JP2012521189A - キサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス耐性アブラナ属植物およびそれらの調製 - Google Patents
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Abstract
本発明は、キサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）（Ｘｃｃ）耐性アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、およびそれらの種子、果実および／または植物部位、ならびにそれらの調製方法に関する。詳細には、本発明は、Ｘｃｃ耐性キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）植物、およびそれらの種子、果実および／または植物部位、ならびにそれらの調製方法に関する。さらに、本発明は、量的形質遺伝子座（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｒａｉｔ Ｌｏｃｉ：ＱＴＬ’ｓ）を同定するための、本Ｘｃｃ耐性および分子マーカー、特別にはランダム増幅マイクロサテライト多型（ＲＡＭＰ）マーカーを提供するＱＴＬ’ｓに関する。
Description
本発明は、キサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）（Ｘｃｃ）耐性アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、およびそれらの種子、果実および／または植物部位、ならびにそれらの調製方法に関する。詳細には、本発明は、Ｘｃｃ耐性キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）植物に関する。本発明は、これらの耐性植物由来の種子、果実、および／またはその他の植物部位にさらに関する。さらに、本発明は、本Ｘｃｃ耐性を提供する量的形質遺伝子座（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｒａｉｔ Ｌｏｃｉ：ＱＴＬ’ｓ）、および本ＱＴＬ’ｓを同定するための分子マーカー、特別にはランダム増幅マイクロサテライト多型（ＲＡＭＰ）マーカーに関する。
微生物のキサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリスは、十字花科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）における黒斑病の一番の原因物質である。世界中で、この微生物はおそらく十字花科の疾病の主要病原体である。黒斑病は、一般にヨーロッパ、アメリカ、アフリカ、アジア、オーストラリアおよびオセアニアの一部において見出される。この細菌性疾病についての主要宿主植物は、キャベツである。しかし黒斑病は、他の十字花科、雑草および観賞植物においても見出される。
キサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリスによる感染は、一般に葉の排水組織を通して、または一部の場合には気孔もしくは損傷部を通して発生する。一次感染後、この微生物は維管束を通して拡がり、それによって葉における黒色葉脈およびＶ形病変を誘発する。結果として、葉の一部、または複数の部分は枯れて黄変する。
キサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリスは、発生初期に種子由来の植物を感染させることができる種子伝染性疾病である。本微生物は、３年間までの期間にわたって種子上で生残することができる。本微生物による感染は、さらにまた植物部位貯蔵室、第２宿主植物および潅漑システムを通して発生することができる。
化学物質によるこの疾病の管理は不可能である。この疾病に対抗するために利用できる最適な対策は、疾病を生じさせない、すなわち微生物を含まない出発材料の使用および衛生対策、例えば感染した宿主植物の除去である。疾病を生じさせない出発材料は、病原体を含まない種子の使用または感染した種子を物理的に処置するステップによって入手できる。成長期中にもＸｃｃ感染を発生しないままでいる耐性植物種の使用および入手可能性は、健常植物、すなわちＸｃｃを含まない植物を栽培するために強く好ましい。
アブラナ属は、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）（以前は、十字花科と称された）の１植物属である。この植物属のメンバーは、キャベツまたはカラシナとしても公知である。アブラナ属は、セイヨウアブラナ、カリフラワー、赤キャベツ、サボイキャベツ、白キャベツ、オックスハートキャベツ、カーリー・ケールキャベツ、ブロッコリー、芽キャベツ、ハクサイ、カブカンラン（ｔｕｒｎｉｐ ｃａｂｂａｇｅ）およびポルトガルキャベツ（トロンチューダ（ｔｒｏｎｃｈｕｄａ））を含む、多数の重要な農作物および園芸作物を含んでいる。
アブラナ属植物の多数の植物部位、例えば根（カブ）、茎（カブカンラン）、葉（例えば、白および赤キャベツ）、腋芽（芽キャベツ）、花（カリフラワー、ブロッコリー）などは消費のために使用される。さらに、セイヨウアブラナおよび菜種もまた、植物油を提供するために使用される。白色もしくは紫色の花、または特異的な色もしくは形状の葉を備える一部の種は、観賞目的のために栽培される。
食品製造のためのアブラナ属植物の重要性およびキサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス感染に関連する経済的損失を考慮に入れると、本発明の幾つかある目的の中でも特に１つの目的は、Ｘｃｃ耐性アブラナ属植物およびその調製方法を提供することである。
Ｘｃｃ耐性アブラナ属植物に対する必要性は、黒斑病を管理するための適正な費用効果的で効率的な手段の非存在によってさらに指摘される。例えば、本細菌に対して利用できる殺生物剤は存在しない。
本発明の幾つかの目的の中でも特に上述の目的は、添付の特許請求項１に規定されたＸｃｃ耐性アブラナ属植物を提供するための方法によって満たされる。
詳細には、特に本発明の上述の目的は、キサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリスアクセプター植物を提供するための方法であって、
−ゲノム内に量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）を含む第１キャベツドナー植物を選択するステップと、
−ゲノム内に量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）を含む第２キャベツドナー植物を選択するステップと、
−アブラナ属アクセプター植物中において、第１ドナー植物由来の量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）および第２ドナー植物由来の量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）を遺伝子移入する、またはゲノム的に組み合わせるステップとを含み、
このとき、
量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）は、配列番号１およびプライマー６のプライマー組み合わせによる１５８〜１６２ｂｐのフラグメント；配列番号２およびプライマー６のプライマー組み合わせによる２８３〜２８７ｂｐのフラグメント；配列番号３およびプライマー６のプライマー組み合わせによる３７０〜３７４ｂｐのフラグメント；ならびに配列番号４およびプライマー６のプライマー組み合わせによる４１〜４５ｂｐのフラグメントからなる群から選択される１つ以上のＲＡＭＰマーカーを特徴とし、
量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）は、配列番号５およびプライマー６のプライマー組み合わせによる８８〜９２ｂｐのフラグメント；配列番号６およびプライマー６のプライマー組み合わせによる１２５〜１２９ｂｐのフラグメント；配列番号７およびプライマー６のプライマー組み合わせによる３３４〜３３８ｂｐのフラグメント；ならびに配列番号８およびプライマー６のプライマー組み合わせによる４７〜５１ｂｐのフラグメントからなる群から選択される１つ以上のＲＡＭＰマーカーを特徴とし、かつ、
このときアブラナ属アクセプター植物は、そのゲノムに関して、第１および第２アブラナ属ドナー植物と同一ではない、方法によって満たされる。
−ゲノム内に量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）を含む第１キャベツドナー植物を選択するステップと、
−ゲノム内に量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）を含む第２キャベツドナー植物を選択するステップと、
−アブラナ属アクセプター植物中において、第１ドナー植物由来の量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）および第２ドナー植物由来の量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）を遺伝子移入する、またはゲノム的に組み合わせるステップとを含み、
このとき、
量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）は、配列番号１およびプライマー６のプライマー組み合わせによる１５８〜１６２ｂｐのフラグメント；配列番号２およびプライマー６のプライマー組み合わせによる２８３〜２８７ｂｐのフラグメント；配列番号３およびプライマー６のプライマー組み合わせによる３７０〜３７４ｂｐのフラグメント；ならびに配列番号４およびプライマー６のプライマー組み合わせによる４１〜４５ｂｐのフラグメントからなる群から選択される１つ以上のＲＡＭＰマーカーを特徴とし、
量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）は、配列番号５およびプライマー６のプライマー組み合わせによる８８〜９２ｂｐのフラグメント；配列番号６およびプライマー６のプライマー組み合わせによる１２５〜１２９ｂｐのフラグメント；配列番号７およびプライマー６のプライマー組み合わせによる３３４〜３３８ｂｐのフラグメント；ならびに配列番号８およびプライマー６のプライマー組み合わせによる４７〜５１ｂｐのフラグメントからなる群から選択される１つ以上のＲＡＭＰマーカーを特徴とし、かつ、
このときアブラナ属アクセプター植物は、そのゲノムに関して、第１および第２アブラナ属ドナー植物と同一ではない、方法によって満たされる。
本発明の第１態様によると、第１および第２ドナー植物を選択または同定するステップは、各ドナー植物のゲノム内の本Ｘｃｃ耐性に関連する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ’ｓ）の存在を決定することによって提供される。
上記のような決定は、好ましくは一般に当分野において公知である標準分子生物学技術を使用することによって提供することができる。これらの技術の１つの例は、潜在的ドナー植物のゲノムＤＮＡを単離するステップを含み、その後には例えばＰＣＲ、ＤＮＡフィンガープリンティングまたはサウザンブロットによって単離されるゲノム内の関連量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）の存在の決定が続く。
各ドナー植物のゲノム内における本遺伝子座を同定するために特に好ましい方法は、当技術分野においてランダム増幅マイクロサテライト多型もしくはＲＡＭＰと呼ばれるＤＮＡフィンガープリンティング技術である。この技術によると、ＰＣＲ反応、または核酸増幅反応は、本プライマー（配列番号１〜８）およびＲＡＰＤプライマー（Ｏｐｅｒｏｎ ＲＡＰＤ １０−ｍｅｒキットＡ−０１〜ＢＨ−２０）を使用することによってドナー植物の単離ゲノム材料上で実施される。
ＰＣＲ反応後、得られた増幅産物は、例えば、ゲル電気泳動法によって分離することができ、塩基対中のそれらのサイズは、例えば分子塩基対ラダー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｅｐａｉｒ ｌａｄｄｅｒ）を使用することによって決定できる。本発明による量的形質遺伝子座１および２（ＱＴＬ１およびＱＴＬ２）は、耐性を示さない潜在的な複数の他のサイズを備える他のバンドに加えて、少なくとも示唆された塩基対サイズを備えるバンドの存在を特徴とする。
適切なドナー植物を選択した後、ドナー植物中で同定された遺伝子座（ＱＴＬ１およびＱＴＬ２）は、所望のアクセプター植物のゲノム内に導入する、またはゲノム的に結合させることができる。これは、例えば標準異種交配、または遺伝子移入を使用して提供することができ、このとき本ＱＴＬ’ｓの遺伝的形質は、好ましくは上述したマーカーの存在を決定することを通して、子孫において決定される。特に好ましい技術は、好ましくはマーカー分析と組み合わせた繰り返し戻し交配である。
本発明によると、アブラナ属アクセプター植物は、そのゲノムに関して、第１および第２アブラナ属ドナー植物と同一ではない。この状況では、これはドナーおよびアクセプター植物のゲノムを示すドナーおよびアクセプター植物間の相違する表現型を確立することによって、または一般ゲノム解析を通して容易に決定することができる。
したがって、本発明による用語「そのゲノムに関して、同一ではない」は、ドナー植物とアクセプター植物との間における、Ｘｃｃ耐性に関連しない１つ以上の表現型の相違を示す。言い換えると、本アクセプター植物は、当技術分野において一般には相違する植物であると見なされる。
本発明の好ましい実施形態によると、第１アブラナ属ドナー植物および第２アブラナ属ドナー植物は、それらのゲノムに関して同一である。これは、第１および第２ドナー植物を選択するステップが、そのゲノム内にＱＴＬ１およびＱＴＬ２の両方を含む１つのドナー植物を選択するステップを含むことを意味する。言い換えると、この好ましい実施形態は、ＱＴＬ１およびＱＴＬ２の両方を有する適切なアブラナ属ドナー変種を同定し、その後に所望のアブラナ属アクセプター植物中にＱＴＬ１およびＱＴＬ２を導入し、それによってこのアクセプター植物にＸｃｃ耐性を提供するステップを含んでいる。
本発明の好ましい実施形態によると、量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）は、プライマー１．１（配列番号１）および６の組み合わせによる１６０ｂｐのフラグメント；プライマー１．２（配列番号２）および６の組み合わせによる２８５ｂｐのフラグメント；プライマー１．３（配列番号３）および６の組み合わせによる３７２ｂｐのフラグメント；ならびにプライマー１．４（配列番号４）および６の組み合わせによる４３ｂｐのフラグメントからなる群から選択される１つ以上のＲＡＭＰマーカーを特徴とする。
本発明のまた別の好ましい実施形態によると、量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）は、プライマー２．１（配列番号５）および６の組み合わせによる９０ｂｐのフラグメント；プライマー２．２（配列番号６）および６の組み合わせによる１２７ｂｐのフラグメント；プライマー２．３（配列番号７）および６の組み合わせによる３３６ｂｐのフラグメント；ならびにプライマー２．４（配列番号８）および６の組み合わせによる４９ｂｐのフラグメントからなる群から選択される１つ以上のＲＡＭＰマーカーを特徴とする。
本発明の特に好ましい実施形態によると、ドナー植物を選択するステップは、分子生物学技術によって、各アブラナ属ドナー植物のゲノム内の各ＱＴＬに対する１つ以上、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上、および最も好ましくは４つの本発明のＲＡＭＰマーカーの存在を決定する、または同定するステップを含んでいる。
本発明の最も好ましい実施形態によると、選択または同定するステップは、第１および第２アブラナ属ドナー植物中のホモ接合性量的形質遺伝子座１および２（ＱＴＬ’ｓ １および２）を選択するステップをさらに含んでいる。
本発明によるアブラナ属アクセプター植物は、好ましくはキャベツ植物であり、好ましくはＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｖａｒ．ｂｏｔｒｙｔｉｓ（カリフラワー、ロマネスコ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｖａｒ．ｃｙｍｏｓａ（ブロッコリー）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｖａｒ．ａｓｐａｒａｇｏｉｄｅｓ（ブロッコリー）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ．ｇｅｍｎｉｆｅｒａ（芽キャベツ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ ｖａｒ．ａｌｂａ（白キャベツ、オックスハートキャベツ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ ｖａｒ．ｒｕｂｒａ（赤キャベツ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ ｖａｒ．ｓａｂａｕｄａ（サボイキャベツ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ａｃｅｐｈｅｌａ ｖａｒ．ｓａｂｅｌｌｉｃａ（カーリー・ケールキャベツ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ａｃｅｐｈｅｌａ ｖａｒ．ｇｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ（カブカンラン）およびＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ．ｔｒｏｎｃｈｕｄａ ｓｙｎ．ｃｏｓｔａｔａ（ポルトガルキャベツ）からなる群から選択される。
上述したＸｃｃ耐性アブラナ属植物の利点を考慮すると、本発明は、また別の態様によると、そのゲノム内に上記に規定した量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ２）および量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）を含む上記に規定したアブラナ属アクセプター植物、ならびにそれらの種子、果実および／またはその他の植物部位に関する。
この態様の特に好ましい実施形態によると、本発明は、受託番号ＮＣＩＭＢ４１５５３を備えるアブラナ属植物ならびにそれらの種子、果実および／またはその他の植物部位に関する。
さらにまた別の態様によると、本発明は、上記に規定した、キサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス耐性アブラナ属アクセプター植物を提供するための、量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）および量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）の使用に関する。
また別の態様によると、本発明は、本キサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス耐性アブラナ属植物を提供するための、配列番号１〜８（それぞれ、プライマー１．１、１．２、１．３、１．４、２．１、２．２、２．３、および２．４）からなる群から選択される１つ以上のプライマーの使用に関する。
以下では、好ましい実施形態の実施例を使用して、本発明をさらに説明する。この実施例は、単に例示することを目的としていて、決して添付の特許請求項に記載した本発明の範囲を限定することは意図していない。
キャベツへのキサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス（Ｘｃｃ）耐性の品種改良は、複雑なプロセスである。Ｘｃｃの数種の変種は記載されていて、Ｘｃｃ耐性は一般にキャベツでは観察されない。本明細書に記載したＸｃｃに対するキャベツの耐性は定量的性質であり、すなわち、耐性およびそのレベルは遺伝的背景に左右される。これは、幾つかの遺伝子がこの耐性に関与することを意味していて、結果としてＸｃｃに対する耐性度を観察できる。
定性的耐性キャベツ植物、すなわち耐性が遺伝的背景から独立して観察されるキャベツ植物を入手するためには、耐性が本質的に劣性である遺伝源が使用される。戻し交配のプログラムを通して、耐性は様々な遺伝的背景（感受性親系）に導入される。植物の耐性レベルは、フィールド試験によって決定される。関与する形質は劣性であるので、感受性植物との各交配の後には、ホモ接合形にある形質を入手するための同系交配世代が続く。この世代の子孫については、フィールド試験においてそれらの耐性レベルについて試験されなければならない。結果として、新規な交配の効果を視認するためには、一年生植物については少なくとも２年間、および二年生植物については少なくとも４年間を要することになる。
関与する耐性は耐性の様々なレベルとして表示することができるので、耐性は定量的数値で表示される（０〜９のスケール上（このとき０は完全感受性を表し、９は完全耐性を表す））。様々な遺伝的背景における耐性は、単純メンデル遺伝の代わりに、正常分布内での表現型等級付けを示すことが証明された。この分布は感受性側にシフトする可能性があり、これは同系交配世代が耐性源と様々な感受性親系との間の交配から様々なレベルの耐性植物を提供することを意味する。
植物の耐性レベルは幾つかの遺伝因子または量的形質遺伝子座によって決定されることが、分離比および耐性レベルの相違に基づいて証明された。量的形質遺伝子座を示す、または代表するＤＮＡマーカーを同定するためには、ＱＴＬ分析が使用されることが多い。ＱＴＬ’ｓは、独立染色体領域であり、基礎遺伝子と結び付けられると、一緒に遺伝形質を説明する、または指示する。
ＤＮＡマーカーを使用して、様々な遺伝的背景を有するキャベツ集団を対象に、全ゲノムにわたるＱＴＬ分析を実施した。これらの様々な集団の植物を用いて、個別植物の耐性レベルを決定するためにフィールド試験を実施した。マーカー分析のデータおよびフィールド試験のスコアは、観察されたＸｃｃ耐性の原因となるＱＴＬ’ｓの同定を可能にした。
総計すると、６つの独立した遺伝性ＱＴＬ’ｓが、ある程度は、観察された耐性レベルに寄与すると同定された。フィールド試験において植物間で観察された耐性レベルのばらつきは、ＱＴＬ’ｓおよびそれらの様々な組み合わせの存在および／または非存在の結果である。同定された６つのＱＴＬ’ｓ中、本明細書でＱＴＬ１およびＱＴＬ２と命名した２つのＱＴＬ’ｓは、耐性を提供する各遺伝的背景において存在した。言い換えると、これら２つのＱＴＬ’ｓは定性的耐性を示しているが、ＱＴＬ’ｓの残り４つは定量的耐性に寄与すると思われる。これらのＱＴＬ’ｓ中の１つ、すなわちＱＴＬ１は主要ＱＴＬ、すなわち観察された耐性への最大寄与を提供するＱＴＬであると見なすことができる。
品種改良プロセスによって得られた各キサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス耐性同系交配系統は、この主要ＱＴＬを有する。第２ＱＴＬは、主要ＱＴＬに類似して、定量的耐性レベルに寄与する。しかしこの寄与は主要ＱＴＬほど大きくないが、この寄与もまた同様に遺伝的背景から独立している。
残り４つのＱＴＬ’ｓは、相違する遺伝的背景において見出される。これら４つのＱＴＬ’ｓは、耐性レベルのばらつきを生じさせる修飾する役割を有する可能性がある。
これを以下の表１に例示したが、この表のキャベツ植物１〜６はこれらの観察を例示するための実施例である。
２つの主要ＱＴＬ’ｓ、すなわちＱＴＬ１およびＱＴＬ２に関連するＤＮＡマーカーの使用は、Ｘｃｃに耐性である植物を選択する機会を提供した。
疾病試験のみによっては、ホモ接合性形態にある両方のＱＴＬ’ｓを有する植物は、本質的には提供されないと思われる。この疾病試験は、さらにまた本質的には安定性耐性を提供しないと思われるヘテロ接合体形にある１つ以上のＱＴＬ’ｓを有する高耐性レベルを備える植物を生じさせることができる。
数千種を超える植物を用いた疾病試験を実施することは、限定数の交配についてしか可能ではない。しかしＤＮＡマーカーの使用は、所望の植物を予備選択するために１，０００種の植物からなるより多くの集団を分析する機会を提供した。
これに加えて、ＤＮＡマーカーを使用して選択するステップは、さらにまた２つの主要ＱＴＬ’ｓが維持される繰り返し戻し交配を実施する機会を提供した。この方法は１交配世代に付き１または２年を獲得したが、これは品種改良プログラムの１０〜２０年間の加速を意味する。この迅速な方法は、雑種内への新規なＸｃｃ耐性の加速された導入を生じさせる。
雑種の生産における追加の複雑化因子は、両方の親における劣性耐性の存在が必要とされることである。好ましくは、両方の親系、もしくはドナー植物は、２つの主要ＱＴＬ’ｓに対してホモ接合性である。ＤＮＡマーカーを使用することによって、２つの主要ＱＴＬ’ｓに対してホモ接合性である、したがって新規な耐性雑種を生産するために適合する親の同定は、比較的短期間で実施できる。
当該の雑種の種子は、ＮＣＩＭＢ（英国、スコットランド、アバディーン（Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）、ＡＢ２１、９ＹＡ）に受託番号ＮＣＩＭＢ４１５５３を付けて寄託されている。
２つの主要ＱＴＬ’ｓは、どちらも起源内において存在することを特徴とする４つのＤＮＡマーカーを特徴とする。ＱＴＬ１は主要ＱＴＬであり、ＱＴＬ２は副ＱＴＬである。
ＤＮＡマーカーは、ＲＡＭＰ技術によって生成された。ｉＳＳＲおよびＲＡＰＤプライマーが結合されるＲＡＭＰ技術は、その中で耐性とともに特異的に分離する１つ以上のＤＮＡフラグメントを含むバンドパターンを提供する。ＲＡＭＰフラグメントおよび表現型耐性スコアをマッピングすることによって、ＱＴＬを同定する密接に関連したＲＡＭＰマーカーが同定された（表２）。ＱＴＬ内のＤＮＡマーカー間の遺伝距離は、ｃＭ（センチモルガン）によって表される。
ＤＮＡマーカーを生成するために使用した一般ＰＣＲ条件は以下の通りであった：
＜ＲＡＭＰ反応のためのＰＣＲミックス＞
反応１回に付き
約０．２ｎｇ／μＬの植物ゲノムＤＮＡ
７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８）
２０ｍＭのＮＨ４ＳＯ４
０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０
２．８ｍＭのＭｇＣｌ２
０．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ
０．１５μＭのフォワードプライマー
０．２０μＭのリバースプライマー
０．０４単位／μＬのＲｅｄ Ｈｏｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢｇｅｎｅ社、エプソム（ＡＢｇｅｎｅ，Ｅｐｓｏｍ））
反応１回に付き
約０．２ｎｇ／μＬの植物ゲノムＤＮＡ
７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８）
２０ｍＭのＮＨ４ＳＯ４
０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０
２．８ｍＭのＭｇＣｌ２
０．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ
０．１５μＭのフォワードプライマー
０．２０μＭのリバースプライマー
０．０４単位／μＬのＲｅｄ Ｈｏｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢｇｅｎｅ社、エプソム（ＡＢｇｅｎｅ，Ｅｐｓｏｍ））
＜ＰＣＲプログラムＲＡＰＤ３５＞
サイクル数
ステップ１：２分間、９３℃ １
ステップ２：３０秒間、９３℃
ステップ３：３０秒間、３５℃
ステップ４：０．３℃／分で７２℃へ加熱する
ステップ５：１分３０秒間、７２℃
ステップ２〜５を繰り返す ４０
ステップ６：５分間、７２℃ １
サイクル数
ステップ１：２分間、９３℃ １
ステップ２：３０秒間、９３℃
ステップ３：３０秒間、３５℃
ステップ４：０．３℃／分で７２℃へ加熱する
ステップ５：１分３０秒間、７２℃
ステップ２〜５を繰り返す ４０
ステップ６：５分間、７２℃ １
＜ＰＡＧＥ／Ｌｉｃｏｒ社（Ｌｉｃｏｒ）＞
ＲＡＭＰパターンを分析するために、「Ｇｅｎｅ ＲｅａｄＩＲ ４２００ ＤＮＡ分析装置」（Ｌｉｃｏｒ社（Ｌｉｃｏｒ Ｉｎｃ．））を利用した。６．５％アクリルアミドの最適濃度に基づいて、単一塩基のサイズに相違を有するフラグメントを分離することができる。
ＲＡＭＰパターンを分析するために、「Ｇｅｎｅ ＲｅａｄＩＲ ４２００ ＤＮＡ分析装置」（Ｌｉｃｏｒ社（Ｌｉｃｏｒ Ｉｎｃ．））を利用した。６．５％アクリルアミドの最適濃度に基づいて、単一塩基のサイズに相違を有するフラグメントを分離することができる。
この系においてフラグメントを視認するためには、標識された（ＩＲＤｙｅ標識）プライマーを使用することが必要である。このために、フォワードプライマーの量の１／３を同一配列を備える標識されたプライマーと置換した。
＜マーカーの概説＞
本発明をもたらした研究では、表２に示したＤＮＡマーカーを生成するために、表３に示したプライマーを使用した。
本発明をもたらした研究では、表２に示したＤＮＡマーカーを生成するために、表３に示したプライマーを使用した。
様々なプライマー組み合わせを用いたＰＣＲ反応は、各ＱＴＬの存在を表す既定の塩基対サイズを備える核酸フラグメントを提供する（表２を参照）。これらのＤＮＡマーカーは、関係するＱＴＬ’ｓについて特徴的、または指示的である。ＱＴＬを特徴付けるこれらのＤＮＡマーカーの組み合わせは、ドナー植物内のＸｃｃ耐性起源由来のＱＴＬ遺伝子移入の存在について疑う余地のない証拠を提供する。
＜用語の定義＞
ｃＭ−センチモルガン：１００個体当たりの交叉回数に基づく、マーカー間の遺伝距離についての単位。
ＤＮＡマーカー：１つの遺伝子に関連づけられるＤＮＡフラグメント、または当該遺伝子もしくは位置の継承を監視するために使用される、ゲノム上に公知の場所に位置する別のＤＮＡフラグメント。
ゲル電気泳動法：分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）をそれらのサイズ、形状もしくは電荷に基づいて、電場の影響下にあるマトリックス（アガロースまたはポリアクリルアミド）中で分離するための方法。
同系交配世代（自家受粉）：自家花粉を用いた個体の受精。
遺伝子移入：異種交配によって別の系統（栽培品種）内に導入された系統（栽培品種）の染色体フラグメント。
ＩＲＤｙｅ標識：Ｌｉｃｏｒイメージングシステムのために使用される、７００ｎｍまたは８００ｎｍで検出される赤外線標識。
単性：単一遺伝子によって決定される。
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）：特異的ＤＮＡフラグメントを増殖させるためのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）増幅法。この合成反応は、ＤＮＡフラグメントとともにハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを利用し、その後にＤＮＡポリメラーゼが連続温度サイクルによってフランキング領域を増幅させる。
プライマー：ポリメラーゼの出発点として機能する一本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的な短いオリゴヌクレオチド（約２０〜５０ｂｐ）。
ＱＴＬ（量的形質遺伝子座）：独立染色体領域であって、遺伝子に関連して形質を示す。
ＲＡＭＰｓ（ランダム増幅マイクロサテライト多型）：それを用いて様々なＤＮＡサンプル間の多型が検出されるＲＡＰＤおよびｉＳＳＲプライマーに基づくＤＮＡフィンガープリンティング技術。
ＲＡＰＤプライマー（ランダム増幅多型ＤＮＡプライマー）：ＧＣ含量は６０％〜７０％の間にあり、プライマー末端は自己相補的ではない「ランダム」配列を備える１０量体。
ｉＳＳＲ（ｉｎｔｅｒ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ：単純配列反復間）：ＳＳＲ（単一配列反復）の５’末端上で設計されたプライマー；２または３ヌクレオチドの繰り返しからなるＤＮＡフラグメント。
ＢＣ（戻し交配）：個体と原初の親の一方との交配。
ＸＣＣ：キサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス。
ｃＭ−センチモルガン：１００個体当たりの交叉回数に基づく、マーカー間の遺伝距離についての単位。
ＤＮＡマーカー：１つの遺伝子に関連づけられるＤＮＡフラグメント、または当該遺伝子もしくは位置の継承を監視するために使用される、ゲノム上に公知の場所に位置する別のＤＮＡフラグメント。
ゲル電気泳動法：分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）をそれらのサイズ、形状もしくは電荷に基づいて、電場の影響下にあるマトリックス（アガロースまたはポリアクリルアミド）中で分離するための方法。
同系交配世代（自家受粉）：自家花粉を用いた個体の受精。
遺伝子移入：異種交配によって別の系統（栽培品種）内に導入された系統（栽培品種）の染色体フラグメント。
ＩＲＤｙｅ標識：Ｌｉｃｏｒイメージングシステムのために使用される、７００ｎｍまたは８００ｎｍで検出される赤外線標識。
単性：単一遺伝子によって決定される。
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）：特異的ＤＮＡフラグメントを増殖させるためのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）増幅法。この合成反応は、ＤＮＡフラグメントとともにハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを利用し、その後にＤＮＡポリメラーゼが連続温度サイクルによってフランキング領域を増幅させる。
プライマー：ポリメラーゼの出発点として機能する一本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的な短いオリゴヌクレオチド（約２０〜５０ｂｐ）。
ＱＴＬ（量的形質遺伝子座）：独立染色体領域であって、遺伝子に関連して形質を示す。
ＲＡＭＰｓ（ランダム増幅マイクロサテライト多型）：それを用いて様々なＤＮＡサンプル間の多型が検出されるＲＡＰＤおよびｉＳＳＲプライマーに基づくＤＮＡフィンガープリンティング技術。
ＲＡＰＤプライマー（ランダム増幅多型ＤＮＡプライマー）：ＧＣ含量は６０％〜７０％の間にあり、プライマー末端は自己相補的ではない「ランダム」配列を備える１０量体。
ｉＳＳＲ（ｉｎｔｅｒ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ：単純配列反復間）：ＳＳＲ（単一配列反復）の５’末端上で設計されたプライマー；２または３ヌクレオチドの繰り返しからなるＤＮＡフラグメント。
ＢＣ（戻し交配）：個体と原初の親の一方との交配。
ＸＣＣ：キサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス。
Claims (16)
- キサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）耐性アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）アクセプター植物を提供するための方法であって、
−ゲノム内に量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）を含む第１キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）ドナー植物を選択するステップと、
−ゲノム内に量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）を含む第２キャベツドナー植物を選択するステップと、
−アブラナ属アクセプター植物中において第１ドナー植物由来の量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）および第２ドナー植物由来の量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）を遺伝子移入する、またはゲノム的に組み合わせるステップとを含み、
このとき、
量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）は、配列番号１およびプライマー６のプライマー組み合わせによる１５８〜１６２ｂｐのフラグメント；配列番号２およびプライマー６のプライマー組み合わせによる２８３〜２８７ｂｐのフラグメント；配列番号３およびプライマー６のプライマー組み合わせによる３７０〜３７４ｂｐのフラグメント；ならびに配列番号４およびプライマー６のプライマー組み合わせによる４１〜４５ｂｐのフラグメントからなる群から選択される１つ以上のＲＡＭＰマーカーを特徴とし、
量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）は、配列番号５およびプライマー６のプライマー組み合わせによる８８〜９２ｂｐのフラグメント；配列番号６およびプライマー６のプライマー組み合わせによる１２５〜１２９ｂｐのフラグメント；配列番号７およびプライマー６のプライマー組み合わせによる３３４〜３３８ｂｐのフラグメント；ならびに配列番号８およびプライマー６のプライマー組み合わせによる４７〜５１ｂｐのフラグメントからなる群から選択される１つ以上のＲＡＭＰマーカーを特徴とし、かつ、
このとき前記アブラナ属アクセプター植物は、ゲノムに関して、第１および第２キャベツドナー植物と同一ではない方法。 - 前記第１キャベツドナー植物および第２キャベツドナー植物は、それらのゲノムに関して実質的に同一である、請求項１に記載の方法。
- 前記量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）は、配列番号１およびプライマー６のプライマー組み合わせによる１６０ｂｐのフラグメント；配列番号２およびプライマー６のプライマー組み合わせによる２８５ｂｐのフラグメント；配列番号３およびプライマー６のプライマー組み合わせによる３７２ｂｐのフラグメント；ならびに配列番号４およびプライマー６のプライマー組み合わせによる４３ｂｐのフラグメントからなる群から選択される１つ以上のＲＡＭＰマーカーを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
- 前記量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）は、配列番号５およびプライマー６のプライマー組み合わせによる９０ｂｐのフラグメント；配列番号６およびプライマー６のプライマー組み合わせによる１２７ｂｐのフラグメント；配列番号７およびプライマー６のプライマー組み合わせによる３３６ｂｐのフラグメント；ならびに配列番号８およびプライマー６のプライマー組み合わせによる４９ｂｐのフラグメントからなる群から選択される１つ以上のＲＡＭＰマーカーを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
- 選択するステップは、各キャベツドナー植物のゲノム内において、請求項１〜４のいずれか一項において定義された１つ以上のＲＡＭＰマーカーの存在を分子生物学技術によって決定するステップを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）および／または量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）は、各キャベツドナー植物のゲノム内における請求項１〜４のいずれか一項において定義された２つ以上のＲＡＭＰマーカーを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）および／または量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）は、各キャベツドナー植物のゲノム内における請求項１〜４のいずれか一項において定義された３つ以上のＲＡＭＰマーカーを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）および／または量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）は、各キャベツドナー植物のゲノム内における請求項１〜４のいずれか一項において定義された４つのＲＡＭＰマーカーを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
- 選択するステップは、前記第１および第２キャベツドナー植物内でホモ接合性量的形質遺伝子座１および２（ＱＴＬ’ｓ１および２）を選択するステップを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アブラナ属アクセプター植物は、キャベツ植物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アブラナ属植物は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｖａｒ．ｂｏｔｒｙｔｉｓ（カリフラワー、ロマネスコ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｖａｒ．ｃｙｍｏｓａ（ブロッコリー）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｖａｒ．ａｓｐａｒａｇｏｉｄｅｓ（ブロッコリー）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ．ｇｅｍｎｉｆｅｒａ（芽キャベツ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ ｖａｒ．ａｌｂａ（白キャベツ、オックスハートキャベツ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ ｖａｒ．ｒｕｂｒａ（赤キャベツ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ ｖａｒ．ｓａｂａｕｄａ（サボイキャベツ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ａｃｅｐｈｅｌａ ｖａｒ．ｓａｂｅｌｌｉｃａ（カーリー・ケールキャベツ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｃｏｎｖａｒ．ａｃｅｐｈｅｌａ ｖａｒ．ｇｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ（カブカンラン）およびＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ．ｔｒｏｎｃｈｕｄａ ｓｙｎ．ｃｏｓｔａｔａ（ポルトガルキャベツ）からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
- そのゲノム内に、請求項１〜１１のいずれか一項に規定された量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）および量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアブラナ属アクセプター植物。
- 前記植物は、受託番号ＮＣＩＭＢ４１５５３である植物である、請求項１２に記載のアブラナ属植物。
- ゲノム内に請求項１〜１１のいずれか一項に規定された量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）および量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）を含む、請求項１２または１３に記載のアブラナ属植物の種子、果実および／または他の植物部位。
- 請求項１〜１３のいずれか一項に記載のキサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス耐性アブラナ属アクセプター植物を提供するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の量的形質遺伝子座１（ＱＴＬ１）および量的形質遺伝子座２（ＱＴＬ２）の使用。
- 請求項１〜１３のいずれか一項に記載のキサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス耐性アブラナ属アクセプター植物を提供するための、配列番号１〜４からなる群から選択される１つ以上のプライマー、および配列番号５〜８からなる群から選択される１つ以上のプライマーの使用。
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