CN102199661A

CN102199661A - 花生δ12-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法

Info

Publication number: CN102199661A
Application number: CN 201110058563
Authority: CN
Inventors: 王传堂; 于洪涛; 唐月异; 王秀贞; 杨伟强; 张建成; 禹山林; 髙华援; 张树伟; 李贵杰
Original assignee: Shandong Peanut Research Institute
Current assignee: Shandong Peanut Research Institute
Priority date: 2011-03-11
Filing date: 2011-03-11
Publication date: 2011-09-28

Abstract

本发明设计了一种农作物基因快速分型方法，尤其涉及一种花生基因的快速分型方法。本发明的花生Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法，包括如下步骤：(1)针对脂肪酸脱氢酶基因FAD2A、FAD2B的野生型和突变型基因各设计一套PCR引物组合和检测体系；(2)采用通用的PCR反应程序；(3)琼脂糖凝胶检测判读个体的基因型，每个检测体系中出现一条1241 bp的内参带，标志PCR反应程序成功。应用本发明的方法来鉴定FAD2A基因的野生型纯合体、突变型纯合体、野生型突变型杂合体，FAD2B基因的野生型纯合体、突变型纯合体、野生型突变型杂合体(之前测序已知其基因型)，全部获得了准确无误的结果。

Description

花生Δ12-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法

技术领域

本发明设计了一种农作物基因快速分型方法，尤其涉及一种花生基因的快速分型方法。

背景技术

花生是我国重要的油料作物和出口商品，有研究表明，油酸含量高的花生油可以有效降低人体内有害胆固醇水平，而不产生副作用。在花生中Δ¹²-脂肪酸脱氢酶(FAD2)的功能是催化油酸脱氢，使之转化成具有两个双键的亚油酸。通常情况下，脂肪酸分子上双键越多越易氧化变质，食品保质期越短。而且亚油酸既能降低人体内有害胆固醇的含量，也能降低有益胆固醇含量，因此，培育高油酸/亚油酸比值的花生品种，使FAD2的酶活性降低，大大提高花生中油酸的含量，成为当前花生育种工作中的重要目标之一。

花生是异源四倍体植物，FAD2A基因和FAD2B基因分别来自两套基因组，两基因的序列高度相似。目前，国内外已报道获得了油酸/亚油酸比值异常高的高油酸花生突变品系。经检测，其中的FAD2A和FAD2B基因均已发生突变。FAD2A基因发生错义突变，编码区第448位碱基由G突变为A(即FAD2A 448G＞A)；FAD2B基因突变最常见的一种情况是编码区第442位插入一个A，导致移码突变(即FAD2B 441_442insA)。两个基因所编码的酶活性大幅降低，因此表现为高油酸性状；FAD2A和FAD2B的等位基因中只要有一个是正常的，便不会出现高油酸性状。此种花生高油酸突变体在育种工作中可作为亲本与具有其他优良性状的材料杂交，以培育同时具有高油酸性状和高产、抗逆或高油等优良性状的花生品种。

从育种应用的角度看，在正常油酸×高油酸(FAD2A 448G＞A和FAD2B441_442insA)花生杂交组合中，需要从F₁(或F_0∶1)和F₂(或F_1∶2)杂交后代中选择出同时具有FAD2A和FAD2B突变型基因的真实杂种个体。在此将FAD2A野生型基因表示为A，突变的等位基因表示为a；将FAD2B野生型基因表示为B，突变等位基因表示为b。具有Aa/aa/Bb/bb基因型的个体，即为我们所要选择保留的真实杂种。目前，在花生高油酸育种上应用的选择技术主要有SSR标记、qPCR法、CAPS标记法、直接测序法、AS-PCR法以及近红外光谱扫描法等，前3种方法操作步骤繁琐或需要特殊的设备，直接测序虽可以确定基因型但价格不菲，当后代群体数目庞大时费用之高难以承受。通过等位基因特异PCR(AS-PCR)的方法来检测花生FAD2A和FAD2B基因型已有报道，但在应用上具有局限性，难以区分AaBB和aaBB、AABb和AAbb基因型。近红外光谱扫描不能识别F₂代同时具备FAD2A、FAD2B突变基因而这两个基因尚未纯合的材料。

发明内容

本发明的技术效果能够克服上述缺陷，提供一种花生Δ¹²-脂肪酸脱氢酶快速分型方法，其可以通过一次实验过程得出大量杂交后代的基因型。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案，其包括如下步骤：

(1)针对脂肪酸脱氢酶FAD2A、FAD2B的野生型和突变型基因各设计一套PCR引物组合和检测体系；

(2)采用通用的PCR反应程序；

(3)琼脂糖凝胶检测判读个体的基因型，每个检测体系中出现一条1241bp的内参带，标志PCR反应程序成功。

根据FAD2A和FAD2B基因之间的序列差异以及两基因自身野生型和突变型等位基因之间的序列差异，设计了专门用来分别检测这4个等位基因的PCR引物组合。对4个等位基因分别设置25μl PCR检测体系，简述如下。体系(1)检测FAD2A野生型等位基因：2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；

引物FAD2A-F：1μl；

引物FAD2A-G：1μl；

引物FAD2-R：0.1-0.8μl；

模板DNA：＜1μg；

ddH₂O：补至25μl。

体系(2)检测FAD2A突变型等位基因：2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；

引物FAD2A-F：1μl；

引物FAD2A-A：1μl；

引物FAD2-R：0.1-0.8μl；

模板DNA：＜1μg；

ddH₂O：补至25μl。

体系(3)检测FAD2B野生型等位基因：2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；

引物FAD2B-F：1μl；

引物FAD2B-C：1μl；

引物FAD2-R：0.1-0.8μl；

模板DNA：＜1μg；

ddH₂O：补至25μl。

体系(4)检测FAD2B突变型等位基因：2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；

引物FAD2B-F：1μl；

引物FAD2B-A：1μl；

引物FAD2-R：0.1-0.8μl；

模板DNA：＜1μg；

ddH₂O：补至25μl。

其中所述的引物FAD2A-F序列(5‘→3’，下同)为GATTACTGATTATTGACTTGCTTTG；引物FAD2A-G序列为GTTTTGGGACAAACACTTCTTC；引物FAD2-R序列为CTCTGACTATGCATCAGAACTTGT；引物FAD2A-A序列为GTTTTGGGACAAACACTTCTTT；引物FAD2B-F序列为CAGAACCATTAGCTTTGTAGTAGTG；引物FAD2B-C序列为AACACTTCGTCGCGGTTG；引物FAD2B-A序列为AACACTTCGTCGCGGTTT。

四组PCR反应体系采用共同的反应程序：94℃预变性1min，94℃变性30-45s，53℃复性30-45s，72℃延伸90s，进行30个循环；72℃后延伸5min；4℃保存。

电泳检测采用1％琼脂糖电泳，取6μl PCR产物，以1μl DL2000Ma rker(Taka ra)作为对照。电压130V，电泳20min，紫外光下观察。所有体系中都应有1条1241bp的内参带，这是PCR反应成功的标志。体系(1)和体系(2)的目的带为557bp，体系(3)和体系(4)的目的带为539bp。在内参带存在的前提下，有目的带就证明基因组中存在此等位基因。

应用本发明的方法来鉴定FAD2A基因的野生型纯合体、突变型纯合体、野生型突变型杂合体，FAD2B基因的野生型纯合体、突变型纯合体、野生型突变型杂合体(之前测序已知其基因型)，全部获得了准确无误的结果。

附图说明

图1为FAD2A基因野生型纯合体和突变型纯合体鉴定(图中左侧为体系1，右侧为体系2)；

图2为FAD2A基因野生型突变型杂合体鉴定(图中左侧为体系1，右侧为体系2)；

图3为FAD2B基因野生型纯合体和突变型纯合体鉴定(图中左侧为体系3，右侧为体系4)；

图4为FAD2B基因野生型突变型杂合体鉴定(图中左侧为体系3，右侧为体系4)。

具体实施方式

本发明的具体应用方法包括如下步骤：

(1)采用“花生健康组织和病组织简便快速DNA提取方法”(专利申请号：200910255786.0)中所述花生子叶组织薄片快速提取待测样品DNA作为PCR模板。

(2)配制前述四种PCR检测体系，分别加入待测模板。

(3)将配好的检测体系放在同一台PCR仪中，同时执行前述共同反应程序。

(4)反应结束后，取样品进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果，判读所测样品的基因型。判读依据为，在扩增得到内参带的前提下，每个体系中扩增得到了目的带，即证明存在该等位基因，反之即不存在该等位基因。例如，体系(1)和(3)有目的带，被测样品的基因型即为AABB；体系(2)和(4)有目的带，被测样品的基因型即为aabb；体系(1)、(2)和(3)有目的带，被测样品的基因型即为AaBB；体系(1)、(2)和(4)有目的带，被测样品的基因型即为Aabb；体系(1)、(3)和(4)有目的带，被测样品的基因型即为AABb；体系(2)、(3)和(4)有目的带，被测样品的基因型即为aaBb；体系(1)、(2)、(3)和(4)都有目的带，被测样品的基因型即为AaBb。

花生高油酸杂交育种可行的方案是：正常油酸花生与高油酸花生(FAD2A448G＞A和FAD2B441_442insA)杂交，采用本方法鉴定F_0∶1真杂种，收获F_1∶2种子，进行近红外扫描。获得的高油酸材料继续就其他农艺性状进行选择；获得的中油酸材料进一步采用本法进行基因分型，获得同时具有FAD2A、FAD2B突变型基因的花生材料(这样的材料后代还有可能分离出高油酸材料)，在F₂代结合田间表现进行选择；收获F_2∶3种子，进行近红外扫描，获得高油酸材料。对F₃代及后期世代其他农艺性状继续选择，直至育成兼具高油酸和其他优良特性的花生品种。这种方法对于育成高油酸高产型花生品种是极为有利的。

Claims

1.一种花生Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)针对脂肪酸脱氢酶基因FAD2A、FAD2B的野生型和突变型基因各设计一套PCR引物组合和检测体系；

(2)采用通用的PCR反应程序；

2.根据权利要求1所述的花生Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法，其特征在于，对FAD2A和FAD2B的野生型和突变型基因各设置25μl PCR检测体系。

3.根据权利要求2所述的花生Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法，其特征在于，FAD2A野生型基因的检测体系为：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；

引物FAD2A-F：1μl；

引物FAD2A-G：1μl；

引物FAD2-R：0.1-0.8μl；

模板DNA：＜1μg；

ddH₂O：补至25μl。

4.根据权利要求3所述的花生Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法，其特征在于，所述的引物FAD2A-F序列为GATTACTGATTATTGACTTGCTTTG；引物FAD2A-G序列为GTTTTGGGACAAACACTTCTTC ；引物FAD2-R序列为CTCTGACTATGCATCAGAACTTGT。

5.根据权利要求2所述的花生Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法，其特征在于，FAD2A突变型基因的检测体系为：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；

引物FAD2A-F：1μl；

引物FAD2A-A：1μl；

引物FAD2-R：0.1-0.8μl；

模板DNA：＜1μg；

ddH₂O：补至25μl。

6.根据权利要求5所述的花生Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法，其特征在于，所述的引物FAD2A-F序列为GATTACTGATTATTGACTTGCTTTG；引物FAD2A-A序列为GTTTTGGGACAAACACTTCTTT ；引物FAD2-R序列为CTCTGACTATGCATCAGAACTTGT。

7.根据权利要求2所述的花生Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法，其特征在

于，FAD2B野生型基因的检测体系为：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；

引物FAD2B-F：1μl；

引物FAD2B-C：1μl；

引物FAD2-R：0.1-0.8μl；

模板DNA：＜1μg；

ddH₂O：补至25μl。

8.根据权利要求7所述的花生Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法，其特征在于，所述的引物FAD2B-F序列为CAGAACCATTAGCTTTGTAGTAGTG；引物FAD2B-C序列为AACACTTCGTCGCGGTTG ；引物FAD2-R序列为CTCTGACTATGCATCAGAACTTGT。

9.根据权利要求2所述的花生Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法，其特征在于，FAD2B突变型基因的检测体系为：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；

引物FAD2B-F：1μl；

引物FAD2B-A：1μl；

引物FAD2-R：0.1-0.8μl；

模板DNA：＜1μg；

ddH₂O：补至25μl。

10.根据权利要求9所述的花生Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因快速分型方法，其特征在于，所述的引物FAD2B-F序列为CAGAACCATTAGCTTTGTAGTAGTG；引物FAD2B-A序列为AACACTTCGTCGCGGTTT；引物FAD2-R序列为CTCTGACTATGCATCAGAACTTGT。