CN117965794A - 香石竹品种鉴定的特异性snp分子标记组合及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种香石竹品种鉴定的特异性SNP分子标记组合及应用，特异性SNP分子标记组合包括30个位点DSNP001～DSNP030，通过设计特异性引物进行SNP位点扩增，根据突变类型的分型结果实现香石竹品种快速鉴定。本发明的技术方案采用目前国际国内品种鉴定领域均认可的SNP标记技术，以基于KASP技术的多种荧光扫描平台如GeneMatrix、LGC‑SNPline、Douglas Array Tape等平台为主，与基于田间试验的品种鉴定技术相比不受环境影响和季节约束；与SSR分子标记相比检测通量高、数据统计分析简单、数据兼容性强、易实现数据共享，弥补了目前缺少香石竹品种鉴定技术方法的空白，实现了香石竹DNA指纹图谱构建、香石竹品种快速鉴定、对未知品种进行鉴定或者分子育种辅助。
Description
技术领域
本发明涉及农业分子生物检测技术领域，具体来说是一种香石竹品种鉴定的特异性SNP分子标记组合及应用。
背景技术
香石竹(Dianthus caryophyllus L.)又称康乃馨，属石竹科(Caryophyllaceae)石竹属(Dianthus L.)的多年生草本植物。香石竹的花语为母爱，其因花色丰富，花形多变，温室培养可四季开花而成为世界著名四大切花之一，除观赏外，香石竹花朵还可用于提取香精作化妆品材料。
DNA分子标记法是当前作物品种鉴定最常用的方法。分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映，包括扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、随机扩增多态性DNA(Random Amplification Polymorphic DNA，RAPD)、简单重复序列(Simple SequenceRepeat，SSR)、单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)等。与传统形态标记、生化标记相比，具有分布广、多态性高、准确性高、操作快速简便、不受外界环境影响等优点。其中作为第三代分子标记的SNP是由基因组DNA序列上单个碱基转换、颠换所引起的DNA序列多态性，与其它分子标记相比，具有数目多、分布广、遗传稳定等优点，已被运用到水稻品种SNP指纹数据采集及品种鉴定，玉米自交系、单交种及纯度的鉴定中。近些年关于石竹属分子标记的研究主要集中在SSR标记的开发，并应用于亲缘关系的鉴定、多态性分析、遗传连锁图谱绘制及QTL定位。关于第三代分子标记SNP用于香石竹品种鉴定的研究报道暂未发现。
目前用于SNP基因分型的方法很多，高通量分型的技术常见的有基因芯片技术、测序法、竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)技术等。芯片技术针对于有参考基因组的作物，且检测通量较大，适合少样本多位点的检测，检测成本较高。测序法检测时间较长，且成本较高。KASP技术为样本高通量检测技术，具有高通量、高质量、准确、低成本、操作简单、灵活等优点，适合多样本少位点的检测，尤其适合品种鉴定的检测技术要求。
相比于需要田间种植的形态学品种鉴定，SNP分子标记技术省去了种植试验所需的农药、化肥以及时间，节约成本和资源；相比于基于大板胶的SSR分子标记技术，SNP分子标记技术操作简单，易于自动化，检测通量高，成本低。因此，针对SNP分子标记技术的优势，开发一套适用于香石竹品种鉴定的SNP分子标记，可以科学应对当前市场存在的问题，为香石竹品种管理提供技术支撑，激励育种创新，确保香石竹产业的健康持续发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种香石竹品种鉴定的特异性SNP分子标记组合及应用，实现对香石竹品种的鉴定。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种香石竹品种鉴定的特异性SNP分子标记组合,所述特异性SNP分子标记组合包括30个位点DSNP001～DSNP030，具体为：
DSNP001位于1号染色体上第7693484位，其脱氧核苷酸为T或G；
DSNP002位于1号染色体上第585842位，其脱氧核苷酸为T或C；
DSNP003位于2号染色体上第39830424位，其脱氧核苷酸为C或T；
DSNP004位于2号染色体上第5188873位，其脱氧核苷酸为G或A；
DSNP005位于2号染色体上第9629855位，其脱氧核苷酸为G或A；
DSNP006位于3号染色体上第37862405位，其脱氧核苷酸为G或A；
DSNP007位于3号染色体上第40176043位，其脱氧核苷酸为A或G；
DSNP008位于4号染色体上第11960641位，其脱氧核苷酸为C或T；
DSNP009位于4号染色体上第14870858位，其脱氧核苷酸为A或G；
DSNP010位于4号染色体上第33129807位，其脱氧核苷酸为A或G；
DSNP011位于5号染色体上第38158253位，其脱氧核苷酸为G或A；
DSNP012位于6号染色体上第35657747位，其脱氧核苷酸为C或T；
DSNP013位于6号染色体上第703572位，其脱氧核苷酸为A或G；
DSNP014位于7号染色体上第19380970位，其脱氧核苷酸为C或T；
DSNP015位于7号染色体上第4186644位，其脱氧核苷酸为A或G；
DSNP016位于8号染色体上第3043420位，其脱氧核苷酸为T或G；
DSNP017位于8号染色体上第3573497位，其脱氧核苷酸为A或T；
DSNP018位于8号染色体上第38051647位，其脱氧核苷酸为G或C；
DSNP019位于9号染色体上第11827432位，其脱氧核苷酸为G或C；
DSNP020位于10号染色体上第194270位，其脱氧核苷酸为A或C；
DSNP021位于10号染色体上第2424784位，其脱氧核苷酸为G或A；
DSNP022位于11号染色体上第33705004位，其脱氧核苷酸为A或T；
DSNP023位于11号染色体上第34096633位，其脱氧核苷酸为G或C；
DSNP024位于12号染色体上第34793864位，其脱氧核苷酸为C或A；
DSNP025位于13号染色体上第19425592位，其脱氧核苷酸为T或C；
DSNP026位于13号染色体上第33938977位，其脱氧核苷酸为C或A；
DSNP027位于14号染色体上第26987170位，其脱氧核苷酸为T或C；
DSNP028位于14号染色体上第29804474位，其脱氧核苷酸为G或A；
DSNP029位于15号染色体上第17208330位，其脱氧核苷酸为A或G；
DSNP030位于15号染色体上第24408485位，其脱氧核苷酸为A或G；
本发明的第二目的是提供一种用于扩增上述特异性SNP分子标记的特异性引物组合，所述特异性引物组合由上述30个SNP位点的检测引物组成，检测各SNP位点的特异性引物由两条正向引物和一条反向引物组成，其序列为：
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DSNP030反向引物序列为：5’-GCATGGCGTCTAGAAGGTTAGAGTA-3’。
对于本领域技术人员来说，含有用于扩增所述特异性SNP分子标记引物对的试剂盒或基因芯片也属于本发明的保护范围。
本发明所述的香石竹品种特异性SNP分子标记组合可以用于：香石竹品种DNA指纹库的构建、香石竹品种鉴定或香石竹品种真实性鉴定。
本发明还提供一种香石竹品种DNA指纹库的构建方法，步骤包括：
(1)提取待测香石竹样本的DNA；
(2)以步骤(1)中的DNA为模板，加入用于鉴定香石竹品种的SNP位点组合的特异性引物组合和PCR预混液，进行PCR扩增，检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测香石竹品种在所述PCR扩增产物的特异性引物所对应的SNP位点的基因型，从而构建香石竹品种DNA指纹库。
本发明还提供一种香石竹品种的鉴定方法，步骤包括：
(1)提取待测香石竹样本的DNA；
(2)以步骤(1)中的DNA为模板，加入用于鉴定香石竹品种的SNP位点组合的特异性引物组合和PCR预混液，进行PCR扩增，检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测香石竹品种在所述PCR扩增产物的特异性引物所对应的SNP位点的基因型；
(3)记录待测样品的分型情况，与构建好的香石竹品种DNA指纹库中所有品种进行比较，寻找与待测品种相同或遗传关系近似的品种。
本发明还提供一种香石竹品种真实性鉴定的方法，步骤包括：
(1)提取需要鉴定的两个待测香石竹样品的DNA；
(2)以步骤(1)中的DNA为模板，分别加入用于鉴定香石竹品种的SNP位点组合的特异性引物组合和PCR预混液，进行PCR扩增，检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得两个待测香石竹样品在所述PCR扩增产物的特异性引物所对应的SNP位点的基因型；
(3)逐一比对送检样品与对照样品每个位点的等位变异数据，按照位点相同、位点差异、数据缺失、无法判定情形记录每个位点的比对结果，统计检测位点数和差异位点数，当品种间差异位点数≥3时，送检样品与对照样品为不同品种；当品种间差异位点数≤2时，送检样品与对照样品为疑同品种。
本发明的有益技术效果是：本发明技术方案采用目前国际国内品种鉴定领域均认可的SNP标记技术，以基于KASP技术的多种荧光扫描平台如GeneMatrix、LGC-SNPline、Douglas Array Tape等平台为主。与基于田间试验的品种鉴定技术相比不受环境影响和季节约束；与SSR分子标记相比检测通量高、数据统计分析简单、数据兼容性强、易实现数据共享，弥补了目前缺少香石竹品种鉴定技术方法的空白，实现了香石竹DNA指纹图谱构建、香石竹品种快速鉴定、对未知品种进行鉴定或者分子育种辅助。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1CM041529.1_29804474位点在92个品种中的分型结果；NTC：不含有模板的对照；GG：样品在CM041529.1_29804474位点基因分型为GG；GA：样品在CM041529.1_29804474位点基因分型为GA；AA：样品在CM041529.1_29804474位点基因分型为AA。
图2 213份香石竹基于Nei’s遗传距离的系统聚类；黄色标记为盆栽香石竹、蓝色标记为切花单头香石竹、绿色标记为切花多头香石竹。
图3 213个香石竹品种的指纹图谱；第一列代表样本名称,第一行为位点名称,W开头编号的是未测序样本,其余是已测序样本。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.SNP位点的开发
取香石竹幼嫩组织0.2g，利用CTAB法提取叶片总DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。挑选50个表型具有代表性的香石竹品种进行简化基因组测序，初步筛选共82584个SNP位点。根据以下开发原则筛选符合KASP开发的SNP位点130个。
筛选原则：
位点检出率等于100％、MAF大于0.15、杂合率小于0.4、去除冗余标记；
SNP位点前后30bp内无其他SNP、无大于或等于8个连续的单碱基重复；
位点上下游50bp和基因组其他位置无同源；
前后150bp的GC含量在40％-60％；
PIC大于或等于0.2、位点多态性大于或等于0.4。
2.引物设计
根据130个SNP位点的侧翼序列，针对每个SNP位点，在SNP位点上游设计两条正向引物，下游设计一条反向引物。两条正向引物分别加上接头序列FAM(GAAGGTGACCAAGTTCATGCT)或HEX(GAAGGTCGGAGTCAACGGATT)，将设计好的引物送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
3.反应体系条件
根据使用的分型设备以及分型试剂配置相应量的反应体系。本研究中位点的开发使用GeneMatrix(成都瀚辰光翼科技有限责任公司)平台以及配套的试剂进行基因分型。反应体系、反应条件如下：
表1反应体系
表2反应条件
4.引物的筛选与确定
采用92份香石竹品种对130个SNP位点进行基因分型验证，排除分型效果差的引物，初步获得单拷贝、无连锁的51对KASP引物。使用121份新收集的品种对51对KASP引物进行复筛。这51个SNP位点在92份品种的KASP分型图中效果较好，能明显将分型结果聚类3簇，分别是两簇纯合、一簇杂合(图1为分型图示例)。运用Python3.9获得每个位点的杂合率、MAF、分型缺失率、PIC等信息，根据核心标记筛选原则，最终挑选出30个SNP位点作为品种核心标记，30个位点参数值见表3，30个SNP位点信息见表4。
筛选原则：
在筛选出的位点中剔除杂合度大于60％的个体；
剔除没有多态性的位点，PIC值在0.3-0.5之间；
剔除分型缺失率高于2％的位点；
MAF值位于0.25-0.5之间。
表3 30个SNP核心位点各参数值各指标值
表4 30个SNP位点信息
5.引物的区分力和鉴别效率评估
筛选出的30对引物均匀分布于香石竹全基因组，在不同来源的213份香石竹品种中都能完全扩增出来，扩增效率高，具有广适性。同时使用PowerMarker V3.25软件根据30对引物(表5)等位基因出现的频率计算213份香石竹材料的Nei’s遗传距离，按照非加权配对法(UPGMA)进行聚类分析(图2)。213份品种被分为2大类，分别是切花香石竹与盆栽香石竹，其中切花香石竹又基本分为切花多头香石竹、切花单头香石竹，除QM13号品种虽然属于切花多头型品种但聚类在切花单头型品种中。
表5引物信息
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利用30对核心引物对213份香石竹品种进行分型，获得213份品种的指纹数据库，运用Python3.9将其可视化(如图3所示)。为验证这套标记体系的鉴别力，统计213份样品两两之间在30个核心位点上的差异位点数，在22791对品种中无差异位点数的仅有12对品种，识别率达到99.95％，满足《植物品种鉴定DNA分子标记法总则》中核心位点能区分95％以上已知品种的要求，品种区分能力较强，可满足绝大部分香石竹品种鉴定的需求。
6数据记录与分析
根据SNP位点的分型结果，纯合位点的基因型数据记录为X:X和Y:Y，其中X、Y为该位点的两个不同等位变异；杂合位点的基因型数据记录为XY；缺失位点等位变异数据记录为--。数据质量需符合对应检测平台的质控要求。
示例1：DSNP004位点的突变是G或A，有一个品种在该位点的分型是G:G，则数据记录为G:G。
示例2：DSNP004位点的突变是G或A，有一个品种在该位点的分型是A:A，则数据记录为A:A。
示例3：DSNP004位点的突变是G或A，有一个品种在该位点的分型缺失，则数据记录为--。
逐一比对送检样品与对照样品每个位点的等位变异数据，按照位点相同、位点差异、数据缺失、无法判定情形记录每个位点的比对结果，统计检测位点数和差异位点数。
依据引物的检测结果进行判定：
a)品种间差异位点数≥3为不同品种；
b)品种间差异位点数≤2为疑同品种。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.香石竹品种鉴定的特异性SNP分子标记组合，其特征在于，所述特异性SNP分子标记组合包括30个位点DSNP001～DSNP030，具体为：
DSNP001位于1号染色体上第7693484位，其脱氧核苷酸为T或G；
DSNP002位于1号染色体上第585842位，其脱氧核苷酸为T或C；
DSNP003位于2号染色体上第39830424位，其脱氧核苷酸为C或T；
DSNP004位于2号染色体上第5188873位，其脱氧核苷酸为G或A；
DSNP005位于2号染色体上第9629855位，其脱氧核苷酸为G或A；
DSNP006位于3号染色体上第37862405位，其脱氧核苷酸为G或A；
DSNP007位于3号染色体上第40176043位，其脱氧核苷酸为A或G；
DSNP008位于4号染色体上第11960641位，其脱氧核苷酸为C或T；
DSNP009位于4号染色体上第14870858位，其脱氧核苷酸为A或G；
DSNP010位于4号染色体上第33129807位，其脱氧核苷酸为A或G；
DSNP011位于5号染色体上第38158253位，其脱氧核苷酸为G或A；
DSNP012位于6号染色体上第35657747位，其脱氧核苷酸为C或T；
DSNP013位于6号染色体上第703572位，其脱氧核苷酸为A或G；
DSNP014位于7号染色体上第19380970位，其脱氧核苷酸为C或T；
DSNP015位于7号染色体上第4186644位，其脱氧核苷酸为A或G；
DSNP016位于8号染色体上第3043420位，其脱氧核苷酸为T或G；
DSNP017位于8号染色体上第3573497位，其脱氧核苷酸为A或T；
DSNP018位于8号染色体上第38051647位，其脱氧核苷酸为G或C；
DSNP019位于9号染色体上第11827432位，其脱氧核苷酸为G或C；
DSNP020位于10号染色体上第194270位，其脱氧核苷酸为A或C；
DSNP021位于10号染色体上第2424784位，其脱氧核苷酸为G或A；
DSNP022位于11号染色体上第33705004位，其脱氧核苷酸为A或T；
DSNP023位于11号染色体上第34096633位，其脱氧核苷酸为G或C；
DSNP024位于12号染色体上第34793864位，其脱氧核苷酸为C或A；
DSNP025位于13号染色体上第19425592位，其脱氧核苷酸为T或C；
DSNP026位于13号染色体上第33938977位，其脱氧核苷酸为C或A；
DSNP027位于14号染色体上第26987170位，其脱氧核苷酸为T或C；
DSNP028位于14号染色体上第29804474位，其脱氧核苷酸为G或A；
DSNP029位于15号染色体上第17208330位，其脱氧核苷酸为A或G；
DSNP030位于15号染色体上第24408485位，其脱氧核苷酸为A或G。
2.用于扩增权利要求1所述特异性SNP分子标记的特异性引物组合，其特征在于，所述特异性引物组合由上述30个SNP位点的检测引物组成，检测各SNP位点的特异性引物由两条正向引物和一条反向引物组成，其序列为：
DSNP001正向引物1序列为：5’-ATGGTGAGCCAATGATCGGTAGAT-3’
DSNP001正向引物2序列为：5’-GGTGAGCCAATGATCGGTAGAG-3’
DSNP001反向引物序列为：5’-ATATATGGCGTGGCATCCGGCAAAT-3’
DSNP002正向引物1序列为：5’-CGTGAGGTGATGCAGATGTTGAA-3’
DSNP002正向引物2序列为：5’-GTGAGGTGATGCAGATGTTGAG-3’
DSNP002反向引物序列为：5’-TCTGCAACAATCGTGCGCTAACCTT-3’
DSNP003正向引物1的序列为：5’-CCTGTCTTCCTCAGATAGCCTC-3’
DSNP003正向引物2的序列为：5’-TCCTGTCTTCCTCAGATAGCCTT-3’
DSNP003反向引物的序列为：5’-GCAAAAGTAGACCCTCTTCTCGCTA-3’
DSNP004正向引物1的序列为：5’-GTTCTGACACTGCCGTCTCG-3’
DSNP004正向引物2的序列为：5’-AAGTTCTGACACTGCCGTCTCA-3’DSNP004反向引物的序列为：5’-ATACACATGTGCGGTCACTGGTGAA-3’
DSNP005正向引物1序列为：5’-CGATTACTTCTAAATGTCAGGAAGTTC-3’DSNP005正向引物2序列为：5’-GTCGATTACTTCTAAATGTCAGGAAGTTT-3’DSNP005反向引物序列为：5’-CAGCCATTTGAGCCGAATCTCTCAA-3’
DSNP006正向引物1序列为：5’-CATCACGAAGACCTGTTATCGAG-3’
DSNP006正向引物2序列为：5’-CCATCACGAAGACCTGTTATCGAA-3’
DSNP006反向引物序列为：5’-CTGGAGGGGATATCGTCTTGTCTAA-3’
DSNP007正向引物1序列为：5’-ATCGTTCAACATCATTGACCACATAAGA-3’DSNP007正向引物2序列为：5’-CGTTCAACATCATTGACCACATAAGG-3’DSNP007反向引物序列为：5’-CGGTCGAGTGGCTGGAAATAAAGAT-3’
DSNP008正向引物1序列为：5’-TTGCTGGTGTTCGCCTTGCC-3’
DSNP008正向引物2序列为：5’-TATTGCTGGTGTTCGCCTTGCT-3’
DSNP008反向引物序列为：5’-GGTGCAACAAGGCTTCAGCATAGTT-3’
DSNP009正向引物1序列为：5’-GCAGGGGTTGTTTGAGCATCGA-3’
DSNP009正向引物2序列为：5’-CAGGGGTTGTTTGAGCATCGG-3’
DSNP009反向引物序列为：5’-CCGTCTCCGTAGCTTAGTGTCTTAA-3’
DSNP010正向引物1序列为：5’-TCTGCCACAGTCACACGTAT-3’
DSNP010正向引物2序列为：5’-TCTGCCACAGTCACACGTAA-3’
DSNP010反向引物序列为：5’-GTGGCGTTGTTAGGGTATGGA-3’
DSNP011正向引物1序列为：5’-GCCAGCTCTAATATGCTACACC-3’
DSNP011正向引物2序列为：5’-GTGCCAGCTCTAATATGCTACACT-3’
DSNP011反向引物序列为：5’-CAGCACGCCGTTTTGCTTCATTCAA-3’
DSNP012正向引物1序列为：5’-CAGAGATCACTGTCCTTAGAGTAC-3’DSNP012正向引物2序列为：5’-CCAGAGATCACTGTCCTTAGAGTAT-3’
DSNP012反向引物序列为：5’-TCCTAGGATTGCAAGTGGATCGGTT-3’
DSNP013正向引物1序列为：5’-CCGCCTATGCAAATGCCGCCA-3’
DSNP013正向引物2序列为：5’-CGCCTATGCAAATGCCGCCG-3’
DSNP013反向引物序列为：5’-ATGTTGCTGCAGCTCCTAAAGGGAA-3’
DSNP014正向引物1序列为：5’-GTTATGACTGCAGCTTGCTGGTG-3’
DSNP014正向引物2序列为：5’-AAGTTATGACTGCAGCTTGCTGGTA-3’
DSNP014反向引物序列为：5’-GAAGGGCATCCCAGAGATTTCCATT-3’
DSNP015正向引物1序列为：5’-CCTTCAATCTTCGTGTAAGACCCT-3’
DSNP015正向引物2序列为：5’-CTTCAATCTTCGTGTAAGACCCC-3’
DSNP015反向引物序列为：5’-GAGAGGAGACGTCAGAGCTCAATAA-3’
DSNP016正向引物1序列为：5’-CAAAAGCGTCTGACAGTGAGTT-3’
DSNP016正向引物2序列为：5’-CAAAAGCGTCTGACAGTGAGTG-3’
DSNP016反向引物序列为：5’-CATGGCTTCCACTGGGAGAG-3’
DSNP017正向引物1序列为：5’-GAAATGTACCTTACAGAATTTTTTTCGGTTT-3’DSNP017正向引物2序列为：5’-GAAATGTACCTTACAGAATTTTTTTCGGTTA-3’DSNP017反向引物序列为：5’-CTTGCTGCGCCTTGAAGTATTCCTA-3’
DSNP018正向引物1序列为：5’-CAAATCAACTCGGTATACTCCAGG-3’
DSNP018正向引物2序列为：5’-CAAATCAACTCGGTATACTCCAGC-3’
DSNP018的反向引物序列为：5’-GTGGTTGAGCTTGCAAGAGC-3’
DSNP019正向引物1序列为：5’-AGAAACATCTATAAAAACTTTATATAGGGTTG-3’DSNP019正向引物2序列为：5’-AGAAACATCTATAAAAACTTTATATAGGGTTC-3’DSNP019反向引物序列为：5’-AGCACAGATGAGTGCCCTCTATCAT-3’DSNP020正向引物1序列为：5’-CCATTTCCCTAGGTAAGGTTGGA-3’
DSNP020正向引物2序列为：5’-CATTTCCCTAGGTAAGGTTGGG-3’
DSNP020反向引物序列为：5’-GAGGTACTTTGTGCAAGGCCTGTTA-3’
DSNP021正向引物1序列为：5’-GAAGCACGGGGCCGTAAGAG-3’
DSNP021正向引物2序列为：5’-AAAGAAGCACGGGGCCGTAAGAA-3’
DSNP021反向引物序列为：5’-GAACAACAATCTTTGGGGCCGTCTT-3’
DSNP022正向引物1序列为：5’-CCTGAAGCGTAGGATCAACCA-3’
DSNP022正向引物2序列为：5’-CCTGAAGCGTAGGATCAACCT-3’
DSNP022反向引物序列为：5’-TGTAGTCGATGAGCAGCTCGT-3’
DSNP023正向引物1序列为：5’-CCAACTGATTATGATCCAAAACGACG-3’
DSNP023正向引物2序列为：5’-CCAACTGATTATGATCCAAAACGACC-3’
DSNP023反向引物序列为：5’-GATTCCCAAGGAAATGGTTGCGCTT-3’
DSNP024正向引物1序列为：5’-ACCTCAGACGCCTCCTACTC-3’
DSNP024正向引物2序列为：5’-ACCTCAGACGCCTCCTACTA-3’
DSNP024反向引物序列为：5’-GTTGGATTGGTGGGCCCATA-3’
DSNP025正向引物1序列为：5’-GCTTCCTAATGTTTCCCTGTTCACT-3’
DSNP025正向引物2序列为：5’-GCTTCCTAATGTTTCCCTGTTCACC-3’
DSNP025反向引物序列为：5’-TGTATGCGCGTGATCCTGATCT-3’
DSNP026正向引物1序列为：5’-AAGGTTCATCGAATTTGCATAACGAATG-3’DSNP026正向引物2序列为：5’-AAAAAGGTTCATCGAATTTGCATAACGAATT-3’DSNP026反向引物序列为：5’-CGATTCCATCCTTTGGGATCCTGAT-3’
DSNP027正向引物1序列为：5’-GTGCTAGAGAACATTAGAAAAACAGCT-3’
DSNP027正向引物2序列为：5’-GCTAGAGAACATTAGAAAAACAGCC-3’
DSNP027反向引物序列为：5’-AATCGAGAAGGCCGGTGTGCTAAAT-3’
DSNP028正向引物1序列为：5’-GGACCGGGTAGGTTAAGACG-3’
DSNP028正向引物2序列为：5’-GGGACCGGGTAGGTTAAGACA-3’
DSNP028反向引物序列为：5’-GCTTTGATGCTCTCACTCTCGAGAA-3’
DSNP029正向引物1序列为：5’-AAACAAAACCTCTGGGAAGGGGAA-3’
DSNP029正向引物2序列为：5’-CAAAACCTCTGGGAAGGGGAG-3’
DSNP029反向引物序列为：5’-CCGAGACACTTGGATCATGATCCTT-3’
DSNP030正向引物1序列为：5’-CGATATTAGCTATGAGAAAACCACTTGTT-3’
DSNP030正向引物2序列为：5’-GATATTAGCTATGAGAAAACCACTTGTC-3’
DSNP030反向引物序列为：5’-GCATGGCGTCTAGAAGGTTAGAGTA-3’。
3.含有用于扩增如权利要求1所述特异性SNP分子标记引物对的试剂盒或基因芯片。
4.香石竹品种特异性SNP分子标记组合的应用，其特征在于，所述应用包括：香石竹品种DNA指纹库的构建、香石竹品种鉴定、香石竹品种真实性鉴定或香石竹分子育种辅助选择。
5.一种香石竹品种DNA指纹库的构建方法，其特征在于，步骤包括：
(1)提取待测香石竹样本的DNA；
(2)以步骤(1)中的DNA为模板，加入用于鉴定香石竹品种的SNP位点组合的特异性引物组合和PCR预混液，进行PCR扩增，检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测香石竹品种在所述PCR扩增产物的特异性引物所对应的SNP位点的基因型，从而构建香石竹品种DNA指纹库。
6.一种香石竹品种的鉴定方法，其特征在于，步骤包括：
(1)提取待测香石竹样本的DNA；
(2)以步骤(1)中的DNA为模板，加入用于鉴定香石竹品种的SNP位点组合的特异性引物组合和PCR预混液，进行PCR扩增，检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测香石竹品种在所述PCR扩增产物的特异性引物所对应的SNP位点的基因型；
(3)记录待测样品的分型情况，与构建好的香石竹品种DNA指纹库中所有品种进行比较，寻找与待测品种相同或遗传关系近似的品种。
7.一种香石竹品种真实性鉴定的方法，其特征在于，步骤包括：
(1)提取需要鉴定的两个待测香石竹样品的DNA；
(2)以步骤(1)中的DNA为模板，分别加入用于鉴定香石竹品种的SNP位点组合的特异性引物组合和PCR预混液，进行PCR扩增，检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得两个待测香石竹样品在所述PCR扩增产物的特异性引物所对应的SNP位点的基因型；
(3)逐一比对送检样品与对照样品每个位点的等位变异数据，按照位点相同、位点差异、数据缺失、无法判定情形记录每个位点的比对结果，统计检测位点数和差异位点数，当品种间差异位点数≥3时，送检样品与对照样品为不同品种；当品种间差异位点数≤2时，送检样品与对照样品为疑同品种。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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