7所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.8所示，下游引物R的序列如SEQ IDNo.9所示；所述A01_45480665C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.10所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.11所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.12所示；所述A01_45480754 G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.13所示，上游引物F2的序列如SEQID No.14所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.15所示；所述A01_47782860G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.16所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.17所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.18所示；所述A01_49602601 G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ IDNo.19所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.20所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.21所示；所述A02_1646465 T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.22所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.23所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.24所示；所述A02_2701397A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.25所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.26所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.27所示；所述A02_3588799 T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.28所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.29所示，下游引物R的序列如SEQ IDNo.30所示；所述A02_5472884 T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.31所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.32所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.33所示；所述A02_6754191 T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.34所示，上游引物F2的序列如SEQID No.35所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.36所示；所述A02_8170488 C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.37所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.38所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.39所示；所述A02_8577597 A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ IDNo.40所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.41所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.42所示；所述A02_25765112C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.43所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.44所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.45所示；所述A02_27723784A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.46所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.47所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.48所示；所述A02_54382820G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.49所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.50所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.51所示；所述A02_60887873T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.52所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.53所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.54所示；所述A02_62939305T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.55所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.56所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.57所示；所述A03_658792A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.58所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.59所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.60所示；所述A03_3674009G/T引物对的上游引物F1的序列如SEQID No.61所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.62所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.63所示；所述A03_7523159A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.64所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.65所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.66所示；所述A03_13206072G/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.67所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.68所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.69所示；所述A03_23182211G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.70所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.71所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.72所示；所述A03_23661296T/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.73所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.74所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.75所示；所述A03_26267190A/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.76所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.77所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.78所示；所述A03_37245547A/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.79所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.80所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.81所示；所述A03_39934962G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.82所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.83所示，下游引物R的序列如SEQ IDNo.84所示；所述A03_40171446T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.85所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.86所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.87所示；所述A03_56848398A/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.88所示，上游引物F2的序列如SEQID No.89所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.90所示；所述A03_59695342C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.91所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.92所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.93所示；所述A03_70680880A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ IDNo.94所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.95所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.96所示；所述A03_71281875G/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.97所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.98所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.99所示；所述A03_73943203A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.100所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.101所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.102所示；所述A03_74166647C/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.103所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.104所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.105所示；所述A04_13574311T/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.106所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.107所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.108所示；所述A04_14532614T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.109所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.110所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.111所示；所述A04_14736752C/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.112所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.113所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.114所示；所述A04_20364491G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.115所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.116所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.117所示；所述A04_41986068C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.118所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.119所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.120所示；所述A04_44208668A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.121所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.122所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.123所示；所述A04_51845506A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.124所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.125所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.126所示；所述A04_61656529A/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.127所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.128所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.129所示；所述A05_77862A/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.130所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.131所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.132所示；所述A05_623182A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.133所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.134所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.135所示；所述A05_1289306T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.136所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.137所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.138所示；所述A05_1462172G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.139所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.140所示，下游引物R的序列如SEQ IDNo.141所示；所述A05_1694631G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.142所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.143所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.144所示；所述A05_2305280G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.145所示，上游引物F2的序列如SEQID No.146所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.147所示；所述A05_2440106C/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.148所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.149所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.150所示；所述A06_3486253T/G引物对的上游引物F1的序列如SEQID No.151所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.152所示，下游引物R的序列如SEQ IDNo.153所示；所述A06_17690070C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.154所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.155所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.156所示；所述A06_42103611G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.157所示，上游引物F2的序列如SEQID No.158所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.159所示；所述A06_46343090C/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.160所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.161所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.162所示；所述A07_6620428C/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.163所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.164所示，下游引物R的序列如SEQ IDNo.165所示；所述A07_32454643C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.166所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.167所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.168所示；所述A07_41016927A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.169所示，上游引物F2的序列如SEQID No.170所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.171所示；所述A07_51533735G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.172所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.173所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.174所示；所述A08_7407835T/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.175所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.176所示，下游引物R的序列如SEQ IDNo.177所示；所述A08_29623285T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.178所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.179所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.180所示；所述A08_33137814C/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.181所示，上游引物F2的序列如SEQID No.182所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.183所示；所述A08_46221340A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.184所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.185所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.186所示；所述A09_10486561C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.187所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.188所示，下游引物R的序列如SEQ IDNo.189所示；所述A09_22374163G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.190所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.191所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.192所示；所述A09_54887251C/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.193所示，上游引物F2的序列如SEQID No.194所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.195所示；所述A09_63174459G/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.196所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.197所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.198所示。
第三方面，本发明提供一种用于鉴定结球甘蓝的试剂盒，至少包括第二方面所述的引物对中的一对。
第四方面，本发明提供第二方面所述的引物对在构建结球甘蓝种质资源指纹图谱中的应用。
第五方面，本发明提供第二方面所述的引物对在鉴定结球甘蓝品种中的应用。
第六方面，本发明提供第二方面所述的引物对在鉴定结球甘蓝父母本与子代差异中的应用。
第七方面，本发明提供第二方面所述的引物对在鉴定结球甘蓝种子纯度中的应用。
有益效果：本发明基于结球甘蓝基因组和重测序KASP技术，开发了一组用于结球甘蓝鉴定的核心SNP标记，可实现对结球甘蓝种质资源、杂交种纯度等快速、准确、有效地鉴定。
附图说明
图1为A01:13487469的KASP分子标记在66份结球甘蓝种质资源中的多态性图谱；
图2为A02:27723784的KASP分子标记在66份结球甘蓝种质资源中的多态性图谱；
图3为33份结球甘蓝品种SNP-DNA指纹图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明：
实施例1
1、KASP标记的开发
KASP分子标记开发步骤：参考甘蓝基因组(http://brassicadb.cn/#/Download/下的Brassica_Genome_data/Braol_JZS_V2.0//)与重测序数据进行比对，经过vcftools(版本：0.1.16)进行过滤，参数设置为平均深度5X及以上，标记质量值30以上，最小完整度0.7以上，最小等位基因频率0.05，双等位标记等；多态信息含量0.2及以上，期望杂合度0.2以上等；用RepeatMasker(版本：4.1.0)标记基因组重复序列，去除重复序列上的SNP标记；截取SNP标记上下游各50bp序列，然后使用blast软件(版本：2.10.1+)把序列比对参考基因组，去除比对上2个(包括原有位置)及2个以上位置的标记；引物设计软件primer3(版本：2.4.0)固定上游引物位置，并设计引物；每隔2Mb选取一个标记，保证每条染色体标记数量超过5对，然后实验检测KASP分子标记成功率。引物编号、SNP位置与等位基因如下表1所示：
表1 66个核心SNP位点的相关信息
| 引物对编号 | 染色体 | SNP物理位置 | 等位基因 | 引物对编号 | 染色体位置 | SNP物理位置 | 等位基因 |
| SNP01 | A01 | 3506256 | C：T | SNP34 | A03 | 73943203 | A：G |
| SNP02 | A01 | 4478950 | G：A | SNP35 | A03 | 74166647 | C：A |
| SNP03 | A01 | 13487469 | C：T | SNP36 | A04 | 13574311 | T：A |
| SNP04 | A01 | 45480665 | C：T | SNP37 | A04 | 14532614 | T：C |
| SNP05 | A01 | 45480754 | G：A | SNP38 | A04 | 14736752 | C：G |
| SNP06 | A01 | 47782860 | G：A | SNP39 | A04 | 20364491 | G：A |
| SNP07 | A01 | 49602601 | G：A | SNP40 | A04 | 41986068 | C：T |
| SNP08 | A02 | 1646465 | T：C | SNP41 | A04 | 44208668 | A：G |
| SNP09 | A02 | 2701397 | A：G | SNP42 | A04 | 51845506 | A：G |
| SNP10 | A02 | 3588799 | T：C | SNP43 | A04 | 61656529 | A：T |
| SNP11 | A02 | 5472884 | T：C | SNP44 | A05 | 77862 | A：C |
| SNP12 | A02 | 6754191 | T：C | SNP45 | A05 | 623182 | A：G |
| SNP13 | A02 | 8170488 | C：T | SNP46 | A05 | 1289306 | T：C |
| SNP14 | A02 | 8577597 | A：G | SNP47 | A05 | 1462172 | G：A |
| SNP15 | A02 | 25765112 | C：T | SNP48 | A05 | 1694631 | G：A |
| SNP16 | A02 | 27723784 | A：G | SNP49 | A05 | 2305280 | G：A |
| SNP17 | A02 | 54382820 | G：A | SNP50 | A05 | 2440106 | C：A |
| SNP18 | A02 | 60887873 | T：C | SNP51 | A06 | 3486253 | T：G |
| SNP19 | A02 | 62939305 | T：C | SNP52 | A06 | 17690070 | C：T |
| SNP20 | A03 | 658792 | A：G | SNP53 | A06 | 42103611 | G：A |
| SNP21 | A03 | 3674009 | G：T | SNP54 | A06 | 46343090 | C：G |
| SNP22 | A03 | 7523159 | A：G | SNP55 | A07 | 6620428 | C：A |
| SNP23 | A03 | 13206072 | G：T | SNP56 | A07 | 32454643 | C：T |
| SNP24 | A03 | 23182211 | G：A | SNP57 | A07 | 41016927 | A：G |
| SNP25 | A03 | 23661296 | T：G | SNP58 | A07 | 51533735 | G：A |
| SNP26 | A03 | 26267190 | A：C | SNP59 | A08 | 7407835 | T：A |
| SNP27 | A03 | 37245547 | A：C | SNP60 | A08 | 29623285 | T：C |
| SNP28 | A03 | 39934962 | G：A | SNP61 | A08 | 33137814 | C：G |
| SNP29 | A03 | 40171446 | T：C | SNP62 | A08 | 46221340 | A：G |
| SNP30 | A03 | 56848398 | A：C | SNP63 | A09 | 10486561 | C：T |
| SNP31 | A03 | 59695342 | C：T | SNP64 | A09 | 22374163 | G：A |
| SNP32 | A03 | 70680880 | A：G | SNP65 | A09 | 54887251 | C：A |
| SNP33 | A03 | 71281875 | G：C | SNP66 | A09 | 63174459 | G：T |
2、KASP引物对的合成
依据开发的SNP位点转化为KASP引物，引物对编号为SNP01-SNP66，引物共分布在9条染色体上，每一条染色体上设置至少4个引物对，每个KASP引物对组合用于扩增对应的SNP标记。每个引物对都由两个正向引物F1和F2以及一条反向引物R构成，共计198条引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.198所示：
SEQ ID No.1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTtcacctatggcaatgagaacttctagaagC，SEQID No.2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTtcacctatggcaatgagaacttctagaagT，SEQ ID No.3：gatgttgaatctatgattgctctctgtt；
SEQ ID No.4：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgggagacattgttagagataataatggaG，SEQ IDNo.5：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgggagacattgttagagataataatggaA，SEQ ID No.6：tagattgctcaacttcaagaccataatg；
SEQ ID No.7：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTggaagccccttcttgtcgcttC，
SEQ ID No.8：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTggaagccccttcttgtcgcttT，
SEQ ID No.9：gagggttcacaacaagggtca；
SEQ ID No.10：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcctggaggaagcactgcactC，
SEQ ID No.11：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcctggaggaagcactgcactT，
SEQ ID No.12：gtcagaagctcgcagcaaag；
SEQ ID No.13：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgtgttggataaacgttatgacacgaaggG，SEQID No.14：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgtgttggataaacgttatgacacgaaggA，SEQ ID No.15：atttcaactcctcaactctcttcttcta；
SEQ ID No.16：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcagatctcgaacctgcaatcatctgG，
SEQ ID No.17：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcagatctcgaacctgcaatcatctgA，
SEQ ID No.18：ttttatcctgtacggttcccttgat；
SEQ ID No.19：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgatactcttctgtaagccttcggtgatG，
SEQ ID No.20：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgatactcttctgtaagccttcggtgatA，
SEQ ID No.21：taatggatcaagattcatcagggatgt；
SEQ ID No.22：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTctggatccagtcacttgtaggaT，
SEQ ID No.23：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTctggatccagtcacttgtaggaC，
SEQ ID No.24：gcagacagactcagaggtcatc；
SEQ ID No.25：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgatagcttgttcattgaccgaactgcA，
SEQ ID No.26：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgatagcttgttcattgaccgaactgcG，
SEQ ID No.27：agagcaatacaatgtaacagcaactc；
SEQ ID No.28：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTactcctgctttcagacagctttcttT，
SEQ ID No.29：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTactcctgctttcagacagctttcttC，
SEQ ID No.30：cctgaaatggagatctactcactgt；
SEQ ID No.31：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcgctgttgtggttgaagcctttT，
SEQ ID No.32：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcgctgttgtggttgaagcctttC，
SEQ ID No.33：cctttcatcttcctcacggtca；
SEQ ID No.34：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTtactgtggccaacgttatgcatcaT，
SEQ ID No.35：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTtactgtggccaacgttatgcatcaC，
SEQ ID No.36：agaagacaaagaatggccatcttg；
SEQ ID No.37：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTccatcctccatcgttgcctctcC，
SEQ ID No.38：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTccatcctccatcgttgcctctcT，
SEQ ID No.39：catgatcgactgctccacacta；
SEQ ID No.40：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTggaacctaatttgaacccctttgagcA，
SEQ ID No.41：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTggaacctaatttgaacccctttgagcG，
SEQ ID No.42：ccatgttatggttgtcaaaagcattc；
SEQ ID No.43：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTtggaacagatttctccgcctC，
SEQ ID No.44：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTtggaacagatttctccgcctT，
SEQ ID No.45：tcccggagaaggaggagaag；
SEQ ID No.46：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTtgattatgaaacctgccaaacttgttgaA，
SEQ ID No.47：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTtgattatgaaacctgccaaacttgttgaG，
SEQ ID No.48：caccagatagactgtgaattggaataag；
SEQ ID No.49：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgttcactagttcctggaattgaaagagcG，
SEQ ID No.50：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgttcactagttcctggaattgaaagagcA，
SEQ ID No.51：acaccgagagtatgtaaatatgtgtact；
SEQ ID No.52：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcgttgaatacagcgtgtctaagcagT，
SEQ ID No.53：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcgttgaatacagcgtgtctaagcagC，
SEQ ID No.54：tgttacaactgttttccctttgctt；
SEQ ID No.55：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcctagagggagtgttgctgctatagT，
SEQ ID No.56：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcctagagggagtgttgctgctatagC，
SEQ ID No.57：caatctcagatgaaaagtcacctgt；
SEQ ID No.58：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTggcaacgttggagtggaaaggA，
SEQ ID No.59：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTggcaacgttggagtggaaaggG，
SEQ ID No.60：acgtacctgagaccagaagga；
SEQ ID No.61：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTatcaccaatctgcaaactatagtggaaacG，
SEQ ID No.62：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTatcaccaatctgcaaactatagtggaaacT，
SEQ ID No.63：gaaactagtctacatgaacttgatcagtg；
SEQ ID No.64：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTtagaccaatccaaagaagacggcaA，
SEQ ID No.65：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTtagaccaatccaaagaagacggcaG，
SEQ ID No.66：aaatcttcaagaaccgggcaattt；
SEQ ID No.67：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgcctaaacagccacacagactgaG，
SEQ ID No.68：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgcctaaacagccacacagactgaT，
SEQ ID No.69：taagaagtatcctccctctcccg；
SEQ ID No.70：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTtctctgagataaggccggtggaaG，
SEQ ID No.71：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTtctctgagataaggccggtggaaA，
SEQ ID No.72：ggaaccagattgtttaccaaggg；
SEQ ID No.73：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgcctcttgaaactcctaacacatcaT，
SEQ ID No.74：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgcctcttgaaactcctaacacatcaG，
SEQ ID No.75：gtaaaaagacggcgggatcatatg；
SEQ ID No.76：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTtaaagattcgtgagatgaataggaaccgtA，
SEQ ID No.77：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTtaaagattcgtgagatgaataggaaccgtC，
SEQ ID No.78：accaatatcatctcttcttgctctaaga；
SEQ ID No.79：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgaacaagcgacctgagagcgtaA，
SEQ ID No.80：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgaacaagcgacctgagagcgtaC，
SEQ ID No.81：ctcaagctaagaacctgcatgc；
SEQ ID No.82：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgccaaagcagttatcgtaaaaggcaG，
SEQ ID No.83：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgccaaagcagttatcgtaaaaggcaA，
SEQ ID No.84：tgtaacaacccgaagctctaatact；
SEQ ID No.85：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTctcattgcaacactttgtaggagacgT，
SEQ ID No.86：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTctcattgcaacactttgtaggagacgC，SEQ IDNo.87：tctgactctcattggcttcatcttta；
SEQ ID No.88：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTggcaatcagcttatctctcaactctgtA，SEQ IDNo.89：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTggcaatcagcttatctctcaactctgtC，SEQ ID No.90：atgtattagggtccaggactctagtaa；
SEQ ID No.91：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcagtccctgagtagcctctgatatctC，
SEQ ID No.92：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcagtccctgagtagcctctgatatctT，
SEQ ID No.93：tctcaaggaaatcaagaatttggtgg；
SEQ ID No.94：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgaatgaaactacattttcgccaaaccttA，SEQID No.95：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgaatgaaactacattttcgccaaaccttG，SEQ ID No.96：catctatgaaggaaaagaacctcttcag；
SEQ ID No.97：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcctttaagtccaagtgttccaagcaacT，SEQ IDNo.98：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcctttaagtccaagtgttccaagcaacG，SEQ ID No.99：tcattatatctatggaggacaggcatc；
SEQ ID No.100：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTccagatgtatgaaccgagtggatcG，SEQ IDNo.101：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTccagatgtatgaaccgagtggatcA，SEQ ID No.102：gaagtcacccagatcgaaaaactc；
SEQ ID No.103：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcttaggccgtatctcactcgacaC，
SEQ ID No.104：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcttaggccgtatctcactcgacaA，
SEQ ID No.105：aactgtcaaaaggatgcttctgc；
SEQ ID No.106：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgagagaacatggaagattttattagctcT，SEQID No.107：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgagagaacatggaagattttattagctcA，SEQ ID No.108：accaagccctacttcaatgtctattata；
SEQ ID No.109：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTagtgctgctgcgactaaccaT，
SEQ ID No.110：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTagtgctgctgcgactaaccaC，
SEQ ID No.111：tgtctcaacgcctttgctga；
SEQ ID No.112：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgcttcattaggtaccacccactgaC，
SEQ ID No.113：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgcttcattaggtaccacccactgaG，
SEQ ID No.114：ttgtatcactctggatcttggcaa；
SEQ ID No.115：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcataaggtttagcagcagtgtccaaaG，SEQ IDNo.116：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcataaggtttagcagcagtgtccaaaA，SEQ ID No.117：ctactaggtaaacgtccattagctga；
SEQ ID No.118：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcctcaactgcagtatgagtcgaagatataC，SEQID No.119：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcctcaactgcagtatgagtcgaagatataT，SEQ ID No.120：agtatcctagaagaaaccaaactcacttc；
SEQ ID No.121：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTaactccggtgggtgaagaagaatcA，SEQ IDNo.122：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTaactccggtgggtgaagaagaatcG，SEQ ID No.123：tgtgtctgtctgaattcaaaaccg；
SEQ ID No.124：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTctcaagcagtagataaaatgggaaagggaA，
SEQ ID No.125：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTctcaagcagtagataaaatgggaaagggaG，
SEQ ID No.126：cttttcttgtctgagagaagaatctgttc；
SEQ ID No.127：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcagcgaaagatccctccgtcaA，
SEQ ID No.128：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcagcgaaagatccctccgtcaT，
SEQ ID No.129：tcccaagtcaacgttcaggag；
SEQ ID No.130：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTttggggatctccagacatagagtaggA，
SEQ ID No.131：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTttggggatctccagacatagagtaggC，
SEQ ID No.132：cttgactatcgatcctatggttccat；
SEQ ID No.133：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcttatatcttccagcttcaaagactacaA，
SEQ ID No.134：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcttatatcttccagcttcaaagactacaG，
SEQ ID No.135：ctaattatgattgcgctttgagagtact；
SEQ ID No.136：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcttctcggggcattgctatttttcatT，
SEQ ID No.137：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcttctcggggcattgctatttttcatC，
SEQ ID No.138：ctacagtagaaaaagttgcagggaag；
SEQ ID No.139：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgcaaaatcgatgataataatcgggtggagG，
SEQ ID No.140：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgcaaaatcgatgataataatcgggtggagA，
SEQ ID No.141：gaagagtagtaacctggacaaaatagtct；
SEQ ID No.142：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcaagacttaccaggaggagtgccG，
SEQ ID No.143：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcaagacttaccaggaggagtgccA，
SEQ ID No.144：ggcatgttctacacaagtatgcg；
SEQ ID No.145：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTttttgtctgatgattctgaacgttcgacG，
SEQ ID No.146：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTttttgtctgatgattctgaacgttcgacA，
SEQ ID No.147：gttctatcaatctacgagaaacctgatg；
SEQ ID No.148：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgatctccctctccatctccccC，
SEQ ID No.149：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgatctccctctccatctccccA，
SEQ ID No.150：tcacttctttcactggcagca；
SEQ ID No.151：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTcttgagagacgaagcttgagagaagaaT，
SEQ ID No.152：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTcttgagagacgaagcttgagagaagaaG，
SEQ ID No.153：aatctcagacatctcaaactctctctc；
SEQ ID No.154：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTtccggtgggaaacttgaaaaaggtC，
SEQ ID No.155：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTtccggtgggaaacttgaaaaaggtT，
SEQ ID No.156：ctacatcaatacaaccaaccgagc；
SEQ ID No.157：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTggagatttctctggtggtctggaacG，
SEQ ID No.158：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTggagatttctctggtggtctggaacA，
SEQ ID No.159：gcttaactttccagtttccttcgaa；
SEQ ID No.160：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgttagagagacagcctcccagcC，
SEQ ID No.161：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgttagagagacagcctcccagcG，
SEQ ID No.162：tcactgcatctcgtgagttctc；
SEQ ID No.163：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgaagcaaacgtagccaaagacaaagaaC，
SEQ ID No.164：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgaagcaaacgtagccaaagacaaagaaA，
SEQ ID No.165：tccttaagaaatttttgggctaggaac；
SEQ ID No.166：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTctcgagtcactcaatttggcaaacaaC，
SEQ ID No.167：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTctcgagtcactcaatttggcaaacaaT，
SEQ ID No.168：agagagaggattgtactctagaacca；
SEQ ID No.169：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTtgttggtaggtctccatcgatttcttcA，
SEQ ID No.170：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTtgttggtaggtctccatcgatttcttcG，
SEQ ID No.171：aaaggtcactcaagaaaagaagaaagg；
SEQ ID No.172：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTacatcccaacaagtcaccgtccG，
SEQ ID No.173：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTacatcccaacaagtcaccgtccA，
SEQ ID No.174：ggtagtaactgagcacgtgaca；
SEQ ID No.175：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTaaattgaagacgttagtagctcaccaagaT，SEQID No.176：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTaaattgaagacgttagtagctcaccaagaA，SEQ ID No.177：gctcataatactccaccactgatactatt；
SEQ ID No.178：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTatccaatgcctgtgatgttagcaaagT，
SEQ ID No.179：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTatccaatgcctgtgatgttagcaaagC，SEQ IDNo.180：cttgttgctcaacttgtaagaactct；
SEQ ID No.181：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgataaccagaggagccgtaccgC，
SEQ ID No.182：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgataaccagaggagccgtaccgG，
SEQ ID No.183：tagccatggagcatcttttcga；
SEQ ID No.184：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTtcgagaaagaaacagaatagaagaatggcA，
SEQ ID No.185：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTtcgagaaagaaacagaatagaagaatggcG，
SEQ ID No.186：ctacaagactctagttcctaccagttaaa；
SEQ ID No.187：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTccatcatctttgtctcttcgacttctactC，SEQID No.188：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTccatcatctttgtctcttcgacttctactT，SEQ ID No.189：atgaatttttcccatcaatcatacaggg；
SEQ ID No.190：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTgcgaaaacacccaactcgccG，
SEQ ID No.191：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTgcgaaaacacccaactcgccA，
SEQ ID No.192：agtcgacagcggagacaatg；
SEQ ID No.193：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTtgaagatgaccagtccgcaagtttC，
SEQ ID No.194：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTtgaagatgaccagtccgcaagtttA，
SEQ ID No.195：ccaacagcactgaacttctcaatt；
SEQ ID No.196：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTggtcccagcgaggaaagcaaG，
SEQ ID No.197：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTggtcccagcgaggaaagcaaT，
SEQ ID No.198：gtcgataaatggactggagctg。
KASP技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels插入和缺失，采用2个荧光探针、2个通用淬灭探针再加多个位点特异探针来检测多个SNP位点，采用全自动荧光定量PCR平台，读取数据，进行基因分型。在反应体系中主要成分为Primer Mix，它是由两条末端碱基不同的等位基因正向引物以及一条通用反向引物构成，两条正向引物5’端分别由不同序列的检测引物序列即荧光探针FAM与VIC，引物F1的5’端添加FAM荧光标签序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；引物F2的5’端添加VIC荧光标签序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。另一主要成分为Master Mix，它能够检测两条正向引物中带有的不同的荧光。通过两个等位基因特异性正向引物的竞争性结合，实现双等位基因的识别。
3、品种的选定以及DNA提取
选用江苏丘陵地区镇江农业科学研究所蔬菜花卉研究室保存的66份结球甘蓝品种，选取品种如下表2：
表2 66份结球甘蓝种质资源的详情表
| DNA序号 | 品种 | DNA序号 | 品种 |
| Boc01 | ZJSSC001 | Boc34 | ZJSSC034 |
| Boc02 | ZJSSC002 | Boc35 | ZJSSC035 |
| Boc03 | ZJSSC003 | Boc36 | ZJSSC036 |
| Boc04 | ZJSSC004 | Boc37 | ZJSSC037 |
| Boc05 | ZJSSC005 | Boc38 | ZJSSC038 |
| Boc06 | ZJSSC006 | Boc39 | ZJSSC039 |
| Boc07 | ZJSSC007 | Boc40 | ZJSSC040 |
| Boc08 | ZJSSC008 | Boc41 | ZJSSC041 |
| Boc09 | ZJSSC009 | Boc42 | ZJSSC042 |
| Boc10 | ZJSSC010 | Boc43 | ZJSSC043 |
| Boc11 | ZJSSC011 | Boc44 | ZJSSC044 |
| Boc12 | ZJSSC012 | Boc45 | ZJSSC045 |
| Boc13 | ZJSSC013 | Boc46 | ZJSSC046 |
| Boc14 | ZJSSC014 | Boc47 | ZJSSC047 |
| Boc15 | ZJSSC015 | Boc48 | ZJSSC048 |
| Boc16 | ZJSSC016 | Boc49 | ZJSSC049 |
| Boc17 | ZJSSC017 | Boc50 | ZJSSC050 |
| Boc18 | ZJSSC018 | Boc51 | ZJSSC051 |
| Boc19 | ZJSSC019 | Boc52 | ZJSSC052 |
| Boc20 | ZJSSC020 | Boc53 | ZJSSC053 |
| Boc21 | ZJSSC021 | Boc54 | ZJSSC054 |
| Boc22 | ZJSSC022 | Boc55 | ZJSSC055 |
| Boc23 | ZJSSC023 | Boc56 | ZJSSC056 |
| Boc24 | ZJSSC024 | Boc57 | ZJSSC057 |
| Boc25 | ZJSSC025 | Boc58 | ZJSSC058 |
| Boc26 | ZJSSC026 | Boc59 | ZJSSC059 |
| Boc27 | ZJSSC027 | Boc60 | ZJSSC060 |
| Boc28 | ZJSSC028 | Boc61 | ZJSSC061 |
| Boc29 | ZJSSC029 | Boc62 | ZJSSC062 |
| Boc30 | ZJSSC030 | Boc63 | ZJSSC063 |
| Boc31 | ZJSSC031 | Boc64 | ZJSSC064 |
| Boc32 | ZJSSC032 | Boc65 | ZJSSC065 |
| Boc33 | ZJSSC033 | Boc66 | ZJSSC066 |
采用改良的CTAB法提取植物幼嫩叶片的DNA，具体方法如下：
步骤1，采取选定品种幼嫩的叶片0.1g，放入取样管中，放入液氮后研磨；
步骤2，在取样管中加入CTAB 600μL，涡旋仪震荡2-3min；
步骤3，65℃水浴30min，水浴期间手动震荡2-3次；
步骤4，加入三氯甲烷：异戊醇(24：1)600μL，手动摇晃5min；
步骤5，在离心机上常温，12000rpm，5min；
步骤6，吸取上清液400μL后加入800μL无水乙醇摇匀，-20℃冷却20min；
步骤7，将样品常温12000rpm，离心5min，倒出上清液晾干；
步骤8，晾干后的样品加入100μL的ddH2O，测定所提取的DNA的浓度与OD值。
将所提取的DNA稀释至20ng/μL，采用5μL的体系，KASP Master Mix 2.5μL，DNA 1μL、F1 0.1μL、F2 0.1μL、R 0.3μL、ddH2O 1.25μL。在BIORAD实时定量仪器上进行PCR扩增、PCR扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s，61℃-55℃退火延伸60s，共10个TouchDown循环(每个循环降低0.6℃)；第二轮PCR反应，95℃变性20s，55℃退火延伸60s，共36个循环。最后在25℃，30s读取基因分型数据。
图1为A01:13487469的KASP分子标记(引物编号为SNP03)在66份结球甘蓝种质资源中的多态性图谱，图2为A02:27723784的KASP分子标记(引物编号为SNP16)在66份结球甘蓝种质资源中的多态性图谱。表示初始DNA浓度为20ng/μL时，66份结球甘蓝材料及2个纯水阴性对照在2个SNP位点的KASP基因分型结果。其中靠近Y轴的点和靠近X轴的点表示两种不同的纯合基因型，处于坐标轴对角线上的点表示杂合基因型。
实时荧光定量PCR结果如图1和图2：2组KASP引物对SNP03和SNP16经体系扩增后，均能得到较好的KASP分型结果。
本发明的KASP基因分型技术对目标SNP/InDel进行精准的双等位基因分型，根据所开发的SNP位点以及设计的引物可以构建所选群体的DNA指纹图谱、品种鉴定、以及种子纯度鉴定等实验。
实施例2：结球甘蓝种质资源指纹图谱的构建
利用KASP平台对66个结球甘蓝品系进行基因型检测。在66个标记中，42个KASP标记成功分型，剩余24个标记中3个未成功分型，2个的未分型材料数>5，19个不具有多态性，为保证结果准确性，在后续分析中将剩余的24个标记去除。
最终获得42个核心SNP标记用于构建结球甘蓝种质资源的指纹图谱。利用42个核心KASP标记对33份江苏丘陵地区镇江农业科学研究所蔬菜花卉研究室的结球甘蓝育种资源(表3)进行基因型检测，构建结球甘蓝种质资源DNA指纹图谱。将33份材料的核心位点分型结果转化为二元编码数据，得到的指纹图谱如图3。利用该DNA指纹图谱可对江苏丘陵地区镇江农业科学研究所蔬菜花卉研究室结球甘蓝种质资源进行有效区分。
表3 33份结球甘蓝品种具体信息
| DNA序号 | 品种 | DNA序号 | 品种 | DNA序号 | 品种 |
| Boc01 | ZJSSC001 | Boc16 | ZJSSC021 | Boc42 | ZJSSC046 |
| Boc03 | ZJSSC002 | Boc18 | ZJSSC023 | Boc44 | ZJSSC048 |
| Boc04 | ZJSSC004 | Boc20 | ZJSSC026 | Boc46 | ZJSSC049 |
| Boc06 | ZJSSC005 | Boc23 | ZJSSC028 | Boc49 | ZJSSC050 |
| Boc07 | ZJSSC006 | Boc25 | ZJSSC029 | Boc51 | ZJSSC052 |
| Boc08 | ZJSSC008 | Boc30 | ZJSSC031 | Boc53 | ZJSSC053 |
| Boc09 | ZJSSC009 | Boc34 | ZJSSC036 | Boc56 | ZJSSC057 |
| Boc10 | ZJSSC011 | Boc36 | ZJSSC037 | Boc59 | ZJSSC059 |
| Boc12 | ZJSSC013 | Boc39 | ZJSSC039 | Boc61 | ZJSSC060 |
| Boc14 | ZJSSC014 | Boc40 | ZJSSC040 | Boc63 | ZJSSC064 |
| Boc15 | ZJSSC017 | Boc41 | ZJSSC042 | Boc66 | ZJSSC066 |
实施例3：结球甘蓝杂交品种的鉴定
利用10个SNP位点所设计的引物鉴定待测的结球甘蓝品种是否为“瑞甘55”，随机选择一个待测品种与标准样品“瑞甘55”各10粒种子，采用上述改良的CTAB法提取DNA，之后在SNP01-SNP66的66个引物对中随机挑选10个SNP位点进行PCR扩增统计基因分型结果，进行品种鉴定，结果如下表4：
表4待测品种与标准样品“瑞甘55'’在10个SNP位点上的分型结果
| 引物对编号 | 待测品种 | 瑞甘55 |
| SNP02 | G：A | G：G |
| SNP09 | A：A | A：G |
| SNP16 | A：A | A：A |
| SNP20 | G：G | A：A |
| SNP25 | T：T | T：G |
| SNP37 | T：C | T：C |
| SNP40 | T：T | T：T |
| SNP52 | C：C | T：C |
| SNP57 | A：G | A：G |
| SNP61 | C：G | C：C |
根据基因分型结果进行比对在SNP02、SNP09、SNP20、SNP25、SNP52和SNP61的基因分型结果不同，判定待测品种不是“瑞甘55”。
实施例4：寻找父母本与子代的差异SNP
利用实施例1所开发的66个KASP引物对，对母本‘BO23’和父本‘GL24’进行杂交得到F1。选取子叶采用改良的CTAB法提取DNA，采用KASP技术进行基因型的检测，同时24个核心KASP-SNP标记进行基因分型检测，检测方法及PCR反应同上。检测结果如下表5：
表5母本‘BO23’、父本‘GL24’及其杂交种F1在25个SNP位点上的分型结果
| 引物对编号 | Q204 | M23 | F1 |
| SNP02 | GA | GG | GG |
| SNP03 | CC | TT | CT |
| SNP04 | CT | CC | CC |
| SNP05 | AA | GA | AA |
| SNP06 | GA | GA | GG |
| SNP08 | CC | TT | TC |
| SNP09 | AG | GG | GG |
| SNP10 | TT | CC | TC |
| SNP11 | TT | TC | TC |
| SNP13 | CC | CT | CC |
| SNP16 | GG | AG | GG |
| SNP20 | AA | AG | AG |
| SNP21 | GT | GT | GT |
| SNP22 | AA | AG | AG |
| SNP23 | GG | GT | GG |
| SNP24 | GG | GG | GA |
| SNP25 | TT | GG | GG |
| SNP26 | CC | AC | CC |
| SNP27 | AA | AC | AA |
| SNP28 | GG | GG | GG |
| SNP29 | TT | TC | TT |
| SNP30 | AC | AC | AA |
| SNP31 | TT | TT | TT |
| SNP33 | GG | GC | GC |
| SNP37 | TT | TC | TT |
结果显示KASP引物筛选出BO23×GL24杂交种F1与父母本之间的差异SNP有SNP03、SNP06、SNP08、SNP10、SNP24和SNP30。
实施例5：种子纯度的鉴定
利用所开发的KASP标记鉴定杂交种‘BO23×GL24’的纯度，根据实施例1所设计66个KASP引物对筛选出杂交种‘BO23×GL24’一代与父母本之间的差异SNP有SNP03、SNP06、SNP08、SNP10、SNP24和SNP30。随机挑取待测杂交种种子94粒，提取DNA。催芽后选取子叶和下胚轴采用改良的CTAB法提取DNA，采用KASP技术进行基因分型检测，选用SNP08这对差异引物进行杂交种种子纯度的鉴定，将94粒种子的DNA分别加入96孔板的94个孔中以及两个阴性对照，根据上述的反应体系以及PCR反应条件，获得94个待测杂交种种子样品在编号为SNP08的SNP标记位点的基因分型结果，统计结果表明：94个样品大部分表现为杂合基因型T：C，杂交种纯度为94.55％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.结球甘蓝的KASP分子标记，其特征在于，至少包括以下分子标记中的一个：A01_3506256 C/T、A01_4478950 G/A、A01_13487469C/T、A01_45480665C/T、A01_45480754 G/A、A01_47782860 G/A、A01_49602601 G/A、A02_1646465 T / C、A02_2701397A/G、A02_3588799 T/C、A02_5472884 T/C、A02_6754191 T/C、A02_8170488 C/T、A02_8577597 A/G、A02_25765112 C/T、A02_27723784 A/G、A02_54382820 G/A、A02_60887873 T/C、A02_62939305 T/C、A03_658792 A /G、A03_3674009G/T、A03_7523159A/G、A03_13206072G/T、A03_23182211G/A、A03_23661296T/G、A03_26267190A/C、A03_37245547A/C、A03_39934962G/A、A03_40171446T/C、A03_56848398A/C、A03_59695342C/T、A03_70680880A/G、A03_71281875G/C、A03_73943203A/G、A03_74166647C/A、A04_13574311T/A、A04_14532614T/C、A04_14736752C/G、A04_20364491G/A、A04_41986068C/T、A04_44208668A/G、A04_51845506A/G、A04_61656529A/T、A05_77862A/C、A05_623182A/G、A05_1289306T/C、A05_1462172G/A、A05_1694631G/A、A05_2305280G/A、A05_2440106C/A、A06_3486253T/G、A06_17690070C/T、A06_42103611G/A、A06_46343090C/G、A07_6620428C/A、A07_32454643C/T、A07_41016927A/G、A07_51533735G/A、A08_7407835T/A、A08_29623285T/C、A08_33137814C/G、A08_46221340A/G、A09_10486561C/T、A09_22374163G/A、A09_54887251C/A和A09_63174459G/T。
2.一种用于检测权利要求1所述的结球甘蓝的KASP分子标记的引物对，其特征在于，至少包括一下引物对中的一个：
所述A01_3506256 C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.1所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.2所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.3所示；
所述A01_4478950 G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.4所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.5所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.6所示；
所述A01_13487469C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.7所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.8所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.9所示；
所述A01_45480665C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.10所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.11所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.12所示；
所述A01_45480754 G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.13所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.14所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.15所示；
所述A01_47782860G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.16所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.17所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.18所示；
所述A01_49602601 G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.19所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.20所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.21所示；
所述A02_1646465 T / C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.22所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.23所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.24所示；
所述A02_2701397A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.25所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.26所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.27所示；
所述A02_3588799 T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.28所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.29所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.30所示；
所述A02_5472884 T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.31所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.32所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.33所示；
所述A02_6754191 T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.34所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.35所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.36所示；
所述A02_8170488 C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.37所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.38所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.39所示；
所述A02_8577597 A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.40所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.41所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.42所示；
所述A02_25765112 C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.43所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.44所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.45所示；
所述A02_27723784 A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.46所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.47所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.48所示；
所述A02_54382820 G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.49所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.50所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.51所示；
所述A02_60887873 T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.52所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.53所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.54所示；
所述A02_62939305 T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.55所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.56所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.57所示；
所述A03_658792 A /G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.58所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.59所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.60所示；
所述A03_3674009G/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.61所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.62所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.63所示；
所述A03_7523159A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.64所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.65所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.66所示；
所述A03_13206072G/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.67所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.68所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.69所示；
所述A03_23182211G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.70所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.71所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.72所示；
所述A03_23661296T/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.73所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.74所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.75所示；
所述A03_26267190A/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.76所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.77所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.78所示；
所述A03_37245547A/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.79所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.80所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.81所示；
所述A03_39934962G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.82所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.83所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.84所示；
所述A03_40171446T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.85所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.86所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.87所示；
所述A03_56848398A/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.88所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.89所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.90所示；
所述A03_59695342C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.91所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.92所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.93所示；
所述A03_70680880A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.94所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.95所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.96所示；
所述A03_71281875G/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.97所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.98所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.99所示；
所述A03_73943203A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.100所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.101所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.102所示；
所述A03_74166647C/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.103所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.104所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.105所示；
所述A04_13574311T/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.106所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.107所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.108所示；
所述A04_14532614T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.109所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.110所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.111所示；
所述A04_14736752C/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.112所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.113所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.114所示；
所述A04_20364491G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.115所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.116所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.117所示；
所述A04_41986068C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.118所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.119所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.120所示；
所述A04_44208668A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.121所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.122所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.123所示；
所述A04_51845506A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.124所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.125所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.126所示；
所述A04_61656529A/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.127所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.128所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.129所示；
所述A05_77862A/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.130所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.131所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.132所示；
所述A05_623182A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.133所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.134所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.135所示；
所述A05_1289306T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.136所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.137所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.138所示；
所述A05_1462172G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.139所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.140所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.141所示；
所述A05_1694631G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.142所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.143所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.144所示；
所述A05_2305280G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.145所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.146所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.147所示；
所述A05_2440106C/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.148所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.149所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.150所示；
所述A06_3486253T/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.151所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.152所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.153所示；
所述A06_17690070C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.154所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.155所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.156所示；
所述A06_42103611G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.157所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.158所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.159所示；
所述A06_46343090C/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.160所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.161所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.162所示；
所述A07_6620428C/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.163所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.164所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.165所示；
所述A07_32454643C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.166所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.167所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.168所示；
所述A07_41016927A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.169所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.170所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.171所示；
所述A07_51533735G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.172所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.173所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.174所示；
所述A08_7407835T/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.175所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.176所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.177所示；
所述A08_29623285T/C引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.178所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.179所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.180所示；
所述A08_33137814C/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.181所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.182所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.183所示；
所述A08_46221340A/G引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.184所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.185所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.186所示；
所述A09_10486561C/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.187所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.188所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.189所示；
所述A09_22374163G/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.190所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.191所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.192所示；
所述A09_54887251C/A引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.193所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.194所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.195所示；
所述A09_63174459G/T引物对的上游引物F1的序列如SEQ ID No.196所示，上游引物F2的序列如SEQ ID No.197所示，下游引物R的序列如SEQ ID No.198所示。
3.一种用于鉴定结球甘蓝的试剂盒，其特征在于：至少包括权利要求2所述的引物对中的一对。
4.权利要求2所述的引物对在构建结球甘蓝种质资源指纹图谱中的应用。
5.权利要求2所述的引物对在鉴定结球甘蓝品种中的应用。
6.权利要求2所述的引物对在鉴定结球甘蓝父母本与子代差异中的应用。
7.权利要求2所述的引物对在鉴定结球甘蓝种子纯度中的应用。
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