KR101756997B1 - 산토모나스 캄페스트리스 ｐｖ． 캄페스트리스 저항성 브라시카 식물 및 그의 제조 - Google Patents

산토모나스 캄페스트리스 ｐｖ． 캄페스트리스 저항성 브라시카 식물 및 그의 제조 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스 (Xcc) 저항성 브라시카 식물, 및 그의 종자, 열매 및/또는 식물 부분, 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 Xcc 저항성 브라시카 올레라세아 식물, 및 그의 종자, 열매 및/또는 식물 부분, 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 Xcc 저항성을 제공하는 양적 형질 유전자좌 (QTL), 및 본 QTL 을 식별하기 위한 분자 마커, 구체적으로 무작위 증폭 미소부수체 다형성 (RAMP) 마커에 관한 것이다.

Description

산토모나스 캄페스트리스 ＰＶ． 캄페스트리스 저항성 브라시카 식물 및 그의 제조{XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS RESISTANT BRASSICA PLANT AND PREPARATION THEREOF}
본 발명은 산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris pv. campestris) (Xcc) 저항성 브라시카 (Brassica) 식물, 및 그의 종자, 열매 및/또는 식물 부분, 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 Xcc 저항성 브라시카 올레라세아 (Brassica oleracea) 식물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 저항성 식물로부터의 종자, 열매 및/또는 다른 식물 부분에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 Xcc 저항성을 제공하는 양적 형질 유전자좌 (Quantitative Trait Loci) (QTL), 및 본 QTL 을 식별하기 위한 분자 마커, 구체적으로 무작위 증폭 미소부수체 다형성 (Random Amplified Microsatellite Polymorphism) (RAMP) 마커에 관한 것이다.
미생물 산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스는 크루시페래 (Cruciferae) 에서 검은무늬병 (blackrot) 의 1 차 원인 물질이다. 세계적으로, 상기 미생물은 아마도 크루시페래의 질병에 대한 주요 병원체일 것이다. 검은무늬병은 유럽, 미주, 아프리카, 아시아, 호주 및 오세아니아 지역에서 흔히 발견된다. 이러한 박테리아성 질병에 대한 주된 숙주 식물은 브라시카 올레라세아이다. 그러나, 검은무늬병은 또한 다른 크루시페래, 잡초 및 관상용 식물에서 발견된다.
산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스에 의한 감염은 일반적으로 잎의 배수조직을 통해 또는 일부의 경우 기공 또는 상해를 통해 발생한다. 1 차 감염 후, 미생물은 관 다발을 통해 확산되어 잎에서 검은 잎맥 및 V-형 병반을 야기한다. 결과적으로, 잎의 부분 또는 부분들이 시들고 누렇게 된다.
산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스는 발달의 초기 단계에서 종자로부터 식물을 감염시킬 수 있는 종자 전파성 질병이다. 미생물은 3 년 이하의 기간 동안 종자에서 생존할 수 있다. 미생물에 의한 감염은 또한 식물 부분 저장고, 2 차 숙주 식물 및 관개 조직을 통해 발생할 수 있다.
화학 물질을 통한 질병의 통제는 가능하지 않다. 질병과 싸우는데 이용가능한 유일한 조치는 무질병 (disease free), 즉 무미생물 (microorganism free) 시작 물질의 사용 및 위생 조치 예컨대 감염된 숙주 식물의 제거이다. 무질병 시작 물질은 무병원체 (pathogen free) 종자의 사용에 의해 또는 감염된 종자의 물리적 처리에 의해 수득될 수 있다. 건강한 식물, 즉 무 Xcc (Xcc free) 식물을 재배하기 위해, 성장 시기 동안 Xcc 감염으로부터도 계속 자유로운 저항성 식물 종의 사용 및 이용가능성이 매우 바람직하다.
브라시카는 브라시카세애 (Brassicaceae) (이전에 크루시페래로서 언급됨) 과의 식물 속이다. 이 속의 일원은 양배추 또는 겨자로도 알려져 있다. 브라시카 속은 다수의 중요한 농작물 및 원예작물, 예를 들어, 평지, 꽃양배추, 붉은 양배추, 사보이 양배추, 흰 양배추, 악스하트 양배추 (oxheart cabbage), 컬리 케일 양배추 (curly cale cabbage), 브로콜리, 방울 양배추 (Brussels sprout), 배추, 순무 양배추 및 포르투갈 양배추 [트론추다 (tronchuda)] 를 포함한다.
브라시카 식물의 다양한 식물 부분, 예컨대 뿌리 (순무), 줄기 (순무 양배추), 잎 (예를 들어, 흰 및 붉은 양배추), 곁눈 (새순), 꽃 (꽃양배추, 브로콜리) 이 소비에 사용된다. 게다가, 평지 및 평지 종자가 또한 식물성 기름을 제공하는데 사용된다. 백색 또는 적색 꽃, 또는 독특한 색 또는 모양의 잎을 갖는 일부 종이 관상 목적으로 경작된다.
식량 생산에 있어서 브라시카 식물의 중요성 및 산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스 감염과 연관되는 경제적 손실을 고려할 때, 다른 목적들 중에서 Xcc 저항성 브라시카 식물 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
Xcc 저항성 브라시카 식물에 대한 필요는 검은 무늬병을 통제하기에 적당한 비용 효과적이고 효율적인 수단의 부재에 의해 추가로 지시된다. 예를 들어, 그 박테리아에 대항하는 이용가능한 살생제가 존재하지 않는다.
다른 목적들 중에서 본 발명의 상기 목적은 첨부된 청구항 1 에서 정의된 Xcc 저항성 브라시카 식물을 제공하는 방법에 의해 충족된다.
구체적으로, 다른 목적들 중에서 본 발명의 상기 목적은 하기 단계를 포함하는, 산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스 저항성 브라시카 수용체 식물을 제공하는 방법에 의해 충족된다:
- 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 을 그의 게놈 내에 포함하는 첫번째 브라시카 올레라세아 공여체 식물을 선별하는 단계;
- 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 를 그의 게놈 내에 포함하는 두번째 브라시카 올레라세아 공여체 식물을 선별하는 단계; 및
- 첫번째 공여체 식물로부터의 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 및 두번째 공여체 식물로부터의 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 를 브라시카 수용체 식물에 유전자이입 또는 게놈 조합하는 단계;
상기 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 은 프라이머 조합 SEQ ID No: 1 및 프라이머 6 이 있는 158 내지 162 bp 의 조각; 프라이머 조합 SEQ ID No: 2 및 프라이머 6 이 있는 283 내지 287 bp 의 조각; 프라이머 조합 SEQ ID No: 3 및 프라이머 6 이 있는 370 내지 374 bp 의 조각; 및 프라이머 조합 SEQ ID No: 4 및 프라이머 6 이 있는 41 내지 45 bp 의 조각으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 RAMP 마커에 의해 특징화되고;
싱기 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 는 프라이머 조합 SEQ ID No : 5 및 프라이머 6 이 있는 88 내지 92 bp 의 조각; 프라이머 조합 SEQ ID No: 6 및 프라이머 6 이 있는 125 내지 129 bp 의 조각; 프라이머 조합 SEQ ID No: 7 및 프라이머 6 이 있는 334 내지 338 bp 의 조각; 및 프라이머 조합 SEQ ID No: 8 및 프라이머 6 이 있는 47 내지 51 bp 의 조각으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 RAMP 마커에 의해 특징화되고;
상기 브라시카 수용체 식물은 그의 게놈에 관하여 첫번째 및 두번째 브라시카 공여체 식물과 동일하지 않음.
도 1 은 Xcc 저항성 및 Xcc 감수성 브라시카가 존재하는 현장 시험을 나타낸다.
도 2 는 도 1 과 동일한 풀 컬러 이미지를 나타낸다.
본 발명의 상기 첫번째 양상에 따르면, 첫번째 및 두번째 공여체 식물의 선별 또는 식별은 각각의 공여체 식물의 게놈에서 본 Xcc 저항성과 관련되는 양적 형질 유전자좌 (QTL) 의 존재를 확인함으로써 수행된다.
그러한 확인은 바람직하게는 당업계에 흔히 알려져 있는 표준 분자 생물학 기술을 사용함으로써 수행될 수 있다. 이들 기술의 예는 잠재적 공여체 식물의 게놈 DNA 를 단리한 후, 단리된 게놈에서 예를 들어 PCR, DNA 지문감식법 또는 서던 블롯에 의해 관련 양적 형질 유전자좌 (QTL) 의 존재를 확인하는 것을 포함한다.
각각의 공여체 식물의 게놈에서 본 유전자좌를 식별하는데 특히 바람직한 방법은 당업계에서 무작위 증폭 미소부수체 다형성, 또는 RAMP 로서 지칭되는 DNA 지문감식 기술이다. 이 기술에 따라, PCR 반응, 또는 핵산 증폭 반응이 공여체 식물의 단리된 게놈 물질에 대해 본 프라이머 (SEQ ID No: 1 내지 8) 및 RAPD 프라이머 (오페론 RAPD 10-머 키트 A-O1-BH-20) 를 사용하여 수행된다.
PCR 반응 후, 수득되는 증폭 산물은 예를 들어 겔 전기영동에 의해 분리될 수 있고, 그들의 염기쌍 크기는 예를 들어 분자 염기쌍 사다리를 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명에 따른 양적 형질 유전자좌 1 및 2 (QTL1 및 QTL2) 는, 저항성에 대한 지표가 아닌 다른 크기의 다른 가능한 복수의 밴드 외에, 적어도 지시된 염기쌍 크기의 밴드의 존재에 의해 특징화된다.
적합한 공여체 식물을 선별한 후, 공여체 식물에서 식별된 유전자좌 (QTL1 및 QTL2) 는 원하는 수용체 식물의 게놈에 도입 또는 게놈 조합될 수 있다. 이는 예를 들어 표준 교배 또는 유전자 이입을 사용하여 달성될 수 있고, 바람직하게는 상기 기술된 마커의 존재를 확인함으로써 자손에서 본 QTL 의 유전이 확인된다. 특히 바람직한 기술은 바람직하게는 마커 분석과 조합된 반복되는 여교배이다.
본 발명에 따르면, 브라시카 수용체 식물은 그의 게놈에 관하여 첫번째 및 두번째 브라시카 공여체 식물과 동일하지 않다. 본 문맥에서, 이는 공여체 식물 및 수용체 식물의 게놈에 대한 지표인 공여체 식물과 수용체 식물 사이의 상이한 표현형을 규명함으로써, 또는 일반적 게놈 분석을 통해 용이하게 확인될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 "그의 게놈에 관하여...동일하지 않다" 는 표현은 공여체 식물과 수용체 식물 사이의 Xcc 저항성과 관련되지 않는 하나 이상의 표현형 차이를 나타낸다. 다시 말해서, 본 수용체 식물은 일반적으로 당업계에서 상이한 식물로서 여겨진다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 첫번째 브라시카 공여체 식물 및 두번째 브라시카 공여체 식물은 그의 게놈에 관하여 동일하다. 이는 첫번째 및 두번째 공여체 식물의 선별이 QTL1 및 QTL2 모두를 그의 게놈 내에 포함하는 하나의 공여체 식물을 선별하는 것을 포함함을 의미한다. 다시 말해서, 이 바람직한 구현예는 QTL1 및 QTL2 모두를 갖는 적합한 브라시카 공여체 변종을 식별한 후, QTL1 및 QTL2 를 원하는 브라시카 수용체 식물에 도입함으로써, Xcc 저항성을 이 수용체 식물에 제공하는 것을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 은 프라이머 조합 1.1 (SEQ ID No: 1) 및 6 이 있는 160 bp 의 조각; 프라이머 조합 1.2 (SEQ ID No: 2) 및 6 이 있는 285 bp 의 조각; 프라이머 조합 1.3 (SEQ ID No: 3) 및 6 이 있는 372 bp 의 조각; 및 프라이머 조합 1.4 (SEQ ID No: 4) 및 6 이 있는 43 bp 의 조각으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 RAMP 마커에 의해 특징화된다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에 따르면, 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 는 프라이머 조합 2.1 (SEQ ID No: 5) 및 6 이 있는 90 bp 의 조각; 프라이머 조합 2.2 (SEQ ID No: 6) 및 6 이 있는 127 bp 의 조각; 프라이머 조합 2.3 (SEQ ID No: 7) 및 6 이 있는 336 bp 의 조각; 및 프라이머 조합 2.4 (SEQ ID No: 8) 및 6 이 있는 49 bp 의 조각으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 RAMP 마커에 의해 특징화된다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에 따르면, 공여체 식물의 선별은 각각의 브라시카 공여체 식물의 게놈에서 각각의 QTL 에 대한 1 이상, 바람직하게는 2 이상, 더욱 바람직하게는 3 이상, 가장 바람직하게는 4 종의 본 RAMP 마커의 존재를 분자 생물학 기술에 의해 확인 또는 식별하는 것을 포함한다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 선별 또는 식별은 첫번째 및 두번째 브라시카 공여체 식물에서 동형접합성 양적 형질 유전자좌 1 및 2 (QTL 1 및 2) 를 선별하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 브라시카 수용체 식물은 바람직하게는 브라시카 올레라세아 식물이고, 바람직하게는 브라시카 올레라세아 convar. 보트리티스 var. 보트리티스 (Brassica oleracea convar. botrytis var. botrytis) (꽃양배추, 로마네스코), 브라시카 올레라세아 convar. 보트리티스 var. 시모사 (Brassica oleracea convar. botrytis var. cymosa) (브로콜리), 브라시카 올레라세아 convar. 보트리티스 var. 아스파라고이데스 (Brassica oleracea convar. botrytis var. asparagoides) (싹 브로콜리), 브라시카 올레라세아 convar. 올레라세아 var. 겜니페라 (Brassica oleracea convar. oleracea var. gemnifera) (방울 양배추), 브라시카 올레라세아 convar. 카피타타 var. 알바 (Brassica oleracea convar. capitata var. alba) (흰 양배추, 악스하트 양배추), 브라시카 올레라세아 convar. 카피타타 var. 루브라 (Brassica oleracea convar. capitata var. rubra) (붉은 양배추), 브라시카 올레라세아 convar. 카피타타 var. 사바우다 (Brassica oleracea convar. capitata var. sabauda) (사보이 양배추), 브라시카 올레라세아 convar. 아세펠라 var. 사벨리카 (Brassica oleracea convar. acephela var. sabellica) (컬리 케일 양배추), 브라시카 올레라세아 convar. 아세펠라 var. 곤길로이데스 (Brassica oleracea convar. acephela var. gongyloides) (순무 양배추) 및 브라시카 올레라세아 var. 트론추다 syn. 코스타타 (Brassica oleracea var. tronchuda syn. costata) (포르투갈 양배추) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
상기 기술된 Xcc 저항성 브라시카 식물의 장점을 고려할 때, 본 발명은, 추가의 양상에 따르면, 그의 게놈 내에 상기 정의된 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 및 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 를 포함하는 상기 정의된 브라시카 수용체 식물, 및 그의 종자, 열매 및/또는 다른 식물 부분에 관한 것이다.
상기 양상의 특히 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 수탁 번호 NCIMB 41553 의 브라시카 식물 뿐만 아니라 그의 종자, 열매 및/또는 다른 식물 부분에 관한 것이다.
추가의 양상에 따르면, 본 발명은 산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스 저항성 브라시카 수용체 식물을 제공하기 위한, 상기 정의된 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 및 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 의 용도에 관한 것이다.
추가의 양상에 따르면, 본 발명은 본 산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스 저항성 브라시카 수용체 식물을 제공하기 위한, SEQ ID No: 1 내지 8 (각각, 프라이머 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 2.1, 2.2, 2.3, 및 2.4) 로 이루어지는 군으로부터 선별되는 하나 이상의 프라이머의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 바람직한 구현예의 하기 실시예를 사용하여 추가로 예시될 것이다. 이 실시예는 단지 설명하려는 것이지, 어떠한 방식으로도 첨부된 청구항에서 개요된 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니다.
실시예
산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스 (Xcc) 저항성을 브라시카 올레라세아로 도입하는 것은 복잡한 과정이다. Xcc 의 여러 변종이 기술되어 있고, Xcc 저항성은 일반적으로 브라시카 올레라세아에서 관찰되지 않는다. 현재 기술된 Xcc 에 대한 브라시카 올레라세아의 저항성은 양적 특성이다. 즉, 저항성 및 그의 수준은 유전적 배경에 의존적이다. 이는 여러 유전자가 이러한 저항성에 관여함을 의미하며, 따라서 Xcc 에 대한 저항성의 도 (degree) 가 관찰될 수 있다.
질적 저항성인, 즉 저항성이 유전적 배경으로부터 독립적인 것으로 관찰되는, 브라시카 올레라세아 식물을 수득하기 위해, 저항성이 본질적으로 열성인 유전적 공급원이 사용된다. 여교배 프로그램을 통해, 저항성이 다양한 유전적 배경 (감수성 부모 라인) 에 도입된다. 식물의 저항성 수준은 현장 시험에 의해 측정된다. 관여되는 형질이 열성이므로, 동형접합 형태로 형질을 수득하기 위해 감수성 식물과의 각각의 교배 후에 근교배 생성이 뒤따른다. 이러한 생성의 자손은 현장 시험에서 그들의 저항성 수준에 대해 시험되어야 한다. 그 결과, 새로운 교배의 효과를 시각화하기 위해, 일년생 식물의 경우 2 년 이상, 2 년생 식물의 경우 4 년 이상이 소요될 것이다.
관여되는 저항성이 상이한 수준의 저항성으로 발현될 수 있으므로, 저항성은 양적 값으로 표현된다 (0 내지 9 등급, 0 은 완전한 감수성을 나타내고, 9 는 완전한 저항성을 나타냄). 다양한 유전적 배경에서 저항성이 단순한 멘델 유전 대신 정상적 분포 내에서 표현형의 단계적 변화를 나타냄이 밝혀졌다. 이러한 분포는 감수성을 향해 변위할 수 있으며, 이는 저항성 공급원과 다양한 감수성 부모 라인 사이의 교배로부터의 근교배 생성이 상이한 수준의 저항성 식물을 제공함을 시사한다.
저항성 수준의 차이 및 분리 비에 기초하여, 식물의 저항성 수준이 여러 유전적 인자 또는 질적 형질 유전자좌에 의해 결정됨이 입증되었다. 양적 형질에 대한 지표인, 또는 이를 나타내는 DNA 마커를 식별하기 위해, QTL 분석이 종종 사용된다. QTL 은 독립적 염색체 영역으로서, 아래 있는 유전자에 연결되어 조합으로 유전적 형질을 설명하거나 지시한다.
DNA 마커를 사용하여, 다양한 유전적 배경의 브라시카 올레라세아 집단에 대해 게놈 범위 (spanning) QTL 분석을 수행했다. 이들 다양한 집단의 식물로, 현장 시험을 수행하여 각각의 식물의 저항성 수준을 측정했다. 마커 분석의 데이타 및 현장 시험의 점수는 관찰된 Xcc 저항성의 원인이 되는 QTL 의 식별을 가능하게 했다.
총 6 종의 독립적으로 유전되는 QTL 이 관찰되는 저항성 수준에 어느 정도 기여하는 것으로 식별되었다. 현장에서 관찰되는 식물들 사이의 저항성 수준의 변이는 QTL 의 존재 및/또는 부재 및 그의 다양한 조합의 결과이다. 식별된 6 종의 QTL 중에서, 본원에서 QTL 1 및 QTL 2 로서 지칭되는 2 종의 QTL 이 저항성을 제공하는 각각의 유전적 배경에 존재했다. 다시 말해서, 이들 2 종의 QTL 은 질적 저항성의 지표이고, 한편 나머지 4 종의 다른 QTL 은 양적 저항성에 기여하는 것으로 보인다. 이들 QTL 중 하나, 즉 QTL 1 이 주-QTL, 즉 관찰되는 저항성에 가장 크게 기여하는 QTL 로서 여겨질 수 있다.
교배 과정에 의해 수득되는 각각의 산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스 저항성 근교배 라인은 이러한 주-QTL 을 보유한다. 두번째 QTL 은, 주-QTL 와 유사하게, 양적 저항성 수준에 기여한다. 그러나, 두번째 QTL 도 유전적 배경으로부터 독립적임에도 불구하고, 이러한 기여는 주-QTL 만큼 크지 않다.
나머지 4 종의 QTL 은 상이한 유전적 배경에서 발견된다. 이들 4 종의 QTL 은 수식 역할을 하여 저항성 수준의 변이를 초래한다.
이는 하기 표 1 에서 예시되고, 표 1 에서 브라시카 올레라세아 식물 1 내지 6 은 이들 관찰을 설명하는 예이다.
표 1 Xcc 에 대한 저항성에 대한 여러 QTL 의 영향의 개관
Figure 112011069241794-pct00001
상기 표의 기호설명:
+ 존재
± 정확한 유전적 배경에 따라 존재할 수 있음
- 부재
2 종의 주 QTL, 즉 QTL 1 및 QTL 2 와 연관되는 DNA 마커의 사용은 Xcc 에 대해 저항성인 식물을 선별하는 기회를 제공했다.
질병 시험은 단독으로 QTL 둘 다를 동형접합 형태로 갖는 식물을 본질적으로 제공하지 않을 것이다. 질병 시험은 또한 안정된 저항성을 본질적으로 제공하지 않을 1 종 이상의 QTL 을 이형접합 형태로 갖는 높은 저항성 수준의 식물을 초래할 수 있다.
1000 개 초과의 식물로 질병 시험을 수행하는 것은 오직 제한된 수의 교배의 경우에 가능하다. 그러나, DNA 마커의 사용은 1000 개의 식물로 이루어지는 더 많은 집단을 분석하여 원하는 식물을 미리 선별하는 기회를 제공했다.
이외에도, DNA 마커를 사용하는 선별은 또한 2 종의 주 QTL 이 유지되는 반복되는 여교배를 수행하는 기회를 제공했다. 이 방법은 교배 생성 당 1 또는 2 년을 벌었으며, 이는 10 내지 20 년의 교배 프로그램의 가속을 의미한다. 이 더 빠른 방법은 신규한 Xcc 저항성의 하이브리드 변종 내로의 가속된 도입을 제공한다.
하이브리드 변종의 생성에 있어서 부가적 복합 인자는 양쪽 부모에서의 열성 저항성의 획득된 존재이다. 바람직하게는, 양쪽 부모 라인, 또는 공여체 식물이 2 종의 주 QTL 에 대해 동형접합이다. DNA 마커를 사용함으로써, 2 종의 주 QTL 에 대해 동형접합이고, 따라서 새로운 저항성 하이브리드를 생성하는데 적합한 부모의 식별을 비교적 단기간에 수행할 수 있다.
그러한 하이브리드의 종자가 NCIMB (애버딘, 스코틀랜드, AB21, 9YA, 영국) 에 수탁 번호 NCIMB 41553 으로 수탁되어 있다.
2 종의 주 QTL 은 모두 공급원에서 그의 존재를 특징화하는 4 종의 DNA 마커에 의해 특징화된다. QTL1 은 주 QTL 이고, QTL2 는 부 QTL 이다.
DNA 마커는 RAMP 기술에 의해 생성된다. RAMP 기술은 iSSR 및 RAPD-프라이머를 조합하고, 저항성과 특이적으로 동시 분리되는 하나 이상의 DNA 조각을 포함하는 밴드 패턴을 제공한다. RAMP-조각 및 표현형 저항성 점수를 지도화함으로써, 가까이 연관된 RAMP-마커를 식별하여 QTL 을 식별하였다 (표 2). QTL 내의 DNA 마커 사이의 유전적 거리는 센티모르간 (cM) 으로 표시된다.
DNA 마커를 생성하는데 사용된 일반적인 PCR 조건은 하기와 같았다:
RAMP 반응용 PCR 믹스:
1 반응 당
~ 0.2 ng/㎕ 게놈 식물 DNA
75 mM Tris-HCL (pH 8.8)
20 mM NH4SO4
0.01% (v/v) Tween20
2.8 mM MgCl2
0.25 mM dNTP
0.15 μM 정방향 프라이머
0.20 μM 역방향 프라이머
0.04 유닛/㎕ Red Hot® DNA 폴리머라제 (ABgene, Epsom)
PCR 프로그램 RAPD35:
사이클
단계 1: 2 분 93 ℃ 1
단계 2: 30 초 93 ℃
단계 3: 30 초 35 ℃
단계 4: 72 ℃ 로 0.3°/초로 가열
단계 5: 1 분 30 초 72 ℃
단계 2-5 반복 40
단계 6: 5 분 72 ℃ 1
PAGE/Licor:
RAMP 패턴을 분석하기 위해 "Gene ReadIR 4200 DNA 분석기" (Licor Inc.) 를 사용했다. 최적 농도의 6.5% 아크릴 아미드를 기초로, 크기 차이가 단일 염기인 조각들을 분리할 수 있었다.
이러한 시스템에서 조각들을 시각화하기 위해, 표지된 (IRDye 표지) 프라이머를 사용할 필요가 있다. 이러한 목적으로 정방향 프라이머 양의 3 분의 1 을 동일한 서열을 갖는 표지된 프라이머로 대체했다.
마커 개관
본 발명의 연구에서, 하기 표 3 에 제시된 프라이머를 사용하여 하기 표 2 에 제시된 DNA 마커를 생성했다.
표 2 1 QTL 당 RAMP 마커의 개관
Figure 112011069241794-pct00002
표 3 SEQ ID No 의 개관
Figure 112011069241794-pct00003
다양한 프라이머 조합에 의한 PCR 반응은 각각의 QTL 의 존재를 나타내는 지시된 염기쌍 크기 (표 2 참조) 의 핵산 조각을 제공한다. 이들 DNA-마커는 관심의 QTL 의 특징 또는 지표이다. QTL 을 특징화하는 이들 DNA-마커의 조합은 공여체 식물에서 Xcc 저항성 공급원으로부터의 QTL 유전자이입의 존재에 대한 명백한 증거를 제공한다.
정의
cM - 센티모르간 - 마커 사이의 유전적 거리에 대한 단위, 100 개체 당 교차의 수에 기초함.
DNA 마커 - 게놈 상의 위치가 알려진 유전자 또는 또다른 DNA 조각에 연결되는 DNA 조각, 이러한 유전자의 유전 또는 그 위치를 모니터링하는데 사용됨.
Gel-전기영동 - 전기장의 영향 하의 매트릭스 (아가로서 또는 폴리아크릴아미드) 에서 분자 (DNA, RNA, 단백질) 를 크기, 모양 또는 전하에 기초하여 분리하는 방법.
근교배 생성 (자가 수분) - 개체와 그 자신의 화분과의 수정.
유전자이입 - 교배에 의해 라인 (품종) 의 염색체 조각이 또다른 라인 (품종) 으로 도입되는 것.
IRDye 표지 - Licor 영상화 시스템에 사용되는 적외선 표지, 700 ㎚ 또는 800 ㎚ 에서 탐지됨.
단일유전자성 - 단일 유전자에 의해 결정됨.
PCR (폴리머라제 연쇄 반응) - 특정 DNA 조각을 증대시키기 위한 시험관내 증폭 방법. 이 합성 반응은 최소 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하고, 프라이머가 DNA 조각과 혼성화한 후, DNA 폴리머라제가 연속적 온도 사이클을 통해 인접 영역을 증폭시킴.
프라이머 - 단쇄 DNA 분자의 서열에 상보성인 짧은 올리고뉴클레오티드 (~20-50bp), 폴리머라제의 시작 점으로서의 역할을 함.
QTL (양적 형질 유전자좌) - 유전자에 연결되어 함께 형질을 설명하는 독립적 염색체 영역(들).
RAMP (무작위 증폭 미소부수체 다형성) - RAPD 및 iSSR 프라이머에 기초하는 DNA 지문감식 기술, 이에 의해 상이한 DNA 샘플들 사이의 다형성이 탐지됨.
RAPD-프라이머 (무작위 증폭 다형성 DNA 프라이머) - "무작위" 서열을 갖는 10-머, GC-함량이 60% 내지 70% 이고, 프라이머 말단이 자가-상보성이 아님.
iSSR (내부 단순 서열 반복) - SSR (단일 서열 반복) 의 5' 말단에 대해 고안된 프라이머; 2 또는 3 개의 뉴클레오티드의 반복으로 이루어지는 DNA 조각.
BC (여교배) - 개체와 원래 부모 중 한쪽과의 교배.
XCC 산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스
Figure 112011069241794-pct00004
Figure 112011069241794-pct00005
NCIMB NCIMB Ltd. NCIMB41553 20080508
SEQUENCE LISTING <110> BEJO Zaden B.V. LIGTHART, Johannes Theodorus Wilhelmus VEENSTRA, Roelof Marinus BIERSTEKER, Klaas DE GEUS, Jan HUITS, Hendrikus Stephanus Maria SCHRIJVER, Albertus Johannes Maria <120> XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS RESISTANT BRASSICA PLANT AND PREPARATION THEREOF <130> 4/2FX68/11 <140> NL1036531 <141> 2009-02-06 <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RAMP primer 1.1 of Table 3 <400> 1 ttagctctct ctctctc 17 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RAMP primer 1.2 of Table 3 <400> 2 ccagcacaca cacaca 16 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RAMP primer 1.3 of Table 3 <400> 3 agattctctc tctctc 16 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RAMP primer 1.4 of Table 3 <400> 4 caactctctc tctct 15 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RAMP primer 2.1 of Table 3 <400> 5 ttgtagagag agagag 16 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RAMP primer 2.2 of Table 3 <400> 6 tctcttcttc ttcttc 16 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RAMP primer 2.3 of Table 3 <400> 7 caactctctc tctct 15 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RAMP primer 2.4 of Table 3 <400> 8 gaaatctctc tctctc 16

Claims (16)

  1. 하기 단계를 포함하는, 산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스 저항성 브라시카 수용체 식물을 제공하는 방법:
    - 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 및 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 을 그의 게놈 내에 포함하는 수탁 번호 NCIMB 41553 의 브라시카 올레라세아 공여체 식물을 선별하는 단계; 및
    - 수탁 번호 NCIMB 41553 의 브라시카 공여체 식물로부터의 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 및 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 를 브라시카 수용체 식물에 유전자이입 또는 게놈 조합하는 단계;
    상기 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 은 프라이머 조합 SEQ ID No: 1 및 프라이머 6 이 있는 158 내지 162 bp 의 조각; 프라이머 조합 SEQ ID No: 2 및 프라이머 6 이 있는 283 내지 287 bp 의 조각; 프라이머 조합 SEQ ID No: 3 및 프라이머 6 이 있는 370 내지 374 bp 의 조각; 및 프라이머 조합 SEQ ID No: 4 및 프라이머 6 이 있는 41 내지 45 bp 의 조각으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 RAMP 마커에 의해 특징화되고;
    상기 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 는 프라이머 조합 SEQ ID No: 5 및 프라이머 6 이 있는 88 내지 92 bp 의 조각; 프라이머 조합 SEQ ID No: 6 및 프라이머 6 이 있는 125 내지 129 bp 의 조각; 프라이머 조합 SEQ ID No: 7 및 프라이머 6 이 있는 334 내지 338 bp 의 조각; 및 프라이머 조합 SEQ ID No: 8 및 프라이머 6 이 있는 47 내지 51 bp 의 조각으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 RAMP 마커에 의해 특징화되고;
    상기 브라시카 수용체 식물은 그의 게놈에 관하여 수탁 번호 NCIMB 41553 의 브라시카 올레라세아 공여체 식물과 동일하지 않음.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 이 프라이머 조합 SEQ ID No: 1 및 프라이머 6 이 있는 160 bp 의 조각; 프라이머 조합 SEQ ID No: 2 및 프라이머 6 이 있는 285 bp 의 조각; 프라이머 조합 SEQ ID No: 3 및 프라이머 6 이 있는 372 bp 의 조각; 및 프라이머 조합 SEQ ID No: 4 및 프라이머 6 이 있는 43 bp 의 조각으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 RAMP 마커에 의해 특징화되는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 가 프라이머 조합 SEQ ID No: 5 및 프라이머 6 이 있는 90 bp 의 조각; 프라이머 조합 SEQ ID No: 6 및 프라이머 6 이 있는 127 bp 의 조각; 프라이머 조합 SEQ ID No: 7 및 프라이머 6 이 있는 336 bp 의 조각; 및 프라이머 조합 SEQ ID No: 8 및 프라이머 6 이 있는 49 bp 의 조각으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 RAMP 마커에 의해 특징화되는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 선별이 수탁 번호 NCIMB 41553 의 브라시카 올레라세아 공여체 식물의 게놈에서 제 1 항에서 정의된 1 종 이상의 RAMP 마커의 존재를 분자 생물학 기술에 의해 확인하는 것을 포함하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 및/또는 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 가 수탁 번호 NCIMB 41553 의 브라시카 올레라세아 공여체 식물의 게놈에서 제 1 항에서 정의된 2 종 이상의 RAMP 마커에 의해 특징화되는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 및/또는 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 가 수탁 번호 NCIMB 41553 의 브라시카 올레라세아 공여체 식물의 게놈에서 제 1 항에서 정의된 3 종 이상의 RAMP 마커에 의해 특징화되는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 및/또는 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 가 수탁 번호 NCIMB 41553 의 브라시카 올레라세아 공여체 식물의 게놈에서 제 1 항에서 정의된 4 종의 RAMP 마커에 의해 특징화되는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 선별이 수탁 번호 NCIMB 41553 의 브라시카 올레라세아 공여체 식물에서 동형접합성 양적 형질 유전자좌 1 및 2 (QTL 1 및 2) 를 선별하는 것을 포함하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 브라시카 수용체 식물이 브라시카 올레라세아 식물인 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 브라시카 식물이 브라시카 올레라세아 convar. 보트리티스 var. 보트리티스 (Brassica oleracea convar. botrytis var. botrytis) (꽃양배추, 로마네스코), 브라시카 올레라세아 convar. 보트리티스 var. 시모사 (Brassica oleracea convar. botrytis var. cymosa) (브로콜리), 브라시카 올레라세아 convar. 보트리티스 var. 아스파라고이데스 (Brassica oleracea convar. botrytis var. asparagoides) (싹 브로콜리), 브라시카 올레라세아 convar. 올레라세아 var. 겜니페라 (Brassica oleracea convar. oleracea var. gemnifera) (방울 양배추), 브라시카 올레라세아 convar. 카피타타 var. 알바 (Brassica oleracea convar. capitata var. alba) (흰 양배추, 악스하트 양배추), 브라시카 올레라세아 convar. 카피타타 var. 루브라 (Brassica oleracea convar. capitata var. rubra) (붉은 양배추), 브라시카 올레라세아 convar. 카피타타 var. 사바우다 (Brassica oleracea convar. capitata var. sabauda) (사보이 양배추), 브라시카 올레라세아 convar. 아세펠라 var. 사벨리카 (Brassica oleracea convar. acephela var. sabellica) (컬리 케일 양배추), 브라시카 올레라세아 convar. 아세펠라 var. 곤길로이데스 (Brassica oleracea convar. acephela var. gongyloides) (순무 양배추) 및 브라시카 올레라세아 var. 트론추다 syn. 코스타타 (Brassica oleracea var. tronchuda syn. costata) (포르투갈 양배추) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  12. 제 1 항에서 정의된 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 및 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 를 그의 게놈 내에 포함하는, 제 1 항에서 정의된 브라시카 수용체 식물.
  13. 삭제
  14. 제 1 항에서 정의된 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 및 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 를 그의 게놈 내에 포함하는, 제 12 항에 따른 브라시카 식물의 종자.
  15. 제 1 항에서 정의된 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 및 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 를 그의 게놈 내에 포함하는, 제 12 항에 따른 브라시카 식물의 열매.
  16. 제 1 항에서 정의된 양적 형질 유전자좌 1 (QTL1) 및 양적 형질 유전자좌 2 (QTL2) 를 그의 게놈 내에 포함하는, 제 12 항에 따른 브라시카 식물의 종자 및 열매 이외의 다른 식물 부분.
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