CN114736973B - 一种与鸡屠体肤色性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与鸡屠体肤色性状相关的SNP分子标记及其应用，属于基因检测技术领域。所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述SNP分子标记的突变位点位于所述SEQIDNO.1中的第175位碱基，所述SNP分子标记的突变位点的基因型包括CC、CG和GG。本发明的SNP分子标记与鸡屠体肤色性状相关，是新的分子标记。通过优选该SNP位点的优势基因型，可以在早期活体阶段对鸡屠体皮肤黄度进行选择，节省了生产成本，有较大的经济应用价值和科研价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种与鸡屠体肤色性状相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
家禽的皮肤颜色作为重要的屠体性状，影响着肉鸡的销售，颜色偏黄的白条鸡在国内市场更受欢迎。因此，如何培育出肤色黄度值高、均匀度高和稳定性好的鸡，一直是一个技术难题。而鸡皮肤屠体黄度因为需要经过屠宰测定获得，故难以进行直接选育，导致针对鸡屠体皮肤黄度性状的选育难度加大，成本较高，亟需能在早期活体水平进行选育的方法。
近些年来畜禽肉产品的颜色越来越成为人们关注的肉质特征，对畜禽肉色以及皮肤颜色的研究也逐渐增多。畜禽皮肤呈现的红色以及黄色是由类胡萝卜素和叶黄素等黄色素沉积的结果，呈现的黑色是黑色素沉积的结果。除一些特别的品种如乌鸡等，家禽皮肤颜色大部分呈现的主要颜色为黄色，其呈色物质为类胡萝卜素和叶黄素。目前关于鸡的皮肤颜色的研究的实际应用仍然停留在营养调控水平，对于基因调控和分子标记相关的研究仍处在不断地探索和验证阶段。
CD36属于B类清道夫受体，本质为膜糖蛋白，在机体内主要参与调节各类心血管脂质代谢和肌细胞形成，通过介导细胞LCFAs的摄取，可以促进脂肪细胞、肠上皮细胞、心肌细胞等脂肪酸转运。其中，鸡摄入的类胡萝卜素主要通过SCARB1和CD36进行吸收，对鸡黄皮肤的形成起着重要作用。此外，有研究表明CD36会影响鸡脂肪沉积调控，CD36的多态性与牛的肌内脂肪以及鸭的血清生化指标和肉质性状显著相关。
分子标记辅助选择(MAS)是一种常用的分子育种技术。MAS可以直接根据遗传物质的多态性进行相应的分析，如单核苷酸多态性(SNP)。分子标记辅助选择技术在其他家畜的育种中已有相当长的历史，与传统育种方法相比，MAS具有存在范围广、遗传稳定、直观准确等优点，目前并未大规模的应用于鸡的育种中。其原因一方面是对于鸡的经济性状的分子标记研究和挖掘较少，可应用于实际育种中选择重要经济性状的分子标记不足；另一方面是分子标记的检测往往成本较高，在世代间隔短、育种群体大的鸡育种中应用分子标记辅助选择技术的成本较常规育种方法更高。但随着更多低成本检测技术的发展以及分子标记的开发，分子标记辅助选择技术在鸡的育种中的应用成本显著降低。因此，进一步挖掘分子水平上与鸡重要经济性状相关的候选基因，通过对其多态性的研究并建立相关分子遗传标记，可以有效推动优质鸡的育种工作。
发明内容
本发明的目的是提供一种与鸡屠体肤色性状相关的SNP分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。该分子标记可以实现方便对鸡屠体皮肤黄度性状进行早期选择，节省生产成本并加速遗传进展。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
技术方案一：一种与鸡屠体肤色性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述SNP分子标记的突变位点位于所述SEQ ID NO.1中的第175位碱基。
进一步地，所述SNP分子标记的突变位点的基因型包括CC、CG和GG。
技术方案二：一种检测所述的SNP分子标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列为如SEQ ID NO.2所示的上游引物和如SEQ ID NO.3所示的下游引物。
技术方案三：一种筛选鸡屠体肤色性状的方法，包括利用PCR技术扩增所述SNP分子标记。
进一步地，所述PCR技术扩增的反应体系为：PCR Mix 5.0μL，上下游引物各0.2μL，DNA模板1.0μL，ddH2O 3.6μL。
进一步地，所述PCR技术扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸15s，34个循环；72℃后延伸10min；4℃保存。
技术方案四：一种鸡的遗传改良的方法，包括以下步骤：先利用所述的分子标记选育出新的品系；再将所述新的品系作为种鸡，逐代提高优势等位基因型的频率；最后得到改良了鸡屠体肤色性状的鸡。
技术方案五：一种所述的分子标记或所述的引物对在鸡屠体肤色性状选育中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明的SNP分子标记，即鸡CD36基因序列中的突变位点c.3759 G>C与鸡皮肤黄度性状相关，是一个新的分子标记，能比较准确的鉴别鸡脱毛后胸部、背部及整体黄度值，提高后代皮肤颜色的均匀度；通过确定该鸡SNP位点的基因型对鸡屠体皮肤黄度性状进行早期选择，可以节省生产成本并加快遗传进展，更好地应用于鸡的育种中，具有较大的经济应用价值和科研价值；本发明公开鸡屠体皮肤黄度的鉴别方法操作简便，准确度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为SNP引物特异性检测结果；其中1-6分别为随机抽选样品，M为2000bp DNAmaker；
图2为鸡CD36基因序列中的c.3759 G>C突变位点分型的示意图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
待测鸡为90日龄的麻黄鸡纯系，数量为522只，平养的饲养方式，饲喂符合国际配方标准的玉米-豆粕型饲料。屠宰时收集血液储存于含有2%EDTA抗凝剂的1.5mL无菌离心管中，用于血液DNA提取；屠宰后脱毛，利用色差仪测定胸部，背部，肩部，腿部LAB值，每个部位重复测定3次取平均值。根据罗氏比色卡进行感官评分后，将鸡屠体放置于摄影棚中胸部朝上拍摄照片，由计算机算法计算得到鸡整体HSV值。
（1）提取待测鸡血液DNA：
所有个体的基因组DNA根据OMEGA E.Z.N.A. BRBC Blood DNA kit LotDD3571020000B06U009试剂盒说明书步骤提取血液DNA，检测质量和浓度后稀释至80ng/μL，4℃保存备用。
（2）SNP检测：
从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/找到CD36基因序列，设计出引物对，上游引物SEQ ID NO.2和下游引物SEQ ID NO.3如下所示：
SEQ ID NO.2
CTGGAACCAACACTCTGAACA。
SEQ ID NO.3
AGCGCTCCTGTTGAATCTGA。
将设计的引物对序列发往擎科生物公司合成，并用该引物对对血液DNA进行PCR扩增，测试引物的特异性，结果如图1所示。利用上述引物对扩增得到的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，SEQ ID NO.1中的第175位碱基为SNP分子标记。突变位点各基因型峰图见图2。
SEQ ID NO.1：
TTATATATGTATATATATAAGGCACTATATTTTATATATACATATTTGTGTGTGTATATATATATACACATACATTTTTTTGTGTGCCAGAACCTAATGGTGAGTTATTTTCACCAAAGGAACAACAGCAGCGCTCCTGTTGAATCTGATACACTAGCATTTAAGCTAAATTTTCTTTAGCTTGAATTCCACCATTAGCAGTTTTACATTTACTCTATCAGTGTGGCCTAGCATGATGTGGTGCTCCAGCAGCACTGATCGAGCAAGTCAAGTCCCATGATTTTGAATGTCTCAGGGCCCAATTTTGCATGCACA。
PCR扩增反应体系包括：2×Taq M5 HiPer plus taq HiFi PCR mix 5.0μL，上下游引物各0.2μL，DNA模板1.0μL，ddH2O 3.6μL。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸15s，34个循环；72℃后延伸10min；4℃保存。将获得的PCR产物送往擎科物公司测序，测序结果检测得到鸡CD36外显子14序列中的突变位点c.3759 G>C，其测序结果分析如图2所示。
（3）确定待测样品该CD36突变位点的基因型
将实施例所有待测鸡血液DNA全部进行PCR特异性扩增得到鸡CD36基因目的片段的PCR产物，用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物对进行DNA测序后，对每一个测序结果的基因型进行分析。在该实验例中成功分型522个个体，接着对各个基因型进行统计分析以得到该位点的基因型频率和等位基因频率。该SNP突变位点的基因及基因型频率统计结构如表1所示。
表1 CD36基因突变位点c.3759 G>C的基因、基因型频率及遗传多样性
（4）CD36突变位点与鸡屠体皮肤黄度性状的关联分析：
采用SPSS 22.0统计分析软件的一般线性模型（多变量）进行统计分析，以各部位屠体皮肤黄度值作为因变量，以突变位点的基因型作为固定因子，采用LSD方法进行事后多重比对。关联分析结果如表2所示。
表2 CD36基因突变位点c.3759 G>C与鸡屠体皮肤黄度性状关联分析
注：同行肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相同字母表示差异不显著。
由表2中可以得出该突变位点与鸡胸部B值、背部B值、H、S和感官评分呈显著相关（P<0.05）。B值代表物体的黄蓝色：正值表示黄色，负值表示蓝色，B值越高表示黄度越高，其中CC基因型个体胸部B值和背部B值显著高于CG基因型个体，GG基因型个体胸部B值和感官评分显著高于CG基因型个体（P<0.05）。可见该SNP位点可以作为提高鸡皮肤黄度的辅助选择和分子遗传育种标记。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种与鸡屠体肤色性状相关的SNP分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 315
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ttatatatgt atatatataa ggcactatat tttatatata catatttgtg tgtgtatata 60
tatatacaca tacatttttt tgtgtgccag aacctaatgg tgagttattt tcaccaaagg 120
aacaacagca gcgctcctgt tgaatctgat acactagcat ttaagctaaa ttttctttag 180
cttgaattcc accattagca gttttacatt tactctatca gtgtggccta gcatgatgtg 240
gtgctccagc agcactgatc gagcaagtca agtcccatga ttttgaatgt ctcagggccc 300
aattttgcat gcaca 315
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ctggaaccaa cactctgaac a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
agcgctcctg ttgaatctga 20
Claims (4)
1.一种筛选鸡屠体肤色性状的方法，其特征在于，包括利用SEQ ID NO.2所示上游和SEQID NO.3所示下游引物通过PCR技术扩增，获得扩增产物，对所述扩增产物进行测序，所述扩增产物的序列仅出现ATGCGAC的基因型的个体胸部B值和背部B值显著高于所述扩增产物的序列同时出现ATGCGAC和ATGGGAC的基因型个体，所述扩增产物的序列仅出现ATGGGAC的基因型个体胸部B值高于所述扩增产物的序列同时出现ATGCGAC和ATGGGAC的基因型个体，所述B值代表物体的黄蓝色：正值表示黄色，负值表示蓝色，B值越高表示黄度越高，所述鸡为麻黄鸡纯系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR技术扩增的反应体系为：PCR Mix5.0μL，上下游引物各0.2μL，DNA模板1.0μL，ddH2O 3.6μL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR技术扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸15s，34个循环；72℃后延伸10min；4℃保存。
4.一种检测鸡屠体肤色性状的引物对在鸡屠体肤色性状选育中的应用，其特征在于，所述引物对包括SEQ ID NO.2所示上游和SEQID NO.3所示下游引物，利用所述引物对通过PCR技术扩增，获得扩增产物，对所述扩增产物进行测序，所述扩增产物的序列仅出现ATGCGAC的基因型的个体胸部B值和背部B值显著高于所述扩增产物的序列同时出现ATGCGAC和ATGGGAC的基因型个体，所述扩增产物的序列仅出现ATGGGAC的基因型个体胸部B值高于所述扩增产物的序列同时出现ATGCGAC和ATGGGAC的基因型个体，所述B值代表物体的黄蓝色：正值表示黄色，负值表示蓝色，B值越高表示黄度越高，所述鸡为麻黄鸡纯系。
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