CN111893193A - 一种鸡显性白快速基因分型检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鸡显性白快速基因分型检测方法，涉及分子标记育种领域技术领域，以解决现有技术中存在的技术检测操作繁琐耗时长、应用范围有限及检测成本高的不足的技术问题，该装置根据显性白基因PMEL17及PMEL17基因外显子10上的9bp插入位点设计引物，引物包括以下3种引物：核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2及SEQ ID No.3所示的引物；建立PCR体系；进行PCR扩增，94℃预变性15min，94℃变性20s,55‑61℃退火和延伸60s,进行10个循环；94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，进行26个循环；94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，进行3个循环；进行数据扫描得到显性白控制基因的分型结果，本发明用于快速检测鸡显性白控制基因PMEL17多态性。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记育种领域，具体涉及一种基于KASP检测鸡显性白PMEL17基因多态性位点分型的方法。
背景技术
白羽鸡可根据控制羽色基因位点不同分为显性白羽和隐性白羽两种。目前已知鸡白羽性状是由5对等位基因控制，控制白羽的5对等位基因对白羽性状连锁影响。根据研究这5对等位基因分别是：(1)抑制色素形成的基因I；(2)控制有色羽性状的色素原基因C；(3)氧化酶基因O，与氧化酶形成有关；(4)色素表现基因P，与色表现有关；(5)非白化基因a，与有色性状有关。通过分子标记技术已定位的分别是抑制色素形成的I基因和色素原C基因。
对于白羽的显性基因I，Kerje等利用红色原鸡和白来航杂交建立的群体进行连锁分析，发现显性白基因座I对应的编码基因为PMEL17(premelanosome protein，前黑素体蛋白)，该蛋白对于真黑素体的发育十分关键。序列分析显示显性白等位基因与PMEL17基因外显子10上的9bp插入片段完全连锁，该突变导致在PMEL17基因的跨膜域上插入了3个氨基酸。9bp的插入通过常规的分子生物学实验检测是非常困难的，近年来，发展了像单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序等分子遗传标记的方法。但这些方法都不同程度的因为操作繁琐耗时长、应用范围有限及检测成本高等原因未得到广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡显性白快速基因分型检测方法，以解决上述背景技术中提到的技术问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供的一种鸡显性白快速基因分型检测方法，具体步骤如下：
S1:根据显性白基因PMEL17及PMEL17基因外显子10上的9bp插入位点设计引物，所述引物包括以下3种引物：
核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2及SEQ ID No.3所示的引物；
S2:建立PCR体系；
S3：进行PCR扩增，94℃预变性15min，94℃变性20s,55-61℃退火和延伸60s,进行10个循环；94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，进行26个循环；94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，进行3个循环；
S4：进行数据扫描得到显性白控制基因的分型结果。
优选的，步骤S2中，建立的PCR体系中的DNA来自鸡的血液，其中，鸡血液中的DNA获取方法如下：
S21：先向离心管中加入Proteinase K，之后再加入血液；
S22：向离心管中加入Buffer ML，涡旋振荡5秒钟使其充分混匀后，将离心管放于56℃水浴锅中孵育15分钟，期间涡旋震荡混匀2次；
S23：将离心管从水浴锅中取出，短暂离心后室温放置5分钟，加入彻底混匀的异丙醇与Magbeads混合物，涡旋震荡混匀5秒钟后将离心管放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟或将离心管连续颠倒混匀10分钟；
S24：将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液，过程中需保持离心管固定于磁力架上；
S25：将离心管从磁力架上取下，加入无水乙醇，加入Buffer GW1后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟，之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液；
S26：重复步骤S25；
S27：将离心管从磁力架上取下，加入无水乙醇，加入Buffer GW2后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟，之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架，将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液；
S28：重复步骤S27；
S29：保持离心管固定于磁力架上，用移液器进一步去除离心管管底和管盖上的溶液，之后室温放置5—10分钟，使乙醇完全挥发；
S210：将离心管从磁力架上取下，加入Buffer EB，涡旋震荡使磁珠完全悬浮于洗脱液中后将其放于56℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟，或将离心管放于56℃水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡10秒钟；
S211：将离心管放于磁力架上静置2分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。
优选的，步骤S29中，如果离心管侧壁上有液珠，则向离心管中加入无水乙醇，盖盖后颠倒离心管，同时保持离心管固定于磁力架上，之后彻底弃去无水乙醇。
优选的，所述PCR体系包括所述3种引物、DNA以及KASP Master Mix的混合物。
本发明的技术是一种对鸡显性白基因的分子鉴定方法，通过对显性白基因和非显性白基因的核苷酸序列比对后设计引物，FAM标记的引物1与显性白基因特异匹配，VIC标记的引物2与非显性白基因特异匹配，通用引物为反向引物，反向引物结合后，与等位基因特异结合的正向引物得以延伸。FAM标记的引物1与显性白基因特异匹配后扩增，仅检测到FAM荧光即为显性白基因纯合子，记为II；VIC标记的引物2与非显性白基因特异匹配后扩增，仅检测到VIC荧光即为非显性白纯合子，记为ii；如果同时检测到FAM和VIC信号，则为非显性白杂合子，记为Ii。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的基因型检测得到的显性白基因PMEL17位点分型。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下面参照附图详细地说明本发明的具体实施方式。在各附图中，相同的附图标记表示相同或相应的技术特征。各附图仅作为示意图，并非一定按实际比例绘制的。
KASP是竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)的缩写，可在广泛的基因组DNA样品种(甚至一些复杂基因组的DNA样品)，对SNPs和特点位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。
该方法利用通用荧光探针，就可以通过PCR的方法实现变异位点分型。含有变异位点的等位基因1和等位基因2作为模板，针对等位基因变异位点设计的两个正向引物和一个通用反向引物，每条正向引物尾部有特异性序列，可与荧光标记结合。
第一轮PCR，能够和模板互补的正向引物得到延伸，无法和模板互补的正向引物无法延伸；第二轮PCR，反向引物结合，与等位基因特异结合的正向引物得以延伸。
随着PCR循环数增加，扩增子数量呈指数增长，此时FAM或VIC标记特异结合的正向引物不再被淬灭从而发出荧光可被检测。不同颜色荧光反映不同SNP类型，使用酶标仪对实验结果进行检测就能够达到我们的最终实验目的。
实施例：
S1:根据显性白基因PMEL17及PMEL17基因外显子10上的9bp插入位点设计引物：
引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT CACCGCTCATCGCCGCTGCT-3’(SEQ ID No.1，下划线部分为特异荧光序列FAM)；
引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT CGTGGGGCTGCTGCTCATC-3’(SEQ ID No.2，下划线部分为特异荧光序列VIC)；
引物3：GCTGTGTTCTCCCCGTGTCTC(SEQ ID No.3)；
S2:建立PCR体系，该体系包括2.5uL DNA、2.5uL KASP Master Mix(LGCGenomics，Hoddeston,UK)以及0.07uL以上3种混合引物。
S3：设置空白对照，将PCR体系中的DNA以等量的ddH2O代替，以作为空白对照。
S4：进行PCR扩增
94℃预变性15min，94℃变性20s,55-61℃退火和延伸60s,进行10个循环
94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，进行26个循环
94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，进行3个循环。
S5：参照《ABI7900HT Fast Real Time PCR System实验室操作规程》进行数据扫描得到显性白控制基因的分型结果。
其中步骤S2中，PCR体系中的DNA来自鸡的血液，本实施例中利用康为世纪的血液基因组DNA提取试剂盒CW2361从鸡血液中提取基因组DNA。
所述鸡血液中的DNA获取方法如下：
S21：向1.5mL的离心管中加入20μL Proteinase K，之后加入200μL的血液。
S22：向离心管中加入200μL Buffer ML，涡旋振荡5秒钟使其充分混匀后，将离心管放于56℃水浴锅中孵育15分钟，期间涡旋震荡混匀2次。
S23：将离心管从水浴锅中取出，短暂离心后室温放置5分钟。加入彻底混匀的320μL异丙醇与Magbeads混合物，涡旋震荡混匀5秒钟后将离心管放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟或将离心管连续颠倒混匀10分钟。
S24：将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
S25：将离心管从磁力架上取下，加入750uL Buffer GW1(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保Magbeads处于混匀状态)。之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
S26：重复步骤S25。
S27：将离心管从磁力架上取下，加入750uL Buffer GW2(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保Magbeads处于混匀状态)。之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架，将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
S28：重复步骤S27。
S29：保持离心管固定于磁力架上，用移液器进一步去除离心管管底和管盖上的溶液，之后室温放置5-10分钟，使乙醇挥发干净。
注意：如果离心管侧壁上有液珠，可向离心管中加入750μL无水乙醇。盖盖后颠倒离心管(保持离心管固定于磁力架上)，之后彻底弃去无水乙醇。
S210：将离心管从磁力架上取下，加入50-200μL Buffer EB。涡旋震荡使磁珠完全悬浮于洗脱液中后将其放于56℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟，或将离心管放于56℃水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡10秒钟。
S211：将离心管放于磁力架上静置2分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。
图1为根据本发明的基因型检测得到的鸡显性白基因分型图，由图1可知，本发明利用KASP进行鸡显性白基因型检测，对DNA样本的需求低，适于大批量样本检测，检测准确性可达100％，且支持低、中或高通量研究及单个重复实验
实验验证情况：
实施案例：49只白来航检测及结果判定。
经检测49只黄羽肉鸡中23只为仅检测到FAM荧光，为显性白基因纯合子。9只为仅检测到VIC荧光，为非显性白基因纯合子。16只同时检测到FAM和VIC信号，则为非显性白杂合子；1只未检测到FAM或HEX荧光，判定检测失败。
以上检测成功的个体分型结果全部与表型相符，一致率达到100％。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (4)
1.一种鸡显性白快速基因分型检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1:根据显性白基因PMEL17及PMEL17基因外显子10上的9bp插入位点设计引物，所述引物包括以下3种引物：
核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2及SEQ ID No.3所示的引物；
S2:建立PCR体系；
S3：进行PCR扩增，94℃预变性15min，94℃变性20s,55-61℃退火和延伸60s,进行10个循环；94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，进行26个循环；94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，进行3个循环；
S4：进行数据扫描得到显性白控制基因的分型结果。
2.根据权利要求1所述的鸡显性白快速基因分型检测方法，其特征在于，步骤S2中，建立的PCR体系中的DNA来自鸡的血液，其中，鸡血液中的DNA获取方法如下：
S21：先向离心管中加入Proteinase K，之后再加入血液；
S22：向离心管中加入Buffer ML，涡旋振荡5秒钟使其充分混匀后，将离心管放于56℃水浴锅中孵育15分钟，期间涡旋震荡混匀2次；
S23：将离心管从水浴锅中取出，短暂离心后室温放置5分钟，加入彻底混匀的异丙醇与Magbeads混合物，涡旋震荡混匀5秒钟后将离心管放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟或将离心管连续颠倒混匀10分钟；
S24：将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液，过程中需保持离心管固定于磁力架上；
S25：将离心管从磁力架上取下，加入无水乙醇，加入Buffer GW1后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟，之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后弃去溶液；
S26：重复步骤S25；
S27：将离心管从磁力架上取下，加入无水乙醇，加入Buffer GW2后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟，之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后颠倒磁力架，将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液；
S28：重复步骤S27；
S29：保持离心管固定于磁力架上，用移液器进一步去除离心管管底和管盖上的溶液，之后室温放置5—10分钟，使乙醇完全挥发；
S210：将离心管从磁力架上取下，加入Buffer EB，涡旋震荡使磁珠完全悬浮于洗脱液中后将其放于56℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟，或将离心管放于56℃水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡10秒钟；
S211：将离心管放于磁力架上静置2分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。
3.根据权利要求2所述的鸡显性白快速基因分型检测方法，其特征在于：步骤S29中，如果离心管侧壁上有液珠，则向离心管中加入无水乙醇，盖盖后颠倒离心管，同时保持离心管固定于磁力架上，之后彻底弃去无水乙醇。
4.根据权利要求1所述的鸡显性白快速基因分型检测方法，其特征在于：所述PCR体系包括所述3种引物、DNA以及KASP Master Mix的混合物。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN114854880A (zh) * | 2022-06-17 | 2022-08-05 | 华南农业大学 | 一种基于kasp技术的丝羽乌骨鸡玫瑰冠分子标记及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103602745A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-02-26 | 河南农业大学 | 一种用于检测鸡pmel17基因显性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法 |
| CN103602744A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-02-26 | 河南农业大学 | 一种用于检测鸡显性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法 |
| CN104711339A (zh) * | 2013-12-12 | 2015-06-17 | 中国农业大学 | 一种鸡显性白羽基因的鉴定方法 |
| CN107151709A (zh) * | 2017-07-13 | 2017-09-12 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 与辣椒辣味相关的snp标记及其应用 |
| CN107217106A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-09-29 | 长江师范学院 | 一种水稻稻米香味基因的snp功能分子标记及应用 |
| CN107475412A (zh) * | 2017-09-20 | 2017-12-15 | 山东农业大学 | 一种与鸡产蛋性状相关的分子标记及其在鸡育种中的应用 |
-
2020
- 2020-08-12 CN CN202010809931.1A patent/CN111893193A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103602745A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-02-26 | 河南农业大学 | 一种用于检测鸡pmel17基因显性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法 |
| CN103602744A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-02-26 | 河南农业大学 | 一种用于检测鸡显性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法 |
| CN104711339A (zh) * | 2013-12-12 | 2015-06-17 | 中国农业大学 | 一种鸡显性白羽基因的鉴定方法 |
| CN107151709A (zh) * | 2017-07-13 | 2017-09-12 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 与辣椒辣味相关的snp标记及其应用 |
| CN107217106A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-09-29 | 长江师范学院 | 一种水稻稻米香味基因的snp功能分子标记及应用 |
| CN107475412A (zh) * | 2017-09-20 | 2017-12-15 | 山东农业大学 | 一种与鸡产蛋性状相关的分子标记及其在鸡育种中的应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 刘文博等: "利用混合样本池法对鸡显性白羽基因PMEL17突变位点的检测", 《遗传》 * |
| 李兴才等: "香炉山鸡隐性白羽鉴定分析", 《中国畜牧杂志》 * |
| 袁海旭等: "鸡主要组织相容性复合体B区域多态性分析", 《中国家禽》 * |
| 高鑫凤等: "雪峰乌骨鸡外观性状相关突变的鉴定以及频率分布", 《中国家禽》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114854880A (zh) * | 2022-06-17 | 2022-08-05 | 华南农业大学 | 一种基于kasp技术的丝羽乌骨鸡玫瑰冠分子标记及其应用 |
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