CN116814801B - 与鸡皮肤黄度相关的LncEDCH1基因分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与鸡皮肤黄度相关的LncEDCH1基因分子标记及其应用，属于分子标记技术领域。所述LncEDCH1基因分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过分析LncEDCH1基因，发现该基因有多个SNP位点，通过对SNP位点进行基因分型并与皮肤黄度关联分析，筛选出了3个与胸部黄度值、腹部黄度值、肩部黄度值和腿部黄度值等肤色性状显著相关的SNP位点，上述3个SNP位点可以准确鉴定鸡肤色性状，为分子标记辅助选择育种提供新的分子标记。

Description

与鸡皮肤黄度相关的LncEDCH1基因分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子标记领域，特别是涉及与鸡皮肤黄度相关的LncEDCH1基因分子标记及其应用。
背景技术
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指基因组中单个碱基发生变异而引起遗传多样性的现象。这种变异通常发生在基因组的多个位置，并且可能会影响基因功能和表达。具有稳定遗传，易于检测等特性。在动物生产实践中，SNP可用于分子标记辅助选择(Molecular Mark-assist Selection，MAS)从而大大缩短选育周期、提高选育效率、减少遗传缺陷和增加育种精度等。因此，它已经被广泛应用于鸡育种实践中，成为现代鸡育种的重要手段之一。
麻黄鸡的肤色的黄度是一个非常重要的品质特征，因为它不仅反映了鸡品种的纯正度和养殖质量的好坏，也直接影响着消费者的选择。而影响皮肤黄度的因素众多，包括遗传因素、饲料成分、环境温度等等，因此找关键的调节基因可以为麻黄鸡育种工作提供更为可靠的理论依据和技术支持。
在鸡肤色的形成过程中，多个基因以及LncRNA等非编码RNA参与了调控，长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200nt，具有低序列保守性和低蛋白编码潜力的调控性非编码RNA，广泛存在于生物体基因组中。研究发现，LncRNA可通过多种作用方式、多层次调控编码基因的表达，广泛参与动物骨骼肌生长发育多个过程的遗传调控。LncEDCH1为EDCH1基因的正向转录物，LncEDCH1可调节成肌细胞的增殖和分化。细胞增殖和分化过程中会对酪氨酸酶和叶黄素的合成和代谢产生影响，进而影响皮肤的黄度。然而，目前仍没有LncEDCH1基因与禽类肤色性状相关的SNP分子标记相关的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种与鸡皮肤黄度相关的LncEDCH1基因分子标记及应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明发现LncEDCH1基因序列有多个SNP位点，并将其与鸡的肤色性状关联分析，为分子标记辅助选择提供新的SNP分子标记。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种与鸡皮肤黄度相关的LncEDCH1基因分子标记，所述LncEDCH1基因分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述LncEDCH1基因分子标记的649bp处存在SNP1位点，所述SNP6位点为C/T突变，所述核苷酸的820bp处存在SNP2位点，所述SNP2位点为T/C突变，所述核苷酸的823bp处存在SNP3位点，所述SNP3位点为G/A突变。
进一步地，所述SNP1位点的基因型包括CC、CT和TT基因型；所述SNP2位点的基因型包括CC、CT和TT基因型；所述SNP3位点的基因型包括AA、AG和GG基因型。
本发明还提供一种扩增所述的LncEDCH1基因分子标记的引物对，包括如SEQ IDNO.2序列所示的上游引物和如SEQ ID NO.3序列所示的下游引物。
本发明还提供一种鉴别鸡皮肤黄度性状的试剂盒，包括所述的引物对。
本发明还提供一种所述的LncEDCH1基因分子标记、所述的引物对或所述的试剂盒在鉴别鸡皮肤黄度性状中的应用。
本发明还提供一种鉴别鸡皮肤黄度性状的方法，包括以下步骤：
(1)以待测鸡基因组DNA为模板，利用所述的引物对进行PCR扩增，获取扩增产物；
(2)对所述扩增产物测序，检测所述的SNP位点的基因型，根据检测的基因型判断鸡肤色性状；
其中，在SNP1中，CT基因型个体的胸部、腿部和腹部肤色黄度值均高于CC和TT基因型；
在SNP2中，CT基因型个体的胸部肤色黄度值均高于CC和TT基因型；
在SNP3中，AG基因型个体的胸部和腿部肤色黄度值均高于AA和GG基因型。
进一步地，所述PCR扩增的扩增体系为：模板DNA2μL、2×Es Taq MasterMix 25μL、上游引物2μL、下游引物2μL和ddH2O 19μL；扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃最终延伸3min；4℃保存。
进一步地，所述皮肤黄度性状包括胸部黄度、腹部黄度、肩部黄度和腿部黄度。
本发明还提供一种所述LncEDCH1基因分子标记、所述的引物对或所述的试剂盒在鸡育种中的应用。
进一步地，所述鸡为麻黄鸡。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过分析LncEDCH1基因，发现该基因有多个与鸡皮肤黄度性状显著相关的SNP位点，为分子标记辅助选择提供新的SNP分子标记，并且通过试验验证：NC_052556.1:g.1704079，C>T位点与腹部色和腿色存在显著相关(p<0.05)，与胸色存在极显著相关(p<0.01)；NC_052556.1:g.1704250，T>C位点与胸色存在显著相关(p<0.05)；NC_052556.1:g.1704253，G>A位点与胸色和腿色存在显著相关(p<0.05)。
可见，本发明发现的3个SNP位点均和鸡肤色性状相关，并且可以准确的鉴定鸡肤色性状，从而为鸡的选育提供科学依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为LncEDCH1引物配对位置及产物长度示意图；
图2为LncEDCH1基因序列SNP位点基因型分型图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1、材料与方法
1.1动物样品
试验动物为450只80日龄麻黄鸡，有表型记录的麻黄鸡有409只。通过采集皮下静脉血液2mL，-80℃保存，用作DNA提取样本。同时记录选择群体的胸部黄度值、腹部黄度值、肩部黄度值、臀部黄度值、腿部黄度值、胫部黄度值和腹脂黄度值等肤色性状。
1.2主要试剂
血样DNA提取试剂盒(品牌：OMEGA；货号：D3392；广州飞扬生物工程有限公司)、2×Es Taq MasterMix(Dye)(品牌：康为；货号：CW0690M；康为世纪生物科技股份有限公司)、DNAmarker(品牌：诺维赞；货号：MD101；江苏诺维赞生物科技股份有限公司)、高纯度低电渗琼脂糖(品牌：擎科；货号：TSJ001；北京擎科生物科技有限公司)。
1.3实验方法
1.3.1引物设计
根据NCBI公布的LncEDCH1基因(NC_052556.1)的全长序列，使用NCBI的Primer-BLAST工具设计引物，由广州擎科生物科技有限公司提供引物合成服务。引物序列相关信息如表1所示，引物在LncEDCH1基因上的配对位置如图1所示。
表1PCR扩增引物序列
1.3.2血样DNA提取
参照血样DNA提取试剂盒操作手册提取血样DNA。
1.3.3LncEDCH1基因部分序列的PCR扩增
分别以上述409个个体血样基因组DNA作为模板，遵循以下反应体系进行：模板DNA2μL、2×Es Taq MasterMix(Dye)25μL、LncEDCH1-F 2μL、LncEDCH1-R 2μL、ddH2O 19μL。
反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃最终延伸3min；4℃保存。PCR产物交由广州擎科生物科技有限公司进行Sanger测序。
1.3.4SNP确定与基因分型
利用通过DNAstar软件的SeqMan工具对PCR产物的Sanger测序结果进行序列峰图的分析以确定潜在SNP位点，并通过该工具比对每个样本的测序数据，进行基因分型。
1.3.5基因型与皮肤黄度性状关联分析
SNP位点与基因型对应个体的皮肤黄度性状数据，在SPSS统计软件中，使用混合线性模型进行关联分析。
2结果
2.1LncEDCH1基因序列PCR扩增及SNP筛选
选取409只80日龄麻黄鸡个体，以每个个体的血样DNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)进行Sanger测序，将测序后的峰图进行比对分析，共检测到16个SNP位点，其中3个位点与鸡肤色性状关联，分别为：
NC_052556.1:g.1704079，C>T；
NC_052556.1:g.1704250，T>C；
NC_052556.1:g.1704253，G>A，如图2所示。
SEQ ID NO.1:
GACCGTCGTTTGGAGTGCACAACGTGTCCACCTTTCTTGAGTTTATTACTTGGTCTCCACGACGTGGGACTATAGCGTATCGGGAGGTCGACGAGACTCACGACCACCTCTTCGTGGCGTCGACCATTCGCTACTCGTGACTCCTACTCCAGCCACGTACCTCGTCCCACCGTAGGTCCCCGACATCTCGACACACGTGCCGACCGACGACGACGATCTTGAACCCCGTGCCACCACCGTCCAACGTCCGACGTAACCACAAGACTCCCGTCCAGACGTGGCCACCCCCTATCGTGACGCACCCGTGTGTCATCCAGACACGACCTCCCGACGTACCACAGTGCGTCCGCATGTACCCACGCCCCTGCAAGACCGACGACCTTACCGTCCTCCCGGGGCTCAGTAACGTCCGTACCCTCGACACCGTCCTCCCTAAGACCGACACCGTCCTGAGCGACCTTGGGTAGAGAAGGCTCGCAGTCGTTTCGACGTGCCTGTTTCTCTACCGAGACCACTCTCCTCTGGGACCACGTGAAGAGTAGGTGGGAGTGAGGGAGAGAAGAGAGAGAAGTTGTAACAAGAAATAGGGGGGGGGGGGTGACTTGAGAAAGAAAGACGCAGAAGGGTTAGGTAGGGTTTATGGGGGAGCTATATGGGGGAGCTATATGGGTGAGAGACTCAAAAGAAACAGGTAAGGTCGTACTCGTCTGGGTGTCCGGTTGCGTTCCTCGGGGCGGTCGGAGAGGGGTTTGGGTAAAGGGTGGGTAGTGGGACTACGTCGTGTGCCTCGAGGGCAATCGTCACATGGGAAGGGGTCGGTGGGGGTAGGGGCGACAGGATACGGGTGAAGACCCTGAGGTAGTGGAGACCCGTCCTCGTGTTCCTCTTCGTCGGAATGGAGACGTCGTTGTTCTCCTCACAGACCCTCCCTGCCA。
注：阴影加粗标注的为与鸡皮肤黄度性状相关的3个SNP位点。
2.2LncEDCH1基因序列SNP位点与皮肤黄度性状的关联分析
对上述3个SNP位点与皮肤黄度性状(胸部黄度值、腹部黄度值、肩部黄度值、臀部黄度值、腿部黄度值、胫部黄度值和腹脂黄度值)进行关联分析，结果如表2所示。
表2鸡LncEDCH1基因的SNP与麻黄鸡皮肤黄度性状的关联结果
注：同行不同小写字母表示显著(P<0.05)，不同大写字母表示极显著(P<0.01)。
由表2可知，NC_052556.1:g.1704079，C>T位点与腹部色和腿色存在显著相关(p<0.05)，与胸色存在极显著相关(p<0.01)，其中，CT杂合基因型个体的腹部黄度显著高于TT突变纯和基因型个体(p<0.05)但CC和CT没有显著差异(p>0.05)，CC和TT没有显著差异(p>0.05)，而CT杂合基因型个体的胸部黄度极显著高于CC野生纯和基因型个体(p<0.01)，但CC和TT没有显著差异，CT和TT没有显著差异(p>0.05)，而CT杂和基因型个体的腿部黄度显著高于CC野生纯和基因型个体(p<0.05)，但CC和TT没有显著差异(p>0.05)，CT和TT没有显著差异(p>0.05)。
NC_052556.1:g.1704250，T>C位点与胸色存在显著相关(p<0.05)，其中，CT杂合基因型个体的胸部黄度显著高于TT突变纯和基因型个体(p<0.05)，但CC和CT没有显著差异(p>0.05)，CC和TT没有显著差异(p>0.05)。
NC_052556.1:g.1704253，G>A位点与胸色和腿色存在显著相关(p<0.05)，其中，AG杂合基因型个体的胸部黄度显著高于GG突变纯和基因型个体(p<0.05)，但AA和AG没有显著差异(p>0.05)，AA和GG没有显著差异(p>0.05)；而AG杂合基因型个体和GG突变纯和基因型个体的腿部黄度显著高于AA野生纯和基因型个体(p<0.05)，但AG和GG没有显著差异(p>0.05)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (3)

1.一种与鸡皮肤黄度相关的LncEDCH1基因分子标记，其特征在于，所述LncEDCH1基因分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述LncEDCH1基因分子标记的649bp处存在SNP1位点，所述SNP1位点为C/T突变，所述核苷酸的820bp处存在SNP2位点，所述SNP2位点为T/C突变，所述核苷酸的823bp处存在SNP3位点，所述SNP3位点为G/A突变；
所述皮肤黄度为胸部、腹部和腿部皮肤的黄度；
所述鸡为麻黄鸡；
所述SNP1位点与腹部、腿部和胸部皮肤的黄度相关；所述SNP2位点与胸部皮肤的黄度相关；所述SNP3位点与胸部和腿部皮肤的黄度相关；
所述SNP1位点的基因型包括CC、CT和TT基因型；所述SNP2位点的基因型包括CC、CT和TT基因型；所述SNP3位点的基因型包括AA、AG和GG基因型。
2.一种鉴别鸡皮肤黄度性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待测鸡基因组DNA为模板，利用检测权利要求1所述的分子标记的引物对进行PCR扩增，获取扩增产物；所述引物对包括如SEQ ID NO.2序列所示的上游引物和如SEQ IDNO.3序列所示的下游引物；
(2)对所述扩增产物测序，检测权利要求1中所述的SNP位点的基因型，根据检测的基因型判断鸡肤色性状；
其中，在SNP1中，CT基因型个体的胸部、腿部和腹部肤色黄度值均高于CC和TT基因型；
在SNP2中，CT基因型个体的胸部肤色黄度值均高于CC和TT基因型；
在SNP3中，AG基因型个体的胸部和腿部肤色黄度值均高于AA和GG基因型；
所述皮肤黄度性状为胸部黄度、腹部黄度和腿部黄度；
所述鸡为麻黄鸡。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的扩增体系为：模板DNA 2μL、2×Es Taq MasterMix 25μL、上游引物2μL、下游引物2μL和ddH2O 19μL；扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃最终延伸3min；4℃保存。
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