CN115820876A - 一种判定鸡羽色的分子标记组合及其在育种中的应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物育种技术领域，涉及一种鸡羽色相关分子标记组合、引物及判定羽色、培育和/或生产特定羽色鸡的方法和应用。本发明提供了一种鸡羽色相关分子标记组合，所述鸡羽色相关分子标记包括MC1R基因、PMEL17基因、SLC45A2基因、TYR基因和SOX10基因。本发明解决了现有的仅用单一标记进行分子育种不具有广泛适用性的问题，依据本发明所列各种基因的组合模式，可以快速有效的培育目标羽色的鸡配套系。

Description

一种判定鸡羽色的分子标记组合及其在育种中的应用方法

技术领域

本发明属于生物育种技术领域，具体涉及一种鸡羽色相关分子标记组合、引物及判定羽色、培育和/或生产特定羽色鸡的方法和应用。

背景技术

鸡的生产性能不受羽色性状影响，但是人们更偏好于有色羽的鸡。同时鸡的羽色便于识别，可以作为育种的遗传标记。羽色伴性基因可用于羽色自别雌雄的家禽配套系培育，因此对于国内优质鸡的育种，家鸡羽色性状是一个重要选择指标，具有重要的经济价值。

由于鸡的羽色性状受众多基因的控制，因此在家禽育种工作中需要解决的难题之一就是羽色选择。但是随着现代生物技术的进步以及在分子生物学和细胞生物学等层面对羽毛色素沉着性状的广泛研究，已经发现许多羽色相关的基因和致因突变位点。包括黑素扩散位点(E)编码基因——黑素皮质激素受体1基因(MelanocortinReceptor 1，MC1R)、显性白基因座(I)编码基因——前黑素小体蛋白17基因(Premelanosome protein 17，PMEL17)、隐性白基因座(c)编码基因——酪氨酸酶基因(TYRosinase，TYR)、深褐色基因座(DB)编码基因——性别决定区Y框蛋白10基因(SRY(sex determiningregionY)-box 10，SOX10)等。迄今为止，已发现的羽色相关基因变异包括氨基酸序列的插入缺失突变；氨基酸序列的错义突变；碱基插入或缺失导致的移码突变；基因非编码区变异；外源序列插入导致的可变剪接变异。总之，羽色形成是一个复杂且精细的过程，受到众多基因和多条信号通路的精确调控。应用上述遗传变异的分子育种方法，经常用于鸡特定羽色的配套系培育。但以往技术往往只关注单个遗传变异在配套系培育中的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸡羽色相关分子标记组合、引物及判定羽色、培育和/或生产特定羽色鸡的方法和应用。本发明解决了现有的仅用单一标记进行分子育种不具有广泛适用性的问题，依据本发明所列各种基因的组合模式，可以快速有效的培育目标羽色的鸡配套系。

本发明提供了一种鸡羽色相关分子标记组合，所述鸡羽色相关分子标记包括MC1R基因、PMEL17基因、SLC45A2基因、TYR基因和SOX10基因。

本发明还提供了检测鸡羽色相关分子标记的试剂在培育和/或生产特定羽色的鸡及鸡配套系或判断鸡羽色中的应用，所述鸡羽色相关分子标记包括MC1R基因、PMEL17基因、SLC45A2基因、TYR基因和SOX10基因。

优选的是，所述培育和/或生产的过程中，鸡的亲本包括白来航鸡。

优选的是，所述试剂包括引物；所述引物包括检测MC1R基因的引物MC1R-F和MC1R-R、检测PMEL17基因的引物PMEL17-F²和PMEL17-R²、检测SLC45A2基因的引物SLC45A2-ex4F和SLC45A2-ex4R、检测TYR基因的引物TYR-F1、TYR-R和TYR-F2、以及检测SOX10基因的引物SOX10-1F、SOX10-1R和SOX10-6R；

所述MC1R-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MC1R-R的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；所述PMEL17-F²的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述PMEL17-R²的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述SLC45A2-ex4F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述SLC45A2-ex4R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述TYR-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述TYR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述TYR-F2的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；所述SOX10-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述SOX10-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述SOX10-6R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明还提供了一组检测鸡羽色相关分子标记的引物，所述引物包括检测MC1R基因的引物MC1R-F和MC1R-R、检测PMEL17基因的引物PMEL17-F²和PMEL17-R²、检测SLC45A2基因的引物SLC45A2-ex4F和SLC45A2-ex4R、检测TYR基因的引物TYR-F1、TYR-R和TYR-F2、以及检测SOX10基因的引物SOX10-1F、SOX10-1R和SOX10-6R；

所述MC1R-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MC1R-R的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；所述PMEL17-F²的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述PMEL17-R²的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述SLC45A2-ex4F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述SLC45A2-ex4R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述TYR-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述TYR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述TYR-F2的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；所述SOX10-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述SOX10-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述SOX10-6R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明还提供了一种判断鸡羽色的方法，包括以下步骤：

利用上述技术方案所述引物分别PCR扩增MC1R基因、PMEL17基因、SLC45A2基因、TYR基因和SOX10基因，根据PCR扩增产物的大小和各基因的基因型，按照下表的判断方法，对鸡羽色进行判断：

。

优选的是，PCR扩增MC1R基因的反应体系每50μL包括：

PCR SuperMix(+dye)25μL、MC1R-F 1μL、MC1R-R 1μL、基因组DNA 6.25μL和ddH₂O 16.75μL；

PCR扩增PMEL17基因的反应体系每20μL包括：2×Taq PCR Mix 10μL、PMEL17-F²0.3μL、PMEL17-R²0.3μL、基因组DNA 1μL和ddH₂O 8.4μL；

PCR扩增SLC45A2基因的反应体系每50μL包括：

PCR SuperMix(+dye)25μL、SLC45A2-ex4F 1μL、SLC45A2-ex4R 1μL、基因组DNA 6.25μL和ddH₂O 16.75μL；

PCR扩增TYR基因的反应体系每20μL包括：

PCR SuperMix(+dye)10μL、TYR-F1或TYR-F 0.4μL、TYR-R 0.4μL、基因组DNA2.5μL和ddH₂O 6.7μL；

和PCR扩增SOX10基因的反应体系每20μL包括：

PCR SuperMix(+dye)10μL、SOX10-1F 0.4μL、SOX10-1R或SOX10-6R 0.4μL、基因组DNA2.5μL和ddH₂O 6.7μL。

优选的是，PCR扩增MC1R基因的反应条件包括：98℃，2min；98℃，10s，60℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，5min；

PCR扩增PMEL17基因的反应条件包括：95℃，5min；95℃，30s，67℃，30s，72℃，30s，34个循环；72℃，7min；

PCR扩增SLC45A2基因的反应条件包括：94℃，5min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，15s，35个循环；72℃，10min；

PCR扩增TYR基因的反应条件包括：TYR-F1/TYR-R：95℃，3min；95℃，30s，62℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，5min或TYR-F2/TYR-R：95℃，3min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，5min；

和PCR扩增SOX10基因的反应条件包括：94℃，5min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min。

本发明还提供了一种培育和/或生产特定羽色杂交后代鸡的方法，包括以下步骤：

确定杂交后代的目标羽色，根据上述技术方案所述方法中鸡不同羽色对应的基因遗传变异组合模式，推断出亲本特定遗传变异的基因型，按照所述亲本特定遗传变异的基因型对鸡亲本进行提纯，利用提纯后的鸡亲本杂交，得到特定羽色杂交后代鸡。

优选的是，所述亲本特定遗传变异的基因型组合生产特定羽色杂交后代鸡的配套模式如下表所示：

；其中，DB*N/DB*N表示纯合野生型；DB*DB/DB*DB代表深褐色纯合型；DB*DB/DB*N代表深褐色杂合型。

本发明提供了一种鸡羽色相关分子标记组合。利用本发明的分子标记组合，能够实现鸡羽色的判断，并且能够实现特定羽色鸡的培育和生产。用白来航鸡与其它有色羽鸡(红羽或黑羽)杂交，是培育蛋鸡配套系的常用方法。但其后代羽毛颜色并不固定，会出现白羽、红羽、红白相间、白羽黑斑等不同羽色表型。本发明提供了一种鸡羽色相关分子标记组合，列出了特定羽色后代对应的5个基因的基因型，以及可用的所有杂交组合模式。能为羽色相关的配套系培育提供实用的分子育种方法。本发明通过检测父本与母本鸡MC1R、PMEL17、SLC45A2、TYR和SOX10基因的遗传变异组合，可以快速判断后代羽色，也可以以杂交后代目标羽色来确定亲本各基因应具备怎样的基因型，通过将上述基因的特定遗传变异在亲本中提纯，可以培育产生特定羽色的配套系，即育种者可根据杂交后代的目标羽色对应的基因变异组合，对亲本鸡各基因的基因型进行纯化选择，从而培育出符合预期的蛋鸡配套系。本发明提供了杂交后代中上述不同基因遗传变异组合对应的羽色。现有技术专注于单个基因遗传变异对羽色的影响，而忽略基因间的互作，往往在一个杂交配套组合模式中适用的单一标记，在其它类似杂交组合中不再适用，原因就是未理清各基因的遗传变异组合模式(互作)对羽色的决定作用。本发明解决了现有的仅用单一标记进行分子育种不具有广泛适用性的问题，依据本发明所列各种基因的组合模式，可以快速有效的培育目标羽色的鸡配套系。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的MC1R基因PCR产物凝胶电泳图。

图2为本发明提供的MC1R基因PCR产物一代测序峰图；

图3为本发明提供的PMEL17基因插入突变的检测结果图；

图4为本发明提供的SLC45A2基因PCR产物凝胶电泳图；

图5为本发明提供的SLC45A2基因PCR产物一代测序峰图；

图6为本发明提供的鸡群SOX10基因8.3kb缺失突变的检测结果图；

图7为本发明提供的鸡群TYR基因7.7kb插入突变的检测结果图；

图8为本发明提供的杂交后代公鸡(白羽)和母鸡(红羽)的MC1R、SLC45A2、PMEL17、TYR、SOX10基因的基因分型情况图；

图9为本发明提供的杂交后代母鸡(白羽)的MC1R、SLC45A2、PMEL17、TYR、SOX10基因的基因分型情况图；

图10为本发明提供的红白相间羽色及白羽鸡的MC1R、SLC45A2、PMEL17、TYR、SOX10基因的基因分型情况图。

具体实施方式

本发明提供了一种鸡羽色相关分子标记组合，所述鸡羽色相关分子标记包括MC1R基因、PMEL17基因、SLC45A2基因、TYR基因和SOX10基因。本发明上述分子标记组合与鸡羽色相关，所述MC1R基因第427位发生或不发生A/G单核苷酸突变；所述PMEL17基因第10外显子上存在或不存在9bp的插入突变；所述SLC45A2基因第4外显子上1111位发生或不发生C/A单核苷酸突变；所述TYR基因第4内含子上存在或不存在7.7kb插入序列；所述SOX10基因转录起始位点上游14kb处存在或不存在8.3kb基因组DNA缺失。通过对上述突变进行检测，能够实现鸡羽色的判断，或指导特定羽色鸡及配套系的生产。

本发明提供了检测鸡羽色相关分子标记的试剂在培育和/或生产特定羽色的鸡及鸡配套系或判断鸡羽色中的应用，所述鸡羽色相关分子标记包括MC1R基因、PMEL17基因、SLC45A2基因、TYR基因和SOX10基因。本发明所述分子标记包括MC1R基因、PMEL17基因、SLC45A2基因、TYR基因和SOX10基因；本发明通过检测所述MC1R基因第427位是否发生A/G单核苷酸突变；所述PMEL17基因第10外显子上不存在或存在9bp的插入突变；所述SLC45A2基因第4外显子上1111位是否发生C/A单核苷酸突变；所述TYR基因第4内含子上不存在或存在7.7kb插入序列；所述SOX10基因转录起始位点上游14kb处不存在或存在8.3kb基因组DNA缺失，即可实现鸡羽色的判断，或指导特定羽色鸡及配套系的生产。在本发明中，所述培育和/或生产的过程中，鸡的亲本优选包括白来航鸡。

银羽(silver，S)基因位于性染色体Z上，是一个伴性羽色基因位点。该位点包含银羽等位基因(S)、野生型金羽(gold，s)等位基因和性连锁不完全白化(sex-linkedimperfect albinism，sal)等位基因，其中银羽基因相对于另外两个等位基因是显性的。鸡群的银羽等位基因(S*S)与影响蛋白跨膜区7的SLC45A2基因第4外显子1111C>A(Leu347Met)转换相关。因为公鸡的染色体组成为ZZ，所以其银羽基因型为纯合或杂合；而母鸡的染色体组成为ZW，所以其为银羽半合子或金羽半合子。SLC45A2基因C/A等位基因在不同组别的鸡中的分布包括金羽纯合型CC(Z^sZ^s，Z^sW)，银羽纯合型AA(Z^SZ^S，Z^SW)，银羽杂合型CA(Z^SZ^s)。

鸡中控制羽色的黑素扩散位点(Extension，E)编码MC1R基因，且E/MC1R位于11号染色体上，已知鸡的MC1R基因是无内含子的单外显子基因，编码314个氨基酸，编码的蛋白质具有七个跨膜结构域。MC1R是G蛋白偶联受体家族最小的成员，其在黑色素生成过程中起到关键作用。研究发现家禽羽色表型主要受MC1R位点的不同等位基因调节，鸡不同的MC1R基因型对应不同的羽色。MC1R基因存在427A>G突变，包括GG纯合型；GA杂合型，以及AA纯合型。

鸡的PMEL17基因，被认为是鸡显性非红羽性状的候选基因，即I，显性白基因(I)，其相对于野生型等位基因(i)是不完全显性的。Kerje等人对红色原鸡和白来航杂交群体进行连锁分析，结果显示显性白性状是由于PMEL17基因第10外显子9bp的插入突变导致的，该插入使PMEL17基因的跨膜域增加3个氨基酸。本发明群体中非显性白纯合基因型表示为ii；显性白纯合基因型为II；显性白杂合基因型为Ii。

隐性白羽基因座(C)上除野生型等位基因，还包括突变的隐性白羽等位基因(C^c)和常染色体白化等位基因(C^A)。白洛克鸡和丝羽乌骨鸡等多个鸡品种携带隐性白羽基因。C^A位点纯合个体显示部分白化，隐性白纯合子个体显示白羽表型。研究发现C基因座位的编码基因是酪氨酸酶(TYR)基因。鸡TYR基因定位于1号染色体。鸡TYR基因的第四内含子上存在插入突变，即插入了一段完整的禽类白血病的7.7kb序列。本发明群体中隐性白羽纯合型表示为C*C/C*C；纯合野生型为C*N/C*N；杂合野生型为C*N/C*C。

深褐色基因位点(Darkbrown，DB)定位于鸡的1号常染色体上。鸡的深褐色基因座(DB)可以降低翅膀特定位置羽毛真黑色素的表达，加强褐黑色素的表达。在深褐色基因位点上存在一对等位基因，分别是野生型(DB*N)和深褐色型(DB*DB)。Gunnarsson等人研究发现，SOX10基因转录起始位点上游14kb处8.3kb基因组DNA缺失是导致鸡出现深褐羽表型的突变原因。本发明群体中深褐色纯合型表示为DB*DB/DB*DB；纯合野生型为DB*N/DB*N；深褐色杂合型为DB*DB/DB*N。

本发明通过检测父本与母本鸡MC1R、PMEL17、SLC45A2、TYR和SOX10基因的遗传变异组合，可以快速判断后代羽色，也可以以杂交后代目标羽色来确定亲本各基因应具备怎样的基因型，通过将上述基因的特定遗传变异在亲本中提纯，可以培育产生特定羽色的配套系。

在本发明中，所述试剂包括引物；所述引物包括检测MC1R基因的引物MC1R-F和MC1R-R、检测PMEL17基因的引物PMEL17-F²和PMEL17-R²、检测SLC45A2基因的引物SLC45A2-ex4F和SLC45A2-ex4R、检测TYR基因的引物TYR-F1、TYR-R和TYR-F2、以及检测SOX10基因的引物SOX10-1F、SOX10-1R和SOX10-6R；

所述MC1R-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MC1R-R的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；所述PMEL17-F²的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述PMEL17-R²的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述SLC45A2-ex4F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述SLC45A2-ex4R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述TYR-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述TYR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述TYR-F2的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；所述SOX10-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述SOX10-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述SOX10-6R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明还提供了一组检测鸡羽色相关分子标记的引物，所述引物包括检测MC1R基因的引物MC1R-F和MC1R-R、检测PMEL17基因的引物PMEL17-F²和PMEL17-R²、检测SLC45A2基因的引物SLC45A2-ex4F和SLC45A2-ex4R、检测TYR基因的引物TYR-F1、TYR-R和TYR-F2、以及检测SOX10基因的引物SOX10-1F、SOX10-1R和SOX10-6R；

所述MC1R-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MC1R-R的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；所述PMEL17-F²的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述PMEL17-R²的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述SLC45A2-ex4F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述SLC45A2-ex4R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述TYR-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述TYR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述TYR-F2的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；所述SOX10-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述SOX10-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述SOX10-6R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明还提供了一种判断鸡羽色的方法，包括以下步骤：

利用上述技术方案所述引物分别PCR扩增MC1R基因、PMEL17基因、SLC45A2基因、TYR基因和SOX10基因，根据PCR扩增产物的大小和各基因的基因型，按照下表的判断方法，对鸡羽色进行判断：

；其中，DB*N/DB*N表示纯合野生型；DB*DB/DB*DB代表深褐色纯合型；DB*DB/DB*N代表深褐色杂合型。

在本发明中，所述判断方法中，鸡的亲本优选包括白来航鸡。

在本发明中，上述判断方法优选为：不存在银羽基因(S)和隐性白纯合基因(cc)，同时深褐色基因(SOX10)的基因型为纯合野生型(DB*N/DB*N)，当MC1R基因突变为GG型时，无论显性白基因(I)存在与否，表现为红羽表型；而当MC1R基因427位点为GA/AA型时，在显性白基因的作用下导致出现白羽表型，没有显性白基因的作用则表现出黑羽表型；

不存在银羽基因(S)和隐性白纯合基因(cc)，同时深褐色基因(SOX10)的基因型为深褐色杂合型(DB*DB/DB*N)，当MC1R基因427位点为GA型时，有显性白基因(I)的作用下出现红白相间羽色表型；

当I和S同时存在时，不管MC1R基因427位点为GG型或是GA/AA型，均表现为白羽表型；

当存在cc(隐性白)，不管MC1R基因427位点为GG型或是GA/AA型，均为白羽表型；

公鸡染色体组成为ZZ，母鸡为ZW。

以MC1R基因为例，已有的检测方法可以通过选择白来航鸡MC1R基因的427位点为GG，使得其与洛岛红等红羽鸡杂交而产生红羽后代。但这一方法并非适用所有白来航与洛岛红品系的杂交。原因是现有技术未考虑其它基因如SOX10、PMEL17、SLC45A2等的基因型。本发明综合考虑了各基因的遗传变异间的互作关系，杂交后代在MC1R基因的427位点为GG的前提下，若能同时保证SOX10基因型为DB*N/DB*N(野生型纯合)、SLC45A2基因型为ss(隐形纯合)、TYR基因为CC或Cc(至少有一拷贝显性基因)，则此杂交后代才能为红羽；若其它基因不变，SOX10基因型为DB*DB/DB*N(杂合型)，则杂交后代为红白相间色；若其它基因不变，TYR基因为cc(隐形纯合)或SLC45A2基因型为SS或Ss(至少有一拷贝显性基因)，则此杂交后代为白羽。

在本发明中，PCR扩增MC1R基因的反应体系优选每50μL包括：

PCRSuperMix(+dye)25μL、MC1R-F 1μL、MC1R-R 1μL、基因组DNA 6.25μL和ddH₂O 16.75μL；

PCR扩增PMEL17基因的反应体系优选每20μL包括：2×Taq PCR Mix 10μL、PMEL17-F²0.3μL、PMEL17-R²0.3μL、基因组DNA 1μL和ddH₂O 8.4μL；

PCR扩增SLC45A2基因的反应体系优选每50μL包括：

PCR SuperMix(+dye)25μL、SLC45A2-ex4F 1μL、SLC45A2-ex4R 1μL、基因组DNA 6.25μL和ddH₂O 16.75μL；

PCR扩增TYR基因的反应体系优选每20μL包括：

PCR SuperMix(+dye)10μL、TYR-F1或TYR-F 0.4μL、TYR-R 0.4μL、基因组DNA2.5μL和ddH₂O 6.7μL；

和PCR扩增SOX10基因的反应体系优选每20μL包括：

PCR SuperMix(+dye)10μL、SOX10-1F 0.4μL、SOX10-1R或SOX10-6R 0.4μL、基因组DNA2.5μL和ddH₂O 6.7μL。

在本发明中，PCR扩增MC1R基因的反应条件优选包括：98℃，2min；98℃，10s，60℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，5min；

PCR扩增PMEL17基因的反应条件优选包括：95℃，5min；95℃，30s，67℃，30s，72℃，30s，34个循环；72℃，7min；

PCR扩增SLC45A2基因的反应条件优选包括：94℃，5min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，15s，35个循环；72℃，10min；

PCR扩增TYR基因的反应条件优选包括：TYR-F1/TYR-R：95℃，3min；95℃，30s，62℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，5min或TYR-F2/TYR-R：95℃，3min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，5min；

和PCR扩增SOX10基因的反应条件优选包括：94℃，5min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min。

本发明还提供了一种培育和/或生产特定羽色杂交后代鸡的方法，包括以下步骤：

确定杂交后代的目标羽色，根据上述技术方案所述方法中鸡不同羽色对应的基因遗传变异组合模式，推断出亲本特定遗传变异的基因型，按照所述亲本特定遗传变异的基因型对鸡亲本进行提纯，利用提纯后的鸡亲本杂交，得到特定羽色杂交后代鸡。

在本发明中，所述培育和/或生产的过程中，鸡的亲本优选包括白来航鸡。在本发明中，所述白来航鸡优选作为母本。本发明列出了特定羽色后代对应的5个基因的基因型，以及可用的所有杂交组合模式。为羽色相关的配套系培育提供实用的分子育种方法。

本发明通过不同父本与母本基因型的组合，生产具有特定基因型的杂交后代，以获得目标羽色后代。

在本发明中，所述亲本特定遗传变异的基因型组合生产特定羽色杂交后代鸡的配套模式如下表所示：

；其中，DB*N/DB*N表示纯合野生型；DB*DB/DB*DB代表深褐色纯合型；DB*DB/DB*N代表深褐色杂合型。表中其它位置的“/”，表示“或”的关系，如CC/Cc表示CC或Cc。与上述技术方案所述判断方法相比，本发明培育和/或生产特定羽色鸡的方法中，配套模式增加了不同基因型对应羽色后代所需的父本与母本基因型，可以达到配套系培育的目的。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种鸡羽色相关分子标记组合、引物及判定羽色、培育和/或生产特定羽色鸡的方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

MC1R基因、PMEL17基因、SLC45A2基因、TYR基因和SOX10基因的遗传变异的检测方法如下：

1.采集血样

首先对各鸡只进行翅下静脉采血，采用肝素锂真空抗凝管抗凝，置于-20℃冰箱，用于后续基因组DNA提取。

2.基因组DNA提取

用血液基因组DNA提取试剂盒提取上述样品的基因组DNA，具体操作如下：

(1)向缓冲液GD和漂洗液PW中加入试剂盒规定量的无水乙醇，备用；

(2)取10μL鸡的抗凝血液，加入190μL缓冲液GA后进行下面的裂解步骤；

(3)加入20μLProteinase K溶液，混匀；

(4)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置3h，这时溶液应变清亮；

(5)加人200μL无水乙醇，使用涡旋振荡器充分振荡混匀15s；

(6)将吸附柱CB3放入收集管中，将上一步所得溶液加入吸附柱中，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(已按照试剂盒规定的量加入了无水乙醇)，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(已按照试剂盒规定的量加入了无水乙醇)，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(9)重复步骤(7)；

(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干残余的漂洗液。

(11)将吸附柱CB3转入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加60μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到1.5mL离心管中。

(12)浓度测定：将DNA样品置于冰上，依次取出1μL滴加至NanoDrop2000核酸分析仪上，测定DNA浓度和纯度，若OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值在1.8～2.0，则说明DNA质量较好；

所提基因组DNA作为后续PCR扩增反应的模板。

3.基因分型

3.1.MC1R基因分型

MC1R基因引物序列如表1所示：

表1 MC1R基因引物

MC1R基因PCR反应体系如表2所示。

表2 PCR反应体系

MC1R基因PCR扩增程序为：98℃，2min；98℃，10s，60℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，5min。

引物对MC1R-F/MC1R-R扩增MC1R基因，扩增产物片段大小为846bp(MC1R基因PCR产物凝胶电泳图如图1所示)，包含红羽致因突变位点；

使用SnapGene软件查看测序结果(MC1R基因PCR产物一代测序峰图如图2所示)，根据测序结果鉴定MC1R基因各SNP位点基因型。

3.2.PMEL17基因分型

PMEL17基因引物序列如表3所示：

表3 PMEL17基因引物

PMEL17基因PCR反应体系如表4所示。

表4 PCR反应体系

PMEL17基因PCR扩增程序为：95℃，5min；95℃，30s，67℃，30s，72℃，30s，34个循环；72℃，7min。

对PMEL17目的片段的PCR扩增产物进行RFLP酶切：取10μLPCR反应产物，加入2μL10×NEBuffer(内切酶配套)、0.5μL内切酶BsrB I、1μL浓度为2.5mM的MgCl₂水溶液，然后加超纯水至20μL，充分混匀后短暂离心，放于37℃恒温箱内4h。PMEL17基因酶切反应体系如表5所示。

表5 RFLP酶切反应体系

反应完后将酶切产物在3％琼脂糖凝胶，1×TAE中电泳，100V电泳1.5h，最后采用凝胶成像系统鉴定显性白基因型。

判型依据如下：当待测鸡基因组DNA的PMEL17基因序列的第10外显子上不存在9bp插入突变时，扩增目的片段长度为219bp；而当存在9bp插入突变时，扩增目的片段长度为228bp。对于显性白羽鸡，由于9bp插入突变，在DNA序列上形成了BsrB I的识别序列，其可将228bp的序列切割成186bp和42bp的片段。由于琼脂糖凝胶检测效率问题，42bp条带可能因为长度太小而在凝胶图上显示不出，因此，在凝胶电泳图上显性白纯合II基因型个体显示一条186bp条带；显性白杂合Ii基因型个体显示219bp和186bp两条条带；非显性白纯合ii基因型个体显示一条219bp条带(PMEL17基因插入突变的检测结果图如图3所示；其中，A：M：Marker；1-4：PMEL17基因经BsrB I内切酶酶切后显示一条186bp条带，为显性白纯合基因型II；5：PMEL17基因经BsrB I内切酶酶切后显示一条219bp条带，为非显性白纯合基因型ii。B：M：Marker；1-6：PMEL17基因经BsrB I内切酶酶切后显示219bp和186bp两条带，为显性白杂合基因型Ii)。

3.3.SLC45A2基因分型

SLC45A2基因引物序列如表6所示：

表6 SLC45A2基因引物

SLC45A2基因PCR反应体系如表7所示。

表7 PCR反应体系

SLC45A2基因PCR扩增程序为：94℃，5min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，15s，35个循环；72℃，10min。

引物对SLC45A2-ex4F/SLC45A2-ex4R扩增SLC45A2基因第4外显子上104bp的片段，目的片段同样包含一个SNP突变位点：1111C>A。

使用SnapGene软件查看测序结果，根据测序结果鉴定金银羽基因型。对鸡群SLC45A2基因第4外显子进行一代测序分析，如SLC45A2基因第4外显子1111位置(包括C/A等位基因)只出现C单碱基峰为C纯合型，即公鸡为金羽基因纯合子Z^sZ^s，母鸡为金羽基因半合子Z^sW；只出现A单碱基峰为A纯合型，即公鸡为银羽基因纯合子Z^SZ^S，母鸡为银羽基因半合子(Z^SW)；出现C和A双碱基峰，即公鸡为金羽基因杂合子Z^SZ^s。图4为SLC45A2基因PCR产物凝胶电泳图。图5为SLC45A2基因PCR产物一代测序峰图。

3.4.SOX10基因分型

SOX10基因引物序列如表8所示：

表8 SOX10基因引物

SOX10基因PCR反应体系如表9所示。

表9 PCR反应体系

SOX10基因PCR扩增程序为(1F/1R；1F/6R)：94℃，5min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min。

引物SOX10-1F和SOX10-6R均位于8.3kb缺失区外，而SOX10-1R位于8.3kb缺失区内，如果SOX10-1F和SOX10-1R扩增有611bp目的条带，而SOX10-1F和SOX10-6R无扩增产物，为野生型纯合子(基因型为DB*N/DB*N)；若SOX10-1F和SOX10-6R有1257bp扩增产物，而SOX10-1F和SOX10-1R无扩增产物，为深褐型纯合子(基因型为DB*DB/DB*DB)；若611和1257bp两个目的片段都有，则是深褐型杂合子(基因型为DB*DB/DB*N)。

图6为鸡群SOX10基因8.3kb缺失突变的检测结果图；其中，1-12和13-24为12个样品分别用SOX10-1F与SOX10-1R和SOX10-1F与SOX10-6R的PCR扩增结果。

3.5.TYR基因分型

TYR基因引物序列如表10所示：

表10 TYR基因引物

TYR基因PCR反应体系如表11所示。

表11 PCR反应体系

TYR基因PCR扩增程序为：

F1/R：95℃，3min；95℃，30s，62℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，5min。

F2/R：95℃，3min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，5min。

下游引物TYR-R位于TYR基因外显子5上，上游引物TYR-F1和TYR-F2分别位于7.7kb插入区内和TYR基因内含子4上。只有引物TYR-F1和TYR-R的345bp PCR扩增片段，而无TYR-F2和TYR-R的目的条带，则为隐性白羽纯合子(基因型为cc)；若只有引物TYR-F2和TYR-R的481bp的扩增产物，而无TYR-F1和TYR-R的目的条带，则为野生型纯合子(基因型为CC)；若扩增产物345bp和481bp两个片段同时存在，则是隐性白羽杂合子(基因型为Cc)。

图7为鸡群TYR基因7.7kb插入突变的检测结果图，其中，1-12和13-24为12个样品分别用TYR-F1与TYR-R和TYR-F2与TYR-R的PCR扩增结果。

掌握上述基因遗传变异检测方法后，可以用亲本鸡只基因组DNA为模板，进行遗传变异检测，只留符合目标基因型的个体留做种用，进行品系提纯。应用提纯后的亲本品种，可用于配套系培育和生产。

实施例2

红羽杂交后代的培育

父本洛岛红：GG ii Z^sZ^s CC(DB*N/DB*N)母本白来航：GG II Z^SW CC(DB*N/DB*N)

通过上述分子试验手段进行基因分型，不断选育纯化MC1R基因427位点、显性白基因(PMEL17)、银羽基因(SLC45A2)、隐性白基因(TYR)以及深褐色基因(SOX10)，使得父本洛岛红和母本白来航MC1R基因427位点均为GG纯合型，同时父本洛岛红为非显性白纯合基因型ii，母本白来航为显性白纯合基因型II；父本洛岛红为金羽纯合型Z^sZ^s，母本白来航为银羽纯合型Z^SW；并且父本洛岛红和母本白来航隐性白和深褐色基因都是纯合野生型。

将GG II Z^SW CC(DB*N/DB*N)基因型白来航鸡母鸡与GG ii Z^sZ^s CC(DB*N/DB*N)基因型洛岛红公鸡进行杂交配套，后代母鸡均为红羽，公雏均为非红羽，培育产生红羽的配套系。两者杂交得到的后代公鸡基因型为GG Ii Z^SZ^s CC(DB*N/DB*N)，表现为白羽表型；后代母鸡基因型为GG Ii Z^sW CC(DB*N/DB*N)，表现为红羽表型。符合预期。

图8为杂交后代公鸡(白羽)和母鸡(红羽)的MC1R、SLC45A2、PMEL17、TYR、SOX10基因的基因分型情况图。

实施例3

白羽杂交后代的培育；

父本洛岛红：GG ii Z^sZ^sCC(DB*N/DB*N)母本白来航：AAII Z^SW CC(DB*N/DB*N)

同样通过上述分子试验手段进行基因分型，不断选育纯化MC1R基因427位点、显性白基因(PMEL17)、银羽基因(SLC45A2)、隐性白基因(TYR)以及深褐色基因(SOX10)，使得父本洛岛红和母本白来航MC1R基因427位点分别为GG纯合型和AA纯合型，同时父本洛岛红为非显性白纯合基因型ii，母本白来航为显性白纯合基因型II；父本洛岛红为金羽纯合型Z^sZ^s，母本白来航为银羽纯合型Z^SW；并且父本洛岛红和母本白来航隐性白和深褐色基因都是纯合野生型。

将AAII Z^SW CC(DB*N/DB*N)基因型白来航鸡母鸡与GG ii Z^sZ^sCC(DB*N/DB*N)基因型洛岛红公鸡进行杂交配套，后代公母雏均为非红羽，培育产生白羽的配套系。两者杂交得到的后代公鸡基因型为GAIi Z^SZ^s CC(DB*N/DB*N)，表现为白羽表型；后代母鸡基因型为GAIi Z^sW CC(DB*N/DB*N)，表现为白羽表型。符合预期。

图9为杂交后代母鸡(白羽)的MC1R、SLC45A2、PMEL17、TYR、SOX10基因的基因分型情况图。

红白相间羽色的培育

父本洛岛红：GG ii Z^sZ^s CC(DB*N/DB*N)母本白来航：AAII Z^SW CC(DB*DB/DB*DB)

同样通过上述分子试验手段进行基因分型，不断选育纯化MC1R基因427位点、显性白基因(PMEL17)、银羽基因(SLC45A2)、隐性白基因(TYR)以及深褐色基因(SOX10)，使得父本洛岛红和母本白来航MC1R基因427位点分别为GG纯合型和AA纯合型，同时父本洛岛红为非显性白纯合基因型ii，母本白来航为显性白纯合基因型II；父本洛岛红为金羽纯合型Z^sZ^s，母本白来航为银羽纯合型Z^SW；并且父本洛岛红和母本白来航隐性白基因都是纯合野生型。但是父本洛岛红公鸡的深褐色基因型为纯合野生型：DB*N/DB*N，而母本白来航母鸡的深褐色基因型为深褐色纯合型：DB*DB/DB*DB。

将AA II Z^SW CC(DB*DB/DB*DB)基因型白来航鸡母鸡与GG ii Z^sZ^s CC(DB*N/DB*N)基因型洛岛红公鸡进行杂交配套，后代母鸡均为红白相间羽色，公雏均为非红羽，培育产生红白相间羽色的配套系。两者杂交得到的后代公鸡基因型为GAIi Z^SZ^s CC(DB*DB/DB*N)，表现为白羽表型；后代母鸡基因型为GA Ii Z^sW CC(DB*DB/DB*N)，表现为红白相间羽色。符合预期(见图10，红白相间羽色及白羽鸡的MC1R、SLC45A2、PMEL17、TYR、SOX10基因的基因分型情况图)。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种鸡羽色相关分子标记组合，其特征在于，所述鸡羽色相关分子标记包括MC1R基因、PMEL17基因、SLC45A2基因、TYR基因和SOX10基因。

2.检测鸡羽色相关分子标记的试剂在培育和/或生产特定羽色的鸡及鸡配套系或判断鸡羽色中的应用，其特征在于，所述鸡羽色相关分子标记包括MC1R基因、PMEL17基因、SLC45A2基因、TYR基因和SOX10基因。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述培育和/或生产的过程中，鸡的亲本包括白来航鸡。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括引物；所述引物包括检测MC1R基因的引物MC1R-F和MC1R-R、检测PMEL17基因的引物PMEL17-F²和PMEL17-R²、检测SLC45A2基因的引物SLC45A2-ex4F和SLC45A2-ex4R、检测TYR基因的引物TYR-F1、TYR-R和TYR-F2、以及检测SOX10基因的引物SOX10-1F、SOX10-1R和SOX10-6R；

所述MC1R-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MC1R-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述PMEL17-F²的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述PMEL17-R²的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述SLC45A2-ex4F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述SLC45A2-ex4R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述TYR-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述TYR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述TYR-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述SOX10-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述SOX10-1R的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，所述SOX10-6R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

5.一组检测鸡羽色相关分子标记的引物，其特征在于，所述引物包括检测MC1R基因的引物MC1R-F和MC1R-R、检测PMEL17基因的引物PMEL17-F²和PMEL17-R²、检测SLC45A2基因的引物SLC45A2-ex4F和SLC45A2-ex4R、检测TYR基因的引物TYR-F1、TYR-R和TYR-F2、以及检测SOX10基因的引物SOX10-1F、SOX10-1R和SOX10-6R；

所述MC1R-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MC1R-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述PMEL17-F²的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述PMEL17-R²的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述SLC45A2-ex4F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述SLC45A2-ex4R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述TYR-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述TYR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述TYR-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述SOX10-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述SOX10-1R的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，所述SOX10-6R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

6.一种判断鸡羽色的方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用权利要求5所述引物分别PCR扩增MC1R基因、PMEL17基因、SLC45A2基因、TYR基因和SOX10基因，根据PCR扩增产物的大小和各基因的基因型，按照下表的判断方法，对鸡羽色进行判断：

。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR扩增MC1R基因的反应体系每50μL包括：2×

PCR SuperMix(+dye)25μL、MC1R-F 1μL、MC1R-R 1μL、基因组DNA 6.25μL和ddH₂O 16.75μL；

PCR扩增PMEL17基因的反应体系每20μL包括：2×Taq PCR Mix 10μL、PMEL17-F²0.3μL、PMEL17-R²0.3μL、基因组DNA 1μL和ddH₂O 8.4μL；

PCR扩增SLC45A2基因的反应体系每50μL包括：2×

PCR SuperMix(+dye)25μL、SLC45A2-ex4F 1μL、SLC45A2-ex4R 1μL、基因组DNA 6.25μL和ddH₂O 16.75μL；

PCR扩增TYR基因的反应体系每20μL包括：2×

PCR SuperMix(+dye)10μL、TYR-F1或TYR-F 0.4μL、TYR-R 0.4μL、基因组DNA2.5μL和ddH₂O 6.7μL；

和PCR扩增SOX10基因的反应体系每20μL包括：2×

PCR SuperMix(+dye)10μL、SOX10-1F 0.4μL、SOX10-1R或SOX10-6R 0.4μL、基因组DNA2.5μL和ddH₂O 6.7μL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR扩增MC1R基因的反应条件包括：98℃，2min；98℃，10s，60℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，5min；

PCR扩增PMEL17基因的反应条件包括：95℃，5min；95℃，30s，67℃，30s，72℃，30s，34个循环；72℃，7min；

PCR扩增SLC45A2基因的反应条件包括：94℃，5min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，15s，35个循环；72℃，10min；

PCR扩增TYR基因的反应条件包括：TYR-F1/TYR-R：95℃，3min；95℃，30s，62℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，5min或TYR-F2/TYR-R：95℃，3min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，5min；

和PCR扩增SOX10基因的反应条件包括：94℃，5min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min。

9.一种培育和/或生产特定羽色杂交后代鸡的方法，其特征在于，包括以下步骤：

确定杂交后代的目标羽色，根据权利要求6～8任一项所述方法中鸡不同羽色对应的基因遗传变异组合模式，推断出亲本特定遗传变异的基因型，按照所述亲本特定遗传变异的基因型对鸡亲本进行提纯，利用提纯后的鸡亲本杂交，得到特定羽色杂交后代鸡。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述亲本特定遗传变异的基因型组合生产特定羽色杂交后代鸡的配套模式如下表所示：

；

其中，DB*N/DB*N表示纯合野生型；DB*DB/DB*DB代表深褐色纯合型；DB*DB/DB*N代表深褐色杂合型。

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