CN104087582A - 猪脂肪沉积性状snp遗传标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于家畜遗传标记制备技术领域，具体涉及一种猪脂肪沉积性状的SNP遗传标记及应用，从猪OLR1基因中克隆获得一种作为遗传标记应用的猪脂肪沉积性状的基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1和图4所示，在图4所示序列的181bp处有一个A/G的碱基突变，该突变导致Pag Ⅰ-RFLP多态性。本发明还公开了制备猪脂肪沉积性状遗传标记的方法以及制备的遗传标记在猪脂肪沉积性状多态性检测中的应用，为猪的标记辅助选择提供了一个新的标记。

Description

猪脂肪沉积性状SNP遗传标记及应用

技术领域

本发明属于猪的分子标记制备技术领域，具体涉及一种猪脂肪沉积性状SNP遗传标记及应用，该遗传标记从猪基因OLR1中克隆获得。 

背景技术

随着分子生物学技术的发展，逐步出现了以分子标记为核心的分子标记辅助选择和分子标记渗入等分子育种技术，这些技术与常规育种技术相结合大大加速了猪育种的进程。分子标记辅助选择可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种，是基因工程在现代家畜育种中的一项重要应用，通过分子标记的方法，不仅能缩短育种时限，大大减少育种的人力物力消耗；另外，分子标记的多样性更使得分子标记在动物育种中的应用潜力大大提高(鲁绍熊,吴常信.,2000)。用于辅助选择的分子标记包括蛋白质标记，微卫星标记，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，简称SNP)标记等。 

SNP标记指由基因组单核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、单碱基插入或缺失等，被公认为是最新的第三代DNA分子标记。其数量多，多态性丰富。其检测方法包括PCR-SSCP、PCR-RFLP、测序及SNP芯片等。限制性内切酶片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)是根据不同品种(个体)基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过琼脂糖电泳进行检测，从而可比较不同品种(个体)的DNA水平的差异(即多态性)(BeuzenN.D.,et al.2000)。 

氧化型低密度脂蛋白受体1(oxidized low-density lipoprotein receptor1,OLR1)是一类可以结合氧化低密度脂蛋白(oxLDL)的受体。Sawamura等(1997)首次在牛内皮细胞上发现了OLR1基因，并成功克隆了人内皮细胞OLR1基因，随后相继克隆了大鼠、小鼠及兔子等OLR1基因的cDNA序列(Miki et al.,1998；Kume et al.,1998)。这几个物种中OLR1基因的编码氨基酸序列比较相似。猪OLR1基因有5个内含子和6个外显子，编码274个氨基酸，与人OLR1基因有79％的相似性，与牛的相似性最高，达到84％(Yamanaka et al.,1998；Ming et al.,2001)。OLR1基因被广泛认为与心血管疾病的形成密切相关，此外在脂肪代谢过程中发挥着重要的作用。Patricia等(2005)首次在脂肪细胞中研究OLR1的作用，证明OLR1在PPARγ和其相 关抗糖尿病配体的参与下，在调控脂代谢，从而潜在地调节胰岛素抵抗方面发挥着重要作用。Juwon A等(2007)研究证明胞外信号调节激酶(ERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路是OLR1在脂肪细胞中发挥作用的重要作用通路。孙超等(2009)研究表明OLR1基因在小鼠前体脂肪细胞分化过程中通过P38MAPK通路发挥作用，对抑制脂肪细胞增殖有一定的作用。李托(2013)在秦川牛群体中分析OLR1基因遗传多态性与肉质性状的相关性，发现在g.10497位点存在C>A突变，CC纯合基因型与秦川牛眼肌面积和眼肌深度有显著相关性。目前，OLR1基因的研究主要集中在人、小鼠、大鼠和牛等物种，对猪OLR1基因的研究报道较少，申请人对该基因在猪中进行了多态性研究和关联分析，为猪的遗传改良提供了重要的理论依据。 

发明内容

本发明的目的在于获得与脂肪沉积性状相关的SNP分子标记及应用。从猪OLR1基因克隆得到一个特异的DNA片段，寻找SNP位点，并建立相应的SNP检测方法，分析其与猪脂肪沉积性状的关系，为猪的标记辅助选择提供一种新的分子标记。 

本发明通过下列技术方案实现： 

申请人通过对猪OLR1基因的分离克隆，发现了一种与猪脂肪沉积性状相关的SNP分子标记，其核苷酸序列如下所示： 

TCCTCGGTGGAAGAGCATTTGTTCGAGATGCAGAGTAGGTACCTGTTTTTTAGTCTGGCCTGGCCACTGATTACATGCATGTCCTTGGATGGACAGGGTATGGTGGGTCTCTAGGCTCCAGCAGGCATGTCTATAAAACCATCCAGAAGATGGCAAAGATCCCTTTGGTTCTGTGGCTTCr(A/G)TGAATCTAATCTAAGATGTTCACATCAACTCTTTGATCAATTCAGAAATGTTCCTCCCTACAGGAATTCATCCAGCAAACCATCGCCCATTCCAGTTTCCCATTCTGGATGGGGTTATCTCTGAGGAAACCCAACAACTCATGGCTCTGGGAGGACGGTACTCCTTTGATGCCCCACTTGTAAGTTTCCTATTCTTTTCCTAATCTGCTGGTGAAGTTACTGCCGCATTCCGCAGAGTGTCCTCTTCCTGCTGGAAAGAACCCTGGGAAATTTCTGAATCTCTCTCCTCAGCCCTCTCATGCAGAGGCTTGCCCCTTGACTCATTCAGACCTTCTCTTGAGTTTTCCTTCTTACATTTATTACTGATTTGAAGCTTTAAGACAAGGCCAAGTGCCTGACCCAAGGTAG 

上述序列中的第181bp处的R是A或G，该突变导致Pag I-RFLP多态性。 

申请人设计了扩增上述猪OLR1基因片段的引物对(该引物对也是检测本发明的分子标记的引物对)，其DNA序列如下所示： 

正向引物：5’TCCTCGGTGGAAGAGCAT3’，与SEQ ID NO：4所示的序列对应。 

反向引物：5’CTACCTTGGGTCAGGCAC3’；与SEQ ID NO：5所述的序列对应。 

本发明建立了一种筛选与猪脂肪沉积性状相关的分子标记的方法，其具体步骤如下： 

提取猪基因组DNA，根据NCBI中公布的猪OLR1基因序列信息，设计PCR扩增引物对(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示)，用该引物对进行PCR 扩增，得到589bp的扩增片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1(其第181bp处的r是A或G，或参见图4，其中：该序列中的r显示碱基突变位置，即181bp处的R是A或G)、SEQ ID NO：2(梅山猪：其第181bp处突变的碱基是A)和SEQ ID NO：3(大白猪：其第181bp处的突变的碱基是G)所示，该突变导致Pag I-RFLP多态性，进而对所获得的PCR产物酶切分型，进行基因型与猪脂肪沉积性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供一个新的分子标记。 

本发明的分子标记可以应用于猪脂肪沉积性状检测中。 

相应地，本发明设计的引物对也可应用于脂肪沉积状检测中。 

更详细的技术方案如《具体实施方式》所述。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明制备的遗传标记的核苷酸序列。序列长度为589bp，其中在该序列的第181bp处显示的“r”为等位基因突变，即存在一个A/G替换。该突变导致导致Pag I-RFLP多态性。 

序列表SEQ ID NO：2是克隆的中国地方猪品种“梅山猪”的部分核苷酸序列。序列长度为589bp，其中在该序列的第181bp处存在一个等位基因突变，即碱基A。 

序列表SEQ ID NO：3是克隆的国外猪种“大白猪”的部分核苷酸序列。序列长度为589bp，其中在该序列的第181bp处存在一个等位基因突变，即碱基G。 

序列表SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5是本发明设计的引物对的核苷酸序列。 

图1：分别是大白猪、长白猪、梅山猪和清平猪OLR1序列比对结果，图中加粗的英文字母代表SNP位点。 

图2：是猪OLR1基因第4内含子的扩增结果。 

琼脂糖浓度为1.5％；图中标记说明：泳道M：DL2000Marker；泳道1－4分别为大白猪、长白猪、梅山猪和清平猪中的扩增片段，片段大小为589bp。 

图3：猪OLR1基因Pag I-RFLP检测结果。 

琼脂糖浓度为1.5％；图中标记说明：泳道M为DL2000Marker；GG基因型，589bp；AG基因型，589bp，179bp，410bp；AA基因型，179bp，410bp。 

图4：是本发明克隆的猪OLR1基因第4内含子的核苷酸序列，其中第181bp处的r是A或G突变，该突变导致Pag I-RFLP多态性。 

具体实施方式

实施例1猪OLR1基因片段的获得及多态性检测方法的建立 

本发明的试验猪品种为大白猪、长白猪(为国外血缘猪品种)、梅山猪和清平猪(为中国地方猪血缘品种)，样品均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎与分子育种湖北省重点实验室提供，为常用品种。 

猪基因组DNA的提取： 

采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下所述： 

(1)采集20-50mg猪的耳组织，用眼科手术剪剪成糊状后放入2ml的离心管中，加入200μl裂解液TL，用枪头吹打均匀。 

(2)加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)，剧烈颠倒充分混匀，55℃水浴锅中消化过夜。 

(3)加入200μl结合液CB(该试剂盒自带)，充分颠倒混匀，70℃放置10min。 

(4)冷却后加入100μl异丙醇，剧烈颠倒充分混匀。 

(5)用1mL的枪头吸取上述混合物，加入吸附柱AC中，10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。 

(6)加入500uL抑制物去除液IR(该试剂盒自带)，12000rpm离心30s，弃废液。 

(7)加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，倒掉废液。 

(8)重复操作步骤7。 

(9)将吸附柱AC放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量去除漂洗液，以免残留的乙醇抑制下游反应。 

(10)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置3-5min，12000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中。 

(11)对提取出的DNA的浓度及质量进行检测后置于-20℃下保存备用。 

根据OLR1基因的基因组序列(GenBank登陆号：NC_010447.4，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010447.4)设计以下引物对： 

正向引物：5’TCCTCGGTGGAAGAGCAT3’，其序列与SEQ ID NO：4对应； 

反向引物：5’CTACCTTGGGTCAGGCAC3’；其序列与SEQ ID NO：4对应。 

利用上述引物在大白猪、长白猪、梅山猪和清平猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系25μL，体系中各组分的浓度为100ng模板DNA、1×Taq buffer2.5mmol/L、MgCl₂1.5mmol/L、dNTPs2.5mmol/L、上述正反向引物各0.5mmol/L、1U TaqDNA聚合酶，PCR的运行程序如下：预变性94℃4min；然后94℃30s，58℃40s，72℃50s，34个循环；最后72℃继续延伸10min。 

对上述四个猪品种的PCR产物经Gel Extraction Kit试剂盒(购自上海生工生物工程技术有限公司，按照试剂盒说明书操作)纯化、克隆测序(测序委托上海生工生物工程技术有限公司进行)，得到片段的大小为589bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2(梅山猪)和SEQ ID NO：3(大白猪)所示。经ClusterW软件进行序列比对，发现其中位于该片段181bp处(第4内含子246bp处)A/G变异引起了Pag Ⅰ酶切位点(T↓CATGA)多态性改变。 

取5.5μL PCR产物加入限制性内切酶0.5μL(10U/μL),10×buffer1μL,ddH₂O3μL,置37℃恒温反应过夜，后经1.5％的琼脂糖凝胶凝胶电泳分析，在凝胶成像系统观察并记录酶切分型结果。当181bp处的碱基都为G时Pag Ⅰ不识别该位点，记为GG型(589bp)，当突变位点碱基 都为A时Pag Ⅰ酶识别该位点，记为AA型(179bp+410bp)，当G和A都存在时记为AG型(589bp+179bp+410bp)。猪OLR1基因的PCR-Pag Ⅰ-RFLP的酶切分型结果如图3。 

实施例2本发明的分子标记在不同猪群中的多态性分布检测验证 

在两个中国地方猪品种(梅山猪、清平猪)和两个国外猪品种(大白猪、长白猪)检测猪OLR1基因第4内含子区PCR-Pag Ⅰ-RFLP多态性分布频率，检测结果如表1所示。在大白猪、长白猪中G等位基因频率较高，在梅山猪、清平猪中，AA基因频率占优势，A等位基因的频率较高，说明国外血缘的猪品种和中国地方猪品种中存在显著的差异。如表1. 

表1  OLR1基因第4内含子区Pag Ⅰ酶切多态在不同品种中的分布结果 

实施例3本发明克隆的分子标记与猪生产性状的关联分析及应用 

为了确定猪OLR1基因多态性与猪脂肪沉积性状是否相关，选择331头大白×梅山F2代(杂交方法为本领域常用方法，血样委托华中农业大学猪遗传育种农业部重点实验室采集)资源群体为试验材料，采用实施例1所建立的Pag Ⅰ-RFLP方法进行多态性检测，采用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version8.0)GLM程序进行单标记方差分析，分析猪OLR1基因Pag Ⅰ-RFLP不同基因型与猪脂肪沉积性状的相关关系，所采用模型为： 

模型Y_ijk＝μ+G_i+S_j+Y_k(+b_ijkX_ijk)+e_ijk

Yij为性状表型值，μ为平均值，G_i为基因型效应，S_j、Y_k为固定效应，分别为性别、年度效应，b_ijk为屠宰体重或屠宰日龄的回归系数，胴体性状以屠宰体重为协变量，肉质性状以屠宰日龄为协变量，e_ijk为残差效应。 

由表2可以看出：对胴体脂肪沉积性状来说，Pag I-RFLP基因型不同时，板油重、6-7腰椎间膘厚等性状存在显著差异(P<0.05)，并且加性效应显著；胸腰椎间膘厚、平均背膘厚等性状存在极显著差异(P<0.01)，并且加性效应极显著。G等位基因具有显著降低背膘厚等脂肪沉积性状的遗传效应。 

表2  猪OLR1基因PCR-Pag Ⅰ-RFLP基因型与脂肪性状的统计分析表 

注：(1)、以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；基因型效应*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。 

主要参考文献 

Juwon A,Matthew K,Franklin,et al.Linoleic acid regulates the expression of oxidized low density lipoprotein receptor(OLR1)in3T3-L1adipocytes via ERK and JNK pathways[J].FASEB Journal,2007,21(5):A455APR 

Patricia C,Hong-Ping Guan,Michael L.PPARy regulates adipocyte cholesterol metabolism via oxidized LDL receptorl.Clin Invest,2005,115(8):2244-2256. 

Sawamura T,Kume N,Aoyama T,et al.An endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein[J].Nature1997,386:73-77. 

李托.秦川牛OLR1基因多态性与肉质性状的关联分析及与bta-miR-370相互作用的研究[D].西北农林科技大学,2013年。 

孙超,刘春伟.脂肪酸对小鼠前体脂肪细胞增殖分化及OLR1基因转录表达的作用[J].西北农林科技大学学报,2009,37(3):1-6。 

序列表

Claims (5)

1.一种猪脂肪沉积性状SNP遗传标记，其核苷酸序列如下所示：

TCCTCGGTGGAAGAGCATTTGTTCGAGATGCAGAGTAGGTACCTGTTTTTTAGTCTGGCCTGGCCACTGATTACATGCATGTCCTTGGATGGACAGGGTATGGTGGGTCTCTAGGCTCCAGCAGGCATGTCTATAAAACCATCCAGAAGATGGCAAAGATCCCTTTGGTTCTGTGGCTTCr(A或G)TGAATCTAATCTAAGATGTTCACATCAACTCTTTGATCAATTCAGAAATGTTCCTCCCTACAGGAATTCATCCAGCAAACCATCGCCCATTCCAGTTTCCCATTCTGGATGGGGTTATCTCTGAGGAAACCCAACAACTCATGGCTCTGGGAGGACGGTACTCCTTTGATGCCCCACTTGTAAGTTTCCTATTCTTTTCCTAATCTGCTGGTGAAGTTACTGCCGCATTCCGCAGAGTGTCCTCTTCCTGCTGGAAAGAACCCTGGGAAATTTCTGAATCTCTCTCCTCAGCCCTCTCATGCAGAGGCTTGCCCCTTGACTCATTCAGACCTTCTCTTGAGTTTTCCTTCTTACATTTATTACTGATTTGAAGCTTTAAGACAAGGCCAAGTGCCTGACCCAAGGTAG

上述序列中的第181bp处的r是A或G，导致Pag I-RFLP多态性。

2.扩增如权利要求1所述遗传标记的引物对，其DNA序列如下所示：

正向引物：TCCTCGGTGGAAGAGCAT，

反向引物：CTACCTTGGGTCAGGCAC。

3.一种制备猪脂肪沉积性状SNP遗传标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：

从猪耳组织中提取基因组DNA，根据猪OLR1基因序列设计引物，其DNA序列如序列表SEQ ID NO：4和5所示，用序列表SEQ ID NO：4和5所示的引物对在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR产物纯化、克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4.权利要求1所述的遗传标记在猪脂肪沉积性状检测中的应用。

5.权利要求2所述的引物对在猪脂肪沉积性状检测中的应用。