CN104651505B - 一种鸡伴性横斑羽基因的鉴定方法 - Google Patents

一种鸡伴性横斑羽基因的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡伴性横斑羽基因的鉴定方法。本发明提供了鉴定鸡伴性横斑羽基因基因型的引物对，其由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。本发明的实验证明了，利用本发明所提供的方法鉴定鸡伴性横斑羽基因的基因型，具有如下优点：操作简单、检测快速、结果准确、重复性好、成本低、毒性低等。本发明对于横斑羽鸡的育种具有重要意义，有利于在育种实践中更有效地对横斑羽性状进行选择，以指导鸡伴性横斑羽性状的分子遗传标记选育。

Description

一种鸡伴性横斑羽基因的鉴定方法
技术领域
本发明属于动物遗传育种领域，涉及一种鸡伴性横斑羽基因的鉴定方法。
背景技术
鸡的羽色丰富多彩，是鸡品种特征的重要组成部分，也是鸡育种工作中一项重要的内容。鸡的芦花羽也叫横斑羽，是一种黑白或深浅条纹相间的羽色，包括性连锁横斑羽和常染色体横斑羽两种类型。伴性横斑羽由于其性状规则，特点明显，伴性遗传，其获得了更多的关注和研究。伴性横斑羽的雌雄自别已经成熟地应用到了育种工作和现代商品鸡的生产中。
伴性横斑羽由Z染色体上单基因B控制，属于不完全显性遗传，具有剂量效应，成年的芦花羽毛色素沉着表型为羽毛黑白条纹相间，B基因纯合子公鸡(ZBZB)的白色横纹宽度大于杂合子个体(ZBZb)及半合子母鸡(ZBW)。刚孵化的雏鸡为黑色绒毛，头上有白色斑点，纯合子公鸡(ZBZB)头顶上的斑点要比母雏(ZBW)的斑点大。隐性纯合子个体(ZbZb或ZbW)无典型的横斑羽表型。该基因除了对羽毛颜色有影响外，还对胫色有稀释作用。
横斑羽作为一种性状，在很多家禽品种中都或多或少的有所表现。但作为研究横斑羽表型的代表性品种，应当是以此作为品种特征的鸡种，非常突出的品种就是芦花鸡。国外主要以普利茅斯横斑洛克鸡(Barred Plymouth Rock，BPR)为研究横斑羽表型的品种。我国主要的横斑羽家鸡品种是山东汶上芦花鸡。
在20世纪20年代到30年代间，研究者开始尝试解释伴性横斑羽的机制。Danforth和Foster(1929)认为这种模式可能由代谢或激素分泌的节律性差异引起的。他们在一日龄的横斑和非横斑羽鸡之间进行了皮肤移植实验，发现长出的羽毛在结构上像受体鸡，在羽毛颜色和横斑模式上像供体鸡。Montalenti(1934)观察到两个毗邻的横斑羽毛并不一定同时出现白色和黑色条带。这两项研究共同表明引起横斑羽的基因表达产物必须作用在羽毛囊。Nickerson(1944)、Bowers和Asano(1984)报道了在白色条带形成时，普利茅斯横斑洛克鸡(BPR)羽毛囊中的未成熟黑色素细胞死亡现象，这些作者都认为细胞死亡是横斑羽白色条带的形成原因。后来，Bowers(1988)提出白色条带的形成是由于羽毛囊中黑色条带的邻近边缘的黑色素细胞的自噬小体退化。Bowers(1994)等报道了来自BPR的黑色素细胞对氧化应激比来自野生型鸡种的更加敏感。
Punnet(1940)发现B基因与真皮黑色素抑制基因(Id)连锁，研究结果证明这2个位点在遗传连锁图上只有10个图距单位。Cock(1964)发现性连锁横斑羽基因由单 基因B控制，性连锁横斑羽属于不完全显性遗传，具有剂量效应，B基因纯合个体白色横纹宽度大于杂合子个体及半合子个体。Bitgood等(1980，1988)通过连锁作图把B等位基因定位在Z染色体的长臂末端，与Id基因、隐性白肤色基因(y)及Z染色体易位断裂点(Tb)位点相距不远，排列顺序由端区向着丝点依次为B-Id-Tb-y，结果表明遗传距离与是否存在易位有关。Dorshorst等(2009)进一步定位研究，结果发现B基因位于Z染色体长臂末端355kb处。等(2010)应用测序技术及基因组精细作图技术，将B基因定位到CDKN2A/B位点，提出在CDKN2A基因中与伴性横斑完全相关的12Kb的单倍型，包含INK4b及部分ARF转录本，这段单倍型里发现了2个非编码SNPs，分别在CDNK2A的启动子区域(SNP1：A→G突变)和内含子1(SNP2：C→A突变)内。此外还发现了2个错义突变，其在ARF的转录序列里，B1(V9D)和B2(R10C)。这4个位点的突变是哪一个或者哪种组合导致的横斑表型还不确定。提出的模型认为：两个错义突变是需要的，但可能并不充分引起伴性横斑羽表型。
细胞周期依赖性激酶抑制基因(cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKN2A)，是一种重要的抑癌基因，属于细胞周期依赖性激酶抑制因子基因家族，具有调节细胞增殖与凋亡的作用。CDKN2A基因又称INK4a-ARF基因，其编码p16INK4a和p14ARF蛋白分别通过RB和p53蛋白发挥作用。CDKN2A基因在诸多肿瘤中的改变，使它在肿瘤发生中的作用日益受到重视。Quelle(1995)等报道CDKN2A/B基因位点在肿瘤抑制和细胞增殖扩散过程中以ARF和INK蛋白调节细胞周期。INK4抑制细胞周期蛋白依赖性激酶D，引起在G1期的细胞周期停滞。在人类和小鼠中，ARF-p53-MDM2网络均可以调节细胞周期和G1期到S期的转变或者直接导致细胞凋亡。Kim(2003)等报道了INK4a转录本在鸡中的缺失，并猜想由其他基因来弥补肿瘤抑制功能。通过鸡INK4b和人Cdk4和Cdk6的共沉淀转染实验，表明了鸡INK4b表现出和典型的INK4b蛋白同样的功能。鸡INK4b还可以引起细胞增殖的大量抑制。
如上所述，伴性横斑羽基因被定位到CDKN2A/B位点，但是其原因突变还没有确定。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种鉴定鸡伴性横斑羽基因基因型的引物对。
本发明提供了鉴定鸡伴性横斑羽基因基因型的引物对，其由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。
本发明另一个目的是提供鉴定鸡伴性横斑羽基因基因型的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述的引物对和限制性内切酶；
所述限制性内切酶为Taal(ThermoScientific公司产品，产品编号#ER1362)或HpyCH4Ⅲ。
上述试剂盒还包括酶切缓冲液和PCR扩增缓冲液；其具体由所述引物对、所述限制性内切酶Taa、酶切缓冲液(与所述限制性内切酶Taal配套使用的缓冲液，ThermoScientific公司，产品编号#BY5)和PCR扩增缓冲液(2×Taq PCR masterMix，北京汇天东方科技有限公司，产品编号HT201)和水组成。
所述引物或所述酶均为单独包装。
上述引物或上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定鸡伴性横斑羽基因基因型中的应用也是本发明保护的范围。
上述伴性横斑羽基因基因型为BB基因型、Bb基因型或bb基因型；
所述BB基因型为ZBZB基因型或ZBW基因型，显性横斑羽纯合(表型横斑羽)；
所述Bb基因型为ZBZb基因型，显性横斑羽杂合(表型横斑羽)；
所述bb基因型为ZbZb基因型或ZbW基因型，隐性横斑羽(表型非横斑羽)。
本发明的第三个目的是提供鉴定或辅助鉴定待测鸡伴性横斑羽基因基因型的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)用上述引物对对待测鸡进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
2)将所述PCR扩增产物用限制性内切酶酶切，得到酶切产物；
3)检测酶切产物，用如下(1)-(3)中任一种鉴定或辅助鉴定鸡伴性横斑羽基因基因型：
(1)若所述酶切产物仅为大小为490-520bp的片段，则所述待测鸡的伴性横斑羽基因基因型为或候选为BB基因型；
(2)若所述酶切产物为大小为490-520bp、430-450bp和60-70bp的片段，则所述待测鸡的伴性横斑羽基因基因型为或候选为Bb基因型；
(3)若所述酶切产物为大小为430-450bp和60-70bp的片段，则所述待测鸡的伴性横斑羽基因基因型为或候选为bb基因型；
所述BB基因型为ZBZB基因型或ZBW基因型；
所述Bb基因型为ZBZb基因型；
所述bb基因型为ZbZb基因型或ZbW基因型。
上述方法中，所述根据如下(1)-(3)中任一种鉴定或辅助鉴定鸡伴性横斑羽基因基因型：
(1)若所述酶切产物仅为大小为506bp的片段，则所述待测鸡的伴性横斑羽基因基因型为或候选为BB基因型；
(2)若所述酶切产物为大小为506bp、440bp和66bp的片段，则所述待测鸡的伴性横斑羽基因基因型为或候选为Bb基因型；
(3)若所述酶切产物为大小为440bp和66bp的片段，则所述待测鸡的伴性横斑羽基因基因型为或候选为bb基因型。
上述方法中，所述检测酶切产物为电泳或测序；
所述PCR扩增产物大小为490-520bp，所述PCR扩增产物大小具体为506bp。
上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测鸡的基因组DNA；
所述PCR扩增的退火条件为62℃30s；
所述酶切温度为65℃，酶切时间为4～6h。
本发明的第三个目的是提供一种白羽鸡的育种方法。
本发明提供的方法，是以经上述方法鉴定得到的BB基因型的鸡为亲本进行育种。
以上所有的所述待测鸡的基因组DNA均可来源于离体的鸡组织器官或血液。
以上所有的所述待测鸡为任意鸡，如石岐杂鸡、寿光鸡、汶上芦花鸡、济宁百日鸡和莱芜黑鸡等。
以上所有的所述BB基因型为CDKN2A/B基因的编码区具有序列表中序列1所示DNA片段有SNP突变的纯合体；以上所有的所述bb基因型为CDKN2A/B基因的编码区具有序列表中序列1所示DNA片段没有SNP突变的纯合体；以上所有的所述Bb基因型为它们的杂合体。
实验证明，本发明从CDKN2A/B基因的一段1.2Kb的序列上筛选到的汶上芦花鸡特有的SNP突变位点，建立了针对该突变的PCR-RFLP基因分型方法，可对汶上芦花鸡伴性横斑羽基因进行分型；利用本发明所提供的方法鉴定鸡伴性横斑羽基因的基因型，具有如下优点：操作简单、检测快速、结果准确、重复性好、成本低、毒性低等。本发明对于横斑羽鸡的育种具有重要意义，有利于在育种实践中更有效地对横斑羽性状进行选择，以指导鸡伴性横斑羽性状的分子遗传标记选育。
附图说明
图1为已知基因型的鸡伴性横斑羽基因PCR-RFLP分型的琼脂糖凝胶电泳图；
其中，泳道bb、BB、Bb为三种基因型的对照；泳道1-2为石岐杂鸡(不含突变的纯合子)；泳道2-2为琅琊鸡(不含突变的纯合子)；泳道3-2为寿光鸡(不含突变的纯合子)；泳道4-3为济宁百日鸡(不含突变的纯合子)；泳道5-1和泳道5-2为汶上芦花鸡(含突变的纯合子)；泳道6-2为莱芜黑鸡(不含突变的纯合子)。
图2为已知基因型的鸡伴性横斑羽基因PCR-RFLP分型的琼脂糖凝胶电泳图；
其中，泳道bb、BB、Bb为三种基因型的对照；泳道1-8和泳道1-9为石岐杂鸡(不含突变的纯合子)；泳道2-9和泳道2-10为琅琊鸡(不含突变的纯合子)；泳道3-8和泳道3-9为寿光鸡(不含突变的纯合子)；泳道4-2和泳道4-4为济宁百日鸡(不含突变的纯合子)；泳道5-4和泳道5-10为汶上芦花鸡(含突变的纯合子)；泳道6-8和泳 道6-9为莱芜黑鸡(不含突变的纯合子)。
图3为未知基因型的鸡伴性横斑羽基因PCR-RFLP分型的琼脂糖凝胶电泳图；
其中，泳道bb、BB、Bb为三种基因型的对照；泳道1-10和泳道1-11为石岐杂鸡(不含突变的纯合子)；泳道2-11和泳道2-12为琅琊鸡(不含突变的纯合子)；泳道3-10和泳道3-11为寿光鸡(不含突变的纯合子)；泳道4-11和泳道4-12为济宁百日鸡(不含突变的纯合子)；泳道5-11和泳道5-12为汶上芦花鸡(含突变的纯合子)；泳道6-10和泳道6-11为莱芜黑鸡(不含突变的纯合子)。
图4为未知基因型的鸡伴性横斑羽基因的PCR鉴定结果；
泳道1-10和泳道1-11为石岐杂鸡(不含突变的纯合子)；泳道2-11和泳道2-12为琅琊鸡(不含突变的纯合子)；泳道3-10和泳道3-11为寿光鸡(不含突变的纯合子)；泳道4-11和泳道4-12为济宁百日鸡(不含突变的纯合子)；泳道5-11和泳道5-12为汶上芦花鸡(含突变的纯合子)；泳道6-10和泳道6-11为莱芜黑鸡(不含突变的纯合子)；泳道3-11、5-11、杂为三种基因型的对照；泳道NC.和NC.为阴性对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、用于鉴定鸡伴性横斑羽基因的基因型的试剂盒及其专用引物
一、用于鉴定鸡伴性横斑羽基因的基因型的引物对的设计
根据伴性横斑羽鸡CDKN2A/B基因序列的一段的1.2kb的参考序列上下游序列，覆盖SNP突变位点，设计如下引物对：
上游引物：5’-GAACGCATTTCCATCGCGG-3’(序列2，为序列1的第1-19位)；
下游引物：5’-AGAGATAGCCTGCCGACCA-3’(序列3，为序列1的后19位的反向互补序列)。
当待测鸡的基因组DNA的CDKN2A/B基因序列扩增目的片段长度为506bp(序列1)；在序列1中形成了Taal(HpyCH4Ⅲ)酶的识别序列，见序列1的第69-70位“ACC|GT”(|处表示Taal(HpyCH4Ⅲ)的切割位点)。
二、用于鉴定鸡伴性横斑羽基因的基因型的试剂盒，包含如下组分：
1、步骤一设计的引物对。
2、PCR反应试剂：2×Taq PCR masterMix(北京汇天东方科技有限公司，产品编号HT201)，ddH2O。
3、酶切所需试剂：10×Buffer Tango(与所述限制性内切酶Taal配套使用的缓冲液，ThermoScientific公司，产品编号#BY5)，Taal(HpyCH4Ⅲ)(ThermoScientific公司产品，产品编号#ER1362)。
三、用于鉴定鸡伴性横斑羽基因的基因型的试剂盒的使用方法
利用步骤二制备的试剂盒鉴定待测鸡的伴性横斑羽基因的基因型，其操作方法如下：
1、PCR扩增突变位点所在片段：
反应体系准备：在PCR反应管中加入2×Taq PCR masterMix 10μl，10μM上下游引物各0.5μl(终浓度为0.25μM)和40～50ng/μl DNA模板1.0μl，加超纯水至20μl，充分混匀后短暂离心。其中，DNA模板为待测鸡的基因组DNA(可来源于离体的鸡组织器官或血液)。
将PCR反应管放入PCR仪进行扩增反应：95℃变性5min；再经过30个循环，每个循环包括95℃30s、62℃30s、72℃30s；然后72℃延伸7min，最终反应产物放于4℃保存。
扩增片段的判定：取3μl反应产物在1.5％琼脂糖凝胶，1×TAE中电泳，检测扩增片段大小，以扩增产物片段是否约为500bp(具体为506bp)，初步判定PCR扩增片段是否正确，若约为500bp，则PCR扩增片段正确，反之，则不正确。
2、酶切：
取10μl步骤1所得PCR产物，加入2μl 10×Buffer Tango(与内切酶配套)、1.0μl内切酶(Taal(HpyCH4Ⅲ)在反应体系中的浓度为0.32U/ul)、然后加超纯水至31μl，充分混匀后短暂离心，放于65℃金属浴4～6h。将酶切产物在3％琼脂糖凝胶，1×TAE，120V电泳1.0h，用凝胶电泳成像系统显像。然后根据电泳图谱，鉴定基因型。
3、鉴定依据：
(1)BB基因型(包括ZBZB基因型或ZBW基因型，伴性横斑羽纯合，表型为横斑羽)：在CDKN2A/B基因序列的编码区上存在单碱基突变(T->A，在序列1第71位A)，且为纯合的个体(突变纯合子)，分型结果为一条带，酶切产物序列长度分别为506bp(经过测序)；
(2)Bb基因型(ZBZb基因型，伴性横斑羽杂合，表型为横斑羽)：在CDKN2A/B基因序列的第1内含上(序列1)存在单碱基突变(序列1第71位A)，但为杂合的个体(突变杂合子)，酶切产物序列长度分别为506bp，440bp和66bp(经过测序)，分型结果为三条带；
(3)bb基因型(包括ZbZb基因型或ZbW基因型，非伴性横斑羽纯合，表型为非横斑羽)：在CDKN2A/B基因序列的编码区上(序列1)不存在单碱基突变(序列1第71位T)，酶切产物序列长度为440bp和66bp(经过测序)，分型结果为两条带。
4、序列测定：
根据步骤3的鉴定结果，还可进一步对步骤1所得PCR产物进行序列测定，验证 结果的准确性。当待测鸡的基因组DNA的CDKN2A/B基因序列的编码区上不存在单碱基突变时，扩增目的片段为序列表中序列1所示的506bp DNA片段，对应等位基因b(Zb)；当待测鸡的基因组DNA的CDKN2A/B基因序列的编码区上存在单碱基突变时，扩增目的片段为序列表中序列所示的506bp DNA片段，但是在71位的碱基突变了，对应等位基因B(ZB)；
当待测鸡的基因组DNA的CDKN2A/B基因序列的编码区(序列1)第71位为A和T，则对应等位基因B(ZB Zb)。
实施例2、利用实施例1制备的试剂盒鉴定鸡伴性横斑羽基因的基因型
一、已知基因型的鸡伴性横斑羽基因的鉴定
1、以已知基因型的如下鸡作为待测鸡：
1只石岐杂鸡(非伴性横斑羽纯合，bb基因型(ZbZb基因型)，表型为非横斑羽)，1只琅琊鸡(非伴性横斑羽纯合，bb基因型(ZbW基因型)，表型为非横斑羽)，1只寿光鸡(非伴性横斑羽纯合，bb基因型(ZbZb基因型)，表型为非横斑羽)，1只济宁百日鸡(非伴性横斑羽纯合，bb基因型(ZbZb基因型)，表型为非横斑羽)，2只汶上芦花鸡(伴性横斑羽纯合，BB基因型(ZBZB基因型)，表型为横斑羽)，1只莱芜黑鸡(非伴性横斑羽纯合，bb基因型(ZbZb基因型)，表型为非横斑羽)。以上各鸡的基因型已经过纯繁和杂交验证，基因型已确定。
采用实施例1制备的试剂盒，按照实施例1步骤三的方法对以上各待测鸡进行伴性横斑羽基因的基因型鉴定，其中DNA模板来自于待测鸡的离体血样。
PCR扩增片段的电泳结果显示，各待测鸡在略大于500bp的位置均检测到目的条带，初步判定PCR扩增正确。
进一步的酶切检测结果如图1所示。从图中可以看出，泳道bb、BB、Bb表示三种基因型。泳道1-2所示的石岐杂鸡分型结果为两条带，酶切产物序列长度经过测序分别为440bp和66bp(66bp处条带较弱)，从而判定其基因型为bb型(非伴性横斑羽纯合)；泳道2-2所示的琅琊鸡分型结果为两条带，酶切产物序列长度经过测序分别为440bp和66bp，从而判定其基因型为bb型(非伴性横斑羽纯合)；泳道3-2所示的寿光鸡鸡分型结果为两条带，酶切产物序列长度经过测序分别为440bp和66bp，从而判定其基因型为bb型(非伴性横斑羽纯合)；泳道4-3所示的济宁百日鸡分型结果为两条带，酶切产物序列长度经过测序分别为440bp和66bp，从而判定其基因型为bb型(非伴性横斑羽纯合)；泳道5-1和5-2所示的汶上芦花鸡分型结果为一条带，酶切产物序列长度经过测序分别为506bp，从而判定其基因型为BB型(伴性横斑羽纯合)；泳道6-2所示的莱芜黑鸡分型结果为两条带，酶切产物序列长度经过测序分别为440bp和66bp，从而判定其基因型为bb型(非伴性横斑羽纯合)；在图中，66bp的小分子条 带隐约可见，在实际的电泳中当产物浓度不高或电泳时间稍长时，66bp的小分子条带可能信号偏弱或跑出胶块以外，此时显示的是506bp条带和/或440bp条带，即BB型对应一条506bp条带，bb型对应一条440bp条带，Bb型对应两条带(分别为506bp和440bp)，于是可以只通过506bp条带和/或440bp条带来判断基因型。图示结果与预计结果一致，证明本方法准确可靠。
进一步，本发明的发明人对以上鉴定为BB基因型的汶上芦花鸡对应PCR产物(序列1)进行序列测定，发现在PCR产物序列有突变(序列1的第71位为A)；对以上鉴定为bb基因型的石岐杂鸡、琅琊鸡、寿光鸡、济宁百日鸡和莱芜黑鸡对应PCR产物进行序列测定，发现在PCR产物序列没有有突变(序列1的第71位为T)。
2、以已知基因型的如下鸡作为待测鸡：
2只石岐杂鸡(非伴性横斑羽纯合，bb基因型，表型为非横斑羽)，2只琅琊鸡(非伴性横斑羽纯合，bb基因型，表型为非横斑羽)，2只寿光鸡(非伴性横斑羽纯合，bb基因型，表型为非横斑羽)，2只济宁百日鸡(非伴性横斑羽纯合，bb基因型，表型为非横斑羽)，2只汶上芦花鸡(伴性横斑羽纯合，BB基因型，表型为横斑羽)，2只莱芜黑鸡(非伴性横斑羽纯合，bb基因型，表型为非横斑羽)。以上各鸡的基因型已经过纯繁和杂交验证，基因型已确定。
采用实施例1制备的试剂盒，按照实施例1步骤三的方法对以上各待测鸡进行伴性横斑羽基因的基因型鉴定，其中DNA模板来自于待测鸡的离体血样。
PCR扩增片段的电泳结果显示，各待测鸡在略大于500bp的位置均检测到目的条带，初步判定PCR扩增正确。
进一步的RFLP酶切检测结果如图2所示。从图中可以看出，泳道bb、BB、Bb表示三种基因型。泳道1-8和1-9所示的石岐杂鸡分型结果为两条带，酶切产物序列长度经过测序分别为440bp和66bp(66bp处条带较弱)，从而判定其基因型为bb型(非伴性横斑羽纯合)；泳道2-9和2-10所示的琅琊鸡分型结果为两条带，酶切产物序列长度经过测序分别为440bp和66bp，从而判定其基因型为bb型(非伴性横斑羽纯合)；泳道3-8和3-9所示的寿光鸡分型结果为两条带，酶切产物序列长度经过测序分别为440bp和66bp，从而判定其基因型为bb型(非伴性横斑羽纯合)；泳道4-2和4-4所示的济宁百日鸡分型结果为两条带，酶切产物序列长度经过测序分别为440bp和66bp，从而判定其基因型为bb型(非伴性横斑羽纯合)；泳道5-4和5-10所示的汶上芦花鸡分型结果为一条带，酶切产物序列长度经过测序分别为506bp，从而判定其基因型为BB型(伴性横斑羽纯合)；泳道6-8和6-9所示的莱芜黑鸡分型结果为两条带，酶切产物序列长度经过测序分别为440bp和66bp，从而判定其基因型为bb型(非伴性横斑羽纯合)；在图中，66bp的小分子条带隐约可见，在实际的电泳中当产物浓度不高 或电泳稍长时，66bp的小分子条带可能信号偏弱或跑出胶块以外，此时显示的是506bp条带和/或440bp条带，即BB型对应一条506bp条带，bb型对应一条440bp条带，Bb型对应两条带(分别为506bp和440bp)，于是我们可以只通过506bp条带和/或440bp条带来判断基因型。图示结果与预计结果一致，证明本方法准确可靠。
进一步，本发明的发明人对以上鉴定为BB基因型的汶上芦花鸡对应PCR产物(序列1)进行序列测定，发现在PCR产物序列有突变(序列1的第71位为A)；对以上鉴定为bb基因型的石岐杂鸡、琅琊鸡、寿光鸡、济宁百日鸡和莱芜黑鸡对应PCR产物进行序列测定，发现在PCR产物序列没有有突变(序列1的第71位为T)。
三、未知基因型的鸡伴性横斑羽基因的鉴定
以12个未知基因型的鸡作为待测鸡，同时设置已知基因型的样本作为对照。
采用实施例1制备的试剂盒，按照实施例1步骤三的方法对以上各待测鸡进行伴性横斑羽基因的基因型鉴定，其中DNA模板来自于待测鸡的离体血样。
PCR扩增片段的电泳结果显示，如图4所示，各待测鸡在略大于500bp的位置均检测到目的条带，初步判定PCR扩增正确。
进一步的RFLP酶切检测结果如图3所示。从图中可以看出，泳道bb、BB、Bb表示三种基因型。泳道1-10和1-11所示的分型结果为两条带，酶切产物序列长度经过测序分别为440bp和66bp，从而判定其基因型为bb型(非伴性横斑羽纯合)；泳道2-11和2-12所示的分型结果为两条带，酶切产物序列长度经过测序分别为440bp和66bp，从而判定其基因型为bb型(非伴性横斑羽纯合)；泳道3-10和3-11所示的分型结果为两条带，酶切产物序列长度经过测序分别为440bp和66bp，从而判定其基因型为bb型(非伴性横斑羽纯合)；泳道4-11和4-12所示的分型结果为两条带，酶切产物序列长度经过测序分别为440bp和66bp，从而判定其基因型为bb型(非伴性横斑羽纯合)；泳道5-11和5-12所示的分型结果为一条带，酶切产物序列长度经过测序分别为506bp，从而判定其基因型为BB型(伴性横斑羽纯合)；泳道6-10和6-11所示的分型结果为两条带，酶切产物序列长度经过测序分别为440bp和66bp，从而判定其基因型为bb型(非伴性横斑羽纯合)；在图中，66bp的小分子条带隐约可见，在实际的电泳中当产物浓度不高或电泳稍长时，66bp的小分子条带可能信号偏弱或跑出胶块以外，此时显示的是506bp条带和/或440bp条带，即BB型对应一条506bp条带，bb型对应一条440bp条带，Bb型对应两条带(分别为506bp和440bp)，于是可以只通过506bp条带和/或440bp条带来判断基因型。图示结果与预计结果一致，证明本方法准确可靠。
进一步，本发明的发明人对以上鉴定为BB基因型的鸡对应PCR产物(序列1)进行序列测定，发现在PCR产物序列有突变(序列1的第71位为A)；对以上鉴定为 bb基因型的鸡对应PCR产物进行序列测定，发现在PCR产物序列没有突变(序列1的第71位为T)。
以上结果，设置的阳性对照的鉴定结果与预计结果一致，证明此次实验操作的准确可靠。本发明的发明人对12个未知基因型的待测鸡，根据提取血样时的家系记录，并追溯至原始数据进行核查，发现鉴定为伴性横斑羽纯合子的两个个体的鸡种为汶上芦花鸡，其他14个鉴定为非伴性横斑羽纯合的个体均为非横斑羽鸡种(石岐杂鸡、琅琊鸡、寿光鸡、济宁百日鸡、莱芜黑鸡)。再次证实了本发明方法的准确可靠。

Claims (7)

1.鉴定鸡伴性横斑羽基因基因型的引物对，其由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。
2.鉴定鸡伴性横斑羽基因基因型的试剂盒，包括权利要求1所述的引物对和限制性内切酶；
所述限制性内切酶为Taal或HpyCH4Ⅲ。
3.权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定鸡伴性横斑羽基因基因型中的应用。
4.根据权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂盒或权利要求3所述的应用，其特征在于：所述伴性横斑羽基因基因型为BB基因型、Bb基因型或bb基因型；
所述BB基因型为ZBZB基因型或ZBW基因型；
所述Bb基因型为ZBZb基因型；
所述bb基因型为ZbZb基因型或ZbW基因型。
5.一种鉴定或辅助鉴定待测鸡伴性横斑羽基因基因型的方法，包括如下步骤：
1)用权利要求1所述引物对对待测鸡进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
2)将所述PCR扩增产物用权利要求2中的所述限制性内切酶酶切，得到酶切产物；
3)检测酶切产物，用如下(1)-(3)中任一种方法鉴定或辅助鉴定鸡伴性横斑羽基因基因型：
(1)若所述酶切产物仅为大小为490-520bp的片段，则所述待测鸡的伴性横斑羽基因基因型为或候选为BB基因型；
(2)若所述酶切产物为大小为490-520bp、430-450bp和60-70bp的片段，则所述待测鸡的伴性横斑羽基因基因型为或候选为Bb基因型；
(3)若所述酶切产物为大小为430-450bp和60-70bp的片段，则所述待测鸡的伴性横斑羽基因基因型为或候选为bb基因型；
所述BB基因型为ZBZB基因型或ZBW基因型；
所述Bb基因型为ZBZb基因型；
所述bb基因型为ZbZb基因型或ZbW基因型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述根据如下(1)-(3)中任一种方法鉴定或辅助鉴定鸡伴性横斑羽基因基因型：
(1)若所述酶切产物仅为大小为506bp的片段，则所述待测鸡的伴性横斑羽基因基因型为或候选为BB基因型；
(2)若所述酶切产物为大小为506bp、440bp和66bp的片段，则所述待测鸡的伴性横斑羽基因基因型为或候选为Bb基因型；
(3)若所述酶切产物为大小为440bp和66bp的片段，则所述待测鸡的伴性横斑羽基因基因型为或候选为bb基因型。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：
所述PCR扩增的模板为待测鸡的基因组DNA。
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