CN102031257A - 一种与鸡屠体性状相关的分子标记及其获取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与鸡屠体性状相关的分子标记及其获取方法和应用，本发明与鸡屠体性状相关的分子标记是位于FTO基因第9外显子G+1479A的单碱基突变。本发明分子标记是通过RT-PCR和RACE技术克隆鸡的FTO基因全长获得，FTO基因全长序列和编码区序列如SEQIDNO:1~2所示。通过与鸡屠体性状关联分析，突变型个体的90日龄的屠体重和翅重显著高于野生型个体，突变型个体的90日龄腿肌重、半净膛重和全净膛重极显著高于野生型个体。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和遗传育种领域，具体涉及一种与鸡屠体性状相关的分子标记及其获取方法和应用。
背景技术
屠体性状是动物生产中重要的经济性状，直接反映动物的产肉性能，如屠体重、半净膛中、全净膛重、胸肌腿肌重及翅重等，因此一直都是动物育种生产中研究的热点。在肉质品质的基础上，进一步提高肉鸡的屠体重和腿肌率是肉鸡选育的目标。
FTO基因（Fat Mass and Obesity Associated）是近年来通过全基因组关联分析与体重指数、肥胖及糖尿病密切相关的一个新基因。人类医学研究发现，FTO的变异导致肥胖症发生的关键因素之一，尤其是位于内含子1的rs9939609变异位点，每增加一个A突变等位基因拷贝，体重增加约1.4 kg（P=3×10-35）( TM Frayling，Genome-wide association studies provide new insights into type 2 diabetes aetiology. Nat Rev Genet 2007; 8: 657-662.; G Thorleifsson, GB Walters, DF Gudbjartsson, et al. Genome-wide association yields new sequence variants at seven loci that associate with measures of obesity. Nat Genet 2009; 41: 18-24.）。随后研究人员在遍布世界各大国的人群中对该基因变异位点进行关联分析，证实了FTO基因是影响体重和肥胖症的关键候选基因。但是对于FTO基因的功能仍然不是很清楚。FTO基因广泛表达于动物的各个组织，高表达于动物个体的脑部组织，特别是下丘脑组织。研究小鼠FTO基因的表达规律，发现FTO基因可能对能量稳态调控起主要作用（R Fredriksson, M Hagglund, PK Olszewski, et al. The obesity gene, FTO, is of ancient origin, up-regulated during food deprivation and expressed in neurons of feeding-related nuclei of the brain. Endocrinology 2008; 149: 2062-2071）。通过基因敲出手段，FTO基因受到抑制的老鼠出生后生长较慢，脂肪组织和瘦肉组织较少，出生6周之内，这些老鼠体重比其它同类轻30％至40％（J Fischer, L Koch, C Emmerling, et al. Inactivation of the Fto gene protects from obesity. Nature 2009; 458: 894-898）。可见，FTO基因对体重的影响极为显著。但是，目前在鸟类研究上，该基因的研究尚未开展。FTO基因在家禽上是否会影响其经济性状，对家禽的生长如肌肉发育、脂肪沉积会起到如何的作用？利用RT-PCR、RACE和PCR-RFLP技术研究克隆FTO基因并筛查有意义的突变位点进行关联分析，研究FTO的分子功能，以期找与重要经济性状相关的分子标记用于家禽分子辅助标记选择育种。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术的不足，提供一种与鸡屠体性状相关的分子标记。
本发明另一目的在于提供上述与鸡屠体性状相关的分子标记的获取方法。
本发明还有一个目的在于提供上述与鸡屠体性状相关的分子标记在鸡选育过程中的应。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
申请人克隆得到鸡的FTO基因全序列共2787bp，9个外显子和8个内含子。其中5’UTR序列80bp，编码区1524bp编码508个氨基酸，3’UTR序列1183bp。FTO基因全序列和编码区序列如SEQ ID NO:1~2所示。
依据所获得序列SEQ ID NO:1进行变异位点筛查，由引物F1和R1（如SEQ ID NO:3~4所示）扩增FTO基因的部分DNA序列（见序列表SEQ ID NO:5），测序发现位于Exon9区域的 G+1479A碱基突变，从而导致Ala467Val氨基酸的改变，同时造成内切酶BbvI识别位点的改变，形成酶切多态性。
本发明与鸡屠体性状相关的分子标记可用于筛选鸡屠体性状。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
利用本发明提供的分子标记对华南农业大学杏花×隐性白鸡F2资源家系进行酶切分型，结果表明：突变型个体的90日龄的屠体重和翅重显著高于野生型个体，突变型个体的90日龄腿肌重、半净膛重和全净膛重极显著高于野生型个体。尤其是一个变异拷贝的个体的屠体重比正常个体平均重45克，杂种优势明显。
附图说明
图1为本发明中FTO基因Exon9区域DNA序列的获取。
图2为本发明中G+1479A的酶切分型电泳图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例 FTO基因标记位点G+1479A的检测及应用
1、样品采集 与DNA提取
用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取1mL血液，注入高压灭菌后的1.5mL离心管中，记录翅号，加入约150μL无菌2%EDTA抗凝剂，轻轻摇匀，-20℃保存备用。
采用常规的酚/氯仿抽提方法，进行基因组DNA的提取。具体步骤如下：
1） 取60??l抗凝血置于1.5ml离心管中，分别加入470 ??l 1×SET缓冲液、12.5μL 20%SDS、6μL 0.01mg/μL 蛋白酶K，置于55℃水浴锅中消化过夜，至不见有粘稠的团块；
2）向消化好的血液中加入500??l的Tirs-饱和酚，轻摇20min，使溶液的两相充分混匀，6-8℃ 10,000rpm离心10min；
3）取上清至另一干净的离心管中，再次加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
4）取上清至另一干净的离心管中，加入500??l氯仿:异戊醇(23:1), 轻摇20min，使溶液的两相充分混匀，6-8℃ 10,000rpm离心10min；
5）转移上清至另一干净的离心管中，加入1ml无水乙醇(-20℃)来回摇摆以沉淀DNA，10,000rpm离心10min后倒出乙醇；
6）用1mL75%乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；
7）待DNA完全干燥后加入300μL灭菌后的TE溶液，50℃水浴锅中过夜以溶解DNA；
8）-20℃或-70℃长期保存DNA，使用前取出按一定比例稀释成PCR模板。
利用试剂盒检测G+1479A位点
检测试剂盒参见下表1：
表1
操作说明：
A）扩增FTO基因的DNA序列
PCR反应混合体系
PCR反应程序：94℃ 3min，33个循环(94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s)，72℃ 10min，10℃保存。
抽取部分PCR产物检测：取3μL的PCR扩增产物（可直接点样），用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并以DNA Marker 2000作为参照。
B） PCR产物酶切分型
取7-10ul的PCR产物（见A），分别加取0.8ul的Buffer和0.4ulBbvI，混匀后37℃水浴2-4h，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并以DNA Marker 2000作为参照，记录个体基因型。
3.采用SAS 8.1软件 (SAS Institute, 1996)中的GLM程序进行关联分析，其数学模型如下：
Y ijkl =μ+G i +D j +H k +e ijkl
Y ijkl 为生长性状观察值，μ为生长性状群体均数，G i 为基因型效应，D j 为家系效应，H k 为批次效应，e ijkl 为随机误差效应。
利用检测试剂盒对华南农业大学杏花×隐性白鸡F2资源家系进行酶切分型后做关联分析结果如下表所示：
G+1399A位点与屠体性状的关联分析结果
注：含不同字母的两组之间比较表示差异显著，大写字母表示差异极显著（P<0.01）小写字母表示差异显著（P<0.05）；括号内容表示不同基因型个体数。
Claims (4)
1.一种与鸡屠体性状相关的分子标记，其特征在于所述分子标记是位于FTO基因第9外显子第1479bp处的G+1479A单碱基突变，所述FTO基因全序列和编码区序列如SEQ ID NO:1~2所示。
2.权利要求1所述与鸡屠体性状相关的分子标记的获取方法，其特征在于该分子标记是通过RT-PCR和RACE技术克隆鸡的FTO基因全长获得。
3.根据权利要求2所述与鸡屠体性状相关的分子标记的获取方法，其特征在于获得所述分子标记时，所用的引物如SEQ ID NO:3~4所示。
4.权利要求1所述与鸡屠体性状相关的分子标记在筛选鸡屠体性状中的应用。
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| CN102031257B (zh) | 2013-11-13 |
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