JP2021122216A - アブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌検出用プライマーセット、及びこのプライマーセットを用いたアブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌の検査方法 - Google Patents
アブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌検出用プライマーセット、及びこのプライマーセットを用いたアブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌の検査方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】アブラナ科植物における黒腐病菌及び斑点細菌病菌検出用プライマーセット及び、該プライマーを利用したアブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌の判定方法の提供。【解決手段】特定の配列を有するプライマーセットを用いた、アブラナ科植物黒腐病の病原であるXanthomonas campestris pv. campestrisと、斑点細菌病の病原であるXanthomonas campestris pv. raphaniを、識別して検出することができるプライマーセット。【選択図】図１
Description
本発明は、アブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌検出用プライマーセットと、このプライマーを利用したアブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌の判定方法に関する。
アブラナ科植物は、キャベツ、芽キャベツ、大根、白菜、ブロッコリー、カリフラワー、チンゲンサイ、ケール、コールラビ、カラシナ、ルタバガ、カブ、パクチョイなどの食用作物を含み、世界中で広く栽培されている。
アブラナ科植物の病害である黒腐病は、Xanthomonas campestris pv. campestris（以下、Ｘｃｃとも表す）、斑点細菌病はXanthomonas campestris pv. raphani（以下、Ｘｃｒとも表す）が病原である。Ｘｃｃ、Ｘｃｒは、いずれも種子伝染するのに加え、病徴に類似する点が多く、分離した細菌を肉眼で識別することは困難である。Ｘｃｃ、Ｘｃｒは、アブラナ科植物に対する病勢や宿主範囲、他の植物への感染性に違いがある。そのため、これらの発生が疑われた場合には、病原細菌の種類を正確かつ迅速に検出、診断することが求められている。
また、種苗を他国に輸出するに際して、輸出相手国の求める病原細菌に対する検疫や検査証明が必要であるが、アブラナ科植物種子の輸出拡大のためにも、アブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌の判定方法が求められている。
アブラナ科植物の病害である黒腐病は、Xanthomonas campestris pv. campestris（以下、Ｘｃｃとも表す）、斑点細菌病はXanthomonas campestris pv. raphani（以下、Ｘｃｒとも表す）が病原である。Ｘｃｃ、Ｘｃｒは、いずれも種子伝染するのに加え、病徴に類似する点が多く、分離した細菌を肉眼で識別することは困難である。Ｘｃｃ、Ｘｃｒは、アブラナ科植物に対する病勢や宿主範囲、他の植物への感染性に違いがある。そのため、これらの発生が疑われた場合には、病原細菌の種類を正確かつ迅速に検出、診断することが求められている。
また、種苗を他国に輸出するに際して、輸出相手国の求める病原細菌に対する検疫や検査証明が必要であるが、アブラナ科植物種子の輸出拡大のためにも、アブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌の判定方法が求められている。
病原細菌の判定方法として、ＰＣＲ法が広く用いられている。例えば、非特許文献１、２には、Xanthomonas属細菌のＤＮＡを特異的に増幅するプライマーが記載されているが、これらは、ＸｃｃとＸｃｒを区別することはできない。また、非特許文献３には、ＸｃｒのＤＮＡを特異的に増幅するプライマーが記載されているが、これは、ＸｃｃのＤＮＡを増幅することはできない。
T.Berg, et al. "PCR-based detection of Xanthomonas campestris pathovars in Brassica seed" Plant Pathology,2005,54,416-427.
Young Jin Park, et al. "Sensitive and specific detection of Xanthomonas campestris pv. campestris by PCR using species-specific primers based on hrpF gene sequences", Microbiologival Reserch,2004,159,419-423.
Mehede Hassan Rubel, et al. "Development of a PCR test for detection of Xanthomonas campestris pv.raphani" Australasian Plant Pathology,2019,48,179-182.
本発明は、ＰＣＲによりアブラナ科植物黒腐病の病原であるXanthomonas campestris pv. campestrisと、斑点細菌病の病原であるXanthomonas campestris pv. raphaniを、識別して検出することができるプライマーセットを提供することを課題とする。
本発明の課題を解決するための手段は以下の通りである。
１．配列番号１、２に記載、またはこれらとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含む共通フォワードプライマー、
配列番号３、４に記載、またはこれらとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｃ用リバースプライマー、
配列番号５、６に記載、またはこれらとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｒ用リバースプライマー、
を含むことを特徴とするアブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌検出用プライマーセット。
２．配列番号１に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含む共通フォワードプライマー、
配列番号３に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｃ用リバースプライマー、
配列番号５に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｒ用リバースプライマー、
を含むことを特徴とするアブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌検出用プライマーセット。
３．配列番号２に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含む共通フォワードプライマー、
配列番号４に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｃ用リバースプライマー、
配列番号６に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｒ用リバースプライマー、
を含むことを特徴とするアブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌検出用プライマーセット。
４．１．〜３．のいずれかに記載のプライマーセットを用いたＰＣＲ法であることを特徴とする、アブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌感染の検査方法。
５．前記ＰＣＲ法が、２．に記載のプライマーセットを用いて１ｓｔＰＣＲを行った後に、３．に記載のプライマーセットを用いて２ｎｄＰＣＲを行うｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法であることを特徴とする、４．に記載の検査方法。
１．配列番号１、２に記載、またはこれらとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含む共通フォワードプライマー、
配列番号３、４に記載、またはこれらとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｃ用リバースプライマー、
配列番号５、６に記載、またはこれらとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｒ用リバースプライマー、
を含むことを特徴とするアブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌検出用プライマーセット。
２．配列番号１に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含む共通フォワードプライマー、
配列番号３に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｃ用リバースプライマー、
配列番号５に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｒ用リバースプライマー、
を含むことを特徴とするアブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌検出用プライマーセット。
３．配列番号２に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含む共通フォワードプライマー、
配列番号４に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｃ用リバースプライマー、
配列番号６に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｒ用リバースプライマー、
を含むことを特徴とするアブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌検出用プライマーセット。
４．１．〜３．のいずれかに記載のプライマーセットを用いたＰＣＲ法であることを特徴とする、アブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌感染の検査方法。
５．前記ＰＣＲ法が、２．に記載のプライマーセットを用いて１ｓｔＰＣＲを行った後に、３．に記載のプライマーセットを用いて２ｎｄＰＣＲを行うｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法であることを特徴とする、４．に記載の検査方法。
本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲにより、ＸｃｃとＸｃｒを検出することができ、さらに、多重ＰＣＲによりＸｃｃとＸｃｒを識別して検出することもできる。本発明のプライマーセットを組み合わせてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行うことにより、検出感度を高めることができる。
多くのXanthomonas属細菌は、約１１．５ｋｂｐのセルロース合成に関係すると推測される遺伝子領域を有するが、Ｘｃｃは、この遺伝子領域の一部が欠落している。図１に、ＸｃｃとＸｃｒ、及び近縁細菌について、この欠落部分とその近傍の遺伝子配列と、本発明のプライマー設計位置を示す。
本発明は、ＸｃｃとＸｃｒに共通する配列から共通フォワードプライマー、欠落部分を挟むようにＸｃｃ用リバースプライマー、Ｘｃｃでは欠落している部分からＸｃｒ用リバースプライマーを設計したものである。
表１に、本発明のプライマーの実施態様例の塩基配列を示す。なお、本発明のプライマーは、これらとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を有するプライマーを含む。以下、配列番号ｎの塩基配列、及びこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を有するプライマーについて、単に「プライマーｎ」とも表す。
本発明の第一のプライマーセットは、プライマー１、２、またはこれらとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含む共通フォワードプライマー、
配列番号３、４に記載、またはこれらとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｃ用リバースプライマー、
配列番号５、６に記載、またはこれらとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｒ用リバースプライマー、を含むことを特徴とする。
配列番号３、４に記載、またはこれらとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｃ用リバースプライマー、
配列番号５、６に記載、またはこれらとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｒ用リバースプライマー、を含むことを特徴とする。
表２に、本発明の第一のプライマーセットの各組み合わせにより増幅されるＤＮＡの塩基対数（ｂｐ）を示す。
第一のプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、共通フォワードプライマーとＸｃｃ用リバースプライマーからはＸｃｃの遺伝子由来の増幅断片のみが、共通フォワードプライマーとＸｃｒ用リバースプライマーからはＸｃｒの遺伝子由来の増幅断片のみが得られる。すなわち、本発明の第一のプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、Ｘｃｃ、Ｘｃｒを検出することができ、さらに、その増幅断片の塩基対数により、ＸｃｃとＸｃｒとを識別することができる。
共通フォワードプライマーとしてプライマー１を用いた場合は、Ｘｃｃ用リバースプライマーとしてプライマー３、Ｘｃｒ用リバースプライマーとしてプライマー５を用いることが好ましい。また、共通フォワードプライマーとしてプライマー２を用いた場合は、Ｘｃｃ用リバースプライマーとしてプライマー４、Ｘｃｒ用リバースプライマーとしてプライマー６を用いることが好ましい。
本発明の第二のプライマーセットは、プライマー１を共通フォワードプライマー、プライマー３をＸｃｃ用リバースプライマー、プライマー５をＸｃｒ用リバースプライマー、として含む。
本発明の第三のプライマーセットは、プライマー２を共通フォワードプライマー、プライマー４をＸｃｃ用リバースプライマー、プライマー６をＸｃｒ用リバースプライマー、として含む。
第二、第三のプライマーセットは、それぞれ単独でも使用することができる。しかし、第三のプライマーセットが増幅する塩基配列は、第二のプライマーセットで増幅される塩基配列に含まれているため、第二のプライマーセットを用いて１ｓｔＰＣＲを行った後に、第三のプライマーセットを用いて２ｎｄＰＣＲを行うｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行うことができる。ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲにより、より検出感度を高めることができる。
本発明の第三のプライマーセットは、プライマー２を共通フォワードプライマー、プライマー４をＸｃｃ用リバースプライマー、プライマー６をＸｃｒ用リバースプライマー、として含む。
第二、第三のプライマーセットは、それぞれ単独でも使用することができる。しかし、第三のプライマーセットが増幅する塩基配列は、第二のプライマーセットで増幅される塩基配列に含まれているため、第二のプライマーセットを用いて１ｓｔＰＣＲを行った後に、第三のプライマーセットを用いて２ｎｄＰＣＲを行うｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行うことができる。ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲにより、より検出感度を高めることができる。
本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲ法は特に限定されず、多重ＰＣＲ法、定量的リアルタイムＰＣＲ法、バイオＰＣＲ法、ＭＰＮ−ＰＣＲ法、競合的ＰＣＲ法等のいずれであってもよい。また、使用する装置、薬剤、温度、ステップ数等は、求める塩基配列を増幅できるものであればよく、特に制限されない。
・プライマー
Ｘｃｃ ＭＡＦＦ３０１１７６株及びＸｃｒ ＭＡＦＦ１０６１８１株の全ゲノム解析を行い、得られたゲノム配列をＭａｕｖｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．４．０）を用いてアライメントを行い、Ｘｃｃで約１１．５ｋｂの欠落がある遺伝子領域を見出した。この欠落領域を挟むＸｃｃの２ｋｂの塩基配列及び欠落の無いＸｃｒの１５ｋｂの塩基配列を抽出した。ＡｐＥ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．５３）を用いてＸｃｃの２ｋｂの塩基配列から鎖長１８−２５ｂｐ、Ｔｍ値５５−６０℃、ＧＣ含量４５−６０％の条件でプライマーを予測し、この中から実際の配列を見比べて変更を加えて、それぞれ配列番号１〜４に記載の塩基配列を有するプライマー１’、プライマー２’、プライマー３’及びプライマー４’を選抜した。次にＸｃｒの１５ｋｂの塩基配列において、プライマー１’から１．５ｋｂ以内の領域に同様にプライマーを予測し、実際の配列を見比べながらＸｃｒの配列の方が長く、両者の増幅断片長が重ならない配列として、それぞれ配列番号５、６に記載の塩基配列を有するプライマー５’及びプライマー６’を選抜した。プライマー１’、３’、５’の組み合わせをプライマーセットＡ、プライマー２’、４’、６’の組み合わせをプライマーセットＢとした。
Ｘｃｃ ＭＡＦＦ３０１１７６株及びＸｃｒ ＭＡＦＦ１０６１８１株の全ゲノム解析を行い、得られたゲノム配列をＭａｕｖｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．４．０）を用いてアライメントを行い、Ｘｃｃで約１１．５ｋｂの欠落がある遺伝子領域を見出した。この欠落領域を挟むＸｃｃの２ｋｂの塩基配列及び欠落の無いＸｃｒの１５ｋｂの塩基配列を抽出した。ＡｐＥ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．５３）を用いてＸｃｃの２ｋｂの塩基配列から鎖長１８−２５ｂｐ、Ｔｍ値５５−６０℃、ＧＣ含量４５−６０％の条件でプライマーを予測し、この中から実際の配列を見比べて変更を加えて、それぞれ配列番号１〜４に記載の塩基配列を有するプライマー１’、プライマー２’、プライマー３’及びプライマー４’を選抜した。次にＸｃｒの１５ｋｂの塩基配列において、プライマー１’から１．５ｋｂ以内の領域に同様にプライマーを予測し、実際の配列を見比べながらＸｃｒの配列の方が長く、両者の増幅断片長が重ならない配列として、それぞれ配列番号５、６に記載の塩基配列を有するプライマー５’及びプライマー６’を選抜した。プライマー１’、３’、５’の組み合わせをプライマーセットＡ、プライマー２’、４’、６’の組み合わせをプライマーセットＢとした。
以下表３、４に示す菌株を用いた。また、レーン４８では、Ｘｃｃ（レーン番号１）とＸｃｒ（レーン番号１７）を混合したものを用いた。
上記各菌の菌液（１０６〜７ｃｆｕ／ｍｌ程度）５μｌをＰＣＲチューブに入れ、ミクスチャー１５μｌ（表５）を加え、プライマーセットＡを用い、多重ＰＣＲを９５℃３分−（９５℃３０秒−６２℃２０秒−７２℃３０秒）×３０サイクル−７２℃５分で行った。
・増幅の確認
得られた試料を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。７７０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ３０１１７６で７６６ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｃ、１０９０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ１０６１８１で１０８５ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｒが存在する。結果を図２に示す。
得られた試料を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。７７０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ３０１１７６で７６６ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｃ、１０９０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ１０６１８１で１０８５ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｒが存在する。結果を図２に示す。
本発明であるプライマーセットＡにより、Ｘｃｃ（レーン１〜１５）、Ｘｃｒ（レーン１６〜２４）を検出することができ、近縁細菌（レーン２５〜３６）、その他の植物病原細菌（レーン３７〜４７）は検出されなかった。また、ＸｃｃとＸｃｒがともに存在していても、いずれか一方のみではなく、両者を区別して検出することができた（レーン４８）。
ＤＭＳＯを含まないミクスチャーを用い、プライマーセットＢを用い、９５℃３分−（９５℃３０秒−６３℃１５秒−７２℃１５秒）×３０サイクル−７２℃５分とした以外は、実施例１と同様にしてＰＣＲを行った。
・増幅の確認
得られた試料を３％アガロースゲルで電気泳動した。２５０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ３０１１７６で２４４ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｃ、３６０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ１０６１８１で３５８ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｒが存在する。結果を図３に示す。
本発明であるプライマーセットＢにより、Ｘｃｃ（レーン１〜１５）、Ｘｃｒ（レーン１６〜２４）を検出することができ、近縁細菌（レーン２５〜３６）、その他の植物病原細菌（レーン３７〜４７）は検出されなかった。また、ＸｃｃとＸｃｒがともに存在していても、いずれか一方のみではなく、両者を区別して検出することができた（レーン４８）。
得られた試料を３％アガロースゲルで電気泳動した。２５０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ３０１１７６で２４４ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｃ、３６０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ１０６１８１で３５８ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｒが存在する。結果を図３に示す。
本発明であるプライマーセットＢにより、Ｘｃｃ（レーン１〜１５）、Ｘｃｒ（レーン１６〜２４）を検出することができ、近縁細菌（レーン２５〜３６）、その他の植物病原細菌（レーン３７〜４７）は検出されなかった。また、ＸｃｃとＸｃｒがともに存在していても、いずれか一方のみではなく、両者を区別して検出することができた（レーン４８）。
ダイコン種子１００粒に対してＸｃｃ汚染種子１粒、Ｘｃｒ汚染種子１粒、及び両汚染種子を１粒ずつ含むサンプルを調製した。汚染種子は減圧接種によって作製したものを使用した。また対照として汚染粒を含まないサンプルも調製した。
それぞれ滅菌蒸留水３．５ｍｌを加えて室温で振とうし、２．５時間後に上清を１ｍｌ回収し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社）を用いてメーカーの指示書に従いＤＮＡの抽出を行った。精製したＤＮＡ５μｌを鋳型とし、プライマーセットＡを用い、実施例１と同様にしてＰＣＲを行った。ただし、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは増幅性の高いもの（本試験ではＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社））とし、添付のマグネシウムを含むバッファーを用いた。
それぞれ滅菌蒸留水３．５ｍｌを加えて室温で振とうし、２．５時間後に上清を１ｍｌ回収し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社）を用いてメーカーの指示書に従いＤＮＡの抽出を行った。精製したＤＮＡ５μｌを鋳型とし、プライマーセットＡを用い、実施例１と同様にしてＰＣＲを行った。ただし、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは増幅性の高いもの（本試験ではＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社））とし、添付のマグネシウムを含むバッファーを用いた。
・増幅の確認
得られた試料を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。７７０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ３０１１７６で７６６ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｃ、１０９０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ１０６１８１で１０８５ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｒが存在する。結果を図４に示す。
得られた試料を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。７７０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ３０１１７６で７６６ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｃ、１０９０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ１０６１８１で１０８５ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｒが存在する。結果を図４に示す。
本発明であるプライマーセットＡにより、汚染種子を浸漬した液中からＸｃｃ（レーン１）、Ｘｃｒ（レーン５）が存在することを確認でき、また、ＸｃｃとＸｃｒの両者を区別して検出することができた（レーン７、８）。レーン２〜４、６は、明確なシグナルが確認できなかったが、これは汚染種子に付着した菌体量が少なかったためであると推測される。
上記で調製した上清を選択培地に５０μｌずつ塗布、２７℃で培養し、３日後に集落形成を確認することで種子浸漬液中にＸｃｃおよび／またはＸｃｒがどの程度存在するかを確認する試験を行ったところ、実施例３のＰＣＲ条件では、培地上に２０個程度の集落が形成される菌濃度であれば、検出可能であった。
実施例３の反応液１μｌを鋳型とし、プライマーセットＢを用い、水５μｌを加えてミクスチャー量を２０μｌとした以外は実施例２と同様にして、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。
・増幅の確認
得られた試料を３％アガロースゲルで電気泳動した。２５０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ３０１１７６で２４４ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｃ、３６０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ１０６１８１で３５８ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｒが存在する。結果を図５に示す。
得られた試料を３％アガロースゲルで電気泳動した。２５０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ３０１１７６で２４４ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｃ、３６０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ１０６１８１で３５８ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｒが存在する。結果を図５に示す。
実施例３の培養試験で、培地上に１個の集落しか形成されなかったレーン６で用いた上清でも、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲにより、Ｘｃｒが検出できた。すなわち、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲによって検出感度が高まり、Ｘｃｃ、Ｘｃｒの存在をより高精度に検出することができた。
実施例３で、Ｘｃｃ、Ｘｃｒの両汚染種子を含む種子浸漬液を塗布した培地に生じた集落について、滅菌した爪楊枝の先端に集落を付け、２５μｌの滅菌蒸留水に菌を懸濁した。このうちの５μｌを鋳型として用い、プライマーセットＡを用い、実施例１と同様にしてＰＣＲを行った。
・増幅の確認
得られた試料を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。７７０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ ３０１１７６で７６６ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｃ、１０９０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ１０６１８１で１０８５ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｒが存在する。結果を図６に示す。
得られた試料を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。７７０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ ３０１１７６で７６６ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｃ、１０９０ｂｐ程度（ＭＡＦＦ１０６１８１で１０８５ｂｐ）の増幅断片が得られればＸｃｒが存在する。結果を図６に示す。
本発明であるプライマーセットＡにより、培地上に混在し、外観からは区別ができない集落から、Ｘｃｃ、Ｘｃｒを識別することができた。
Claims (5)
- 配列番号１、２に記載、またはこれらとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含む共通フォワードプライマー、
配列番号３、４に記載、またはこれらとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｃ用リバースプライマー、
配列番号５、６に記載、またはこれらとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｒ用リバースプライマー、
を含むことを特徴とするアブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌検出用プライマーセット。 - 配列番号１に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含む共通フォワードプライマー、
配列番号３に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｃ用リバースプライマー、
配列番号５に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｒ用リバースプライマー、
を含むことを特徴とするアブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌検出用プライマーセット。 - 配列番号２に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含む共通フォワードプライマー、
配列番号４に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｃ用リバースプライマー、
配列番号６に記載、またはこれとミスマッチヌクレオチドが２個以内である塩基配列を含むＸｃｒ用リバースプライマー、
を含むことを特徴とするアブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌検出用プライマーセット。 - 請求項１〜３のいずれかに記載のプライマーセットを用いたＰＣＲ法であることを特徴とする、アブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌感染の検査方法。
- 前記ＰＣＲ法が、請求項２に記載のプライマーセットを用いて１ｓｔＰＣＲを行った後に、請求項３に記載のプライマーセットを用いて２ｎｄＰＣＲを行うｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法であることを特徴とする、請求項４に記載の検査方法。
Priority Applications (1)
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| JP2020016947A JP2021122216A (ja) | 2020-02-04 | 2020-02-04 | アブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌検出用プライマーセット、及びこのプライマーセットを用いたアブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌の検査方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP2020016947A JP2021122216A (ja) | 2020-02-04 | 2020-02-04 | アブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌検出用プライマーセット、及びこのプライマーセットを用いたアブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌の検査方法 |
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| JP2020016947A Pending JP2021122216A (ja) | 2020-02-04 | 2020-02-04 | アブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌検出用プライマーセット、及びこのプライマーセットを用いたアブラナ科黒腐病菌及び斑点細菌病菌の検査方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012521189A (ja) * | 2009-02-06 | 2012-09-13 | ベーヨ・ザーデン・ベスローテン・フェンノートシャップ | キサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス耐性アブラナ属植物およびそれらの調製 |
-
2020
- 2020-02-04 JP JP2020016947A patent/JP2021122216A/ja active Pending
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|---|---|---|---|---|
| JP2012521189A (ja) * | 2009-02-06 | 2012-09-13 | ベーヨ・ザーデン・ベスローテン・フェンノートシャップ | キサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス耐性アブラナ属植物およびそれらの調製 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LEU, Y. S. ET AL.: "Multiplex Polymerase Chain Reaction for Simultaneous Detection of Xanthomonas campestris p", PLANT PATHOLOGY BULLETIN, vol. 19, no. 2, JPN6023018709, 2010, pages 137 - 147, ISSN: 0005058327 * |
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