CN103477973B - 一种创建抗跳甲白菜型油菜资源的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种创建抗跳甲白菜型油菜资源的方法，该方法包括以下步骤：以春油菜区白菜型油菜主栽品种“浩油11号”为母本，以抗跳甲芥菜型油菜品种“严小村芥菜”为父本，进行白菜型油菜A^rA^r×芥菜型油菜A^jA^jBB的种间杂交；通过幼胚拯救，获得F1，即A^rA^rA^jB；选择具有38条染色体同时花粉育性不少于50％的F1植株进行剥蕾自交，获得F2，即A^jA^r；通过细胞学观察选择染色体数目为20的单株再进行跳甲抗性鉴定，获得抗跳甲白菜型油菜资源。本发明创建的杂种F1花粉育性达到50％以上，可自交结实，保证芥菜型油菜遗传成分向后代渗入；缩短资源创新年限，加快育种进程；把抗跳甲相关基因导入白菜型油菜，创建抗跳甲白菜型油菜资源，具有重要的市场应用价值。

Description

一种创建抗跳甲白菜型油菜资源的方法

技术领域

本发明属于农作物遗传成分导入领域，尤其涉及一种创建抗跳甲白菜型油菜资源的方法。

背景技术

白菜型油菜为油菜三大类型之一，学名Brassia rapa。包括原产中国的芸薹和油白菜。中国又称小白菜、矮油菜、甜油菜等。染色体组为AA，n＝10。

芥菜型油菜，学名Brassica juncea俗称油辣菜，籽粒细小，多为金黄色或暗红色，含油量高，芥菜型油菜具有耐瘠性强等特点，其基因组组成为AABB，n＝36。

跳甲，俗称“土崩子”“土跳搔”，以危害十字花科蔬菜幼苗为主，亦危害茄果类、瓜类、豆类蔬菜，春季发生严重。

芥菜型油菜和白菜型油菜属于芸薹属两个不同的栽培种，其中芥菜型油菜为异源四倍体，基因组为A^jA^jBB，白菜型油菜为二倍体，基因组为A^rA^r。两个栽培种的A染色体属于同源染色体，但是在长期的进化过程中产生了较大的遗传差异。青藏高原是芥菜型油菜的起源中心之一，境内分布着非常丰富的芥菜型油菜种质资源，其中一些资源具有早熟、抗旱、黄籽、大粒、抗虫等特性，比如炉霍小油菜具有早熟性，牛尾梢具有抗旱性，严小村芥菜具有抗跳甲特性。目前一些高海拔、高纬度的春油菜区生产上种植的还是上世纪八十年代培育的白菜型油菜常规品种，如门源小油菜、浩油11号、青油241等少数几个品种。

白菜型油菜的抗逆性、产量和品种更新速度远远落后于甘蓝型油菜，这一情况严重阻碍了白菜型油菜产区的农业增产增收。

造成这一问题的其中一个原因是长期种植少数几个白菜型油菜品种导致专一性病虫害发生逐年严重，例如跳甲是春油菜区油菜苗期主要害虫之一，而现有白菜型油菜品种普遍不抗跳甲，这也是导致其减产的主要原因。

传统的通过芥白种间杂交创建白菜型油菜种质资源的方式主要是以染色体数目多的芥菜型油菜(2n＝36)作母本，以染色体数目少的白菜型油菜(2n＝20)作父本进行种间杂交。以此方式获得的杂种F1基因组为AⁿA^rC，其表现为雄性高度不育，雌性部分可育，以自交的方式不能获得种子，即使以白菜型油菜亲本对F1回交，仅能得到少量种子。回交后代往往育性差，稳定慢，大约回交后再自交两代才能获得新型白菜型油菜，全过程至少需要四个年度才能够达到改良目标，因此需要的育种周期较长。

黄条跳甲成虫俗称蹦蹦虫、菜蚤、土跳蚤、地蹦子等，幼虫称白蛆。在青海、新疆等干旱地区，危害最为严重，该跳甲对春油菜的幼苗造成危害，虫害可导致减产10％～30％，是影响高产、稳产的一个关键因素。跳甲开始危害一般发生在4月下旬(温度在15～20℃)，此时油菜正处于幼苗期(子叶期到2片真叶之间)，跳甲可将子叶和生长点全部吃掉，常造成成片枯死，大面积缺苗，植株畸形、主茎缺失、导致大幅度减产甚至全田毁种。

研究表明，芥菜型油菜普遍有较强的抗跳甲特性，尤其“严小村”芥菜抗性最强，甘蓝型油菜次之，白菜型抗性最差(余青兰等，2012)。

理论上，通过种间杂交创建白菜型油菜新资源的途径主要包括细胞质替换和核基因组的遗传物质渗入。芥白杂种后代的核基因组遗传物质渗入主要以A基因组转移、A基因组内同源重组和A基因组与B基因组间部分同源重组为媒介。

芥菜型油菜具有A基因组，和白菜型油菜杂交后代自交或与白菜型油菜连续回交的过程，A染色体在减数分裂终变期能够始终处于二价体的配对状态，而B染色体在后代的减数分裂中会逐渐被消除，这为通过芥白种间杂交创建新的白菜型油菜资源提供了可能性。

芥菜型油菜的A^j染色体和白菜型油菜A^r染色体属于同源染色体，A^j经异源多倍化后在漫长的进化过程中早已发生了大量的基因组改变，与现有白菜型油菜的A^r染色体具有较大的遗传差异，因此在芥白杂种及其后代的减数分裂中A基因组同源重组是促进遗传物质向白菜型油菜渗入的重要因素(Chen等，2007)。Choudhary等在芥菜型油菜和白菜型油菜杂种F1(AAB)减数分裂中发现了由A、B染色体部分同源配对引起的终变期多价体和后期I的染色体桥。以上研究表明，A、B染色体之间具有一定的亲缘关系，这为通过部分同源重组促进遗传物质向白菜型油菜渗入提供了可能。

以芥白种间杂交创建抗跳甲白菜型油菜资源的研究至今尚未见报道。以向白菜型油菜转移芥菜型油菜优异基因为目的的芥白种间杂交目前能查到两篇文献，一篇是王丹等于2006年在中国农学通报上发表的《芥菜型油菜与白菜种间杂种的获得与鉴定》，另一篇是牛妍等于2013年在植物遗传资源学报上发表的《芥菜型油菜和白菜型油菜种间杂种的遗传分析》。

以上两个研究技术方案的共同之处是全部以染色体数目多的芥菜型油菜为母本，以染色体数目较少的白菜型油菜或大白菜为父本进行有性种间杂交，通过子房培养或者收获自然种子而成功获得杂种F1代，通过细胞学观察F1植株的染色体数目均为28条，F1植株均雄性不育。王丹等的研究内容仅截止到创建出F1植株，并对F1植株进行了形态学、细胞学和花粉育性的分析，未见白菜型油菜资源创新方面的后续报道；牛妍等的研究仅限于对以芥菜型油菜为母本获得的杂种F1、BC1F1和BC1F2群体的细胞遗传学、自交亲和性及花粉育性方面的分析，并没有提及白菜型油菜资源创新结果。

归纳以上两个研究，可以总结出芥白种间杂交现有技术方案如下：

1、以染色体数目多的芥菜型油菜为母本，以染色体数目少的白菜型油菜或白菜为父本，进行种间有性杂交；

2、通过自然收获种子或者通过子房培养获得杂种F1植株；

3、通过细胞学检测F1植株的体细胞染色体数目为28条；

4、利用父本白菜型油菜对雄性不育的F1植株回交获得BC1F1群体；

5、BC1F1植株继续自交获得新型白菜型油菜资源。

现有技术方案杂种F1雄性败育，不能进行自交，需要用白菜型油菜亲本进行回交，这个过程会导致芥菜型油菜遗传成分向后代渗入的比例偏少；资源创新的时间长，至少第四年才能获得大批新型白菜型油菜资源。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种创建抗跳甲白菜型油菜资源的方法，旨在解决现有芥菜型油菜与白菜型油菜种间杂交F1雄性败育，不能进行自交，需要用白菜型油菜亲本进行回交，导致芥菜型油菜遗传成分向后代渗入的比例偏少；资源创新的时间长，至少四年才能获得大批新型白菜型油菜资源的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种创建抗跳甲白菜型油菜资源的方法，该创建抗跳甲白菜型油菜资源的方法包括以下步骤：

步骤一、以春油菜区白菜型油菜主栽品种“浩油11号”为母本，以抗跳甲芥菜型油菜品种“严小村芥菜”为父本，进行白菜型油菜A^rA^r×芥菜型油菜A^jA^jBB的种间杂交；

步骤二、通过幼胚拯救，获得F1，即A^rA^rA^jB；

步骤三、选择具有38条染色体同时花粉育性不少于50％的F1植株进行剥蕾自交，获得F2，即A^jA^r；

步骤四、通过细胞学观察选择染色体数目为20的单株再进行跳甲抗性鉴定，获得抗跳甲白菜型油菜资源。

进一步，步骤一种间杂交的具体操作方法如下：

(4)在白菜型油菜盛花期，将一个白菜型油菜单株已经开放的花朵全部摘除，用75％酒精擦拭花蕾杀灭沾染的花粉，将开花前1-2天的花蕾去掉雄蕊，再将小花蕾全部摘除；取严小村芥菜套袋内新鲜花粉授予白菜型油菜子房柱头上；

(5)授粉25-30天之间，取回发育中的角果，将体视显微镜放于超净工作台中，在无菌条件下，拨开角果，在体式显微镜下剥出濒临凋亡的裸胚，放置于MS培养基中，待幼胚发育成苗后，再将其栽于MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA分化培养基中，快繁继代，将快繁出的杂种苗放于MS+0.25mg/L NAA培养基生根，生根后，将杂种苗栽于试验田；

(6)在杂种植株蕾苔期，取子房进行体细胞观察，选择染色体数目为38条的植株挂牌标记；在初花期，对具有38条染色体的植株进行花粉育性观察。

进一步，初花期对植株进行花粉育性观察时用于花粉粒染色的试剂为醋酸洋红。

进一步，对可育F1进行剥蕾自交的具体操作方法如下：

在开花前将花序套上硫酸纸袋，花开前剥出柱头，将其自身的花粉授予柱头上，然后再套上纸袋，10天后取下纸袋，将未授粉的花蕾去掉。

进一步，进行辅助自交授粉时可进行重复授粉。

本发明提供的创建抗跳甲白菜型油菜资源的方法以种间杂交方式获得的F1为非预期杂种，即染色体数目并非双亲正常配子之和的28条(正常情况下，白菜型油菜配子具有10条染色体，芥菜型油菜配子具有18条染色体)，而是具有38条染色体。

导致这一结果的原因是，当以染色体数目较少的亲本作母本时，正常配子形成的受精卵不能够正常发育，在发育早期就会凋亡，而母本白菜型油菜会发生一定频率的不减数分裂，形成具有20条染色体的雌配子，该类型雌配子染色体数目多于芥菜型油菜雄配子(具有18条染色体)，这样的雌配子与来自芥菜型油菜的雄配子结合后形成的合子胚能够正常发育25-30天左右，而此时通过幼胚拯救技术可以获得具有38条染色体的杂种。

本发明以染色体数目少的白菜型油菜“浩油11号”(A^rA^r)为母本，以现有抗跳甲芥菜型油菜资源“严小村芥菜”(A^jA^jBB)为父本，进行种间杂交，获得的F1代大部分植株具有38条染色体，其基因组为A^rA^rA^jB，花粉粒育性达到50％左右，少部分植株具有28条染色体，其基因组为A^rA^jC，表现为完全败育。通过细胞学和花粉育性观察，选择具有38条染色体的植株进行人工剥蕾自交，在下一代即有可能获得基因组为A^rAⁿ类型的植株。相比传统的正交方法，大大缩短白菜型油菜种质资源创新年限。

本发明提供的创建抗跳甲白菜型油菜资源的方法创建的杂种F1花粉育性达到50％以上，可以自交结实，不需再用白菜型油菜亲本回交，从而保证芥菜型油菜遗传成分更多的向后代渗入；本方法从进行芥白种间杂交第一年开始，第三年就会获得大批新型白菜型油菜资源，缩短资源创新年限；以具有抗跳甲特性的芥菜型油菜为父本进行杂交，能够把抗跳甲相关基因导入白菜型油菜，创建一批抗跳甲白菜型油菜资源；此外，获得的F1具有可育性，可直接自交形成F2群体，一方面增加芥菜型油菜遗传成分向后代渗入的可能性，另一方面缩短种质资源创新年限，加快育种进程。

附图说明

图1是本发明实施例提供的创建抗跳甲白菜型油菜资源的方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

图1示出了本发明实施例提供的创建抗跳甲白菜型油菜资源的方法流程图。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

以春油菜区白菜型油菜主栽品种“浩油11号”为母本，以抗跳甲芥菜型油菜品种“严小村芥菜”为父本，进行种间杂交。具体操作方法是，在白菜型油菜盛花期，将一个长势健壮白菜型油菜单株已经开放的花朵全部摘除，用75％酒精擦拭花蕾杀灭沾染的花粉，将开花前1-2天的花蕾去掉雄蕊，再将小花蕾全部摘除。取严小村芥菜套袋内新鲜花粉授予白菜型油菜子房柱头上；

授粉25-30天之间，取回发育中的角果，将体视显微镜放于超净工作台中，在无菌条件下，拨开角果，在体式显微镜下剥出濒临凋亡的裸胚，放置于MS培养基中。待幼胚发育成苗后，再将其栽于MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/L NAA分化培养基中，快繁继代，将快繁出的杂种苗放于MS+0.25mg/L NAA培养基生根。生根后，将杂种苗栽于试验田；

在杂种植株蕾苔期，取幼嫩的子房进行体细胞观察，选择染色体数目为38条的植株挂牌标记；

在初花期，对具有38条染色体的植株进行花粉育性观察，用于花粉粒染色的试剂为醋酸洋红。

选择具有38条染色体同时花粉育性超过50％的植株进行剥蕾自交，具体操作方法是，在开花前将花序套上硫酸纸袋，待花开一定数量后，将未开放的花蕾剥开，露出柱头，将其自身的花粉授予柱头上，然后再套上纸袋。10天后取下纸袋，将未授粉的花蕾去掉。(此步骤要给尽量多的花蕾授粉，以期获得足够多的自交种子)

在F2群体中筛选体细胞染色体数目为20的植株，同时对其抗跳甲性进行鉴定，获得抗跳甲的新型白菜型油菜资源。

本发明实施例提供的创建抗跳甲白菜型油菜资源的方法以种间杂交方式获得的F1为非预期杂种，即染色体数目并非双亲正常配子之和的28条(正常情况下，白菜型油菜配子具有10条染色体，芥菜型油菜配子具有18条染色体)，而是具有38条染色体。

导致这一结果的原因是，当以染色体数目较少的亲本作母本时，正常配子形成的受精卵不能够正常发育，在发育早期就会凋亡，而母本白菜型油菜会发生一定频率的不减数分裂，形成具有20条染色体的雌配子，该类型雌配子染色体数目多于芥菜型油菜雄配子(具有18条染色体)，这样的雌配子与来自芥菜型油菜的雄配子结合后形成的合子胚能够正常发育25-30天左右，而此时通过幼胚拯救技术可以获得具有38条染色体的杂种。

本发明实施例以染色体数目少的白菜型油菜“浩油11号”(A^rA^r)为母本，以现有抗跳甲芥菜型油菜资源“严小村芥菜”(A^jA^jBB)为父本，进行种间杂交，获得的F1代大部分植株具有38条染色体，其基因组为A^rA^rA^jB，花粉粒育性达到50％左右，少部分植株具有28条染色体，其基因组为A^rA^jC，表现为完全败育。通过细胞学和花粉育性观察，选择具有38条染色体的植株进行人工剥蕾自交，在下一代即有可能获得基因组为A^rAⁿ类型的植株。相比传统的正交方法，大大缩短白菜型油菜种质资源创新年限。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种创建抗跳甲白菜型油菜资源的方法，其特征在于，该创建抗跳甲白菜型油菜资源的方法包括以下步骤：

步骤一、以春油菜区白菜型油菜主栽品种“浩油11号”为母本，以抗跳甲芥菜型油菜品种“严小村芥菜”为父本，进行白菜型油菜ArAr×芥菜型油菜AjAjBB的种间杂交；

步骤二、通过幼胚拯救，获得F1，即ArArAjB；

步骤三、选择具有38条染色体同时花粉育性不少于50％的F1植株进行剥蕾自交，获得F2，即AjAr；

步骤四、通过细胞学观察选择染色体数目为20的单株再进行跳甲抗性鉴定，获得抗跳甲白菜型油菜资源；

种间杂交的具体操作方法如下：

(1)在白菜型油菜盛花期，将一个白菜型油菜单株已经开放的花朵全部摘除，用75％酒精擦拭花蕾杀灭沾染的花粉，将开花前1-2天的花蕾去掉雄蕊，再将小花蕾全部摘除；取严小村芥菜套袋内新鲜花粉授予白菜型油菜子房柱头上；

(2)授粉25-30天之间，取回发育中的角果，将体视显微镜放于超净工作台中，在无菌条件下，拨开角果，在体式显微镜下剥出濒临凋亡的裸胚，放置于MS培养基中，待幼胚发育成苗后，再将其栽于MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA分化培养基中，快繁继代，将快繁出的杂种苗放于MS+0.25mg/L NAA培养基生根，生根后，将杂种苗栽于试验田；

(3)在杂种植株蕾苔期，取子房进行体细胞观察，选择染色体数目为38条的植株挂牌标记；在初花期，对具有38条染色体的植株进行花粉育性观察；

初花期对植株进行花粉育性观察时用于花粉粒染色的试剂为醋酸洋红；

对可育F1进行剥蕾自交的具体操作方法如下：

在开花前将花序套上硫酸纸袋，花开前剥出柱头，将其自身的花粉授予柱头上，然后再套上纸袋，10天后取下纸袋，将未授粉的花蕾去掉；

进行辅助自交授粉时进行重复授粉。