ES2344262T3 - Planta de brassica resistente al hongo leptosphaeria maculans (pie negro). - Google Patents

Abstract

Una planta de Brassica napus que contiene un nivel de glucosinolatos alifáticos en una harina de semillas desengrasada y seca, de menos que 30 micromoles/g, que comprende en el cromosoma 8 un gen de resistencia a Leptosphaeria maculans que se deriva de Brassica rapa subespecies sylvestris, en que dicha planta de Brassica napus se deriva de unas semillas que se depositaron bajo el número de accesión al ATCC PTA-5410, y en que dicho gen está flanqueado por los marcadores de AFLP E32/M50-M362 y P34/M48-M283 en el cromosoma N08 en estas semillas.

Description

Planta de Brassica resistente al hongo Leptosphaeria maculans (pie negro).

Campo del invento

El invento se refiere al sector de la represión de enfermedades fúngicas en Brassica napus. Se proporcionan unas plantas y semillas de B. napus, que comprenden un lugar (locus) de resistencia al hongo pie negro (necrosis del cuello de crucíferas), que se deriva del cromosoma 8 de B. rapa, en su genoma. También se proporcionan unas plantas y semillas de B. napus que comprenden por lo menos dos o por lo menos tres lugares (loci) de resistencia al pie negro, situados en diferentes cromosomas, en su genoma. Se proporcionan además unas herramientas de detección para detectar la presencia de unos o más alelos de resistencia en plantas, tejidos o semillas de B. napus, así como unos métodos para transferir uno o más lugares de resistencia a otras plantas de Brassica y unos métodos para combinar diferentes lugares de resistencia en semillas y plantas híbridas. Se proporcionan también unos métodos para aumentar la durabilidad
de la resistencia a L. maculans, así como unos usos de las plantas y semillas y de los procedimientos del invento.

Técnica de antecedentes

El pie negro o chancro de tallo es una enfermedad principal de Brassica napus L. (colza de semilla oleaginosa o Canola), causando anualmente unas muy grandes pérdidas económicas en todo el mundo, en particular en Europa, Australia y América del Norte. El pie negro es causado por el patógeno fúngico Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. & De Not. (anamorfo Phoma lingam Tode ex. Fr.). Se pueden desarrollar síntomas de L. maculans en cotiledones, hojas, vainas y tallos. Unas lesiones de hojas se desarrollan después de una infección por ascosporas dispersadas en el viento y/o conidiosporas dispersadas en agua (por salpicadura). Unos síntomas (o chancros) de tallos pueden surgir mediante una infección directa de los tallos o mediante un crecimiento sistémico del hongo a partir de lesiones de hojas, a través del tejido vascular dentro del tallo [Hammond y colaboradores, (1985), Plant Pathology 34:557-565]. Los chancros de tallo pueden descortezar al tallo, lo cual puede conducir al acostamiento o aposentamiento de las plantas y a la muerte de las plantas. Unos chancros menos graves pueden causar una restricción en el flujo de agua y de nutrientes, lo cual a su vez puede conducir a un acorchamiento de semillas y vainas. Una infección de vainas puede conducir a una prematura desintegración (rotura en añicos) de las vainas y a una infección de las semillas.

La incorporación de una resistencia al pie negro en cultivares de B. napus es uno de los principales objetivos en programas de crianza por todo el mundo. Aunque tanto la atomización o pulverización de fungicidas como las prácticas de cultivo se usan para reducir las pérdidas de rendimiento causadas por una infección por pie negro, el método de represión más confiable hasta la fecha es una resistencia genética.

La Brassica napus (2n = 38, genoma AACC) es una especie anfidiploide, que se originó a partir de una hibridación espontánea de Brassica rapa L. (sinónimos B. campestris; 2n = 20, AA) y de Brassica oleracea L. (2n = 18, CC). La B. napus contiene los grupos completos de cromosomas de estos dos genomas diploides.

Una resistencia al pie negro es comprobada o bien en un invernadero o en experimentos realizados en el campo. En una forma de realización, se comprueba preferiblemente una resistencia al pie negro en experimentos realizados en el campo, y se puede comprobar en diferentes estadios del desarrollo de las plantas. Cuando se hace referencia a una resistencia al pie negro, normalmente se distinguen por lo tanto diferentes tipos de resistencias, dependiendo del estadio de la planta y del tejido que se ha comprobado, tal como una resistencia de plántulas (resistencia "precoz") y una resistencia de plantas adultas (resistencia "tardía" o del "tallo"). Los tejidos de plantas analizados en cuanto a la resistencia son, por ejemplo, cotiledones, hojas y bases de tallos. Se ha informado de que una resistencia genética al pie negro es o bien monogénica (está bajo el control de un gen principal) o poligénica (está bajo el control de varios genes menores o secundarios).

Se han cartografiado un cierto número de lugares de resistencia en B. napus. Por ejemplo, se informó de que un único lugar de resistencia dominante, designado como LEM1, está situado en el grupo de engarce 6 (que es ahora conocido por los autores del invento por ser el cromosoma N07 en la nomenclatura de Sharpe y colaboradores (1995, Genome 38:1112-1121)) de B. napus cv. Major, basándose en inoculaciones de heridas (lesiones) de plántulas [Fereirra y colaboradores, (1995), Genetics 85 (2): 213-217]. La resistencia en el campo en plantas adultas, en el cv. Cresor de primavera, fue cartografiada en el cromosoma N07 por Dion y colaboradores, [(1995), TAG 91: 1190-1194] y designada como LmFr. Se informó de que los cultivares Maluka y Shiralee tienen un lugar principal que controla la resistencia de las plántulas, designada como LmR1, en el cromosoma N07 [Mayerhofer y colaboradores (1997), Genome 40: 294-301.]. Rimmer y colaboradores, [(1999), Proceedings of the 10^{th} International Rapeseed Congress [Actas del 10º Congreso Internacional sobre semillas de colza] informaron también sobre unos lugares de resistencia, designados como RLM, en el cromosoma N07.

Sin embargo, la falta de una adecuada resistencia hallada en Brassica napus (genoma AACC) y la continua amenaza de descomposición de la resistencia cuando un cultivar resistente se usa de un modo ampliamente propagado y durante más largos períodos de tiempo, ha conducido a los criadores y científicos a investigar unas alternativas fuentes de resistencia. El foco principal se ha dirigido hacia la identificación y la transferencia de alelos de resistencia a partir de especies de Brassica relacionadas tales como B. rapa (AA), B. oleracea (CC), B. nigra (genoma BB), B. juncea (genoma AABB) y B. carinata (BBCC).

Una fuente principal de resistencia al pie negro es el genoma B. Gerdemann-Knörck informaron en 1994 sobre la introducción de una resistencia al pie negro dentro de B. napus a partir de B. nigra por una hibridación somática asimétrica [Gerdemann-KnÓrck y colaboradores (1994), Plant Breeding 113:106-113].

Otro enfoque ha consistido en generar los denominados linajes de B. napus "sintéticos" por una hibridación interespecífica de dos especies diploides (genomas AA y CC) y unos subsiguientes procesos de cultivo in vitro de los embriones y de duplicación de los cromosomas.

La resistencia al pie negro se introdujo en B. napus de esta manera generando unas plantas de B. napus sintéticas a partir de accesiones silvestres de B. rapa (genoma AA) [Crouch y colaboradores (1994), Plant Breeding 112: 265-278] y de accesiones silvestres de B. atlantica (genoma CC) [Mithen y Magrath (1992), Plant Breeding 108: 60-68, y Mithen y Herron (1991) Proceedings of the 8^{th} International Rapeseed Congress].

Seis accesiones de B. rapa ssp sylvestris silvestre se cruzaron con B. oleracea ssp alboglabra con el fin de desarrollar una serie de linajes de B. napus sintéticos con un genoma C común pero con diferentes genomas A [Crouch y colaboradores, (1994), supra]. Se encontró que los B. rapa ssp sylvestris #75 y #76 son resistentes a materiales aislados de pie negro en unos ensayos realizados en invernaderos (ensayos con cotiledones y hojas), mientras que el B. rapa ssp sylvestris #29 era susceptible. Dos de los linajes sintéticos derivados de los #75 o #76 y B. oleracea ssp alboglabra, y sus híbridos F1 con cultivares de colza de semilla oleaginosa, mostraron una alta resistencia al pie negro en experimentos en realizados en invernaderos. Solamente uno de estos linajes mostró también resistencia en experimentos realizados en el campo, en Inglaterra y Australia.

Crouch (tesis doctoral, universidad de Anglia oriental, Norwich, Reino Unido) describe unos marcadores de RFLP engarzados a unas regiones del genoma que contribuyen a la resistencia en el campo, el cartografiado de estas regiones para cinco grupos de engarce y la localización de lugares con rasgos cuantitativos (QTL, acrónimo de quantitative trait loci) que contribuyen a la resistencia en diferentes tejidos. El análisis de intervalos de unos QTL identificados, que contribuyen a la resistencia de las hojas tanto en el Grupo 1 procedente del progenitor sintético [cromosoma N7 de acuerdo con Sharpe y colaboradores(1995), Genome 38:1112-1121] como en el Grupo 3 procedente del progenitor cultivar (cromosoma N3 de acuerdo con Sharpe y colaboradores) y de un QTL que contribuye a la resistencia en la parte inferior del tallo, del hipocotilo y de la raíz en el Grupo 1, el Grupo 2 (cromosoma N10 de acuerdo con Sharpe y colaboradores) y el Grupo 5 (la asociación de este grupo con los grupos de engarce de Sharpe y colaboradores es incierta). El cartografiado de intervalos no fue capaz de identificar ningún QTL que contribuyese a la resistencia en la parte superior del tallo.

Los linajes sintéticos de B. napus descritos por Crouch y Mithen (supra) no fueron agronómicamente apropiados, puesto que ellos contenían altos niveles de glucosinolato, altos niveles de ácido erúcico, tenían una mala fertilidad y padecían de una autoincompatibilidad [Easton, Australian Research Assembly on Brassicas [Asamblea Australiana de Investigación sobre Brassicas] 2001].

En la primavera del 2000 la entidad Pacific Seeds llevó al mercado en Australia la variedad de B. napus polinizada de manera abierta Surpass400, que recibió una clasificación nacional de resistencia al pie negro de 9,0, que es el más alto nivel conocido de resistencia. Los ancestros del Surpass400 incluyen una B. napus "sintética", derivada de cruces interespecíficos entre B. rapa ssp sylvestris procedente de Sicilia y B. oleracea ssp alboglabra [Li y colaboradores, Australian Research Assembly on Brassicas 2001; Easton, supra]. Se informó de que un alelo dominante principal para la resistencia al pie negro en el estadio de las plántulas está presente en Surpass400 [Li y colaboradores, Australian Research Assembly on Brassicas 2001].

Yu y colaboradores [(2002), Can. J. Plant Pathology 24: 96-97; Plant, Animal & Microbe Genomes Conference [Conferencia sobre genomas de plantas, animales y microbios] 12-16 de Enero, (2002)] informaron sobre dos lugares de resistencia en poblaciones de B. napus que se derivaban de cruces con los linajes de crianza 6270 y 6279. El alelo nuclear dominante designado como LepR1 en el cromosoma N02 confería resistencia en el linaje 6270 a materiales aislados de L. maculans procedentes de los grupos de patogenicidad PG2, PG3 y PG4. El segundo lugar, designado como LepR2 situado en el cromosoma N10, era incompletamente dominante y confería resistencia de los cotiledones a los materiales aislados de PG2 y PG3.

Rimmer y colaboradores [13th Crucifer Genetics Workshop [13º Taller genético sobre crucíferas], 23-26 de Marzo (2002)] informaron sobre el cartografiado de cuatro lugares de resistencia en B. napus. Dos lugares de resistencia se derivaron de B. napus (no de B. rapa) y se cartografiaron en el cromosoma N7 y en el cromosoma N8. Los otros dos lugares se derivaron de B. rapa ssp sylvestris y se cartografiaron en el cromosoma 2 y en el cromosoma 10.

En los primeros días de 2003 se hicieron los primeros informes acerca de la descomposición de la resistencia del Surpass400. Parece ser que se había desarrollado en solamente tres años una cepa más virulenta del hongo, que es capaz de infectar al Surpass400. Queda por ver con qué rapidez la cepa será capaz de diseminarse a diferentes sitios, pero se necesitan manifiestamente nuevos genes de resistencia y métodos para acrecentar la durabilidad de la resistencia.

\newpage

Con la amenaza constante de una descomposición de la resistencia genética como un resultado de cambios en la población de patógenos, es deseable identificar nuevas fuentes genéticas de resistencia, métodos para transferir a éstas dentro de unas variedades con alto rendimiento agronómico y métodos para acrecentar la durabilidad de la resistencia.

El presente invento, que incluye las diferentes formas de realización proporcionadas en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, proporciona unas plantas que comprenden un nuevo gen de resistencia al pie negro, Lem-08-syl, y unos métodos para transferir al Lem-08-syl dentro de otros linajes de crianza u otras variedades, así como unos métodos para detectar la presencia o ausencia del Lem-08-syl en plantas.

Sumario del invento

En una forma de realización de este invento, se proporcionan plantas, semillas y tejidos de B. juncea que comprenden un nuevo gen de resistencia al pie negro en el cromosoma 8, en que el gen de resistencia se deriva de B. rapa. Las plantas de B. rapa en las oraciones y frases precedentes pueden ser procedentes de accesiones de B. rapa silvestres, tales como B. rapa ssp sylvestris.

En una forma de realización del presente invento, se proporcionan unas plantas de B. napus que comprenden un fragmento del cromosoma R08 de B. rapa, en que dicho fragmento comprende un gen de resistencia al pie negro, en que estas plantas de B. napus se seleccionan entre el grupo que se compone de: una planta de B. napus que contiene un transgén integrado dentro su genoma, la progenie de una planta de B. napus que contiene dicho gen de resistencia al pie negro, en que dicha progenie resulta de unos cruces entre plantas de B. napus que contienen dicho gen de resistencia al pie negro y plantas de Surpass400; una planta de B. napus que contiene un nivel de glucosinolatos alifáticos en una harina de semillas seca y desengrasada de menos que 30 mmol/g; una planta de B. napus en que el componente sólido de la semilla contiene menos de 30 micromoles de cualquiera, o cualquier mezcla, de los compuestos glucosinolato de 3-butenilo, glucosinolato de 4-pentenilo, glucosinolato de 3-hidroxi-3-butenilo y glucosinolato de 2-hidroxi-4-pentenilo por gramo de material sólido exento de aceite, secado al aire; una planta de B. napus que produce un aceite (después de haber triturado las semillas) que contiene menos de 2% de ácido erúcico (de los ácidos grasos totales en el aceite); una planta de colza de semilla oleaginosa de primavera de B. napus, una planta de colza de semilla oleaginosa de invierno de B. napus, una planta de B. napus que no contiene un gen de resistencia al pie negro en el cromosoma N2; una planta de B. napus que no contiene un gen de resistencia al pie negro en el cromosoma N10; unas plantas de B. napus que no contienen un gen de resistencia cartografiado en el cromosoma 2 o un gen de resistencia cartografiado en el cromosoma 10; cuyo gen de resistencia se deriva de B. rapa ssp. Sylvestris; una planta de B. napus que comprende un transgén que puede hacer estériles masculinas a las plantas, preferiblemente un gen de barnasa; la progenie de una planta de B. napus que contiene dicho gen de resistencia al pie negro, en que dicha progenie resulta de unos cruces entre plantas de B. napus que contienen dicho gen de resistencia al pie negro, y cualquiera de las siguientes variedades de colza de semilla oleaginosa; una variedad de B. napus resistente a ciertos herbicidas; una variedad de B. napus con un alto contenido de aceite en sus semillas; una variedad de B. napus con un alto contenido de ácido oleico en sus semillas: una variedad de B. napus con un bajo contenido de ácido linolénico en sus semillas, Jet Neuf, Quantum, Maluka, Hyola43, Hyola60, Surpass400, Surpass402CL, Surpass603CL, Surpass501TT, una planta RoundupReady®, una planta LibertyLink®, una planta que contiene un transgén de esterilidad masculina, InVigor® 40, InVigor® 70, InVigor® 90, InVigor® 2573, InVigor® 2663, InVigor® 2733, InVigor® 5020, InVigor® 5030, o
InVigor® 5070.

En una forma de realización adicional de este invento, las plantas, las semillas y los tejidos de B. napus que se describen aquí anteriormente comprenden el nuevo gen de resistencia al pie negro del cromosoma 8.

Las plantas de B. rapa en los párrafos precedentes pueden proceder de accesiones de B. rapa tales como B. rapa ssp sylvestris.

En todavía otra forma de realización de este invento, el anterior gen de resistencia al pie negro comprende el Lem-08-syl que aquí se define, particularmente cuando el Lem-08-syl está asociado con por lo menos un marcador de AFLP seleccionado del grupo que consiste en: P34/M48-M283.0, E32/M50-M362.0 y E36/M51-M171.1.

En otra forma de realización del invento, se proporcionan uno o más marcadores moleculares, tales como unos marcadores de AFLP, engarzados al gen de resistencia al pie negro procedente del cromosoma 8 de B. rapa. En una forma de realización particular, los marcadores moleculares que se han de usar en este invento, se seleccionan entre unos marcadores específicos para B. rapa, tales como E32/M50-M362.0, E36/M51- M171.1 o P34/M48-M283.

En una forma de realización adicional se proporcionan unas semillas híbridas que comprenden un gen de resistencia al pie negro procedente del cromosoma R08 de B. rapa, en que dichas semillas híbridas desarrollan unas plantas que tienen las características expuestas en el segundo párrafo completo de este sumario.

Se proporcionan también unas semillas de B. napus depositadas en el ATCC bajo el número de accesión PTA-5410, así como unos métodos de usar estas semillas para introgresar el gen de resistencia al pie negro situado en el cromosoma R08 de B. rapa dentro de otros linajes de crianza u otras variedades de Brassica, y unas plantas de B. napus que se derivan de dichas semillas y que comprenden el gen de resistencia al pie negro de este invento.

\newpage

En una forma de realización adicional del invento, se proporcionan unas plantas o semillas de B. napus que comprenden por lo menos dos, preferiblemente por lo menos tres o cuatro genes de resistencia al pie negro, cada uno de ellos situado en un cromosoma diferente. Esto incluye unas plantas que comprenden un gen de resistencia al pie negro en el cromosoma N08, y que comprenden además un gen de resistencia al pie negro en los cromosomas N07, N10 y/o N14, o un gen de resistencia al pie negro de B. napus cv. Jet Neuf, Quantum, Maluka, Hyola60 o Surpass400. En una forma de realización, se proporcionan unas plantas que comprenden por lo menos dos lugares de resistencia al pie negro que se derivan de B. rapa, tales como los situados en el cromosoma N08 y en el cromosoma N10.

El invento proporciona además unas plantas, en las que los lugares de resistencia al pie negro son apilados en dichas plantas cruzando una planta progenitora estéril masculina, preferiblemente una planta que comprende un gen de barnasa bajo el control de un promotor específico para tapetum o para estámenes, que comprende un gen de resistencia al pie negro procedente de B. rapa de este invento, con una planta que comprende en su genoma un gen para restaurar la fertilidad, preferiblemente con uno o más lugares de resistencia al pie negro en un cromosoma distinto del cromosoma 8, tales como unos lugares situados en los cromosomas N07, N10 y/o N14, o un gen de resistencia de Jet Neuf, Quantum, Maluka, Hyola60 o Surpass400. Alternativamente el progenitor estéril masculino comprende el gen de resistencia al pie negro de este invento, y uno o más lugares adicionales de resistencia al pie negro, tales como unos lugares de resistencia situados en los cromosomas N07, N10 y/o N14, o un gen de resistencia de Jet Neuf, Quantum, Maluka, Hyola60 o Surpass400. Esta planta es cruzada con una planta que comprende un gen para restaurar la fertilidad.

En una forma de realización se proporcionan unas plantas y semillas que comprenden por lo menos un gen de resistencia al pie negro del cromosoma R08 de B. rapa. En una forma de realización adicional, se proporcionan unas plantas y semillas que comprenden otros lugares adicionales de resistencia al pie negro situados en otros cromosomas, tales como los Lem10, Lem7 y/o Lem14. En una forma de realización de este invento se proporciona también la progenie de cruces de las plantas de este invento que comprenden el gen Lem-08-syl con plantas de las conocidas variedades Hyola 60, Hyola 43, Surpass501TT, Surpass400, Surpass404CL, Surpass402CL, Surpass603CL, o cualquier otra variedad de colza de semilla oleaginosa con una alta clasificación de resistencia al pie negro (véase, p. ej., Khangura y colaboradores, 2003, Department of Agriculture (Departamento de agricultura), Australia Occidental, calificación Farmnote nº 6/2003, ISSN 0726-934X).

El invento proporciona también unos métodos para detectar la presencia o ausencia del Lem-08-syl en plantas, semillas o tejidos de Brassica.

Se proporcionan también unos estuches de detección, útiles para detectar la presencia o ausencia del Lem-08-syl en plantas, semillas o tejidos de Brassica, preferiblemente de B. napus o B. juncea. Se proporcionan aquí también cualquiera de los marcadores AFLP de este invento, particularmente cualquiera de los E32/M50-M362, E36/M51-M171.1 y P34/M48-M283. Una forma de realización de este invento está dirigida al uso de dichos marcadores en un análisis de AFLP de B. napus.

En otra forma de realización de este invento, las plantas que comprenden un nuevo gen de resistencia al pie negro en el cromosoma 8, en que el gen de resistencia se deriva de B. rapa, tal como se usa aquí, son unas plantas de B. napus que comprenden el patrón de calidad de canola, establecido por el Canola Council of Canadá (Consejo sobre Canola del Canadá) (http://www.canola-council.org).

Otras formas de realización de este invento se especifican en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción detallada de las formas de realización

El B. napus tiene 19 pares de cromosomas, aquí numerados como N01 hasta N19, de acuerdo con Sharpe y colaboradores [(1995), Genome 38:1112-1121] y Parkin y colaboradores [(1995), Genome 38:1122-1131]. Los N01 hasta N10 son cromosomas del genoma A, mientras que los N11 hasta N19 son cromosomas del genoma C. La B. rapa (sinónimo: B. campestris) tiene 10 pares de cromosomas (genoma A), aquí numerados como R01 hasta R10, para corresponderse con los N01 hasta N10 B. napus. La B. juncea, una especie anfidiploide que resulta de una hibridación de ancestros diploides de B. nigra y B. rapa, tiene 18 pares de cromosomas, 10 que se originan de B. rapa (genoma A, aquí numerados como J01 hasta J10 para corresponderse con N01 hasta N10) y 8 que proceden de B. nigra
(genoma B).

En una forma de realización del invento, se proporcionan unas plantas de B. napus o unas plantas de B. juncea que comprenden en el cromosoma N08 o J08 (respectivamente) un fragmento de un cromosoma 8 (R08) de B. rapa, que lleva un gen de resistencia al pie negro, denominado aquí como "Lem-08-syl".

Una "variedad" se usa aquí en conformidad con el convenio de UPOV y se refiere a una agrupación de plantas situadas dentro de un taxón botánico único del más bajo rango conocido, cuya agrupación puede ser definida por la expresión de las características que resultan de un genotipo dado o de una combinación dada de genotipos, se puede distinguir de cualquier otra agrupación de plantas por la expresión de por lo menos una de dichas características, y se considera como una unidad con respecto a su idoneidad para ser propagada en estado inalterado.

\newpage

El "Lem-08-syl", tal como se usa aquí, se refiere al gen de resistencia al pie negro situado en el cromosoma 8 de B. rapa que, cuando se introgresa en una variedad o linaje de crianza de Brassica napus o Brassica juncea susceptible a una infección por el pie negro, confiere a dicha planta una resistencia al pie negro. El Lem-08-syl es obtenible por ejemplo a partir de semillas depositadas en la ATCC (acrónimo de American Type Culture Collection [Colección americana de cultivos tipo], 10801 University Blvd, Manassas, VA 20110-2209, EE.UU.) bajo el número de accesión PTA-5410 el 22 de Agosto de 2003. Preferiblemente, el Lem-08-syl es el gen de resistencia al pie negro que se deriva de B. rapa y está situado en el cromosoma N08 de las semillas depositadas bajo el número de depósito PTA-5410, preferiblemente el gen que está asociado con los cebadores de AFLP E32/M50-M362 y/o P34/M48-M283. En una forma de realización de este invento, el "Lem-08-syl" es el "gen de resistencia al pie negro" que está asociado con los marcadores de AFLP E32/M50-M362.0 y/o P34/M48-M283.0 a una distancia de aproximadamente 4,7 y/o aproximadamente 5,7 cM, respectivamente, en unas semillas depositadas en el ATCC bajo el número de accesión
PTA-5410.

Cuando se ha introgresado en un cultivar susceptible al pie negro tal como el Kristina, el Lem-08-syl aumenta la resistencia al pie negro desde una calificación de aproximadamente 1,0-2,0 hasta una calificación de aproximadamente 6,0-9,0, cuando se comprueba una resistencia al pie negro en una escala de 1,0 a 9,0, en la que 1,0 es el fenotipo más susceptible y 9,0 es el fenotipo más resistente. Se entiende que unas condiciones ambientales, tales como la situación, las condiciones climáticas y la presión de la enfermedad, así como la percepción individual de la persona que comprueba los síntomas de enfermedad, pueden tener un cierto efecto sobre la calificación de la resistencia al pie negro. Por lo tanto, deberá ser reducida al mínimo una variación en estos factores en ensayos comparativos. Cualesquiera otras clasificaciones de resistencia conocidas en la técnica se pueden aplicar de acuerdo con este invento para comparar las plantas del invento con unas plantas testigos, p. ej. las clasificaciones de resistencia al pie negro WA establecidas en la cita de Khangura y colaboradores (2003, Department of Agriculture, Western Australia, Farmnote nº 6/2003, ISSN 0726-934X).

El fragmento de B. rapa introgresado, que comprende el Lem-08-syl se deriva, en una forma de realización, de subespecies de B. rapa silvestres, preferiblemente de la subespecie sylvestris, pero también se puede derivar de otras accesiones de B. rapa, tales como las accesiones Europea silvestre y Asiática silvestre, tal como se describen en la cita de Song y colaboradores, [(1990), TAG 79:497-506] o de variedades cultivadas de B. rapa. Se entiende que el tamaño del fragmento de B. rapa introgresado puede variar, siempre y cuando que se retenga el sitio de resistencia al pie negro. La presencia del Lem-08-syl se puede ensayar detectando unos marcadores moleculares engarzados al Lem-08-syl o ensayando si la resistencia al pie negro es aumentada en la progenie de un cruce entre una planta de Brassica susceptible o no completamente resistente, con una planta que comprende el Lem-08-syl. Preferiblemente, el fragmento de B. rapa no comprende lugares adicionales indeseables de ningún tipo, tales como, pero sin limitarse a, lugares que afectan a la época de floración, al requisito de vernalización (determinación germinal), a la tolerancia a la congelación, etc.

El término "pie negro" tal como se utiliza aquí se refiere a la enfermedad causada por el patógeno fúngico Leptosphaeria maculans o Phoma lingam (anamorfo). La definición abarca materiales aislados tanto Tox^{0} como Tox^{+}, independientemente de que se pueda encontrar que éstos pertenecen a diferentes especies en unos posteriores estudios taxonómicos [Rouxel y colaboradores (1995), Blackleg News Nº4].

Los materiales aislados de L. maculans pueden ser clasificados en diferentes grupos de patogenicidad (PG, acrónimo de pathogenicity groups), dependiendo de sus interacciones específicas con los cultivares de B. napus Westar, Galcier y Quinta [Mengistu y colaboradores (1991), Plant Disease 75:1279-1282]. Los materiales aislados del PG4 causan lesiones de esporulación en la totalidad de los tres cultivares, mientras que los materiales aislados del PG3 causan una reacción de resistencia en cotiledones de Quinta, y los materiales aislados del PG2 causan una reacción de resistencia en cotiledones de Quinta y Glacier. Los materiales aislados del PG1 no son patógenos sobre estos anfitriones. Los materiales aislados de los PG2, PG3 y PG4 son referidos también como materiales aislados "altamente agresivos" o "altamente virulentos" o "fuertemente patógenos", mientras que los materiales aislados del PG1 son citados como "no agresivos" o "no virulentos" o "débilmente patógenos" en la bibliografía. Algunas veces, el grupo altamente agresivo es denominado también "A" mientras que el grupo débilmente agresivo es denominado "NA" [Badawy y Hoppe (1989), J Phytopathology 127:146-157]. Más recientemente, el grupo altamente agresivo es distinguido con respecto del grupo débilmente agresivo por su producción de toxinas (materiales aislados Tox^{+} frente a materiales aislados Tox^{0}) [recopilado por Rouxel y colaboradores, Blackleg News Nº 4, (1995)]. Se ha encontrado que los materiales Tox^{0} causan una necrosis de la médula, no acompañada por síntomas externos, y se ha sugerido que ha sido subestimado el efecto sobre la pérdida de rendimiento causada por materiales aislados Tox^{0} [Johnson y Lewis (1994), Plant Pathology 43:269-277]. Los materiales aislados Tox^{0} se distinguen además en tres grupos NA1, NA2 y NA3 y se ha sugerido que los materiales aislados NA1 son predominantes en Europa y que los materiales aislados NA2 son más importantes en Canadá [Gall y colaboradores (1995), Mycol Res 99:221-229].

El término "ajeno" o "extraño" tal como se usa aquí, cuando se hace referencia a un gen o a un transgén, o a un cierto género de planta, o a una cierta especie o variedad de planta, se refiere a un gen que normalmente no está presente en plantas de ese género o de esa especie o variedad, o que ha sido añadido al genoma de esa planta mediante transformación genética usando unos métodos conocidos en la especialidad, o un gen endógeno que ha sido modificado por métodos químicos, inducido por radiaciones o por otros métodos de mutagénesis de plantas.

\newpage

Un lugar ("locus") tal como se usa aquí es la posición que un gen ocupa en un cromosoma. Un "lugar de resistencia al pie negro" se refiere a la posición en el cromosoma en la que está situado un "gen de resistencia al pie negro". Esta posición se puede identificar por la situación en el mapa genético de un cromosoma. Se incluye en esta definición el fragmento (o segmento) de un ADN genómico del cromosoma en el que está situado el lugar de resistencia al pie negro.

El "cromosoma 8", como se usa en el presente contexto cuando se hace referencia a la situación del gen de resistencia de este invento, particularmente el Lem-08-syl, es el cromosoma número 8 del genoma A de acuerdo con la nomenclatura de Sharpe y colaboradores (1995, Genome 38:1112-1121).

Un "gen de resistencia al pie negro" como se usa en el presente contexto, se refiere a una secuencia de ADN que confiere, o está asociada con, una resistencia aumentada de una planta, preferiblemente de una planta de B. napus, a L. maculans, en comparación con una planta que carece del o los gen(es) de resistencia o que tiene una forma no funcional (o desactivada) del o los gen(es). El "Lem-08-syl" es el "gen de resistencia al pie negro" que está asociado con los marcadores de AFLP E32/M50-M362.0 y P34/M48-M283.0 a una distancia de aproximadamente 4,7 y aproximadamente 5,7 cM, respectivamente, en unas semillas depositadas en el ATCC bajo el número de accesión PTA-5410. Este gen de resistencia puede ser transferido a diferentes variedades de B. napus, e incluso a diferentes especies de plantas de Brassica, p. ej. B. juncea, p. ej., usando los marcadores moleculares de este invento.

Se encontró que la resistencia al pie negro que se deriva de B. rapa ssp sylvestris, es segregada como un único gen dominante (el Lem-08-syl). Usando una medida cualitativa de la resistencia al pie negro, el Lem-08-syl es cartografiado en el cromosoma N08, preferiblemente en el extremo distante del cromosoma N08, del mapa genético de B. napus. La posición y el efecto el Lem-08-syl se confirmaron por cartografiado de los QT, con lo que el pico del QTL identificado correspondía a la posición del Lem-08-syl en el mapa genético y explicaba un 77,8% de las varianza para la resistencia al pie negro (LOD (logaritmo de los números impares) de 68,12), mostrando que el Lem-08-syl tiene un efecto altamente significativo sobre la resistencia al pie negro.

"Una resistencia aumentada" de plantas que comprenden un cierto gen de resistencia, se refiere a una reducción en el daño causado por una infección fúngica en comparación con el daño causado sobre plantas testigos. El daño puede ser comprobado, por ejemplo, como el número y el tamaño de los síntomas en las hojas, la frecuencia y la gravedad de los síntomas en los tallos, el acostamiento de las plantas debido a una infección del tallo, etc. En particular, la reducción en el daño se manifiesta en una pérdida reducida de rendimiento cuando las plantas se hacen crecer bajo la presión de una enfermedad en el campo, en comparación con plantas testigos. Dicha reducción en la pérdida de rendimiento puede ser debida, por ejemplo, al hecho de que la infección, la reproducción, la diseminación o la supervivencia del hongo es reducida o evitada en plantas con una resistencia aumentada. El concepto de resistencia aumentada se puede referir también a unas plantas que son completamente resistentes, es decir a unas plantas en las que no se encuentran síntomas de enfermedad o a unas plantas que obtienen las más altas calificaciones de resistencia en sistemas de ensayo disponibles para la clasificación o calificación del pie negro, p. ej. Khangura y colaboradores (2003, Department of Agriculture, Western Australia, Farmnote nº 6/2003, ISSN 0726-934X).

Una resistencia aumentada se puede comprobar también en unos bioensayos llevados a cabo en entornos controlados, tales como cámaras de crecimiento, pero idealmente es confirmada en pruebas en el campo, puesto que las comprobaciones de entornos controlados con frecuencia no reflejan las condiciones existentes en el campo. Esto puede ser debido al hecho de que unos pocos materiales aislados de esporas únicas del hongo son ensayados normalmente en bioensayos mientras que en el campo existe una variación mucho mayor que en la población de patógenos [véase Crouch y colaboradores, supra].

Un "alelo" tal como se usa en el presente contexto es una forma de una serie de posibles formas alternativas de un gen. En una especie diploide hay dos alelos presentes en un lugar dado, aunque pueden existir en la población más de dos alelos para el lugar. Si los dos alelos en un correspondiente lugar de cromosomas homólogos son idénticos, se hace referencia a que el lugar es homocigótico. Por ejemplo, unas plantas doblemente haploides (DH, acrónimo de double haploid) que son generadas por duplicación de un cromosoma, son homocigóticas en todos los lugares.

Un "marcador" (molecular) tal como se usa en el presente contexto se refiere a una característica genética medible, con una posición fija en el genoma, que normalmente es heredada de una manera de acuerdo con las leyes de Mendel, y que se puede usar para el cartografiado de un rasgo que interese. La naturaleza del marcador es dependiente del análisis molecular que se use y se puede detectar al nivel de los ADN, de los ARN o de las proteínas. El cartografiado genético se puede realizar usando unos marcadores moleculares, tales como, pero sin limitarse a, los RFLP (acrónimo de restriction fragment length polymorphisms = polimorfismos de longitudes de fragmentos de restricción); Botstein y colaboradores (1980), Am J Hum Genet 32:314-331; Tanksley y colaboradores (1989), Bio/Technology 7:257-263), el RAPD [acrónimo de random amplified polymorphic DNA = ADN polimórfico amplificado aleatoriamente; Williams y colaboradores (1990), NAR 18:6531-6535], el AFLP [acrónimo de Amplified Fragment Length Polymorphism = polimorfismo de longitud amplificada de fragmento; Vos y colaboradores; (1995) NAR 23:4407-4414], SNP's o microsatélites [también denominados SSR's; Tautz y colaboradores (1989), NAR 17:6463-6471]. Unos/as apropiados/as cebadores o sondas son dictados/as por el método de cartografiado que se use.

Los términos "AFLP®" (el AFLP® es una marca comercial registrada de KeyGene N.V., Wageningen, Países Bajos), "un análisis de AFLP" y "un marcador de AFLP" se usan de acuerdo con una terminología clásica [Vos y colaboradores (1995), NAR 23:4407-4414; documento EP0534858]. Un marcador de AFLP, tal como se usa en el presente contexto, es un fragmento de ADN con un tamaño específico, que es generado y visualizado como una banda sobre un gel llevando a cabo un análisis de AFLP. Cada marcador de AFLP es designado por la combinación de cebadores que se usa para amplificarlo, seguido por el tamaño aproximado (en pares de bases) del fragmento de ADN amplificado. Se entiende que el tamaño de estos fragmentos puede variar ligeramente, dependiendo de las condiciones y del equipo de laboratorio que se usen. Cada vez que se hace referencia a un marcador de AFLP refiriéndose a una combinación de cebadores y al tamaño específico de un fragmento, ha de entenderse que dicho tamaño es aproximado, y que comprende, o se pretende que incluya, las ligeras variaciones observadas en diferentes laboratorios. Cada marcador de AFLP representa un cierto lugar en el genoma. Los marcadores de AFLP son generalmente dominantes (no son distinguibles los individuos homocigóticos y heterocigóticos), aunque algunos marcadores de AFLP puede ser calificados como concomitantemente dominantes (distinguiendo a los individuos homocigóticos y heterocigóticos, p. ej., por una intensidad de la banda).

Se dice que un marcador molecular está "engarzado" a un gen o lugar, si el marcador y el gen o lugar tienen una mayor asociación en herencia que lo que se podría esperar de una asignación independiente, es decir que el marcador y el lugar segregan concomitantemente en una población segregadora y están situados en el mismo cromosoma. El concepto de "engarce" se refiere a la distancia genética del marcador al lugar (o de dos lugares o dos marcadores uno respecto del otro). Cuanto más cercano sea el engarce, tanto menor será la probabilidad de que tenga lugar un suceso de recombinación, que separa el marcador con respecto del gen o lugar. La distancia genética (distancia en el mapa) se calcula a partir de las frecuencias de recombinación y es expresada en unidades de centiMorgan (cM) [Kosambi (1944), Ann. Eugenet. 12:172-175].

Un marcador de AFLP puede estar engarzado a un gen o lugar en "fase de acoplamiento" o en "fase de repulsión". Por ejemplo, un marcador dominante de AFLP engarzado en acoplamiento a un gen o lugar está presente en individuos que contienen el gen o lugar y está ausente en individuos que carecen del gen o lugar, mientras que un marcador dominante de AFLP engarzado en fase de repulsión a un gen o lugar está ausente en individuos que contienen el gen o lugar y está presente en individuos que carecen del gen o lugar. Los marcadores de AFLP del presente invento, que están engarzados al Lem-08-syl, están engarzados preferiblemente en acoplamiento al Lem-08-syl. Similarmente, los marcadores de AFLP engarzados a otros genes o lugares de resistencia al pie negro que aquí se describen, tales como el Lem-10-syl, están engarzados preferiblemente en acoplamiento al Lem-10-syl.

Un "marcador de AFLP específico para B. rapa", tal como se usa en el presente contexto, es un marcador de AFLP que normalmente está presente solamente en plantas de B. rapa diploides, y no en especies de Brassica alotetraploides, preferiblemente no lo está en B. napus o en B. juncea. En una forma de realización de este invento, un marcador de AFLP específico para B. rapa es un marcador que está presente en B. rapa pero no está presente en B. napus, preferiblemente no está presente en ninguna de las siguientes variedades de B. napus: Surpass400, Tapidor, Doublol, Mohican, Columbus, Aglona, Apache, Falcon, Silex, Kana, Express, Apex, Bristol, Vivol, Polo (W), Orient, Mandarin, Sh7, Wuhac96.40006, Wuh5365, NAN93-1046, LE043-3, Yu-dal, Wuhan96.40005, Sh97.1020, Monty, Narendra, Drakkar, Kristina, Spok, Acrobat, Cyclone o Stellar, particularmente un marcador que está presente en B. rapa pero no está presente en B. napus var. Kristina. Por ejemplo, un marcador de AFLP específico para B. rapa no está presente normalmente en el ADN de B. napus o en el ADN de B. juncea (a menos que sea introgresado dentro de B. napus o B. juncea a partir de una B. rapa diploide, especialmente una accesión de B. rapa silvestre). Así, cuando se lleva a cabo una reacción de AFLP con un marcador de AFLP específico para B. rapa (usando la combinación de cebadores de AFLP específicos del marcador) y usando como ADN de plantilla un ADN de B. napus y B. juncea (que no comprende segmentos introgresados de B. rapa), preferiblemente un ADN de las variedades antes enumeradas, mientras que una banda con el tamaño esperado está presente cuando se usa un ADN de B. rapa como plantilla. Ejemplos de marcadores de AFLP específicos para B. rapa, engarzados al Lem-08-syl, son E32/M50-M362.0, E36/M51-M171.1 ó P34/M48-M283.0. Un marcador de AFLP específico para B. rapa no necesita ser cartografiado en ningún cromosoma de B. rapa en un mapa genético, siempre y cuando que sea hallado en B. rapa pero no en B. napus, preferiblemente no lo sea en las plantas de B. napus antes enumeradas, es considerado como específico para B. rapa, tal como se usa aquí. También se pueden generar adicionales marcadores de AFLP específicos para B. rapa, engarzados al Lem-08-syl, llevando a cabo un análisis de AFLP tal como se describe en el Ejemplo 1 y en el Ejemplo 2.

Sin embargo, se entiende que unos marcadores de AFLP pueden ser convertidos en otros tipos de marcadores moleculares. Cuando se hace referencia a un marcador de AFLP específico en el presente invento, se entiende que la definición abarca otros tipos de marcadores moleculares usados para detectar la variación genética que originalmente ha sido identificada por el marcador de AFLP. Por ejemplo, si un marcador de AFLP es convertido en otro marcador molecular usando métodos conocidos, este otro marcador está incluido en la definición. Por ejemplo, unos marcadores de AFLP pueden ser convertidos en unos marcadores específicos para una secuencia tales como, pero sin limitarse a, marcadores de STS (acrónimo de sequenced-tagged-site = sitio etiquetado y secuenciado) o marcadores de SCAR (acrónimo de sequence-characterized-amplified-region = región amplificada y caracterizada por una secuencia) usando una tecnología clásica tal como se ha descrito en las citas de Meksem y colaboradores [(2001), Mol Gen Genomics 265(2):207-214], Negi y colaboradores [(2000), TAG 101:146-152], Barret y colaboradores, (1989), TAG 97:828-833], Xu y colaboradores [(2001), Genome 44(1):63-70], Dussel y colaboradores [(2002), TAG 105:1190-1195] o Guo y colaboradores [(2003), TAG 103:1011-1017]. Dussel y colaboradores [(2002), TAG 105:1190-1195] convirtieron unos marcadores de AFLP engarzados a resistencia en unos marcadores de sitios etiquetados por secuencia basándose en una PCR, tales como marcadores indel (de inserción/deleción) y unos marcadores de CAPS (acrónimo de cleaved amplified polymorphic sequence = secuencia polimórfica amplificada y disociada).

La conversión de un marcador de AFLP en un marcador de STS implica generalmente la purificación del fragmento de ADN a partir del gel de AFLP y la clonación y secuenciación del fragmento de ADN. La clonación y la secuenciación de fragmentos (bandas) de AFLP se pueden llevar a cabo usando métodos conocidos [Guo y colaboradores TAG 103:1011-1017]. Basándose en la secuencia del marcador se pueden desarrollar unos cebadores de PCR específicos para el lugar (interno) [Paran y Michelmore (1993), TAG 85:985-993], que amplifican a fragmentos de diferentes tamaños, o en los que el producto de la PCR es disociado con una enzima de restricción después de una amplificación para revelar un polimorfismo. Puesto que los cebadores internos de PCR, con frecuencia, no revelan unos polimorfismos relacionados con las diferencias de sitios de restricción por EcoRI, MseI o PstI (u otras enzimas), se puede usar una PCR inversa [Hartl y Ochmann (1996), en: Harwood A, coordinador de edición, Methods in molecular biology [Métodos en biología molecular] vol 58: se pueden usar protocolos básicos de ADN y ARN, Humana Press, Totowa NJ páginas 293-301] o de ambulación en PCR [Negi y colaboradores (2000), TAG 101:146-152; Siebert y colaboradores, (1995), NAR 23:1087-1088] para identificar unas secuencias flanqueadoras que se pueden usar luego para generar unos simples marcadores basados en la PCR, específicos para el lugar. Los cebadores se pueden diseñar con facilidad usando unos programas lógicos de ordenador tales como los que se proporcionan por Sci-Ed (Scientific & Educational Software PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045 EE.UU.). El polimorfismo del marcador de STS se puede detectar mediante una electroforesis en gel, o se puede detectar usando ensayos fluorométricos, tales como la tecnología de TaqMan® technology (de Roche Diagnostics).

El análisis de AFLP con marcadores engarzados con el Lem-08-syl es referido seguidamente como el "Protocolo de identificación por el AFLP del Lem-08-syl". En una forma de realización del invento, el protocolo de identificación por el AFLP del Lem-08-syl se realiza con un marcador de AFLP específico para B. rapa, tal como, pero in limitarse a, E32/M50-M362.0 ó E36/M51-M171.1 y/o P34/M48-M283.0.

En una forma de realización del invento, la planta que comprende un nuevo gen de resistencia al pie negro, que se deriva del cromosoma R08 de B. rapa, preferiblemente el Lem-08-syl, como se usa aquí, es una planta de B. napus que se selecciona entre el grupo que se compone de:

-

una planta de B. napus que cumple el patrón de calidad de canola establecido por el Canola Council of Canada (http://www.canolacouncil.org),

-

una planta de B. napus que contiene un transgén integrado dentro de su genoma,

-

la progenie de una planta de B. napus que contiene dicho gen de resistencia al pie negro, en que dicha progenie resulta de cruces entre plantas de B. napus que contienen dicho gen de resistencia al pie negro y plantas de Surpass400,

-

una planta de B. napus que contiene un nivel de glucosinolatos alifáticos en una harina de semillas desengrasada y seca, de menos que 30 mmol/g,

-

una planta de B. napus cuyo componente sólido de las semillas contiene menos de 30 micromoles de uno cualquiera o de cualquier mezcla de los compuestos glucosinolato de 3-butenilo, glucosinolato de 4-pentenilo, glucosinolato de 3-hidroxi-3-butenilo y glucosinolato de 2-hidroxi-4-pentenilo por gramo de material sólido exento de aceite, y secado al aire,

-

una planta de B. napus que produce un aceite (después de haber triturado las semillas) que contiene menos 2% de ácido erúcico (de los ácidos grasos totales en el aceite);

-

una planta de colza de semilla oleaginosa de primavera de B. napus

-

una planta de colza de semilla oleaginosa de invierno de B. napus,

-

una planta de B. napus que no contiene un gen de resistencia al pie negro en el cromosoma N2,

-

una planta de B. napus que no contiene un gen de resistencia al pie negro en el cromosoma N10;

-

unas plantas de B. napus que no contienen un gen de resistencia cartografiado en el cromosoma 2 o un gen de resistencia cartografiado en el cromosoma 10, cuyo gen de resistencia se deriva de B. rapa ssp. Sylvestris,

-

una planta de B. napus que comprende un transgén que puede hacer estériles masculinas a plantas, preferiblemente un gen de barnasa;

-

la progenie de una planta de B. napus que contiene dicho gen de resistencia al pie negro, en que dicha progenie resulta de unos cruces entre plantas de B. napus que contienen dicho gen de resistencia al pie negro con cualquiera de las siguientes variedades de colza de semilla oleaginosa:

una variedad de B. napus resistente a ciertos herbicidas, una variedad de B. napus con un alto contenido de aceite en sus semillas, una variedad de B. napus con un alto contenido de ácido oleico (por lo menos 70 por ciento, preferiblemente por lo menos 80 por ciento de los ácidos grasos totales) en sus semillas, una variedad de B. napus con un bajo contenido de ácido linolénico (menos que 10 por ciento, preferiblemente menos que 5 por ciento de los ácidos grasos totales) en sus semillas, Jet Neuf, Quantum, Maluka, Hyola43, Hyola60, Surpass400, Surpass402CL, Surpass603CL, Surpass501TT, una planta RoundupReady®, una planta LibertyLink®, una planta que comprende un transgén de esterilidad masculina, InVigor® 40, InVigor® 70, InVigor® 90, InVigorc® 2573, InVigor® 2663, InVigor® 2733, InVigor® 5020, InVigor® 5030, o InVigor® 5070.

En una forma de realización del invento, se proporcionan unas plantas de B. napus de acuerdo con la reivindicación 1, que comprenden por lo menos un marcador molecular específico para B. rapa, que está engarzado a un lugar de resistencia al pie negro. En particular, se proporciona una planta de B. napus que comprende los marcadores de AFLP E32/M50-M362.0 y/o E36/M51-M171.1 y/o P34/M48-M283 engarzados al Lem-08-syl.

En una forma de realización adicional, se proporcionan unas plantas de B. napus que comprenden por lo menos un marcador de AFLP engarzado al Lem-08-syl. Por ejemplo, se proporcionan unas plantas que comprenden uno o más marcadores de AFLP seleccionados entre P34/M48-M283.0, E32/M50-M362.0 y/o E36/M51-M171.1. Unos marcadores adicionales de AFLP engarzados al Lem-08-syl se pueden identificar por métodos conocidos, tales como, por ejemplo, cartografiado de QTL, Análisis de Segregantes a Granel [BSA; acrónimo de Bulk Segregant Analysis Michelmore y colaboradores, PNAS 88: 9828-9832] combinados con un análisis de AFLP, tal como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Con el fin de identificar unos marcadores de AFLP engarzados más cercanamente, se analizan más plantas individuales y más combinaciones de cebadores de AFLP mediante un análisis de AFLP y los marcadores se sitúan en un mapa de engarce genético usando métodos conocidos, y tal como se describe en los Ejemplos. El engarce entre el marcador de AFLP y el lugar que comprende el Lem-08-syl está preferiblemente cercano, es decir preferiblemente en menos que aproximadamente 6 cM, más preferiblemente en menos que o igual a 5,7 cM, más preferiblemente en menos que 5 cM, en menos que o igual a 4,7 cM, y lo más preferiblemente en menos que 4 cM. En una forma de realización del invento, el Lem-08-syl está flanqueado por dos marcadores dominantes de AFLP, tales como E32/M50-M362.0 y P34/M48-M283.0, que están engarzados al Lem-08-syl en acoplamiento a una distancia de aproximadamente 4,7 y aproximadamente 5,7 cM, respectivamente, desde el Lem-08-syl.

Los marcadores de AFLP engarzados al Lem-08-syl se pueden usar para una selección asistida por marcadores (MAS, acrónimo de marker assisted selection) o una clonación de Lem-08-syl basada en el mapa. La MAS implica escrutar plantas en cuanto a la presencia o ausencia de marcadores engarzados. En particular las plantas se escrutan en cuanto a la presencia de marcadores que flanquean al gen o lugar engarzado. Basándose en la presencia o ausencia del o los marcador(es) se seleccionan o desechan plantas durante el programa de crianza. La MAS puede acelerar significativamente los programas de crianza y la introgresión de un gen particular dentro de otro fondo genético y puede reducir también los problemas con interacciones de genotipo x entorno. La MAS es también útil para combinar diferentes lugares de resistencia al pie negro en una planta. La presencia o ausencia del Lem-08-syl se puede inferir a partir de la presencia o ausencia de marcadores de AFLP engarzados al Lem-08-syl, usando p. ej. el protocolo de identificación por el AFLP del Lem-08-syl. Por ejemplo, unas plantas derivadas de unas semillas depositadas en la ATCC bajo el número de accesión PTA-5410 pueden ser cruzadas con otras plantas de B. napus y luego la progenie procedente de este cruce se escruta en cuanto a la presencia de uno o más marcadores de AFLP engarzados al Lem-08-syl. Se lleva a cabo un análisis de AFLP usando, por ejemplo, uno o varios marcador(es) de AFLP cercanamente engarzado(s), tales como, pero sin limitarse a, E32/M50-M362.0 y/o P34/M48-M283.0. Se pueden usar marcadores engarzados al Lem-10-syl para combinar el Lem-08-syl y el Lem-10-syl en un linaje de planta, y para desarrollar una nueva variedad que comprende dos lugares de resistencia que se derivan de B. rapa.

Los procedimientos de crianza tales como cruce, autopolinización y cruce de retorno son bien conocidos en la especialidad [véanse Allard RW (1960) Principles of Plant Breeding [Principios de crianza de plantas]. John Wiley & Sons, Nueva York, y Fehr WR (1987) Principles of Cultivar Development [Principios de desarrollo de cultivares], Volumen 1, Teoría y Técnicas, Collier Macmillan Publishers, Londres. ISBN 0-02-949920-8]. El Lem-08-syl puede ser transferido dentro de otros linajes de crianza o de otras variedades o bien usando tradicionales métodos de crianza a solas o usando una MAS adicionalmente. En los tradicionales métodos de crianza, el fenotipo de resistencia al pie negro es comprobado en el campo o en ensayos en entornos controlados con el fin de seleccionar o desechar plantas que comprendan o carezcan del Lem-08-syl. Se pueden hacer diferentes cruces para transferir el Lem-08-syl dentro de linajes o variedades de B. napus o de linajes o variedades de B. juncea. El Lem-08-syl puede ser transferido al genoma A de B. juncea mediante cruces interespecíficos entre B. napus y B. juncea [Roy (1984), Euphytica 295-303]. El programa de crianza puede implicar una operación de cruce para generar una F1 (primera generación filial), seguida por varias generaciones de autopolinización (generación de F2, F3, etc.). El programa de crianza puede implicar también unas operaciones de cruce de retorno (BC), en las cuales la progenie se cruza de retorno con uno de los linajes parentales (denominado el progenitor recurrente). Los criadores seleccionan unos rasgos importantes agronómicamente, tales como los de alto rendimiento, alto contenido de aceite, perfil de aceite, época de floración, altura de la planta, resistencia a la enfermedad, resistencia al desgrane o destrucción de vainas, etc., y desarrollan de esta manera unos linajes de crianza de élite (linajes con buenas características agronómicas). Además, las plantas son criadas para cumplir con unos patrones de calidad, tales como la calidad de "canola" (menos que 30 \mumoles por gramo de glucosinolatos en una harina exenta de aceite y menos que 2% en peso de ácido erúcico en el aceite, véase, p. ej. el documento de patente de los EE.UU. US 6.303.849B1 para la calidad de canola de B. juncea).

El "Protocolo de Identificación por el AFLP del Lem-08-syl" se refiere a la extracción de un ADN a partir de un tejido de planta, tal como un tejido de hoja o semillas, y a la realización de unos análisis de AFLP en cuanto a uno o mas de los marcadores de AFLP engarzados. El protocolo de identificación del Lem-08-syl se puede llevar a cabo en un ADN obtenido a partir de plantas individuales o en un ADN obtenido a partir de montones a granel (o agrupaciones). En una forma de realización se proporcionan unos estuches para detectar la presencia del Lem-08-syl en un ADN de B. napus o B. juncea. Dicho estuche comprende por lo menos un par de cebadores de PCR que son capaces de amplificar un marcador de ADN engarzado al Lem-08-syl. El estuche puede comprender uno o más de los siguientes pares de cebadores: E32/M50, P34/M48, P31/M59, E32/M48, E31/M61 o E36/M51, capaces de amplificar un fragmento de ADN con un tamaño de aproximadamente 362 pb, 283 pb, 97 pb, 162 pb, 237 pb o 171 pb (pb = pares de bases), respectivamente. En particular, se incluyen en el estuche E32/M50 y/o P34/M48. El estuche puede comprender además unas muestras, que se pueden usar como testigos positivos o negativos y unos reactivos adicionales para un análisis de AFLP, como se describen en el Ejemplo 1. Las muestras pueden ser muestras de tejidos o muestras de ADN. Como un testigo positivo se pueden incluir por ejemplo unas semillas depositadas en la ATCC bajo el número de accesión PTA-5410 o se pueden derivar unas semillas a partir de ellas. Como testigos negativos se pueden incluir semillas del cultivar Kristina o Stellar.

En una forma de realización del invento, se proporcionan unas plantas y semillas de B. napus que comprenden el Lem-08-syl. Se generan semillas cruzando dos linajes parentales congénitos, en que uno de los linajes parentales congénitos comprende el Lem-08-syl en el cromosoma N08. Con el fin de producir semillas híbridas puras, uno de los linajes parentales es estéril masculino y es polinizado con polen del otro linaje. Haciendo crecer linajes parentales en filas y cosechando solamente la semilla F1 del progenitor estéril masculino, se producen semillas híbridas puras. Con el fin de generar linajes parentales estériles masculinos, se puede usar el sistema que se describe en el documento EP 0.344.029 o US 6.509.516, en el que un gen que codifica una proteína fitotóxica (barnasa) es expresado bajo el control de un promotor específico para tapetum, tal como el TA29, que asegura una destrucción selectiva de células de tapetum. La transformación de plantas con el gen quimérico pTA29:barnasa da como resultado unas plantas en las que se impide completamente la formación de polen [Mariani y colaboradores (1990), Nature 347: 737-741]. Un análisis citoquímico e histoquímico del desarrollo de anteras de plantas de Brassica napus que comprenden el gen quimérico pTA29-barnasa ha sido descrito por De Block and De Brouwer [(1993), Planta 189:218-225]. Para restaurar la fertilidad en la progenie de la planta estéril masculina, la planta estéril masculina (progenitora MS) es cruzada con una planta transgénica (progenitora RF) que lleva un gen restaurador de la fertilidad que, cuando es expresado, es capaz de inhibir o impedir la actividad del gen de esterilidad masculina [documentos de patente de los EE.UU. n^{os} 5.689.041; 5.792.929; De Block y De Brouwer, supra]. El uso de genes reguladores concomitantes en la producción de plantas estériles masculinas para aumentar la frecuencia de transformantes que tienen un buen rendimiento agronómico, se describe en el documento de solicitud de patente internacional WO96/26283. Típicamente, cuando el ADN de esterilidad codifica una barnasa, el ADN concomitantemente regulador codificará un gen barstar, preferiblemente se usa un gen barstar optimizado tal como se describe en la solicitud de patente PCT publicada WO 98/10081. Se entiende que se pueden usar diferentes promotores para impulsar la expresión de barnasa con el fin de hacer estéril masculina a la planta. Similarmente, el barstar se puede engarzar operativamente a diferentes promotores, tales como los virus del mosaico de la coliflor (Cauliflower mosaic virus).

Unas plantas estériles masculinas se pueden generar también usando otras técnicas, tales como los sistemas de esterilidad masculina citoplasmática y restaurador [p. ej. el sistema de Ogura, solicitud de patente de los EE.UU. publicada 20020032916, los documentos US 6.229.072, WO97/02737, US 5.789.566 o el sistema Polima del documento US 6.365.798, WO98/54340 o el sistema de Kosena del documento WO95/09910, US 5.644.066].

Ya sea el progenitor MS o el progenitor RF o ambos, pueden comprender el Lem-08-syl en el cromosoma N08. Esto se puede conseguir introgresando el Lem-08-syl dentro de un linaje de B. napus y luego transformando este linaje con el gen pTA29-barnasa o con el gen pNOS-barstar usando métodos conocidos. Alternativamente, el Lem-08-syl se puede introgresar directamente en un linaje progenitor MS o RF transgénico, cruzando una planta que comprende el Lem-08-syl con el progenitor MS o con el progenitor RF. Las semillas híbridas F1 generadas a partir del cruce entre los progenitores MS y RF contendrán entonces el Lem-08-syl.

Las plantas transgénicas pueden contener adicionalmente un gen endógeno o un transgén, que confiere una resistencia a ciertos herbicidas tales como el gen bar o pat, que confiere resistencia al glufosinato amonio (Liberty o Basta) [documentos EP 0 242 236 y EP 0 242 246 incorporados por su referencia]; o cualquier gen EPSPS modificado, tales como el gen 2mEPSPS procedente de maíz [documentos EP 0 508 909 y EP 0 507 698 incorporados por su referencia], que confiere resistencia al glifosato (RoundupReady).

En una forma de realización adicional, el invento proporciona métodos de apilar (o de disponer piramidalmente) lugares de resistencia al pie negro en un(a) único(a) linaje de planta o variedad, y en particular en semillas híbridas y plantas híbridas. Aunque hay un nivel máximo de resistencia al pie negro que una planta puede desarrollar (resistencia completa o casi completa), hay una ventaja en apilar lugares de resistencia al pie negro. Primeramente, los diferentes lugares de resistencia pueden tener diferentes modos de acción. Esto tiene el efecto de que es menos probable que la población patógena sea capaz de superar una resistencia, o por lo menos de que es menos probable que sea capaz de superar una resistencia dentro de un breve período de tiempo. Aunque se puede desarrollar un material aislado patógeno (p. ej., mediante mutación o recombinación genética) que es capaz de superar un modo de acción, es menos probable que se desarrolle un único material aislado que sea capaz de superar varios modos de acción. Además, diferentes lugares de resistencia pueden conferir resistencia en diferentes etapas del desarrollo de una planta. Por ejemplo, un lugar puede conferir resistencia en la etapa de cotiledones, otro lugar puede conferir resistencia a madurar hojas y un lugar adicional conferir resistencia a una infección del tallo. La durabilidad de una resistencia al pie negro en una planta que comprende lugares de resistencia apilados es aumentada, lo cual significa que la resistencia no se frenará (o se frenará significativamente más tarde que lo que ocurriría si la planta contuviese solamente un sitio de resistencia principal) si la planta se hace crecer en un área grande (acreage) en muchos sitios. El invento proporciona unos métodos y medios para apilar el gen de resistencia al pie negro Lem-08-syl en el cromosoma N08 con adicionales lugares de resistencia al pie negro, tales como, pero sin limitarse a, el Lem-10-syl (en el cromosoma N10, genoma A), el Lem-07 (en el cromosoma N07, genoma A), el Lem-14 (en el cromosoma N14, genoma C). En particular, se proporciona una planta que comprende por lo menos dos lugares de resistencia al pie negro, procedentes de accesiones de B. rapa silvestres, tales como el Lem-08-syl y el Lem-10-syl.

Con el fin de apilar lugares de resistencia en un único linaje o una única variedad de planta o en semillas híbridas y plantas híbridas, los lugares se pueden combinar siguiendo unos procedimientos generales de cruce y selección.

A menos que se señale otra cosa distinta en los Ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo de acuerdo con protocolos clásicos, tal como se describen en la obra de Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación Molecular, un Manual de Laboratorio), Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, en los Volúmenes 1 y 2 de la obra de Ausubel y colaboradores (1994) Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos actuales en Biología Molecular], Current Protocols, EE.UU. y en los Volúmenes I y II de la obra de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edición, Academic Press (Reino Unido = RU). Unos materiales y métodos clásicos para el trabajo molecular en plantas se describen en la obra Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D. Croy, publicada conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications, RU. Unos materiales y métodos clásicos para reacciones en cadena de la polimerasa se pueden encontrar en la obra de Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual [Cebadores de PCR, un Manual de Laboratorio], Cold Spring Harbor Laboratory Press, y en la obra de McPherson y colaboradores (2000) PCR - Basics: From Background to Bench [Características básicas de PCR, desde los fundamentos al banco de laboratorio], primera edición, editorial Springer, Alemania. Unos procedimientos clásicos para un análisis de AFLP se describen en la cita de Vos y colaboradores, (1995, NAR 23:4407-4414) y en la solicitud de patente europea publicada EP 534858.

Estas son las secuencias halladas en la adjunta enumeración de secuencias y a las que se hace referencia en la descripción del invento o de los Ejemplos:

SEQ ID NO:1: secuencia 5'-3' del adaptador de MsI

SEQ ID NO:2: secuencia 3'-5' del adaptador de MsI

SEQ ID NO:3: secuencia 5'-3' del adaptador de EcoRI

SEQ ID NO:4: secuencia 3'-5' del adaptador de EcoRI

SEQ ID NO:5: secuencia 5'-3' del adaptador de PstI

SEQ ID NO:6: secuencia-3'-5' del adaptador de PstI

SEQ ID NO:7: cebador E01 de AFLP

SEQ ID NO:8: cebador M01 de AFLP

SEQ ID NO:9: cebador M02 de AFLP

SEQ ID NO:10: cebador P01 de AFLP

SEQ ID NO:11: cebador E31 de AFLP

SEQ ID NO:12: cebador E32 de AFLP

SEQ ID NO:13: cebador E36 de AFLP

SEQ ID NO:14: cebador M48 de AFLP

SEQ ID NO:15: cebador M50 de AFLP

SEQ ID NO:16: cebador M51 de AFLP

SEQ ID NO:17: cebador M59 de AFLP

SEQ ID NO:18: cebador M61 de AFLP

SEQ ID NO:19: cebador P31 de AFLP

SEQ ID NO:20: cebador P34 de AFLP

Ejemplos Ejemplo 1 Cartografiado del Lem-08-syl mediante un análisis de AFLP Generación de poblaciones de cartografiado de BC3 y DH

La Kristina es una variedad de colza de semilla oleaginosa de primavera (SOSR) susceptible de infección por el pie negro. El RFM292 es un linaje sintético de B. napus. El RFM292 fue generado cruzando una accesión silvestre de B. rapa ssp sylvestris procedente de Sicilia (#75) [Crouch y colaboradores (1994)] con una accesión silvestre de B. atlantica procedente de Túnez (#25) [Mithen y Magrath (1992)], rescatando los embriones y duplicando los cromosomas mediante un tratamiento con colquicina, tal como se describe en la cita de Crouch y colaboradores (1994).

La Kristina fue cruzada con el RFM292. Unas plantas F1 derivadas de este cruce fueron cruzadas de retorno con Kristina, generando una población BC1, que fue autopolinizada para generar plantas BC1S1. La resistencia de las plantas BC1S1 fue ensayada en una prueba en el campo y se seleccionaron linajes resistentes para una autopolinización adicional con el fin de generar plantas BC1S3. Con el fin de seleccionar plantas para autopolinización, ellas se ensayaron en cuanto a resistencia a diversos materiales aislados de pie negro (materiales aislados Canadienses, Australianos, Británicos). Unos linajes BC1S3 resistentes fueron luego cruzados de retorno nuevamente dos veces con Kristina para generar unas poblaciones BC2 y BC3. 300 plantas BC3 fueron ensayadas en cuanto a la resistencia al pie negro en ensayos realizados en cámaras de crecimiento. Unas agrupaciones de plantas BC3 resistentes y unas agrupaciones de plantas BC3 susceptibles fueron analizadas mediante un Análisis de Segregantes a Granel (BSA, acrónimo de Bulk Segregant Analysis) de AFLP [Michelmore y colaboradores PNAS 88: 9828-9823] tal como se describe seguidamente, con el fin de identificar marcadores de AFLP engarzados con resistencia al pie negro. Además 300 plantas BC3 fueron sometidas a un análisis de AFLP con el fin de cartografiar la resistencia al pie negro como se describe seguidamente.

Además, una población doblemente haploide (DH, acrónimo de double haploid) se derivó de los F1 (individuos de BC2) de un cruce entre Kristina y BC1S3 mediante cultivo de microsporas [Mollers y colaboradores (1994), Euphytica 75:95-104]. La población DH se usó para comprobar la fenotipificación múltiple, los resultados del cartografiado obtenidos a partir del análisis de BC3 y el engarce de marcadores de AFLP con el gen de resistencia al pie negro Lem-08-syl.

\vskip1.000000\baselineskip

Análisis del polimorfismo de longitudes amplificadas de fragmentos (AFLP) Extracción del ADN

El ADN se extrajo a partir de linajes progenitores, linajes testigos, plantas BC3 y plantas DH usando un protocolo de CTAB modificado. Diez discos de hojas (con un diámetro de 0,8 cm) por cada muestra se congelaron en nitrógeno líquido, se maceraron con una mano de almirez y un mortero y se transfirieron a unos tubos de Eppendorf. Se añadió a cada muestra 1 ml del tampón de CTAB (100 ml = 10 ml de Tris-HCl 1 M de pH 7,5, 28 ml de NaCl 5 M, 4 ml de EDTA 0,5 M, 1 g de CTAB, agua) y los tubos de Eppendorf se incubaron a 65ºC durante 90 minutos y se invirtieron varias veces durante la incubación. Después de una breve centrifugación, se añadieron 500 \mul de una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico (24/1) y las muestras se homogeneizaron durante 5 minutos. Los tubos de Eppendorf fueron luego centrifugados a 7.000 rpm (revoluciones por minuto) durante 10 minutos y el material sobrenadante se transfirió a tubos de Eppendorf limpios. El ADN fue precipitado por adición de 1 ml de isopropanol y centrifugando a 13.000 rpm durante 10 minutos. El sedimento se lavó con 500 \mul de una solución de lavado (76% de EtOH, NaOAc 0,2 M) durante 20 minutos, seguido por un segundo lavado (76% de EtOH, NH_{4}Oac 0,01 M) durante 10 minutos. Los sedimentos fueron secados al aire y disueltos en 100 \mul de TE (Tris-HCl 1 M de pH 8, EDTA 5 M). (CTAB = bromuro de hexadecil-trimetil-amonio).

\vskip1.000000\baselineskip

Análisis de AFLP

El análisis de AFLP fue adaptado a partir de Vos y colaboradores (1995). El ADN genómico fue restringido con las enzimas de restricción MseI y EcoRI, o con las MseI y PstI y unos adaptadores (Proligo®) fueron ligados a los fragmentos de restricción (las secuencias de los adaptadores son tal como se describen en Vos y colaboradores (1995), y en los documentos EP 0534858 y US 6,045.994].

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencias de adaptadores

1

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

La digestión por restricción y la ligación de los adaptadores se llevaron a cabo en una única reacción en placas de microtitulación por adición de 10 \mul de una mezcla para restricción (5 U de EcoRI, 5 U de MseI, 4 \mul del tampón de OPA, agua hasta llegar a un volumen de 10 \mul) y 10 \mul de una mezcla para ligación de adaptadores (50 pMoles del adaptador de MseI, 5 pMoles del adaptador de EcoRI, 1 \mul de ATP 10 mM, 1 \mul del tampón de OPA, 5 U de la ligasa de T4, agua hasta llegar a un volumen de 10 \mul) a muestras de ADN (con un volumen de 30 \mul), seguida por una incubación a 37ºC durante 4 horas. Las muestras fueron diluidas 10 veces con TE0.1 (10 mM de Tris.HCl de pH 8, 0,1 mM de EDTA).

Las secuencias de cebadores de AFLP corresponden a la cita de Vos y colaboradores (1995), y a los documentos EP 0534858 y US 6.045.994 (Proligo®). Una amplificación previa con unos cebadores +1 (que tienen una extensión selectiva para una base) se llevó a cabo en placas de microtitulación (Biozyme) usando un ciclador de PCR Hybaid Omnigene [ciclo 1: 94ºC durante 30 segundos (desnaturalización), 65ºC durante 30 segundos (reanillado), 72ºC durante 60 segundos (elongación); los ciclos 2-13: la temperatura de reanillado es disminuida a razón de 0,7ºC por ciclo; los ciclos 14-36: 94ºC durante 30 segundos, 56ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 60 segundos]. La mezcla para amplificación previa consistía en 5 \mul de una plantilla de ADN diluida a 10 veces, 25 \mul de una mezcla de un cebador y dNTPs (10x = 750 ng \mul de cada cebador, 20 \mul de dNTPs 5 mM, 200 \mul de agua), 20 \mul de una mezcla de una polimerasa y un tampón (10x = 50 \mul de un tampón 10xPCR, 2 \mul de la polimerasa de Taq (5 U/\mul), 148 \mul de agua) cubierta por 50 \mul de un aceite mineral. Para la amplificación selectiva de fragmentos de restricción (usando el ADN previamente amplificado como plantilla) se usaron unos cebadores +3 (que tenían 3 extensiones selectivas
para bases).

4

5

El cebador de EcoRI o PstI fue marcado o etiquetado con "y 33P-ATP". La mezcla de reacción se componía de 5 \mul de un ADN de plantilla (producto de amplificación previa, diluido en 10x), 5 \mul de una mezcla de cebadores y dNTPs (10x = 50 ng de cebador marcado, 300 ng de un cebador no marcado, 8 \mul de dNTPs 5mM, agua hasta 50 \mul), 10 \mul de una mezcla de la polimerasa de Taq y un tampón (10x = 20 \mul de un tampón de 10xPCR, 0,8 \mul de la polimerasa de Taq, agua hasta 100 \mul) y 20 \mul de un aceite mineral. El tampón de 10xPCR se compone de 100 mM de Tris de pH 8,3, 15 mM de MgCl_{2} y 500 mM de KCl. Los ciclos de PCR son idénticos a los que usan para la identificación
previa.

Los productos de PCR fueron separados sobre geles desnaturalizadores de poli(acrilamida) al 4,5% durante (durante 2,5 h a 110 W), conjuntamente con una escalera de ADN de 10 pb sequamark. Los geles secados fueron expuestos durante una noche (a Fujifilm, pantallas de BAS-MS 2040) y escrutados en un escrutador Fuji BAS-2500. Las imágenes digitales de los geles fueron analizadas usando un programa lógico AFLP-Quantar PRO software
(de KeyGene).

Unas bandas polimórficas (de marcadores) fueron calificadas y los marcadores de AFLP fueron denominados basándose en la combinación específica de cebadores +3 con la que ellos fueron generados, seguido por el peso molecular aproximado de la banda polimórfica (estimado por comparación con la escalera de 10 pb). Por ejemplo, E32/M50-M362.0 se refiere a una banda con un tamaño de aproximadamente 362 pares de bases, generada por amplificación selectiva de segmentos de restricción con el par de cebadores E32 y M50. No se calificaron los marcadores monomórficos (es decir, una banda con cierto tamaño, que está presente en todas las plantas).

\vskip1.000000\baselineskip

Fenotipificación de plantas BC3 en ensayos en cámaras de crecimiento

300 plantas BC3 fueron ensayadas en cuanto a resistencia al pie negro en ensayos realizados en cámaras de crecimiento. Un cierto número de linajes testigos tales como los cultivares Kristina, Stellar, Surpass400 y el linaje RFM292 se incluyeron en los ensayos (aproximadamente 40-50 plantas por linaje).

Un material aislado Leroy1 de L. maculans con una única espora (Phoma lingam) se usó en los ensayos de resistencia a la enfermedad. El Leroy1 es un material aislado Canadiense. El material aislado fúngico se hizo crecer sobre placas de agar V8 (1 litro = 800 ml de agua, 200 ml de jugo de V8, 0,75 g de CaCO_{3}, 15 g de agar Difco, 40 mg de Rosa de Bengala y 100 mg/l de sulfato de estreptomicina para impedir el crecimiento de las bacterias) durante 1-2 semanas a 25ºC en la oscuridad, seguido por 1-2 días bajo luz ultravioleta UV (14/10 horas de luz/oscuridad) a 20ºC. Se cosecharon picnidiosporas por inundación de las placas con 5 ml de agua destilada estéril y soltando las esporas con una varilla de vidrio estéril. Las esporas fueron filtradas a través de una malla de nylon (de 45 \mum), centrifugadas a 3.500 rpm durante 10 minutos y vueltas a suspender en agua destilada estéril. Las concentraciones de las esporas se midieron usando un hemocitómetro y se ajustaron a 10^{7} esporas/ml usando agua destilada estéril. Las suspensiones de esporas fueron almacenadas a -20ºC.

Unas semillas de plantas de B. napus fueron esterilizadas en la superficie y sembradas en una tierra normalizada en bandejas de recipientes múltiples, y transferidas después de aproximadamente 3 semanas a unos recipientes con un diámetro de 10 cm. Las plantas se hicieron crecer en unas cámaras de crecimiento durante aproximadamente 2,5 semanas a 18-20ºC (día), 14 h/10 h (luz/oscuridad), humedad relativa 70%, hasta que emergieron tres hojas verdaderas. Unas inoculaciones se llevaron a cabo lesionando el peciolo de la hoja más antigua con una aguja cercana al tronco (dos lesiones de aproximadamente 0,5 cm) y aplicando una pequeña picadura superficial con la aguja dentro del tronco en una posición cercana al eje de la hoja. 10 \mul de una suspensión de esporas (10^{7} esporas/ml) se aplicaron al tallo lesionado. La humedad en la cámara de crecimiento fue mantenida en 100% de HR (humedad relativa) durante 3 días.

Después de nueve semanas se comprobaron los síntomas en los tallos. Se calificaron los síntomas tanto externos como internos. Los síntomas externos fueron calificados midiendo la lesión circundante (ceñidura) (A). Los síntomas internos fueron calificados cortando (horizontalmente) a través de la base del tallo con unas tijeras de podar y calificando el porcentaje del diámetro de tallo que muestra síntomas de enfermedad (B) y midiendo la longitud de la lesión interna (cortando el tallo a lo largo del eje vertical) (C). Todas las calificaciones de los tallos se llevaron a cabo en una escala de 0 (ningún síntoma) a 5 (síntomas sumamente graves, p. ej. ceñidura completa). Una calificación de enfermedad global se calculó de la siguiente manera: calificación de tallo global = 1 x A + 2 x B + 2 x C. La calificación de tallo global variaba entre 0 y 25. Los testigos susceptibles, tales como la Kristina, tenían de modo uniforme y coherente una calificación de 25.

Las plantas mostraron unos fenotipos distintos y distinguibles, y podrían ser divididas en clases distintas distinguibles basándose en la calificación de tallo global usando un valor de corte de 12,5. 147 plantas eran resistentes (R) y 140 eran susceptibles (S) al pie negro. Por lo tanto, la resistencia y la susceptibilidad basadas en el tallo, segregadas en una relación de 1:1 (Chi^{2}= 0,17) indicaban que un único gen dominante de resistencia al pie negro se segregaba en la población BC3, el cual fue denominado "Lem-08-syl".

\newpage

Análisis de segregantes a granel (BSA)

Con el fin de identificar marcadores de AFLP engarzados al Lem-08-syl, se llevó a cabo un BSA de acuerdo con Michelmore y colaboradores [(1991), PNAS 88:9828-9823]. Los datos fenotípicos obtenidos para las 300 plantas BC3 en el anterior ensayo realizado en cámaras de crecimiento, se usaron para seleccionar los linajes más resistentes y más susceptibles para el BSA. Cuatro agrupaciones de cinco individuos resistentes y seis agrupaciones de cinco individuos susceptibles se generaron. Las agrupaciones de ADN se generaron agrupando cantidades iguales de productos previos a la amplificación. Luego las agrupaciones se ensayaron mediante un análisis de AFLP usando 47 (+3) combinaciones de cebadores de AFLP.

Unos fragmentos (marcadores) polimórficos de AFLP, presentes solamente en las agrupaciones resistentes y ausentes en la mayor parte de las agrupaciones susceptibles, fueron calificados. La calificación se realizó solamente para los marcadores de AFLP engarzados a la resistencia en acoplamiento (es decir, procedentes del progenitor donante). No se realizó ninguna calificación para marcadores engarzados a susceptibilidad (es decir, en repulsión, a partir del progenitor recurrente). Se encontró que 41 marcadores de AFLP eran (parcialmente) discriminadores entre agrupaciones resistentes y susceptibles. Se seleccionaron 12 de los mejores marcadores de AFLP (basándose en la calidad de la pauta y la óptima capacidad de discriminar entre agrupaciones resistentes y susceptibles) para escrutar inicialmente 43 plantas individuales de los anteriores montones a granel de la población BC3 (20 individuos resistentes y 23 individuos susceptibles) con el fin de analizar el engarce de los marcadores.

El análisis del engarce se llevó a cabo usando los 12 marcadores de AFLP y el marcador fenotípico (Lem-08-syl) usando el programa lógico JoinMap Version 3.0 [Van Ooijen y Vorrips, (2001), JoinMap Version 3,0, Software para el cálculo de los mapas de engarce genético, Plant Research International, Wageningen, Países Bajos].

Las frecuencias de recombinación por pares entre marcadores dentro de un grupo de engarce se calcularon usando parámetros por defecto de JoinMap V3,0, usando el algoritmo de Kosambi [Kosambi (1944), Ann. Eugenet. 12:172-175]. El orden relativo de los marcadores y la distancia entre marcadores se calcularon también usando ajustes predeterminados por defecto de JoinMap V3.0.

El análisis del engarce agrupó a 4 marcadores dominantes de AFLP y al Lem-08-syl en un grupo de engarce. Los otros 7 marcadores de AFLP fueron agrupados conjuntamente en un grupo separado y no se consideraron adicionalmente. Los cuatro marcadores de AFLP engarzados, que estaban presentes en la agrupación de plantas resistentes y ausentes en la agrupación de plantas susceptibles, fueron E32/M50-M362.0*, E32/M48-M162.7, E31/M61-M237.6 y E36/M51-M171.1*. Dos de estos marcadores (etiquetados con *) eran marcadores específicos para B. rapa, lo que significa que en la correspondiente posición no se halla ninguna banda en plantas de B. napus cultivadas, mientras que el marcador está presente en la especie diploide de B. rapa. Esto indicaba que el lem-08-syl fue introgresado desde la accesión silvestre de B. rapa. Estos dos marcadores fueron colocados en un mapa de B. rapa interno en el cromosoma R08. Puesto que el R08 corresponde al N08 en B. napus, el grupo de engarce de B. napus fue denominado N08 [de acuerdo con Sharpe y colaboradores (1995), Genome 38:1112-1121].

El Lem-08-syl, por lo tanto, se cartografió en el extremo distante del cromosoma 8 (N08) del mapa de B. napus, como se muestra seguidamente

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

Las distancias genéticas entre lugares se dan en centiMorgans (cM).

Los marcadores de AFLP específicos para B. rapa E32/M50-M362.0 y E36/M51-M171.1 flanqueaban al Lem-08-syl, confirmando que el Lem-08-syl está situado en un segmento de ADN introgresado a partir de B. rapa ssp sylvestris.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Generación de marcadores de AFLP engarzados más cercanamente

Con el fin de generar unos marcadores de AFLP que están engarzados más cercanamente al Lem-08-syl, unas agrupaciones por adición de plantas BC3 se sometieron a un análisis BSA (como antes se describe). Nuevas agrupaciones resistentes y susceptibles fueron generadas y escrutadas usando combinaciones de cebadores de AFLP +3 PstI/MseI. Se identificaron dos marcadores adicionales engarzados Lem-08-syl, P34/M48-M283.0 y P31/M59-M97.1. El P34/M48-M283.0 no ha sido todavía cartografiado en B. rapa, pero se encontró que estaba presente en B. rapa y se encontró que estaba ausente de B. napus, y por lo tanto proporciona otro marcador específico para B. rapa.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Cartografiado de engarce usando 259 plantas BC3 individuales

El análisis de AFLP de 259 de las 300 plantas BC3 se llevó a cabo usando las 6 combinaciones de cebadores de AFLP antes identificadas, a saber E32/M50, P34/M48, P31/M59, E32/M48, E31/M61 y E36/M51. Usando los datos fenotípicos obtenidos a partir de ensayos realizados en cámaras de crecimiento para las 300 plantas BC3 (que antes se describen) y estos datos de AFLP, se llevó a cabo el análisis de engarce usando el JoinMap V3.0.

Se genero el siguiente mapa genético:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

Los dos marcadores específicos para B. rapa cartografiados flanqueaban una región de aproximadamente 21 cM, lo que se confirmó en un mapa de B. rapa interno.

El cartografiado de QTL (cartografiado de intervalos) se llevó a cabo también usando los mismos datos de AFLP y la calificación de pie negro global (calificación cuantitativa) para las 300 plantas BC3. El pico del QTL identificado correspondía a la posición del Lem-08-syl en el mapa genético, y explicaba un 77,8% de la varianza para la resistencia al pie negro (calificación LOD de 68,12, umbral de LOD de 3,0) (véase la Fig. 1).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Esquema pasa a página siguiente)

\newpage

Fig. 1 Cartografiado de intervalos de resistencia al pie negro

8

En conclusión, se identificaron 6 marcadores engarzados al Lem-08-syl. Los marcadores AFLP engarzados más cercanamente fueron E32/M50-M362.0 y P34/M48-M283.0.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Confirmación de marcadores de AFLP engarzados en la población de cartografiado DH

Con el fin de confirmar el hallazgo de que hay una perfecta correlación entre la presencia (o ausencia) de los marcadores de AFLP E32/M50-M362.0 y P34/M48-M283.0 y la presencia (o ausencia) de resistencia del Lem-08-syl, los linajes DH (descritos en el Ejemplo 1) se analizaron en cuanto a resistencia al pie negro en pruebas en el campo realizadas en Canadá y Australia en 2001.

Los linajes DH fueron escrutados también en cuanto a la presencia de los marcadores de AFLP E32/M50-M362.0 y P34/M48-M283.0. El ADN se extrajo a partir de 2 discos de hojas por cada linaje DH y el análisis de AFLP, tal como se ha descrito anteriormente, se llevó a cabo usando las combinaciones de cebadores E32/M50 y P34/M48. La presencia de una banda de aproximadamente 362 pb o 283 pb para PC E32/M50 y PC P34/M48, respectivamente, se calificó como un signo más (+). Como testigo negativo se uso el ADN procedente de los cultivares de B. napus Kristina y Stellar. También un linaje BC1S3 (34B), del que se conocía que no comprendía el Lem-08-syl, se incluyó como testigo negativo. Como linaje testigo positivo se incluyó el BC1S3-45B, conocido porque comprende el Lem-08-syl. Basándose en los análisis de AFLP se hizo una predicción de si la planta contenía o no el Lem-08-syl y de si era resistente a una infección por pie negro. La predicción se confirmó en las pruebas en el campo seguidamente dadas.

\vskip1.000000\baselineskip

Resultado de los análisis de AFLP

9

Se predijo que los linajes DH que contenían los dos marcadores de AFLP flanqueadores contenían el Lem-08-syl, y por lo tanto se predijo que eran resistentes a una infección por pie negro. Con el fin de ensayar la resistencia al pie negro de los linajes DH, se llevaron a cabo pruebas en el campo.

\vskip1.000000\baselineskip

Pruebas en el campo en Canadá

Unas semillas de los linajes DH se sembraron en filas individuales y en dos repeticiones en Canadá. Se calculó la calificación media de pie negro de las dos repeticiones y se da en la tabla siguiente. Se incluyeron unos linajes testigos, tales como Kristina, Stellar, Westar, Quantum, Dunkeld y/u Oscar. Se comprobó la resistencia al pie negro por cada fila en madurez a una escala de 1 a 9, adaptada a partir de NIAB.

\vskip1.000000\baselineskip

Calificación de la enfermedad de pie negro

1

= una mayoría de muerte de plantas

2-3

= una proporción significativa de plantas muertas o que están muriendo

4-6

= la mayoría de las plantas tienen chancro en la base del tallo pero poca muerte de plantas

7-8

= una pequeña cantidad de chancro en la base del tallo y poca o ninguna muerte de plantas

9

= no hay síntomas externos de chancro de tallo y no hay muerte de plantas.

11

\newpage

12

\vskip1.000000\baselineskip

El fenotipo de resistencia al pie negro, predicho por la presencia de los marcadores de AFLP que flanquean al Lem-08-syl, se confirmó en la prueba en el campo realizada en Canadá, como se muestra en la tabla anterior.

\vskip1.000000\baselineskip

Pruebas en el campo realizadas en Australia

Unas semillas de una selección de linajes DH y de diversos linajes testigos se sembraron en dos sitios en Australia. Ambos sitios fueron sembrados dentro del rastrojo de plantas cultivadas de canola comerciales, para proporcionar un alto nivel de presión de enfermedad.

En ambos sitios que sembraron dos repeticiones de filas únicas de tres metros. Se comprobó una infección por pie negro (dos veces en cada sitio, una vez en la época de floración, y una vez en madurez. La resistencia se comprobó visualmente en cada fila a una escala de 1 a 9. Se calculó la media de las dos repeticiones.

\vskip1.000000\baselineskip

Calificación de la enfermedad de pie negro

1

= una mayoría de muerte de plantas

2-3

= una proporción significativa de plantas muertas o que están muriendo

4-6

= la mayoría de las plantas tienen chancro en la base del tallo pero poca muerte de plantas

7-8

= una pequeña cantidad de chancro en la base del tallo y poca o ninguna muerte de plantas

9

= no hay síntomas externos de chancro de tallo y no hay muerte de plantas.

\vskip1.000000\baselineskip

Como se muestra en la tabla siguiente, se observó también que los linajes DH que contenían los marcadores de AFLP engarzados y que se predijeron que eran resistentes al pie negro, eran resistentes a una infección por pie negro en el campo en la época de la floración. Una excepción la constituyó el linaje DH 77-3-6, que estadísticamente no tenía ninguna resistencia significativamente más alta que la media y se le dio la categoría de "intermedia".

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Como se muestra en la tabla siguiente, todos los linajes que contenían los marcadores de AFLP engarzados y que se predijeron que eran resistentes al pie negro, eran también resistentes a una infección por pie negro en el campo, en la madurez (nuevamente con la excepción del linaje 77-3-6), aunque los niveles de resistencia en la madurez (es decir hacia el final de la estación de crecimiento) eran menores que durante la floración (el significado de los asteriscos es como anteriormente).

14

\newpage

En conclusión, los datos de las pruebas en el campo muestran que cuando los dos marcadores de AFLP que flanquean al Lem-08-syl estaban presentes en el ADN, la planta era resistente a una infección por pie negro. Los datos confirman por lo tanto que los marcadores de AFLP están engarzados al Lem-08-syl, y que se pueden usar para predecir el fenotipo de las plantas.

Las semillas del linaje DH 77-3-12, que comprende el Lem-08-syl y marcadores de AFLP engarzados, que incluyen unos marcadores específicos para B. rapa, en su genoma, han sido depositados en la American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Blvd, Manassas, VA 20110-2209, EE.UU.) el 22 de Agosto de 2003 bajo el número de accesión PTA-5410 por Bayer BioScience N.V. (La viabilidad de las semillas se confirmó el 29 de Agosto de 2003).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 El "Protocolo de identificación por el AFLP del Lem-08-syl" muestra la ausencia del Lem-08-syl en cultivares de B. napus comercialmente disponibles

Un análisis de AFLP (como se describe en el Ejemplo 1) con unos marcadores engarzados al Lem-08-syl es citado seguidamente como "Protocolo de identificación por el AFLP del Lem-08-syl". En una forma de realización del invento, el protocolo de identificación por el AFLP del Lem-08-syl se realiza con un marcador de AFLP específico para B. rapa, tal como, pero sin limitarse a, E32/M50-M362.0 or E36/M51-M171.1 y/o marcadores de B. napus engarzados tales como P34/M48-M283.0.

Para confirmar la ausencia del Lem-08-syl en una gama de cultivares de B. napus disponibles, se llevó a cabo el "protocolo de identificación por el AFLP del Lem-08-syl" (tal como se describe en el Ejemplo 1) con las combinaciones de cebadores (PC = acrónimo de primer combination) E32/M50, PC E36/M51 y PC P34/M48.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

\newpage

Los resultados de este protocolo con grupos de plantas agrupadas fueron:

15

\vskip1.000000\baselineskip

También, la ausencia del Lem-08-syl procedente de otras variedades de plantas es confirmada en un análisis de AFLP adicional realizado en las siguientes variedades, usando los marcadores de AFLP E32/M50-M362.0, P34/M48-M283 y E36/M51-M171.1: Surpass400, Hyola60, Hyola50, Apex, Excel, Maluka, Quantum. Las variedades testigos positivos en este análisis (incluyendo los anteriores linajes DH que contienen el Lem-08-syl) muestran la presencia de este gen de resistencia, tal como se espera.

Los resultados anteriores muestran que unos cultivares comerciales de colza de semilla oleaginosa de invierno (WOSR = acrónimo de winter oilseed rape) y de colza de semilla oleaginosa de primavera (SOSR, acrónimo de spring oilseed rape) tales como Surpass400, Hyola 60, Hyola 50, etc. no contienen los marcadores de AFLP específicos para B. rapa E32/M50-M362.0 y E36/M51-M171.1, confirmando que el fragmento de ADN específico para B. rapa situado en el cromosoma 8, que comprende el Lem-08-syl, está ausente de estos cultivares.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Cartografiado de lugares de resistencia al pie negro en Surpass400

Con el fin de cartografiar los lugares de resistencia presentes en Surpass400, se generó una población DH a partir de un cruce entre un linaje de crianza de B. napus en Canadá susceptible a una infección al pie negro y el Surpass400 (cultivar resistente al pie negro comercial de Pacific Seeds (Advanta)). La resistencia al pie negro en el Surpass400 se origina aparentemente a partir de un cruce entre B. rapa ssp sylvestris y B. oleracea ssp. alboglabra [Li y colaboradores (2001, supra)].

La resistencia de la población DH se comprobó en una prueba en el campo en Australia en 2002. Se llevó a cavo un análisis de AFLP, para cartografiar la resistencia al pie negro.

Se pudieron cartografiar tres lugares de resistencia por un análisis de QTL:

-

un lugar principal en el cromosoma N10 (genoma A), aquí citado como Lem-10-syl

-

un lugar en el cromosoma N07 (genoma A), aquí citado como Lem-07

-

un lugar en el cromosoma N14 (genoma C), aquí citado como Lem-14.

\vskip1.000000\baselineskip

No se encontró ningún lugar de resistencia en el cromosoma N08. Estos datos confirmaron que el Lem-08-syl no está presente en el Surpass400, aunque el Surpass400 aparentemente también comprende una resistencia al pie negro derivada de plantas silvestres de B. rapa ssp sylvestris de acuerdo con la información publicada

Unas plantas con el alelo de resistencia procedente del Surpass400 progenitor en la totalidad de los 3 lugares tenían una calificación de la resistencia al pie negro de 7-8 (en una escala de 1-9 como antes se ha descrito) y eran por lo tanto resistentes. Las plantas con los alelos del progenitor Canadiense en la totalidad de los tres lugares tenían unas calificaciones de resistencia al pie negro de 3-4 y por lo tanto eran susceptibles.

Es probable que el lugar de resistencia al pie negro Lem-10-syl se derive de B. rapa ssp sylvestris (esto confirmaría los datos de Rimmer y colaboradores), mientras que los Lem-07 y Lem-14 se derivan más probablemente de B. napus. De manera interesante, no se encontró ningún lugar de resistencia en el cromosoma N02, aunque Yu y colaboradores [Plant, Animal & Microbe Genomes 12-16 de Enero de 2002, Cartel 460] describieron la presencia de un lugar de resistencia al pie negro que se deriva del B. rapa en el cromosoma N02.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Disposición piramidal del Lem-08-syl con otros lugares de resistencia al pie negro

Con el fin de generar una planta con una resistencia al pie negro fuerte y duradera, se combinaron diferentes lugares de resistencia y alelos de resistencia en un única planta (lo que se cita como apilamiento o disposición piramidal de resistencia). En este ejemplo, el Lem-08-syl se combinó con los lugares de resistencia presentes Surpass400, es decir Lem-10-syl, Lem-07 y Lem-14.

(a)

El desarrollo de una población que contiene una resistencia tanto al Surpass400 como al Lem-08-syl

Varias plantas de Surpass 400 fueron emasculadas a mano y cruzadas con un polen procedente de 4-5 plantas procedentes de una población F2 99-AN13. La población 99-AN13 era una población segregadora que contenía el Lem-08-syl.

(b)

Desarrollo adicional de la población

Un pequeño número de plantas F1 se hicieron crecer bajo alta presión de enfermedad en 2001. Dos plantas que mostraban un fenotipo resistente se autopolinizaron y seleccionaron. Unas plantas F2 y F3 adicionales han sido autopolinizadas y se han tomado selecciones de plantas únicas. Solamente se han seleccionado las plantas que muestran un fenotipo de resistencia.

\vskip1.000000\baselineskip

Con el fin de determinar si la resistencia en el campo que se ha observado es debida a la presencia combinada tanto del Lem-08-syl como de uno o más lugares de resistencia al Surpass400, las plantas son escrutadas con unos marcadores moleculares engarzados a los diferentes lugares de resistencia, es decir por ejemplo con unos marcadores engarzados al Lem-08-syl y unos marcadores engarzados al Lem-10-syl. Se seleccionan plantas individuales que comprenden la deseada combinación de lugares de resistencia, mientras que se desechan otras plantas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Métodos de producción de semillas híbridas

Unas semillas híbridas de B. napus, que comprenden una resistencia apilada al pie negro, se desarrollan de diferentes maneras.

\vskip1.000000\baselineskip

Esquema 1

Los lugares de resistencia están apilados en la semilla híbrida

Se desarrolla un progenitor femenino que es estéril masculino (MS), que comprende el gen de barnasa bajo el promotor específico para tapetum pTA29 integrado en su genoma, y que comprende además el Lem-08-syl en el cromosoma N08. Para desarrollar este progenitor femenino, o bien una planta que comprende el Lem-08-syl es transformada con un gen quimérico que comprende el pTA29 engarzado operativamente al gen de barnasa, o una planta transgénica, que es estéril masculina, que comprende el pTA29 engarzado operativamente con el gen de barnasa, es cruzada con una planta que comprende el Lem-08-syl.

Se desarrolla un progenitor masculino (RF), que comprende el pTA29-barstar en su genoma, así como el Lem-10-syl y/u otros lugares de resistencia al pie negro.

Con el fin de desarrollar unas semillas híbridas, el progenitor MS es cruzado con el progenitor RF, y las semillas híbridas son cosechadas a partir del progenitor femenino. Las plantas que crecen a partir de estas semillas son completamente fértiles, y comprenden en su genoma el Lem-08-syl y/u otros lugares de resistencia.

\vskip1.000000\baselineskip

Esquema 2

Los lugares de resistencia están apilados en el progenitor femenino (MS)

Se desarrolla un progenitor femenino que es estéril masculino (MS), que comprende el gen de barnasa bajo el promotor específico para tapetum pTA29 integrado en su genoma, y que comprende además varios lugares de resistencia al pie negro en su genoma, tales como el Lem-08-syl en el cromosoma N08, el Lem-10-syl en el cromosoma 10 y/u otros lugares. Para desarrollar este progenitor femenino, o bien una planta, que comprende varios lugares de resistencia al pie negro, es transformada con un gen quimérico que comprende el pTA29 engarzado operativamente al gen de barnasa, o una planta transgénica, que es estéril masculina, que comprende el pTA29 engarzado operativamente al gen de barnasa, es cruzada con una planta que comprende varios lugares de resistencia al pie negro en su genoma.

Se desarrolla un progenitor masculino (RF), que comprende el pTA29-barstar en su genoma.

Para desarrollar unas semillas híbridas, el progenitor MS es cruzado con el progenitor RF, y las semillas híbridas son cosechadas a partir del progenitor femenino. Las plantas que han crecido a partir de estas semillas son plenamente fértiles, y comprenden en su genoma el Lem-08-syl juntamente con el Lem-10-syl u otros lugares de resistencia.

También se desarrollan otros dos esquemas adicionales, dichos esquemas son: 1) un esquema idéntico al esquema 1 anterior, excepto que el gen de resistencia al Lem-08-syl está presente en las plantas RF, y 2) un esquema idéntico al esquema 2 anterior, excepto que el gen de resistencia al Lem-08-syl está presente en las plantas RF.

Todos los esquemas se usan para desarrollar unos híbridos puros, que tienen varios lugares de resistencia al pie negro en su genoma.

Similarmente se pueden desarrollar unas semillas híbridas, que comprenden el Lem-08-syl a solas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9 Transferencia del Lem-08-syl dentro de otros linajes de élite de Brassica

El Lem-08-syl es transferido a otros linajes de procreación de élite por el siguiente método. Una planta que contiene el Lem-08-syl (planta donante), tal como plantas que se derivan de las semillas depositadas en la ATCC bajo el número de accesión PTA-5410, se cruza con un linaje de élite de B. napus (progenitor de élite/progenitor recurrente), o con una variedad que carece del Lem-08-syl. Se usa el esquema de introgresión siguiente (el Lem-08-syl es denominado abreviadamente N08):

16

17

En el esquema de introgresión anterior, un material de cruce de retorno se ensaya en cada generación en cuanto a la presencia de marcadores de AFLP engarzados al Lem-08-syl y se seleccionan unos linajes que contienen el Lem-08-syl. En vez de ensayar en cuanto a la presencia del Lem-08-syl usando unos marcadores de AFLP engarzados se pueden ensayar plantas en unas pruebas en el campo en cuanto a la resistencia al pie negro, y se pueden seleccionar unas plantas con alta resistencia. Sin embargo, esto es solamente factible si el linaje de élite, dentro del que se ha de introgresar el Lem-08-syl, no contiene ya unos altos niveles de resistencia al pie negro. Por ejemplo, si el linaje de élite era el Surpass400, que tiene una muy alta resistencia al pie negro, necesita ser llevada a cabo una selección asistida por marcadores (procreación asistida por marcadores) para el Lem-08-syl, puesto que sería extremadamente difícil seleccionar un material que comprendiese la deseada combinación de lugares de resistencia en el campo. Sin embargo, si el progenitor de élite es un linaje, que es susceptible, o por lo menos no es tan resistente como los linajes que comprenden el Lem-08-syl, una MAS (selección asistida molecularmente) en el anterior esquema se puede reemplazar por una selección en el campo bajo alta presión de la enfermedad de pie negro.

<110> Bayer Bioscience N.V.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Planta de Brassica resistente al hongo Leptosphaeria maculans (pie negro)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> BCS 03-2006

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 2003271381

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-12-24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia 5'-3' del adaptador de MseI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacgatgagt cctgag

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia 3'-5' del adaptador de MseI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tactcaggac tcat

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia 5'-3' del adaptador de EcoRI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgtagact gcgtacc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia 3'-5' del adaptador de EcoRI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgacgcatg gttaa

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia 5'-3' del adaptador de PstI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgtagact gcgtacatgc a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia 3'-5' del adaptador de PstI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catctgacgc atgt

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador E01 de AFLP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactgcgtac caattca

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador M01 de AFLP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgagtcct gagtaaa

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador M02 de AFLP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgagtcct gagtaac

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador P01 de AFLP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactgcgtac atgcaga

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador E31 de AFLP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactgcgtac caattcaaa

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador E32 de AFLP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactgcgtac caattcaac

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador E36 de AFLP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactgcgtac caattcacc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador M48 de AFLP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgagtcct gagtaacac

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador M50 de AFLP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgagtcct gagtaacat

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador M51 de AFLP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgagtcct gagtaacca

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador M59 de AFLP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgagtcct gagtaacta

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador M61 de AFLP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgagtcct gagtaactg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador P31 de AFLP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactgcgtac atgcagaaa

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador P34 de AFLP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactgcgtac atgcagaat

\hfill

19

Claims (22)

1. Una planta de Brassica napus que contiene un nivel de glucosinolatos alifáticos en una harina de semillas desengrasada y seca, de menos que 30 micromoles/g, que comprende en el cromosoma 8 un gen de resistencia a Leptosphaeria maculans que se deriva de Brassica rapa subespecies sylvestris, en que dicha planta de Brassica napus se deriva de unas semillas que se depositaron bajo el número de accesión al ATCC PTA-5410, y en que dicho gen está flanqueado por los marcadores de AFLP E32/M50-M362 y P34/M48-M283 en el cromosoma N08 en estas semillas.

2. La planta de la reivindicación 1, que produce un aceite, después de haber triturado las semillas, que contiene menos de 2% de ácido erúcico de los ácidos grasos totales en el aceite.

3. La planta de la reivindicación 1 ó 2, en la que el componente sólido de la semilla contiene menos de 30 micromoles de cualquiera o cualquier mezcla de los compuestos glucosinolato de 3-butenilo, glucosinolato de 4-pentenilo, glucosinolato de 2-hidroxi-3-butenilo y glucosinolato de 2-hidroxi-4-pentenilo por gramo de material sólido exento de aceite, secado al aire.

4. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es estéril masculina.

5. La planta de la reivindicación 4, que comprende un transgén que puede hacer estériles masculinas a las plantas.

6. La planta de la reivindicación 5, en la que dicho transgén es un gen de barnasa.

7. La planta de la reivindicación 4, que se generó usando un sistema citoplasmático de esterilidad masculina.

8. Una planta obtenida a partir de las plantas de las reivindicaciones 5 ó 6, que comprende dicho gen de resistencia a Leptosphaeria maculans y en la que se ha restaurado la fertilidad.

9. La planta de la reivindicación 8, que comprende un transgén capaz de inhibir o evitar la actividad del gen de esterilidad masculina.

10. La planta de la reivindicación 9, en la que dicho transgén es un gen barstar.

11. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que es una planta híbrida.

12. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que dicho gen de resistencia a Leptosphaeria maculans está asociado con por lo menos un marcador de AFLP seleccionado entre el grupo que consiste en: P34/M48-M283, E32/M50-M362 y E36/M51-M171.1.

13. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicho gen de resistencia a Leptosphaeria maculans está asociado con por lo menos un marcador de AFLP seleccionado entre el grupo que consiste en E32/M50-M362 y P34/M48-M283.

14. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que se deriva de las semillas depositadas en la ATCC bajo el número de accesión PTA-5410.

15. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende además en su genoma por lo menos un adicional gen de resistencia a Leptosphaeria maculans.

16. La planta de la reivindicación 15, en la que dicho gen de resistencia adicional está situado en los cromosomas N10, N14 y/o N07, o en la que dicho gen de resistencia adicional procede de uno cualquiera de los siguientes cultivares de B. napus: Jet Neuf, Quantum, Maluka, Hyola60, o Surpass 400.

17. Semillas de la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende dicho gen de resistencia a Leptosphaeria maculans.

18. Las semillas de la reivindicación 17, que son semillas híbridas.

19. Las semillas de la reivindicación 17 ó 18, que se derivan de las semillas depositadas en la ATCC bajo el número de accesión PTA-5410.

20. Un método para detectar la presencia o ausencia del gen de resistencia a Leptosphaeria maculans de la reivindicación 1 en el ADN de un tejido o unas semillas de B. napus, que comprende:

-

la extracción de un ADN a partir de un tejido de planta

-

llevar a cabo un análisis de AFLP en cuanto a uno o más de los marcadores de AFLP P34/M48-M283.0, E32/M50-M362.0 y E36/M51-M171.1.

\vskip1.000000\baselineskip

21. Uso de una cualquiera de los marcadores de AFLP E32/M50-M362, E36/M51-M171.1 y P34/M48-M283, para vigilar la introgresión del gen de resistencia a Leptosphaeria maculans de la reivindicación 1 en plantas de Brassica napus, o para un análisis de AFLP de plantas de Brassica napus.

22. Uso de la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para producir un aceite de colza de semilla oleaginosa o una torta de semillas de colza de semilla oleaginosa.