CN104711339B - 一种鸡显性白羽基因的鉴定方法 - Google Patents

一种鸡显性白羽基因的鉴定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104711339B
CN104711339B CN201310682694.7A CN201310682694A CN104711339B CN 104711339 B CN104711339 B CN 104711339B CN 201310682694 A CN201310682694 A CN 201310682694A CN 104711339 B CN104711339 B CN 104711339B
Authority
CN
China
Prior art keywords
genotype
chicken
sequence
dominant white
dominant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310682694.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104711339A (zh
Inventor
邓学梅
赵妤娟
张熙悦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN201310682694.7A priority Critical patent/CN104711339B/zh
Publication of CN104711339A publication Critical patent/CN104711339A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104711339B publication Critical patent/CN104711339B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种鸡显性白羽基因的鉴定的方法。本发明提供了用于鉴定鸡显性白羽基因的引物，具体为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对。实验证明，利用本发明所提供的方法鉴定鸡显性白羽基因的基因型（II基因型或Ii基因型或ii基因型），具有如下优点：操作简单、检测快速、结果准确、毒性低、适用范围广等。本发明对于白羽鸡的育种具有重要意义，有利于在育种实践中更有效的对白羽性状进行选择，以指导鸡显性白羽性状的分子遗传标记选育。

Description

一种鸡显性白羽基因的鉴定方法
技术领域
本发明属于动物遗传育种领域，涉及一种鸡显性白羽基因的鉴定方法。
背景技术
鸡羽色表型是一类复杂的质量性状，受多种基因调控。羽色性状的相关研究较多，但相关基因功能及其突变的研究较少，目前只有少部分基因得到证实与特定羽色的形成有关。
鸡的羽色可分为白羽和有色羽。鸡的白羽又分为显性白羽和隐性白羽两类。其中，显性白羽鸡以白来航鸡为代表，隐性白羽鸡如丝羽乌骨鸡和各种隐性白鸡，有色羽鸡如寿光鸡等。
显性白羽基因是影响鸡羽色的一个主要基因座位，定位于第22连锁群（E22C19W28），该连锁群与人类第12号及小鼠第10号染色体同源，该基因编码黑素细胞特异的PMEL17蛋白。该基因在真黑素小体早期发育过程中发挥关键作用，当黑色素在成熟的黑素体中合成时，会沉积在一种腔内纤维状组织。这种纤维会螯合并聚集黑色素。这种纤维的形成是黑素体生成过程中关键的一步。有研究表明黑素细胞中条纹状纤维的形成有赖于PMEL17蛋白的裂解。Kerje等研究发现显性白羽鸡PMEL17基因序列的第10外显子上的9bp插入突变是显性白羽性状形成的主要原因，插入突变导致该蛋白跨膜区多出3个氨基酸，而使其编码的蛋白跨膜域结构发生改变，从而阻碍了黑色素的沉着，这就导致了显性白羽性状的形成。其所对应的等位基因为I，而隐性等位基因i不含该突变。对应的显性白羽鸡的基因型为I-，有色羽或隐性白羽鸡的基因型为ii。韩国首尔国立大学JIN WON CHOI等利用等位基因特异性PCR技术对白来航、韩国Ogol鸡和横斑洛克鸡的PMEL17基因的突变位点进行了检测，其中提供了两对等位基因特异性引物检测PMEL17基因的9bp突变位点，这两对引物的下游引物相同，设在突变位点之后，检测显性突变的上游引物设在突变位点附近，其中3’末端4个碱基与9bp突变位点上的碱基相配对，检测非显性突变的上游引物与检测显性突变的上游引物起始位点一致，但是3’末端4个碱基与9bp突变位点之后紧挨的4个碱基相配对，该方法在做检测时，每个样本都需要用这两对引物分别检测，综合两者结果才能准确判断样本的基因型。当样本量加大，不仅检测量翻倍，同时还会产生较多的误差，影响检测效率。刘文博等利用混合样本池法对不同鸡的PMEL17基因突变位点进行了检测，验证了在相同实验条件下，PCR产物混合样本池法的检测精度高于DNA样本混合池法。该方法利用PAGE胶直接检测9bp插入突变，能够分辨不同的基因型，但PAGE胶配制过程较琼脂糖胶复杂很多，且具有更大的毒性，其存在电泳及银染过程耗时较多，且稳定性较差、不易重复等弊端。
如上所述，显性白羽鸡PMEL17基因的突变位点只有9bp碱基的插入，突变型和非突变型基因的序列长度差异很小。目前已报道的检测显性白羽基因的方法中，不论是在PMEL17基因突变位点前后设计引物然后扩增，再通过PAGE法进行鉴别；还是通过两对等位基因特异性引物对样本的PMEL17基因突变位点进行检测，都存在耗时较长，稳定性差等问题，不适用于育种中大量样本的检测。PCR-RFLP方法是基因型检测中得到普遍公认的方法，其特点是稳定性好，可重复，适用于大规模样品检测，该方法的关键是找到或制造特异性的酶切位点。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡显性白羽基因的鉴定的方法。
本发明提供了一对用于鉴定鸡显性白羽基因的引物对。
本发明所提供的专用引物为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对。
含有所述引物对的试剂盒也属于本发明的保护范围。
为了方便检测，所述试剂盒中还含有限制性内切酶BsrB I。
在本发明的一个实施例中，所述试剂盒中含有如下组分：所述引物对、所述限制性内切酶BsrB I（NEB公司产品）、2×Taq PCR masterMix（北京汇天东方科技有限公司，产品编号HT201）、ddH2O、10×NEBuffer（与所述限制性内切酶BsrB I配套使用的缓冲液，NEB公司，产品编号#B7004S）、浓度为2.5mM的Mg2+水溶液（如MgCl2）。
所述引物对或所述试剂盒可用于鉴定或辅助鉴定待测鸡的显性白羽基因的基因型；所述显性白羽基因的基因型为如下三种中的任一种：
（a1）II基因型：显性白羽纯合（表型白羽）；
（a2）Ii基因型：显性白羽杂合（表型白羽）；
（a3）ii基因型：非显性白羽纯合（表型可为有色羽，也可为白羽）。
所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
根据所述试剂盒中含有组分的不同，所述试剂盒的制备方法具体可包括如下（c）或（d）的步骤：
（c）将所述引物对中的两条单链DNA分别单独包装；
（d）将所述引物对中的两条单链DNA和所述限制性内切酶BsrB I分别单独包装。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定鸡显性白羽基因的基因型的方法，是检测待测鸡的显性白羽基因的基因型为如下三种中的哪一种：（a1）II基因型：显性白羽纯合（表型白羽），（a2）Ii基因型：显性白羽杂合（表型白羽），（a3）ii基因型：非显性白羽纯合（表型可为有色羽，也可为白羽），可为如下（A）或（B）：
（A）具体可包括如下（A1）和（A2）的步骤：
（A1）以待测鸡的基因组DNA为模板，用所述引物对（序列3和序列4）进行PCR扩增，得到PCR产物；
（A2）用限制性内切酶BsrB I酶切步骤（A1）所得PCR产物，根据酶切结果按照如下方法确定所述待测鸡的显性白羽基因的基因型：若酶切产物为184bp和42bp的两个DNA片段，则所述待测鸡为或候选为II基因型；若酶切产物为184bp、42bp和217bp的三个DNA片段，则所述待测鸡为或候选为Ii基因型；若酶产物为217bp的一个DNA片段，则所述待测鸡为或候选为ii基因型。
（B）具体可包括如下步骤：
（B1）检测待测鸡的基因组DNA中是否含有序列表中序列1和序列2所示DNA片段；
（B2）根据步骤（B1）的检测结果按照如下方法确定所述待测鸡的显性白羽基因的基因型：若所述待测鸡的基因组DNA中含有序列2所示的DNA片段，同时不含有序列1所示的DNA片段，则所述待测鸡为或候选为II基因型；若所述待测鸡的基因组DNA中同时含有序列1和序列2所示的DNA片段，则所述待测鸡为或候选为Ii基因型；若所述待测鸡的基因组DNA中含有序列1所示的DNA片段，同时不含有序列2所示的DNA片段，则所述待测鸡为或候选为ii基因型。
在所述鉴定或辅助鉴定鸡显性白羽基因的基因型的方法中，（B）的步骤（B1）中，所述“检测待测鸡的基因组DNA中是否含有序列表中序列1和序列2所示DNA片段”的方法具体可为：以所述待测鸡的基因组DNA为模板，用所述引物对（序列3和序列4）进行PCR扩增，得到PCR产物，对PCR产物进行序列测定，若PCR产物的序列含有序列表中序列1，则所述待测鸡的基因组DNA中含有序列表中序列1所示DNA片段，若PCR产物的序列不含有序列表中序列1，则所述待测鸡的基因组DNA中不含有序列表中序列1所示DNA片段；若PCR产物的序列含有序列表中序列2，则所述待测鸡的基因组DNA中含有序列表中序列2所示DNA片段，若PCR产物的序列不含有序列表中序列2，则所述待测鸡的基因组DNA中不含有序列表中序列2所示DNA片段。
本发明的又一个目的是提供一种白羽鸡的育种方法。
本发明所提供的白羽鸡的育种方法，是以如下鸡为亲本进行育种：经以上所述鉴定或辅助鉴定鸡显性白羽基因的基因型的方法鉴定得到的II基因型的鸡。
在实际的育种工作中，加入显性白羽纯合个体（白来航个体）作为阳性对照样本，更有利于鸡显性白羽基因基因型的鉴定。
以上所有的所述待测鸡的基因组DNA均可来源于离体的鸡组织器官或血液。
以上所有的所述待测鸡均可为任意鸡，如白来航鸡、寿光鸡、隐性白鸡和/或丝羽乌骨鸡。
以上所有的所述II基因型为PMEL17基因的第10外显子具有序列表中序列2所示DNA片段的纯合体；以上所有的所述ii基因型为PMEL17基因的第10外显子具有序列表中序列1所示DNA片段的纯合体；以上所有的所述Ii基因型为它们的杂合体。
实验证明，利用本发明所提供的方法鉴定鸡显性白羽基因的基因型（II基因型或Ii基因型或ii基因型），具有如下优点：操作简单、检测快速、结果准确、重复性好、毒性低、适用范围广等。本发明对于白羽鸡的育种具有重要意义，有利于在育种实践中更有效地对白羽性状进行选择，以指导鸡显性白羽性状的分子遗传标记选育。
附图说明
图1为已知基因型的鸡显性白羽基因RFLP分型的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道1为白来航鸡（含突变纯合子）；泳道2和泳道3为丝羽乌骨鸡与白来航杂交F1代个体（含突变杂合子）；泳道4和泳道5为丝羽乌骨鸡（不含突变的纯合子）。
图2为已知基因型的鸡显性白羽基因的PCR鉴定结果。其中，泳道1和泳道2分别为丝羽乌骨鸡和隐性白鸡（不含突变的纯合子）；泳道3为丝羽乌骨鸡与白来航杂交F1代个体；泳道4为白来航鸡。
图3为已知基因型的鸡显性白羽基因RFLP分型的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道1为白来航鸡（含突变纯合子）；泳道2为丝羽乌骨鸡与白来航杂交F1代个体（含突变杂合子）；泳道3和泳道4分别为丝羽乌骨鸡和隐性白鸡（不含突变的纯合子）。
图4为16个未知待测样本以及1只隐性白鸡、1只寿光鸡和1只白来航的显性白羽基因RFLP分型检测琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为白来航鸡；泳道2为寿光鸡；泳道3为隐性白鸡；泳道4～19为16个未知待测样本。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、用于鉴定鸡显性白羽基因的基因型的试剂盒的制备及其使用方法
一、用于鉴定鸡显性白羽基因的基因型的引物对的设计
根据显性白羽鸡PMEL17基因序列的第10外显子上的9bp插入突变的上下游序列，设计如下引物对：
上游引物：5’-AACGGCAACGGCTTGGCTGTGG-3’（序列3，为序列1和序列2的第1-22位）；
下游引物：5’-CCGGTAGGTGTAGGCAGCGGTG-3’（序列4，为序列1和序列2的后22位的反向互补序列）。
当待测鸡的基因组DNA的PMEL17基因序列的第10外显子上不存在9bp插入突变时，扩增目的片段长度为217bp（序列1）；当待测鸡的基因组DNA的PMEL17基因序列的第10外显子上存在9bp插入突变时，扩增目的片段长度为226bp（序列2）。对于显性白羽鸡，由于9bp插入突变，在序列2中形成了BsrB I的识别序列，见序列2的第182-187位“CCG|CTC”（|处表示BsrB I的切割位点）。
二、用于鉴定鸡显性白羽基因的基因型的试剂盒的制备
用于鉴定鸡显性白羽基因的基因型的试剂盒，包含如下组分：
1、步骤一设计的引物对。
2、PCR反应试剂：2×Taq PCR masterMix（北京汇天东方科技有限公司，产品编号HT201），ddH2O。
3、RFLP所需试剂：10×NEBuffer（NEB公司，产品编号#B7004S）；BsrB I内切酶（NEB公司）；浓度为2.5mM的MgCl2水溶液。
三、用于鉴定鸡显性白羽基因的基因型的试剂盒的使用方法
利用步骤二制备的试剂盒鉴定待测鸡的显性白羽基因的基因型，其操作方法如下：
1、PCR扩增突变位点所在片段：
反应体系准备：在PCR反应管中加入2×Taq PCR masterMix10μl，10pmol/L上下游引物各0.3μl和40～50ng/μl DNA模板1.0μl，加超纯水至20μl，充分混匀后短暂离心。其中，DNA模板为待测鸡的基因组DNA（可来源于离体的鸡组织器官或血液）。
将PCR反应管放入PCR仪进行扩增反应：95℃变性5min；再经过34个循环，每个循环包括95℃30s、67℃30s、72℃30s；然后72℃延伸7min，最终反应产物放于4℃保存。
扩增片段的判定：取3μl反应产物在1.5%琼脂糖凝胶，1×TAE中电泳，检测扩增片段大小，以扩增产物片段是否略小于250bp（具体为217bp或者226bp），初步判定PCR扩增片段是否正确。
2、RFLP酶切：
取10μl步骤1所得PCR产物，加入2μl10×NEBuffer（内切酶配套）、0.5μl内切酶（BsrB I）、1μl浓度为2.5mM的MgCl2水溶液，然后加超纯水至20μl，充分混匀后短暂离心，放于37℃恒温箱内3～4h。将酶切产物在3%琼脂糖凝胶，1×TAE，100V电泳1.5h，用凝胶电泳成像系统显像。然后根据电泳图谱，鉴定基因型。
3、鉴定依据：
（1）II基因型（显性白羽纯合，表型为白羽）：在PMEL17基因序列的第10外显子上存在9bp插入突变，且为纯合的个体（突变纯合子），分型结果为两条带，酶切产物序列长度分别为184bp和42bp；
（2）Ii基因型（显性白羽杂合，表型为白羽）：在PMEL17基因序列的第10外显子上存在9bp插入突变，但为杂合的个体（突变杂合子），分型结果为三条带，酶切产物序列长度分别为217bp，184bp和42bp；
（3）ii基因型（非显性白羽纯合，表型可为有色羽，也可为白羽，当表型为白羽时属于隐性白羽）：在PMEL17基因序列的第10外显子上不存在9bp插入突变，分型结果为一条带，酶切产物序列长度为217bp。
4、序列测定：
根据步骤3的鉴定结果，还可进一步对步骤1所得PCR产物进行序列测定，验证结果的准确性。当待测鸡的基因组DNA的PMEL17基因序列的第10外显子上不存在9bp插入突变时，扩增目的片段为序列表中序列1所示的217bp DNA片段，对应基因i；当待测鸡的基因组DNA的PMEL17基因序列的第10外显子上存在9bp插入突变时，扩增目的片段为序列表中序列2所示的226bp DNA片段，对应基因I。
实施例2、利用实施例1制备的试剂盒鉴定鸡显性白羽基因的基因型
一、已知基因型的鸡显性白羽基因的鉴定
1、以已知基因型的如下鸡作为待测鸡：
1只白来航鸡（显性白羽纯合，II基因型，表型为白羽），2只丝羽乌骨鸡（非显性白羽纯合，ii基因型，表型为白羽，属隐性白羽），以及2只丝羽乌骨鸡与白来航鸡杂交F1代（显性白羽杂合，Ii基因型，表型为白羽）。以上各鸡的基因型已经过纯繁和杂交验证，基因型已确定。
采用实施例1制备的试剂盒，按照实施例1步骤三的方法对以上各待测鸡进行显性白羽基因的基因型鉴定，其中DNA模板来自于待测鸡的离体血样。
PCR扩增片段的电泳结果显示，各待测鸡在略小于250bp的位置均检测到目的条带，初步判定PCR扩增正确。
进一步的RFLP酶切检测结果如图1所示。从图中可以看出，泳道1所示的白来航鸡分型结果为两条带，酶切产物序列长度分别为184bp和42bp，从而判定其基因型为II型（显性白羽纯合）；泳道2和泳道3所示的丝羽乌骨鸡与白来航鸡杂交F1代个体的分型结果为三条带，酶切产物序列长度分别为217bp，184bp和42bp，从而判定其基因型为Ii型（显性白羽杂合）；泳道4和泳道5所示的丝羽乌骨鸡的分型结果均为一条带，酶切产物序列长度为217bp，从而判定其基因型均为ii型（非显性白羽纯合）。在图中，42bp的小分子条带隐约可见，而其他条带很弱的杂带均来源于反应体系中所加试剂。在实际的电泳中当产物浓度不高或电泳稍长时，42bp的小分子条带可能信号偏弱或跑出胶块以外，此时显示的是184bp条带和/或217bp条带，即II型对应一条184bp条带，ii型对应一条217bp条带，Ii型对应两条带（分别为184bp和217bp），于是我们可以只通过184bp条带和/或217bp条带来判断基因型。图示结果与预计结果一致，证明本方法准确可靠。
进一步，本发明的发明人对以上鉴定为II基因型的白来航鸡对应PCR产物进行序列测定，发现PCR产物仅为序列表中序列2所示DNA片段；对以上鉴定为Ii基因型的丝羽乌骨鸡与白来航鸡杂交F1代个体对应PCR产物进行序列测定，发现PCR产物为序列表中序列1所示DNA片段和序列2所示DNA片段的混合物；对以上鉴定为ii基因型的丝羽乌骨鸡对应的PCR产物分别进行序列测定，发现两者的PCR产物均为序列1所示DNA片段。
2、以已知基因型的如下鸡作为待测鸡：
1只白来航鸡（显性白羽纯合，II基因型，表型为白羽），1只丝羽乌骨鸡（非显性白羽纯合，ii基因型，表型为白羽，属隐性白羽），1只隐性白鸡（非显性白羽纯合，ii基因型，表型为白羽，属隐性白羽），以及1只丝羽乌骨鸡与白来航鸡杂交F1代（显性白羽杂合，Ii基因型，表型为白羽）。以上各鸡的基因型已经通过纯繁和杂交验证，基因型已确定。
采用实施例1制备的试剂盒，按照实施例1步骤三的方法对以上各待测鸡进行显性白羽基因的基因型鉴定，其中DNA模板来自于待测鸡的离体血样。
PCR扩增片段的电泳结果如图2所示，各待测鸡在略小于250bp的位置均检测到目的条带，初步判定PCR扩增正确。
进一步的RFLP酶切检测结果如图3所示。从图中可以看出，由于产物浓度不高，42bp的小分子条带信号很弱，几乎看不到。于是，可以通过184bp条带和/或217bp条带来判断样品的基因型。泳道1所示的白来航鸡分型结果理论上为两条带，酶切产物序列长度分别为184bp和42bp，实际看到的是184bp条带，从而判定其基因型为II型（显性白羽纯合）；泳道2所示的丝羽乌骨鸡与白来航鸡杂交F1代个体的分型结果理论上为三条带，酶切产物序列长度分别为217bp，184bp和42bp，实际看到的是217bp和184bp两个条带，从而判定其基因型为Ii型（显性白羽杂合）；泳道3和泳道4所示的丝羽乌骨鸡和隐性白鸡的分型结果均为一条带，酶切产物序列长度为217bp，从而判定其基因型均为ii型（非显性白羽纯合）。以上结果与与预计结果一致，证明本方法准确可靠。
进一步，本发明的发明人对以上鉴定为II基因型的白来航鸡对应PCR产物进行序列测定，发现PCR产物仅为序列表中序列2所示DNA片段；对以上鉴定为Ii基因型的丝羽乌骨鸡与白来航鸡杂交F1代个体对应PCR产物进行序列测定，发现PCR产物为序列表中序列1所示DNA片段和序列2所示DNA片段的混合物；对以上鉴定为ii基因型的丝羽乌骨鸡和隐性白鸡对应的PCR产物分别进行序列测定，发现两者的PCR产物均为序列1所示DNA片段。
三、未知基因型的鸡显性白羽基因的鉴定
以16个未知基因型的鸡作为待测鸡，同时设置已知基因型的1只隐性白鸡（非显性白羽纯合，ii基因型，表型为白羽，属隐性白羽）、1只寿光鸡（非显性白羽纯合，ii基因型，表型为有色羽）和1只白来航鸡（显性白羽纯合，II基因型，表型为白羽）作为对照。
采用实施例1制备的试剂盒，按照实施例1步骤三的方法对以上各待测鸡进行显性白羽基因的基因型鉴定，其中DNA模板来自于待测鸡的离体血样。
RFLP酶切检测结果如图4所示。理论上，显性白羽纯合个体应产生两条带，即184bp和42bp，显性白羽杂合个体应产生三条带，即217bp、184bp和42bp，非显性白羽纯合个体应产生一条带，即217bp。在实际的电泳中当产物浓度不高或电泳稍长时，42bp的小分子条带可能信号偏弱或跑出胶块以外，此时显示的是184bp条带和/或217bp条带，即II型对应一条184bp条带，ii型对应一条217bp条带，Ii型对应两条带（分别为184bp和217bp）。从图中可以看出，白来航鸡分型结果主要为184bp条带，从而判定其基因型为II型（显性白羽纯合）；隐性白鸡和寿光鸡的分型结果均为一条带，酶切产物序列长度为217bp，从而判定其基因型均为ii型（非显性白羽纯合）；16个未知待检测样本有2个个体（图4中泳道6和7）的分型结果为主要一条184bp条带，从而判定其基因型均为II型（显性白羽纯合），其余14个个体（图4中泳道4、5和8～19）的分型结果均为一条217bp条带，从而判定其基因型均为ii型（非显性白羽纯合）。
进一步，本发明的发明人对以上鉴定为II基因型的白来航鸡以及鉴定为II基因型的2个未知待测样本对应PCR产物分别进行序列测定，发现这些鸡的PCR产物均仅为序列表中序列2所示DNA片段；对以上鉴定为ii基因型的寿光鸡、隐性白鸡以及鉴定为ii基因型的14个未知待测样本对应的PCR产物分别进行序列测定，发现这些鸡的PCR产物均为序列1所示DNA片段。
以上结果，隐性白鸡、寿光鸡和白来航鸡的鉴定结果与预计结果一致，证明此次实验操作的准确可靠。本发明的发明人对16个未知基因型的待测鸡，根据提取血样时的家系记录，并追溯至原始数据进行核查，发现鉴定为显性白羽纯合子的两个个体的鸡种为白来航，其他14个鉴定为非显性白羽纯合的个体均为青脚矮小隐性白鸡。再次证实了本发明方法的准确可靠。

Claims (4)

1.试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有引物对和限制性内切酶BsrB I；所述引物对为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对。
2.权利要求1所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测鸡的显性白羽基因的基因型中的应用；所述显性白羽基因的基因型为如下三种中的任一种：
(a1)II基因型：显性白羽纯合；
(a2)Ii基因型：显性白羽杂合；
(a3)ii基因型：非显性白羽纯合。
3.权利要求1所述试剂盒的制备方法，包括将所述引物对中的两条单链DNA和所述限制性内切酶BsrB I分别单独包装。
4.鉴定或辅助鉴定鸡显性白羽基因的基因型的方法，是检测待测鸡的显性白羽基因的基因型为如下三种中的哪一种：(a1)II基因型：显性白羽纯合，(a2)Ii基因型：显性白羽杂合，(a3)ii基因型：非显性白羽纯合，其特征在于：所述方法包括如下(A1)和(A2)的步骤：
(A1)以待测鸡的基因组DNA为模板，用引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；所述引物对为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对；
(A2)用限制性内切酶BsrB I酶切步骤(A1)所得PCR产物，根据酶切结果按照如下方法确定所述待测鸡的显性白羽基因的基因型：若酶切产物为184bp和42bp的两个DNA片段，则所述待测鸡为或候选为II基因型；若酶切产物为184bp、42bp和217bp的三个DNA片段，则所述待测鸡为或候选为Ii基因型；若酶产物为217bp的一个DNA片段，则所述待测鸡为或候选为ii基因型。
CN201310682694.7A 2013-12-12 2013-12-12 一种鸡显性白羽基因的鉴定方法 Active CN104711339B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310682694.7A CN104711339B (zh) 2013-12-12 2013-12-12 一种鸡显性白羽基因的鉴定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310682694.7A CN104711339B (zh) 2013-12-12 2013-12-12 一种鸡显性白羽基因的鉴定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104711339A CN104711339A (zh) 2015-06-17
CN104711339B true CN104711339B (zh) 2017-11-03

Family

ID=53411057

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310682694.7A Active CN104711339B (zh) 2013-12-12 2013-12-12 一种鸡显性白羽基因的鉴定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104711339B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108192981B (zh) 2017-12-29 2019-08-16 北京市华都峪口禽业有限责任公司 白来航鸡红羽致因突变基因型鉴定及红羽粉壳蛋鸡配套系培育方法
CN108085400B (zh) * 2017-12-29 2019-09-10 中国农业大学 白来航鸡红羽致因突变基因型的鉴定及专用标记
CN109652558A (zh) * 2018-08-10 2019-04-19 贵州大学 一种用于鉴定香炉山鸡隐性白羽基因型的引物及其应用
CN112514846A (zh) * 2019-09-18 2021-03-19 中国农业大学 一种从显性白羽鸡中发掘、筛选和提纯有色羽鸡的方法
CN111893193A (zh) * 2020-08-12 2020-11-06 北京康普森农业科技有限公司 一种鸡显性白快速基因分型检测方法
CN116686778B (zh) * 2023-07-11 2024-04-26 南昌师范学院 一种利用快大型白羽肉鸡和隐性白羽洛克鸡培育隐性白羽品系的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101696452A (zh) * 2009-10-19 2010-04-21 华中农业大学 一种鸡隐性白羽基因的分子鉴定方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101696452A (zh) * 2009-10-19 2010-04-21 华中农业大学 一种鸡隐性白羽基因的分子鉴定方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Genotype on the Pigmentation Regulating PMEL17 Gene Affects Behavior in Chickens Raised Without Physical Contact with Conspecifics;Anna-Carin Karlsson et al;《Behav Genet》;20111231;第41卷;第312-322 *
quantitative genotyping by amplifying the polymorphic sequences of pre-malanosomal protein (PMEL17) gene using real-time polymerase chain reaction in chickens;Minematsu et al;《Br Poult Sci》;20080930;第49卷(第5期);第542-549页 *
利用混合样本池法对鸡显性白羽基因PMEL17 突变位点的检测;刘文博等;《遗传》;20120229;第32卷(第2期);第148-152页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104711339A (zh) 2015-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3741873B1 (en) Identification of white legroms red-plucking mutagenic mutant genotype in pink shell laying hens and red plucking
CN104711339B (zh) 一种鸡显性白羽基因的鉴定方法
CN106381331B (zh) 草鱼生长速度相关的snp标记及其应用
CN108220408B (zh) 一种节粮型青胫隐性白羽肉鸡新品系的选育方法
CN114686597B (zh) 一种银龙鱼性别鉴定snp分子标记及其应用
CN104962634B (zh) 用于检测鸡体尺性状的试剂盒及鸡的分子育种方法
CN110468218A (zh) 一种山羊igf2bp1基因插入/缺失标记的检测方法
CN113502335A (zh) 一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用
CN109593876A (zh) 高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组及其应用
CN111910008A (zh) 一种鸡生长发育相关的分子标记及其应用
CN107267627A (zh) 与猪生产性状相关的Six1基因分子标记的制备与应用
CN104651505B (zh) 一种鸡伴性横斑羽基因的鉴定方法
CN114606332A (zh) 用于判断西瓜果肉硬度的SNP位点、Hf-KASP1标记及其应用
CN108676899A (zh) 一种与二花脸母猪产仔性状相关的snp标记及其检测方法
CN104894289B (zh) 用于检测鸡生长性状的试剂盒及鸡的分子育种方法
CN107988385B (zh) 一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒
CN108085400B (zh) 白来航鸡红羽致因突变基因型的鉴定及专用标记
CN111575350B (zh) 南丹瑶鸡鸡蛋浓蛋白高度和蛋黄颜色关联的snp分子标记的筛选方法和用途
CN116769891A (zh) 一种快速鉴定中华鳖遗传性别的snp标记及其引物和应用
CN115820870B (zh) 一种与鸡肤色和屠体性状相关的cdk5基因分子标记及应用
CN104762373A (zh) 鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记及其应用
CN110438245B (zh) 文蛤的snp标记及其应用
CN109439764B (zh) 一种鉴定仿土鸡蛋和土鸡蛋的分子标记及应用
CN114686595B (zh) 一种用于银龙鱼性别鉴定的snp分子标记及其应用
CN105256045B (zh) 一种鉴定猪宰后24小时背最长肌pH值大小的方法及其专用引物对

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant