CN103468678A - 高油酸花生分子标记及其辅助选择回交育种方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高油酸分子标记和利用该标记进行辅助选择的回交育种方法及其应用。分子标记的变异特异引物序列为：正向引物MITE-INS-F和反向引物MITE-INS-R；其无变异特异引物序列为：正向引物WILD-F和反向引物WILD-R。利用分子标记进行回交育种包括将基因型AABB的花生亲本，与基因型aabb亲本杂交，然后回交；利用基因组中的一对引物扩增FAD2A基因片段，选择含Aa基因型的单株；利用花生ahFAD2B位点的引物作为标记进行PCR检测，选择含Bb基因型的单株；将两个标记均显性即含AaBb基因型的单株与亲本AABB回交，直至从后代中选出基因型为aabb,其它农艺性状与轮回亲本一致的高油酸单株，然后自交和扩大繁殖。本发明分子标记，方法简单，成本低，结果稳定；该分子标记进行回交育种，可显著提高性状选择的准确性，降低育种成本，提高育种效率。

Description

高油酸花生分子标记及其辅助选择回交育种方法和应用

技术领域

本发明属于农业生物工程领域，具体涉及一种高油酸分子标记和利用该标记进行辅助选择的回交育种方法及其应用。

背景技术

栽培花生（Arachis hypogaea），又名落花生，蝶形花科，属一年生草本植物。花生原产南美，其种植地区主要分布在亚洲、非洲和美洲，其中亚洲约占60%，非洲约占30%， 美洲约占5.5%。我国是世界第一花生生产、消费和出口大国，花生在各省、市、自治区均有种植。花生作为重要的油料作物,其籽粒脂肪酸组成对花生的营养品质和贮藏品质均有很大影响。花生油中的油酸和亚油酸占总脂肪酸的80%左右。油酸是一种单不饱和脂肪酸,能降低身体低密度脂蛋白（LDL)水平,维持高密度脂蛋白（HDL)的水平；油酸比亚油酸等多不饱和脂肪酸的稳定性高,高油酸的食用油更耐贮藏,而且高温烹调不易氧化变质。因此,高油酸花生不仅有益于人们的身体健康,也可有效延长花生制品的保质期和货架期。

选育高油酸花生新品种是花生育种的重要目标之一。目前我国大面积推广的花生品种油酸含量不高,大多数花生种质资源的籽仁油酸含量在37%-55%之间，70%以上高油酸含量的花生资源几乎没有。

自从美国Norden（1987）筛选出油酸含量高达80%的高油酸花生自然突变体F435后，围绕花生油酸、亚油酸含量的分子基础及遗传规律研究取得了较大进展。已知FAD2 ( △¹²脂肪酸脱氢酶)是脂肪酸生物合成途径中催化油酸在第12碳位脱氢，形成双键向亚油酸转变的关键酶。花生基因组中存在两个ahFAD2等位基因，即ahFAD2A和 ahFAD2B，分别来自A和B基因组。高油酸是ahFAD2A基因在448 bp处发生G-A碱基替换，同时ahFAD2B基因突变的结果。高油酸花生自然突变体F435是ahFAD2B在442bp处发生一个A插入；高油酸花生诱发突变体M2-225和C458分别是在ahFAD2B基因起始密码子后997 bp和665 bp处存在MITE插入，导致基因功能丧失(Patel et al, 2004)。

为利用高油酸突变体作为杂交亲本进行分子标记辅助选择育种（MAS），Barkley等(2010)开发了F435突变位点的实时定量 PCR方法进行高油酸基因分型；Chen等(2010)开发了F435突变位点特异的普通PCR方法；Chu等（2011）利用CAPS方法进行了分子标记辅助选择的高油酸花生品种选育，但这些方法均有相应的不足，具有荧光标记成本高、结果不稳定和方法繁琐、酶成本高等缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题：针对现有技术存在的缺陷，提供一种高油酸花生分子标记；该标记引物具有标记方法简单、成本低和结果稳定的优点；

还提供了利用该分子标记进行高油酸花生的回交育种方法，该育种方法可显著提高性状选择的准确性，降低育种成本，提高育种效率。

本发明的技术方案：

一种高油酸花生分子标记，在花生ahFAD2B位点的变异特异引物序列分别为：

正向引物MITE-INS-F：GGATGATGGATTGTATGG，

反向引物MITE-INS-R：CTCTGACTATGCATCAG；

在花生ahFAD2B位点无变异特异引物序列分别为： 

正向引物WILD-F为：CAGAACCATTAGCTTTG，

反向引物WILD-R为：CTGAGACATAAATTAGAAGCC。

利用所述的分子标记进行高油酸花生的回交育种方法，包括以下步骤：

（1）将基因型AABB的普通油酸含量的花生亲本，与基因型aabb的高油酸含量的花生亲本杂交，得到后代F₁；

（2）选择后代F₁做父本，与基因型AABB的花生亲本回交，得到后代BC₁F₁；

（3）提取后代BC₁F₁单株的DNA，利用花生基因组中的一对引物扩增FAD2A基因片段，其中正向引物aF19为：GATTACTGATTATTGACTT，反向引物R3为：CCCTGGTGGATTGTTCA，

扩增后测序，选择含Aa基因型的单株；

然后利用所述花生ahFAD2B位点的变异特异引物和无变异特异引物作为标记分别对（Aa）基因型的单株进行PCR检测选择Bb基因型的单株；将两个标记均显性即含AaBb基因型的BC₁F₁单株继续与亲本AABB回交，得到后代BC₂F₁；

（4）提取后代BC₂F₁单株的DNA，按照步骤（3）的方法进行引物扩增和PCR检测，将两个标记均显性即AaBb基因型的BC₂F₁单株继续与优良亲本AABB回交，得到后代BC₃F₁；

（5）提取后代BC₃F₁单株的DNA，将两个标记均显性即含AaBb基因型的BC₃F₁植株进行自交，按照步骤（3）的方法进行引物扩增和PCR检测，从后代中选择基因型为aabb的高油酸含量的单株，即得到所述的高油酸花生品种。

所述普通油酸含量花生亲本的油酸含量<55%，高油酸含量的花生亲本油酸含量>70%。

其中利用FAD2A引物的扩增步骤为：

（1）PCR反应体系：PCR反应体系总体积为50 μL，包括10×buffer 5 μL、2 mmol L^–1 dNTPs 5 μL、25 mmol L^–1 MgSO₄ 3 μL、10 μmol L^–1的正向引物和反向引物引物各1.5 μL、模板DNA 200 ng、La Taq酶1 U；

（2） PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50.9℃退火30 s，72℃延伸45 s，30次循环；最后72℃延伸10 min。

所述利用花生ahFAD2B位点的变异特异引物和无变异特异引物进行PCR检测的方法为：

先利用正向引物MITE-INS-F和反向引物MITE-INS-R进行PCR，检测有无MITE插入；然后利用正向引物WILD-F和反向引物WILD-R进行PCR，检测是否有MITE插入纯合体；

具体步骤为：

（1）PCR反应体系：PCR反应体系总体积为10 μL, 含10×buffer 1 μL、2 mmol L^–1 dNTPs 1 μL、10 μmol L^–1正向引物和反向引物各0.5 μL、模板DNA 200 ng、Taq酶0.1 U；

（2）PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55.7℃或55.2℃退火30 s，72℃延伸45 s，30次循环；最后72℃延伸10 min；

（3）电泳检测：将两对FAD2B引物的PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳；

（4）凝胶经染色后在凝胶扫描仪中检测扩增条带；根据两次电泳的带型得到样本相应的基因型。

所述的高油酸花生分子标记在回交育种中的应用。

本发明的积极有益效果：

1、本发明提供一种高油酸花生分子标记在花生ahFAD2B位点的变异特异引物和无变异特异引物；利用该分子标记进行基因分型及油酸含量验证表明，无论在AA背景下还是在aa背景下，B基因组的基因型从BB、Bb到bb油酸含量均呈逐渐升高趋势，表明PCR分型结果与基因型对应的油酸含量变化一致，可以作为油酸性状选择的辅助标记。

2、本发明针对ahFAD2B的MITE插入突变位点的普通PCR分子标记，方法简单，成本低，结果稳定；与定量PCR方法、酶切方法比较，操作简单；不用荧光染料及限制性内切酶，检测成本低；通过两个杂交群体后代的验证结果，普通PCR条件可重复试验，结果稳定。

3、利用本发明的分子标记进行回交育种，为辅助选择高油酸花生育种提供了新的技术手段，可显著提高性状选择的准确性，降低育种成本，提高育种效率。

由于油酸含量的化学测定需要破坏籽粒，并且需要一定的样品量，所以传统高油酸育种需要等到育种高世代，性状基本稳定并且种子量较多时，才进行高油酸性状的选择。油酸含量的化学测定成本较高，高世代检测也增加了育种成本，降低育种效率；而本发明在分离世代的早代即可当代检测确定高油酸基因型，基因型选择准确率高，不需化学测定，成本低；结合回交育种，四个世代即可得到稳定的高油酸优良品种，能显著提高育种效率。

附图说明

图1利用MITE-INS引物进行ahFAD2B位点变异检测的扩增带型图；

图2利用WILD引物进行ahFAD2B野生型位点检测的扩增带型图；

图3利用分子标记进行高油酸花生回交育种的路线图。

具体实施方式

实施例一、高油酸花生分子标记

（一）分子标记的引物序列及其带型

1. ahFAD2B位点变异特异引物（检测MITE插入）

在花生FAD2突变型基因MITE插入序列的63 bp处设计正向引物MITE-INS-F，在MITE插入的下游472 bp处设计反向引物MITE-INS-R，以检测MITE插入；如果存在位点变异，将扩增出613 bp的预期条带；如果没有位点变异，将扩增不出任何条带，得到的引物如下：

正向引物MITE-INS-F： 5’……GGATGATGGATTGTATGG…….3’

反向引物MITE-INS-R： 5’…..CTCTGACTATGCATCAG …...3’ 。

2. ahFAD2B位点无变异特异引物（检测野生型无MITE插入）

在花生FAD2野生型基因 -80 bp处设计正向引物WILD-F，654 bp处设计反向引物WILD-R，如果存在位点变异，将扩增不出任何条带；如果不存在位点变异，将扩增出754 bp的预期条带，得到的引物如下：

正向引物WILD-F：5’…..CAGAACCATTAGCTTTG…...3’

反向引物WILD-R：5’….. CTGAGACATAAATTAGAAGCC…...3’ 。

MITE是指微型反向重复转座元件，其组织结构类似DNA转座子，两端含有反向重复序列。

3. 不同基因型的分子标记带型，参见表1。

                         表1 基因型与带型对照表

从表1基因型与带型对照表可以得出如下结论：BB基因型只有一条野生型带（Ⅰ型）； Bb基因型具有突变型和野生型两条带（Ⅱ型）；bb基因型只有一条突变型带（Ⅲ型）。

实施例二、利用分子标记进行基因分型及其油酸含量验证

1. 远杂9102×wt09-0023后代基因分型及其油酸含量

提取远杂9102×wt09-0023杂交组合的F3:4单株后代DNA,利用上述设计的ahFAD2B位点的两对分子标记引物分别进行PCR扩增，扩增结果带型如图1、图2（图中株系编号为三位数的为远杂9102×wt09-0023，株系编号四位数的是阜花12×wt09-0023）。结合FAD2A的测序结果，将FAD2B带型与基因型、油酸含量进行比较（表2）。

结果表明，在AA背景下B基因组的基因型从BB、Bb到bb，油酸含量从31.9%、38.1%提高到63.3%；在aa背景下B基因组的基因型从BB、Bb到bb，油酸含量从38.0%、49.3%提高到69.4%。可见，无论在AA背景下还是在aa背景下，B基因组的基因型从BB、Bb到bb油酸含量均呈逐渐升高的趋势，表明PCR分型结果与基因型对应的油酸含量变化一致，可以作为油酸性状选择的辅助标记。

表2 远杂9102×wt09-0023后代FAD2B带型与基因型、油酸含量比较

 2. 阜花12×wt09-0023后代基因分型及其油酸含量

提取阜花12×wt09-0023杂交组合的F3:4单株后代DNA,利用上述ahFAD2B位点的两对分子标记引物分别进行PCR扩增，扩增结果带型如图1、图2。结合FAD2A的测序结果，将FAD2B带型与基因型、油酸含量进行比较（表3）。

结果表明，在AA背景下，B基因组的基因型从BB、Bb到bb，油酸含量从31.9%、37.8%提高到48.9%；在aa背景下，B基因组的基因型从Bb到bb，油酸含量从47.6%提高到71.2%。可见，无论在AA背景还是在aa背景下，B基因组的基因型从BB、Bb到bb油酸含量均呈逐渐升高的趋势，表明PCR分型结果与基因型对应的油酸含量变化一致，可以作为油酸性状选择的辅助标记。

表3阜花12×wt09-0023后代FAD2B带型与基因型、油酸含量比较

实施例三、利用分子标记进行高油酸花生的回交育种方法，参见图3，该方法包括以下步骤：

（1）采用普通油酸含量（油酸含量<55%）其它性状优良的亲本（如抗病、高产、早熟、含油量高、适应性广等），与高油酸亲本（油酸含量>70%）进行杂交，得到F₁；

（2）选择后代F₁做父本，与基因型AABB的花生亲本回交，得到后代BC₁F₁；

（3）提取花生BC₁F₁单株的DNA，首先利用FAD2A中的一对引物扩增FAD2A基因片段，其中正向引物为aF19：GATTACTGATTATTGACTT，反向引物为R3：CCCTGGTGGATTGTTCA，

扩增后测序，选择含Aa基因型的单株；

然后利用所述花生ahFAD2B位点的变异特异引物和无变异特异引物分别对含Aa基因型的单株进行PCR检测，将两个标记均显性即AaBb基因型的BC₁F₁单株继续与优良亲本AABB回交，得到后代BC₂F₁；

（4）提取后代BC₂F₁单株的DNA，按照步骤（3）的方法进行引物扩增和PCR检测，将两个标记均显性即AaBb基因型的BC₂F₁单株继续与优良亲本AABB回交，得到后代BC₃F₁； 

（5）提取后代BC₃F₁单株的DNA，将两个标记均显性即AaBb基因型的BC₃F₁植株进行自交，按照步骤（3）的方法进行引物扩增和PCR检测，从后代中选择基因型为aabb的油酸含量70%以上的高油酸单株，并且具有轮回亲本其它性状的单株（除油酸含量提高外，其它农艺性状如产量、抗病性、株型等基本与轮回亲本一致），即得到所述的高油酸花生品种。 

实施例四、利用分子标记进行高油酸花生的回交育种方法，参见图3，该方法包括以下步骤：

（1）采用普通油酸含量（油酸含量<55%）但其它性状优良的亲本（如抗病、高产、早熟、含油量高、适应性广等），与高油酸亲本（油酸含量>70%）进行杂交，得到F₁，优良亲本遗传贡献占50%；

（2）以F₁为父本，与基因型AABB的花生亲本回交，得到后代BC₁F₁，优良亲本遗传贡献占75%；

（3）提取花生BC₁F₁单株的DNA，首先利用FAD2A中的一对引物扩增FAD2A基因片段，其中正向引物为aF19：GATTACTGATTATTGACTT，反向引物为R3：CCCTGGTGGATTGTTCA，

扩增后测序，选择含Aa基因型的单株；

然后利用所述花生ahFAD2B位点的变异特异引物和无变异特异引物分别对含Aa基因型的单株进行PCR检测，将两个标记均显性即 含AaBb基因型的BC₁F₁单株继续与优良亲本AABB回交，得到后代BC₂F₁；优良亲本遗传贡献占87.5%；

（4）提取后代BC₂F₁单株的DNA，按照步骤（3）的方法进行引物扩增和PCR检测，将两个标记均显性即 含AaBb基因型的BC₂F₁单株继续与优良亲本AABB回交，得到后代BC₃F₁；优良亲本遗传贡献占93.8%；

（5）BC₃F₁自交，按照步骤（3）的方法进行引物扩增和PCR检测，即得到油酸含量70%以上的高油酸单株（aabb），并且具有轮回亲本其它性状（除油酸含量提高外，其它农艺性状如产量、抗病性、株型等基本与轮回亲本一致）；

（6）将基因型为aabb的高油酸花生单株自交，进行扩大繁殖，参加后续株行、株系和产量比较试验，即得到所述的高油酸花生品种。

其中利用FAD2A引物的扩增步骤为：

（1）PCR反应体系：PCR反应体系总体积为50 μL，包括10×buffer 5 μL、2 mmol L^–1 dNTPs 5 μL、25 mmol L^–1 MgSO₄ 3 μL、10 μmol L^–1的正向引物和反向引物引物各1.5 μL、模板DNA 200 ng、La Taq酶1 U；

（2） PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50.9℃退火30 s，72℃延伸45 s，30次循环；最后72℃延伸10 min。

其中利用花生ahFAD2B位点的变异特异引物和无变异特异引物进行PCR检测的方法是：

先利用正向引物序列MITE-INS-F和反向引物序列MITE-INS-R进行PCR，检测有无MITE插入；然后利用正向引物序列WILD-F和反向引物序列WILD-R进行PCR，检测是否有MITE插入纯合体。

具体步骤为：

（1）PCR反应体系：PCR反应体系总体积为10 μL, 含10×buffer 1 μL、2 mmol L^–1 dNTPs 1 μL、10 μmol L^–1正向引物和反向引物各0.5 μL、模板DNA 200 ng、Taq酶0.1 U；

（2） PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55.2℃(WILD-F/WILD-R)或 55.7℃(MITE-INS-F/MITE-INS-R) 退火30 s，72℃延伸45 s，30次循环；最后72℃延伸10 min；

（3）电泳检测：将两对FAD2B引物的PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳；凝胶经染色后在凝胶扫描仪中检测扩增条带；

（4）按照表1的带型对照表得到样本相应的基因型。

                                          序列表

 

<110>  河南省农业科学院

 

<120>  高油酸花生分子标记及其辅助选择回交育种方法和应用

 

<130>  PCR技术

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.4

 

<210>  1

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Arachis hypogaea

 

<400>  1

ggatgatgga ttgtatgg                                                   18

 

 

<210>  2

<211>  17

<212>  DNA

<213>  Arachis hypogaea

 

<400>  2

ctctgactat gcatcag                                                    17

 

 

<210>  3

<211>  17

<212>  DNA

<213>  Arachis hypogaea

 

<400>  3

cagaaccatt agctttg                                                    17

 

 

<210>  4

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Arachis hypogaea

 

<400>  4

ctgagacata aattagaagc c                                               21

 

 

<210>  5

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Arachis hypogaea

 

<400>  5

gattactgat tattgactt                                                  19

 

 

<210>  6

<211>  17

<212>  DNA

<213>  Arachis hypogaea

 

<400>  6

ccctggtgga ttgttca                                                    17

 

 

Claims (6)

1.一种高油酸花生分子标记，其特征在于，所述分子标记在花生ahFAD2B位点的变异特异引物序列分别为：

正向引物MITE-INS-F：GGATGATGGATTGTATGG，

反向引物MITE-INS-R：CTCTGACTATGCATCAG；

在花生ahFAD2B位点无变异特异引物序列分别为： 

正向引物WILD-F为：CAGAACCATTAGCTTTG，

反向引物WILD-R为：CTGAGACATAAATTAGAAGCC。

2.利用权利要求1所述的分子标记进行高油酸花生的回交育种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）将基因型AABB的普通油酸含量的花生亲本，与基因型aabb的高油酸含量的花生亲本杂交，得到后代F₁；

（2）以后代F₁做父本，与基因型AABB的花生亲本回交，得到后代BC₁F₁；

（3）提取后代BC₁F₁单株的DNA，利用花生基因组中的一对引物扩增FAD2A基因片段，其中正向引物aF19为：GATTACTGATTATTGACTT，反向引物R3为：CCCTGGTGGATTGTTCA，

扩增后测序，选择含Aa基因型的单株；

然后利用所述花生ahFAD2B位点的变异特异引物和无变异特异引物作为标记分别对含Aa基因型的单株进行PCR检测，选择Bb基因型的单株；将两个标记均显性即含AaBb基因型的BC₁F₁单株继续与亲本AABB回交，得到后代BC₂F₁；

（4）提取后代BC₂F₁单株的DNA，按照步骤（3）的方法进行引物扩增和PCR检测，将两个标记均显性即AaBb基因型的BC₂F₁单株继续与优良亲本AABB回交，得到后代BC₃F₁；

（5）提取后代BC₃F₁单株的DNA，将两个标记均显性即含AaBb基因型的BC₃F₁植株进行自交，按照步骤（3）的方法进行引物扩增和PCR检测，从后代中选择基因型为aabb的高油酸含量的单株，即得到所述的高油酸花生品种。

3.如权利要求2所述的回交育种方法，其特征在于：所述普通油酸含量花生亲本的油酸含量<55%，高油酸含量的花生亲本油酸含量>70%。

4.如权利要求2所述的回交育种方法，其特征在于：其中利用FAD2A引物的扩增步骤为：

（1）PCR反应体系：PCR反应体系总体积为50 μL，包括10×buffer 5 μL、2 mmol L^–1 dNTPs 5 μL、25 mmol L^–1 MgSO₄ 3 μL、10 μmol L^–1的正向引物和反向引物引物各1.5 μL、模板DNA 200 ng、La Taq酶1 U；

（2） PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50.9℃退火30 s，72℃延伸45 s，30次循环；最后72℃延伸10 min。

5.如权利要求2-4任一项所述的回交育种方法，其特征在于：所述利用花生ahFAD2B位点的变异特异引物和无变异特异引物进行PCR检测的方法为：

先利用正向引物MITE-INS-F和反向引物MITE-INS-R进行PCR，检测有无MITE插入；然后利用正向引物WILD-F和反向引物WILD-R进行PCR，检测是否有MITE插入纯合体；

具体步骤为：

（1）PCR反应体系：PCR反应体系总体积为10 μL, 含10×buffer 1 μL、2 mmol L^–1 dNTPs 1 μL、10 μmol L^–1正向引物和反向引物各0.5 μL、模板DNA 200 ng、Taq酶0.1 U；

（2）PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55.7℃或55.2℃退火30 s，72℃延伸45 s，30次循环；最后72℃延伸10 min；

（3）电泳检测：将两对FAD2B引物的PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳；

（4）凝胶经染色后在凝胶扫描仪中检测扩增条带；根据两次电泳的带型得到样本相应的基因型。

6.权利要求1-5任一项所述的高油酸花生分子标记在回交育种中的应用。

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