CN105603094B

CN105603094B - 一种乌骨鸡肤色性状相关的snp分子标记及应用

Info

Publication number: CN105603094B
Application number: CN201610096090.8A
Authority: CN
Inventors: 王欢欢; 章学东; 张雷; 楼立峰; 陈美玲; 李庆海; 张成先; 陈贤惠
Original assignee: Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Current assignee: Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-02-22
Filing date: 2016-02-22
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2036-02-22
Also published as: CN105603094A

Abstract

本发明提供了一种SNP分子标记在乌骨鸡肤色性状检测中的应用，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，第171 bp处碱基突变类型为A/G。本发明还提供了用于检测该SNP位点的引物序列及PCR‑RFLP方法，根据DraI酶切后、电泳条带的不同可区分位点的基因型，进而判断样本Fm基因的纯合与杂合。出现342 bp一条带，为GG纯合基因型；出现171 bp、342 bp两条带，为AG杂合基因型；出现171 bp一条带，为AA隐性纯合基因型。利用本发明所提供的SNP标记和检测方法，在乌骨鸡的雏鸡阶段就可以判断个体基因型，做到肤色性状的早选择早淘汰，这对于提高选种效率、节约育种成本，具有重要的实用价值。

Description

一种乌骨鸡肤色性状相关的SNP分子标记及应用

技术领域

本发明涉及一种用于检测与乌骨鸡肤色性状相关的Fm基因纯合与杂合的SNP标记，属农业生物技术领域。

背景技术

乌骨鸡在我国的饲养历史非常悠久，通常具有乌皮、乌骨、乌肉等特征，是我国传统的、珍奇的药食两用鸡种，据明代《本草纲目》记载“其性甘、平、无毒，补虚劳嬴弱，治消渴，益产妇，治女人崩中带下，一切虚损诸病”，因此深得消费者青睐。乌骨鸡品种主要有泰和丝羽乌骨鸡、东乡绿壳蛋鸡、江山乌骨鸡等，均是当前乌骨鸡育种中常用的优秀素材，但随着外来鸡种的引入及血缘混杂，乌骨鸡群体中存在着黑肤不全不纯的情况。例如，据对东乡绿壳蛋鸡保种群的肤色观察，群体肤色以黑色或浅黑色为主，少数个体为白色，这种情况影响到后期杂交利用的肤色整齐度和均匀性。

已有研究表明，鸡的黑色肤色为质量性状，是由单基因Fm(Fibromelanosis，纤维化黑色变)控制的常染色体显性遗传。因此，无法根据个体的表型来判断其基因型是否纯合，虽然通过与白色肤鸡种测交可以进行验证，但测交周期长、耗资大，难以做到全群实施。现代分子生物技术的迅猛发展为解决这个问题提供了可能。据基因组研究，Fm基因位于鸡20号染色体的10.3-13.1Mb区域，包含了由417Kb中间区域间隔的两段重复碱基序列，其中，第一段重复序列有EDN3、ATP5E等功能基因；中间区域有GNAS、STX16、ANKRD60等功能基因。另一方面，物种DNA序列的单核苷酸突变(SNP)是继微卫星之后的新一代遗传标记，数量多且分布广泛、稳定性高。因此，通过对Fm基因区间的SNP筛选和标记，可以方便准确地鉴定候选个体的基因型，从而有效加快育种进程，降低育种成本。

发明内容

本发明提供了一种与乌骨鸡肤色性状相关的Fm基因纯合与杂合的SNP分子标记及其检测方法。

本发明对家鸡基因组(NC_006107.3)20号染色体的Fm基因区段进行单核苷酸多态性检测，得到1个与乌骨鸡肤色性状相关的SNP分子标记，该分子标记位于核酸序列SEQ IDNo.1所示第171bp处，突变碱基为A/G。

本发明首先提供了SNP分子标记在乌骨鸡肤色性状检测中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，第171bp处碱基突变类型为A/G。

另外，本发明提供了一种引物对在乌骨鸡肤色性状检测中的应用，其特征在于，所述引物对的DNA序列为：

F 5’-ACGACAGCAGGAAACGT-3’

R 5’-TGTGGCAGGCAGGTAACTGTGT-3。

本发明的第三个目的在于提供用于判断乌骨鸡Fm基因纯合或杂合的SNP检测方法。

乌骨鸡肤色性状检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以待测样本的基因组DNA为模板，利用引物对通过PCR方法扩增目标序列；所述引物对的DNA序列为：

F 5’-ACGACAGCAGGAAACGT-3’

R 5’-TGTGGCAGGCAGGTAACTGTGT-3；

(2)利用限制性内切酶DraI对扩增产物进行酶切，再对酶切产物进行电泳分离；

(3)SNP分子标记第171bp处碱基A/G突变位点为GG纯合时，酶切产物电泳出现342bp一条带；A/G突变位点为AG杂合时，出现171bp、342bp两条带；A/G突变位点为AA纯合时，出现171bp一条带。

(4)所述SNP分子标记用于判断乌骨鸡肤色Fm基因的纯合与杂合，GG代表Fm基因纯合；AG代表Fm杂合；AA代表Fm隐性纯合。

SNP分子标记与检测方法可在辅助选育乌骨鸡肤色性状的过程中应用，通过标记检测，能够区分出同样表现黑肤外观的Fm纯合与杂合型乌骨鸡。根据DraI酶切后、电泳条带的不同可区分位点的基因型，进而判断样本Fm基因的纯合与杂合。出现342bp一条带，为GG纯合基因型；出现171bp、342bp两条带，为AG杂合基因型；出现171bp一条带，为AA隐性纯合基因型。利用本发明所提供的SNP标记和检测方法，在乌骨鸡的雏鸡阶段就可以判断个体基因型，做到肤色性状的早选择早淘汰，这对于提高选种效率、节约育种成本，具有重要的实用价值。

附图说明

图1为SEQ ID No.1的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

图2为SNP标记的DraI酶切产物琼脂糖凝胶电泳图

图3为SNP标记的各基因分型的测序峰图

具体实施方式

以下结合附图和实施例进一步阐述本发明。

实施例1 黑色素主效基因Fm的SNP分子标记检测方法

1、实验仪器设备

超低温冰箱(Thermo，美国)；高速冷冻离心机(Eppendorf 5417R，德国)；梯度PCR仪(ABI PCR system 9700，美国)；可调式微量移液器(Eppendorf，德国)；GEL EQ电泳凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)；紫外可见分光光度计(BioSpec-nano，日本)。

2、鸡血液基因组DNA提取

采集鸡翅静脉血液，于75％乙醇中保存。用AxyPrep总血基因组DNA小量试剂盒(Axygen，美国)提取鸡血液全基因组DNA。提取后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量；紫外可见分光光度计测定DNA浓度。

3、引物设计

针对NCBI数据库Gallus gallus基因组(NC_006107.3)20号染色体的Fm基因区段设计特异性引物，引物信息见表1。扩增产物的核酸序列见SEQ ID No.1。

表1 引物信息

4、实时荧光定量PCR扩增

以样本DNA为模板，用PCR仪进行扩增。PCR反应体系为：DNA 20ng，2×Taq PCRMaster Mix 12.5μL，上下游引物各10μM，加水补至25μL。反应条件为：94℃ 5min，然后进入PCR循环，94℃ 30sec，57℃ 30sec，72℃ 40sec，35个循环；最后72℃延伸10min。反应完全后，取扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，确保产物单一且大小正确，电泳结果见附图1。

5、RFLP酶切

将PCR产物用限制性内切酶DraI进行酶切，酶切位点位于SEQ ID No.1的第171bp处。反应体系为：PCR产物5μL，10×buffer 2μL，酶1μL，加水补至20μL。37℃酶切1h。酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像系统分析成像结果。

6、结果与分析

该SNP位点位于鸡20号染色体的11310233碱基，此处A/G类型突变会引起DraI酶切的不同。DraI等位酶切SEQ ID No.1序列后，片段大小为171bp，因此：若PCR-RFLP只检测到一条带，且分子量大小为342bp，表明该SNP位点的等位基因是GG纯合型；若检测到两条带，且大小分别为342bp、171bp，表明该位点等位基因是AG杂合型；若只检测到171bp一条带，表明该位点等位基因是AA隐性纯合型。三种SNP分型的酶切电泳结果见附图2。7、测序对照

将三种基因型的PCR产物回收后进行DNA测序，测序结果见附图3。根据测序峰图与根据酶切条带的判断结果是一致的。

实施例2 东乡绿壳蛋鸡的肤色测交验证试验

1、试验材料与方法

东乡绿壳蛋鸡是原产于江西省的地方乌骨鸡种，群体肤色以黑色或浅黑色为主，少数个体为白色，表明存在Fm基因的纯合与杂合。试验在东乡绿壳蛋鸡保种群中随机选择23只公鸡，采集翅静脉血液提取基因组DNA，按照实施例1中的步骤进行检测。根据测定结果，选择三种基因型的东乡公鸡共计12只，以1:6的配种比例与72只兴安麻鸡(广西省地方鸡种，白肤、黑胫)进行测交，种蛋孵化出雏后，观察并记录子代肤色。

2、结果与分析

东乡绿壳蛋鸡的SNP检测结果表明：23只公鸡中，判断为GG基因型的有6只，表明其Fm基因纯合；判断为AG基因型的有14只，表明其Fm基因杂合；判断为AA基因型的有3只，表明其Fm基因隐性纯合。这一检测结果基本与东乡群体的肤色现状相符。

测交公鸡的酶切电泳图参见图2，其SNP位点基因型与子代肤色统计如表2所示。12只东乡公鸡中，判为GG基因型的有3只，其81只测交子代的肤色均为黑色；判为AG基因型的有7只，其209只测交子代的黑肤和白肤比例分别为56.0％和44.0％，经卡方检验二者差异不显著；判为AA基因型的有2只，其52只测交子代均为白色肤。三种基因型的肤色测交验证结果与理论结果保持一致。

表2 测交试验数据

实施例3 SNP标记检测方法在不同鸡种中的应用

1、实验材料与方法

分别选择江山乌骨鸡、伊莎B系蛋鸡、伊莎D系蛋鸡、“东乡×伊莎B”杂交组合鸡、“东乡×兴安”杂交组合鸡若干只，采集翅静脉血液提取基因组DNA，按照实施例1中的步骤进行检测。根据酶切电泳结果判断样本的SNP基因型，并采用卡方检验进行相关分析。

2、结果与分析

各鸡种的SNP标记检测结果见表3。

表3 不同鸡种的SNP分型结果

江山乌骨鸡原产于浙江省江山市，片状白羽，乌皮、乌肉、乌骨，为Fm基因纯合型的乌骨鸡参考鸡种，检测发现群体中的基因型以GG为主；伊莎B系、伊莎D系蛋鸡为国外引进鸡种，白色皮肤，为Fm隐性纯合的参考鸡种，检测发现均为AA基因型；试验中“东乡×伊莎B”、“东乡×兴安”杂交组合的父本都选用东乡Fm纯合型公鸡，子代为Fm杂合的参考鸡种，检测到的基因型基本为AG型。这些检测结果经卡方检验均与理论结果相符，表明该标记检测方法可用于育种实践。

<110> 杭州市农业科学研究院

<120> 一种乌骨鸡肤色性状相关的SNP分子标记及应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 342

<212> DNA

<213> 黑色素主效基因Fm

<400> 1

acgacagcag gaaacgtttc tcactgatag tgcaagcaaa atgtctagat tgattttgcc 60

tccagttttc agctaaggtc atgaactcaa tgaacacaga atccaaactg ccccactgag 120

gtcaaaagga caactgatat gcccagggtg aagccaggca ccactgtttt tnaaggacta 180

cctaaaaagt tacattcagt cattcggctt tgttttgcaa caggcattta gaaagtctcc 240

tgatttttat gtgaattata gttaagattc tttttcccct agaattcttg tggctacatt 300

tctcaaagca tcagctaagc acacagttac ctgcctgcca ca 342

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acgacagcag gaaacgt 17

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtggcaggc aggtaactgt gt 22

Claims

1.检测SNP分子标记的试剂在乌骨鸡肤色性状检测中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，第171 bp处碱基突变类型为A/G。

2.一种引物对在乌骨鸡肤色性状检测中的应用，其特征在于，所述引物对的DNA序列为：

F 5’- ACGACAGCAGGAAACGT -3’

R 5’- TGTGGCAGGCAGGTAACTGTGT -3。

3.乌骨鸡肤色性状检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以待测样本的基因组DNA为模板，利用引物对通过PCR方法扩增目标序列；所述引物对的DNA序列为：

F 5’- ACGACAGCAGGAAACGT -3’

R 5’- TGTGGCAGGCAGGTAACTGTGT -3；

（2）利用限制性内切酶DraI对扩增产物进行酶切，再对酶切产物进行电泳分离；

（3）SNP分子标记第171 bp处碱基A/G突变位点为GG纯合时，酶切产物电泳出现342 bp一条带；A/G突变位点为AG杂合时，出现171 bp、342 bp两条带；A/G突变位点为AA纯合时，出现171 bp一条带；

（4）所述SNP分子标记用于判断乌骨鸡肤色Fm基因的纯合与杂合，GG代表Fm基因纯合；AG代表Fm杂合；AA代表Fm隐性纯合。