CN116790767B - 与鸡皮肤乌度相关的tyr基因分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与鸡皮肤乌度相关的TYR基因分子标记及其应用，属于家禽育种领域。本发明对五黑鸡的血液样本进行研究，发现TYR基因的第一外显子上存在两个与五黑鸡翅下胸部皮肤乌度显著关联的SNP位点，两个SNP位点分别为SNP1和SNP2，SNP1为如SEQ ID NO：1所示序列存在NC_052532.1:g667T>C，SNP2为如SEQ ID NO：1所示序列存在NC_052532.1:g759T>C。经试验发现，上述两个位点与五黑鸡皮肤乌度显著相关，可作为五黑鸡皮肤乌度选育的分子标记，辅助五黑鸡皮肤乌度性状的早期筛选，这对推进五黑鸡品种的选育和鸡皮肤乌度研究具有积极意义。

Description

与鸡皮肤乌度相关的TYR基因分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及家禽育种领域，特别是涉及与鸡皮肤乌度相关的TYR基因分子标记及其应用。

背景技术

随着经济发展，人们对鸡肉品质的要求逐渐提高。如今人们对更具风味，营养价值更高的黄羽肉鸡、麻鸡、乌鸡等优质地方品种更加青睐。家禽的皮肤颜色作为重要的屠体性状，影响着肉鸡的经济价值。其中，五黑鸡是一种珍稀的家禽品种，以其独特的五黑特征而著称，包括黑毛、黑皮、黑肉、黑骨、黑内脏，五黑鸡作为中国优质地方鸡种已有上千年的养殖历史，被誉为“中国黑宝”，其肉质表现乌黑，富含多种微量元素和维生素，鸡肉中大量黑色素沉积使其更具营养价值且带有保健作用。五黑鸡的皮肤乌度极大程度的影响着五黑鸡的冰鲜销售，如何培育出乌度值高、稳定性好、肤色均匀的五黑鸡成为一个选育难题。

黑色素的沉积可以使动物皮肤和毛发带有一定颜色，保护机体免受太阳紫外线的辐射。黑色素还具有清除自由基和抗氧化的生理活性，有研究表明泰和乌鸡黑色素在体外有较强的过氧化氢自由基和O^-2自由基清除活性。此外，小鼠在饲喂乌骨鸡肌肉黑色素后体内的谷胱甘肽过氧化物酶水平显著升高，而苯二醛的水平却显著降低，表明黑色素具有一定的抗氧化作用。刘鑫等发现毛木耳黑色素提取物能够减轻H₂O₂引起的细胞损伤，抑制由H₂O₂引起的细胞内活性氧的增加。此外，黑色素在抗衰老方面有着重要作用，目前已有研究表明，喂食乌鸡黑色素能够显著降低果蝇衰老标记物老年素的含量，对寿命延长具有积极作用。研究发现饲喂乌鸡黑色素的老年小鼠的肝脏、肾脏和肠道的代谢类酶活性与普通饲喂的小鼠相比得到显著增强。

TYR基因编码的酪氨酸酶是动物黑色素合成代谢过程中的一个十分重要的限速酶。一般情况下，酪氨酸在酪氨酸酶的作用下发生羟化反应，形成多巴胺酪氨酸，多巴胺酪氨酸被多巴胺酪氨酸酶进一步氧化，生成多巴醌，多巴醌是一种高度反应性的中间体，容易被还原为多巴胺或被氧化为黑色素前体物质。TRY基因突变可能会导致黑色素合成代谢紊乱。陈志强等在研究鸡TYR基因的5’调控区时发现TYR基因在乌骨鸡中有非常高的遗传多样性。目前已有大量研究表明，TYR在被毛颜色较深的动物中表达丰度较被毛颜色浅的动物中显著升高。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指基因组水平上由单个核苷酸的插入、缺失、颠换和转换等而引起的基因组DNA序列的多态性，因具有广泛存在，稳定遗传，易于检测的特点而作为一种准确有效的分子标记技术在畜禽分子育种领域得到广泛应用。筛选SNP分子标记对于培育出乌度值高、稳定性好、肤色均匀的五黑鸡具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供与鸡皮肤乌度相关的TYR基因分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该分子标记位于TYR基因的第一外显子上且存在两个SNP位点，其与五黑鸡翅下胸部皮肤乌度值显著相关，这为五黑鸡的皮肤乌度筛选提供了有效的SNP分子标记。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与鸡皮肤乌度相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述分子标记包括单核苷酸多态性位点SNP1和SNP2，其中，所述SNP1为如SEQ ID NO：1所示序列存在NC_052532.1:g667T>C，所述SNP2为如SEQ ID NO：1所示序列存在NC_052532.1:g759T>C。

优选的是，所述SNP1和所述SNP2均存在基因型TT、CT和CC三种基因型。

本发明还提供一种鉴别鸡皮肤乌度的方法，包括以下步骤：

(1)以待测鸡基因组DNA为模板，利用引物扩增所述的分子标记或者包括所述的分子标记的基因片段，获取扩增产物；所述引物为如SEQ ID NO：2所示的上游引物和SEQ IDNO：3所示的下游引物；

(2)对所述扩增产物测序，检测相应单核苷酸多态性位点的基因型，根据检测的基因型判断待测鸡的皮肤乌度。

优选的是，所述扩增的反应体系为：模板DNA1μL、2×GS Taq PCR Mix 15μL、上游引物1.2μL、下游引物1.2μL和ddH₂O 11.6μL。

优选的是，所述扩增的反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性25s，55℃退火25s，72℃延伸15s，34个循环；72℃最终延伸5min，4℃保存。

优选的是，所述SNP1和所述SNP2两个位点处基因型为TT、CT和CC基因型时，都与鸡翅下胸部皮肤乌度显著相关。

本发明还提供所述的分子标记在辅助鸡育种中的应用。

优选的是，所述分子标记应用于鸡皮肤乌度性状的选育中。

优选的是，所述鸡皮肤乌度性状为鸡翅下胸部皮肤乌度。

本发明公开了以下技术效果：

本发明对265只五黑鸡的血液样本进行DNA提取、PCR扩增和Sanger测序，发现TYR基因的第一外显子上存在两个与五黑鸡翅下胸部皮肤乌度显著关联的SNP位点(P＜0.05)，可作为五黑鸡皮肤乌度选育的分子标记，应用于五黑鸡皮肤乌度性状的早期辅助选择，对推进五黑鸡品种的选育和鸡皮肤乌度研究具有积极意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为部分TYR-1的PCR扩增后电泳结果；M为2000bp标准DNA分子，其余泳道均为TYR-1PCR扩增样品；

图2为TYR-1的SNP测序峰图；B1、19表示野生型位点，基因型为TT；B93、B84表示突变位点，基因型为CT；B87、26表示突变位点，基因型为CC。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1、实验材料和方法

1.1实验动物及数据采集

本发明实验动物由珠海裕禾农牧有限公司提供46只五黑鸡(父本，编号1-46)，50只白洛克鸡(母本，编号A1-A50)，138只黑皮肤黑冠裕禾快大型黑鸡(子代，编号B1-B138)，31只黄皮肤红冠裕禾快大型黑鸡(子代，编号C1-C31)，共计265只。

使用色差仪(型号3nh-NR20XE，深圳市三恩时科技有限公司)按照使用说明测量每个个体的翅下胸部和龙骨左侧胸部肤色数据，并根据仪器说明记录L值(亮度系数，表示从白到黑的变化)、A值(红度，表示从红+A到绿-A的变化)、B值(黄度，表示从黄+B到蓝-B的变化)。其中L值越低，代表皮肤乌度越高。同一部位连续测量两次，记录数据结果取平均值。使用含EDTA一次性采血管(江苏宇力医疗器械有限公司)进行翅下静脉采血，每只约1.5mL，血样保存在4℃冰箱，用作后续DNA提取样本。

1.2DNA提取

按照制造商说明书要求使用NRBC Blood DNA Midi血液DNA提取试剂盒(Omega BIO-TEK)从血液样本中提取总DNA，并使用NanoDrop2000c超微分光光度计和1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，将质量合格的DNA保存在-20℃。

1.3PCR引物设计

根据NCBI(Gallus gallus isolate bGalGal1 chromosome 1,bGalGal1.mat.broiler.GRCg-Nucleotide-NCBI(nih.gov))和Ensemble(Transcript:ENSGALT00010018717.1(TYR-202)-Exons-Gallus_gallus-Ensembl genome browser 109)给出的参考序列TYR基因(登录号：GeneID:373971；参考基因组：bGalGal1.mat.broiler.GRCg7b)的第一外显子序列为988bp的序列信息，使用引物设计软件Primer Premier 5.0设计特异性引物，并交由北京擎科生物科技股份有限公司(广州)合成。引物序列相关信息如表1所示。

表1PCR所用引物信息

注：阴影加粗标注的为与鸡皮肤乌度相关的SNP位点；加粗双下划线标注的为引物；两个引物之间的序列(包括引物)为扩增产物即SEQ ID NO：1的序列；整个序列为988bp，是第一外显子TYR-1的全序列。

1.4PCR扩增

以上述血样基因组DNA作为模板，遵循以下反应体系进行：模板DNA 1μL、2×GSTaq PCR Mix 15μL、上游引物F1.2μL(100μM)、下游引物R1.2μL(100μM)和ddH₂O 11.6μL，涡旋振荡后瞬时离心。根据Taq酶说明设置PCR反应程序：95℃预变性3min，34个循环(94℃变性25s，55℃退火25s，72℃延伸15s)，72℃最终延伸5min，PCR产物4℃保存。

1.5琼脂糖凝胶电泳

配制1％的琼脂糖凝胶，使用移液枪取5μL PCR产物至上样孔，以2000bp DNAMarker作为参照，将加完样品的凝胶块按要求放入电泳槽内，并加入没过凝胶的电泳液后接通电源，观测loading buffer位置，约15分钟后停止电泳，使用GDS-8000PC凝胶成像系统(美国UVP公司)观察条带，并记录扩增出目的条带的样品信息，拍照保存。

1.6Sanger测序

将条带清晰、没有杂带，且与目的产物大小一致的PCR产物送由擎科生物科技股份有限公司(广州)进行测序。

1.7基因分型与SNP筛选

利用Snapgene软件对PCR产物的Sanger测序结果进行序列峰图分析以确定潜在SNP位点。通过DNAstar软件的SeqMan工具比对每个样本的测序数据，进行基因分型。

1.8统计分析

采用IBM SPSS Statistics27软件进行关联分析，使用混合模型线性分析方法分析五黑鸡TYR基因不同的SNP位点与翅下胸部皮肤乌度(L1)和左侧龙骨胸部皮肤乌度(L2)之间的关系，统计并记录软件分析结果。

2、结果与分析

2.1TYR基因外显子序列PCR扩增及SNP筛选

针对TYR基因的5个外显子分别设计引物，通过PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳发现引物TYR-1(见图1)、TYR-3、TYR-4、TYR-5可以扩增出目的条带，将共计265个PCR产物送测序。使用snapGene查看测序结果和峰图，并与NCBI上的参考基因组比对，发现只有外显子1引物TYR-1在全基因组序列818bp和910bp碱基处存在SNP，分别为NC_052532.1:g818T＞C，NC_052532.1:g910 T＞C。且两个突变均为同义突变，818bp处SNP突变前后均编码为亮氨酸，910bp处SNP突变前后均编码半胱氨酸。

2.2TYR基因外显子序列SNPs位点与五黑鸡皮肤乌度性状的关联分析

将上述两个SNP位点与五黑鸡的皮肤乌度(翅下胸部皮肤乌度L1，龙骨左侧胸部皮肤乌度L2)进行关联分析，结果见表2和图2，结果显示，NC_052532.1:g667T>C、NC_052532.1:g759T>C两个SNP位点均与翅下胸部皮肤乌度(L1)显著相关(P＜0.05)，而与龙骨左侧胸部皮肤乌度(L2)均无显著关联(P₈₁₈＝0.606，P₉₁₀＝0.703)。

表2SNP位点与皮肤乌度值关联分析

注：基因型后括号内数字代表该基因型在实验动物群体中的样本个数；无字母标注和有相同字母标注的基因型表示两组差异不显著(P＞0.05)，不同字母标注表示差异显著(P＜0.05)。

从上述结果可看出，本发明对父本五黑鸡(46只)、母本白洛克鸡(50只)、子代黄皮肤红冠裕禾快大型黑鸡(31只)、子代黑皮肤黑冠裕禾快大型黑鸡(138只)共265个样本的TYR第一外显子测序发现两个SNP位点NC_052532.1:g667T>C和NC_052532.1:g759T>C均与五黑鸡翅下胸部皮肤乌度值显著相关，可以作为五黑鸡皮肤乌度选育的潜在分子标记，为五黑鸡的现代化选育工作提供分子靶点和理论依据。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种鉴别五黑鸡皮肤乌度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以待测鸡基因组DNA为模板，利用引物扩增分子标记或者分子标记的基因片段，获取扩增产物；所述引物为如SEQ ID NO：2所示的上游引物和SEQ ID NO：3所示的下游引物；所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述分子标记包括单核苷酸多态性位点SNP1和SNP2，其中，所述SNP1为SEQ ID NO：1所示序列第667位存在T>C，所述SNP2为如SEQID NO：1所示序列第759位存在T>C；

（2）对所述扩增产物测序，检测SNP1和SNP2的基因型，根据检测的基因型判断待测鸡的皮肤乌度；

所述SNP1和所述SNP2均存在TT、CT和CC三种基因型；

所述鸡的皮肤乌度为鸡翅下胸部皮肤乌度，所述SNP1和所述SNP2两个位点处基因型为TT、CT和CC基因型时，都与鸡翅下胸部皮肤乌度显著相关；

在所述SNP1位点处，TT基因型的鸡翅下胸部皮肤乌度高于CC基因型的鸡翅下胸部皮肤乌度，TT基因型和CT基因型的鸡翅下胸部皮肤乌度无显著差异，CT基因型和CC基因型的鸡翅下胸部皮肤乌度无显著差异；在所述SNP2位点处，TT基因型的鸡翅下胸部皮肤乌度高于CT基因型的鸡翅下胸部皮肤乌度，TT基因型和CC基因型的鸡翅下胸部皮肤乌度无显著差异，CT基因型和CC基因型的鸡翅下胸部皮肤乌度无显著差异。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应体系为：模板DNA 1 μL、2×GS Taq PCR Mix 15 μL、上游引物1.2 μL、下游引物1.2 μL和ddH₂O 11.6 μL。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应程序为：95 ℃预变性3 min；94℃变性25s，55℃退火25s，72℃延伸15s，34个循环；72 ℃最终延伸5 min，4 ℃保存。

4.检测分子标记的试剂在辅助五黑鸡翅下胸部皮肤乌度育种中的应用，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述分子标记包括单核苷酸多态性位点SNP1和SNP2，其中，所述SNP1为SEQ ID NO：1所示序列第667位存在T>C，所述SNP2为如SEQID NO：1所示序列第759位存在T>C；

所述SNP1和所述SNP2均存在TT、CT和CC三种基因型；

所述SNP1和所述SNP2两个位点处基因型为TT、CT和CC基因型时，都与鸡翅下胸部皮肤乌度显著相关；

在所述SNP1位点处，TT基因型的鸡翅下胸部皮肤乌度高于CC基因型的鸡翅下胸部皮肤乌度，TT基因型和CT基因型的鸡翅下胸部皮肤乌度无显著差异，CT基因型和CC基因型的鸡翅下胸部皮肤乌度无显著差异；在所述SNP2位点处，TT基因型的鸡翅下胸部皮肤乌度高于CT基因型的鸡翅下胸部皮肤乌度，TT基因型和CC基因型的鸡翅下胸部皮肤乌度无显著差异，CT基因型和CC基因型的鸡翅下胸部皮肤乌度无显著差异。