CN104762373A - 鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记及其应用 - Google Patents

鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记及其应用，选择PGC-1α基因外显子第646位核苷酸G→A的突变点作为分子标记，所述分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，在SEQ ID NO.1的第97bp处发生G97-A97的碱基突变。本发明能够为鸡肌纤维类型性状的选育提供一种快速、简便、价格低廉的基因分析方法，有利于筛选出慢肌纤维含量较多、肉品质相对较好的肉鸡个体，指导鸡肌纤维类型性状的分子标记辅助选育。

Description

鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记及其应用。
背景技术
随着生活水平的不断提高和消费观念的转变，人们对于鸡肉的质量和口味的要求越来越高，对优质鸡的需求日渐扩大。优质鸡主要强调的是肉质，而肌纤维是构成肌肉组织的基本单位，大量的研究表明肌纤维类型是直接影响肌肉品质的重要因素，慢肌纤维含量较多的肉品质相对较好，因此培育慢肌纤维含量多的优质鸡品种成为现今家禽育种专家的目标之一。
随着分子数量遗传学、分子生物学技术的飞速发展，有关分子遗传标记和标记辅助选择的研究得到广泛开展，并在畜禽育种中应用，产生了巨大的效益。肌纤维类型具有中等偏高的遗传力，理论上以其作为选育指标改善鸡肌肉品质是可行的。选育慢肌纤维比例高的肌纤维类型性状是优质鸡育种中的主要目标之一，从分子水平上鉴定影响肌纤维类型的基因或标记是目前鸡功能基因研究的热点之一，但前提是要找到与该性状紧密连锁的标记。将DNA分析作为主要的研究手段应用于优质鸡的育种中，主要目的是通过在DNA分子水平上寻找与肉鸡肌纤维类型性状密切相关的遗传标记，用于早期的选育，从而加快育种进程。目前尚未见有关鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记的研究报道。
过氧化物体增殖物激活受体γ辅激活因子1-α(peroxisomeproliferators activated receptor gamma coactivator alpha,PGC-1α)对肌肉中的能量代谢产生着非常重要的作用，其在肌肉肌纤维细胞中表达丰富，慢肌纤维的表达要高于快肌纤维。对小鼠的研究表明，PGC-1α可能是调控肌纤维类型的关键因子并可以组合肌纤维转化过程中的多条信号通路。
然而关于PGC-1α基因在鸡肌纤维类型中的研究鲜有报道。本发明将鸡PGC-1α基因作为肌肉肌纤维类型性状的候选基因，提供了鸡PGC-1α基因外显子的一个SNP位点作为鸡肌纤维类型性状的分子标记，并公开了应用方法。
发明内容
为解决上述技术问题，在一个方面，本发明公开了一种鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记，另外，本发明还公开了该鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记的应用。
本发明公开了一种鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记，选择PGC-1α基因外显子第646位核苷酸G→A的突变点作为分子标记，所述分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，在SEQ ID NO.1的第97bp处发生G97-A97的碱基突变。
本发明还公开了一种利用以上所述鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记进行快速选育方法，检测PGC-1α基因的SNP位点，即SEQ ID NO.1的第97bp是否发生G97-A97的碱基突变作为选育条件。
优选的，检测PGC-1α基因的SNP位点即SEQ ID NO.1的第97bp是否发生G97-A97的碱基突变所采用的步骤包括：
1)PCR扩增SNP位点所在片段；
2)对上步的PCR扩增产物进行LDR检测反应。
优选的，该方法所用的PCR扩增引物为：
上游引物序列：5’-TTCCATCGCCAAAATAAAAG-3’，
下游引物序列：5’-GGAGTTGCTGTAGCCAAAAT-3’。
优选的，PCR扩增体系为：
50ng/μL DNA模板1μL、20mMdNTP2μL、100mM Mg2+0.6μL、10×PCR反应缓冲液2μL、10μM上下游引物各0.4μL、5U/μLTaq酶0.2μL、5×Q-solution 4μL、加ddH2O至总体积20μL。
优选的，PCR扩增反应程序为：
94℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环、最后72℃延伸8min。
优选的，LDR检测反应探针为：
A探针PGC-1α_modify序列：
5’-P-TCGGGCATCGGGGAAGGGCTGGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’，
B探针PGC-1α_G序列：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCTCCTGGGGCGGAGGGGTGCCG-3’，
C探针PGC-1α_A序列：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCTCCTGGGGCGGAGGGGTGCCA-3’。
优选的，LDR检测反应的体系为：
PCR产物1μL、10×PCR反应缓冲液1μL、0.5μM探针混合物1μL、40U/μLDNA连接酶0.05μL、加ddH2O至总体积10μL。
优选的，LDR检测反应的程序为：
94℃预变性2min、94℃变性30s、60℃退火2min，30个循环。
本发明又公开了一种利用以上所述鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记进行快速选育试剂盒，该试剂盒包括PGC-1α基因的PCR扩增引物和LDR检测反应探针，PCR扩增引物为：
上游引物序列为：5’-TTCCATCGCCAAAATAAAAG-3’，
下游引物序列为：5’-GGAGTTGCTGTAGCCAAAAT-3’；
LDR检测反应探针为：
A探针PGC-1α_modify序列：
5’-P-TCGGGCATCGGGGAAGGGCTGGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’，
B探针PGC-1α_G序列：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCTCCTGGGGCGGAGGGGTGCCG-3’，
C探针PGC-1α_A序列：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCTCCTGGGGCGGAGGGGTGCCA-3’。
根据本发明的鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记及其应用，可以取得以下所述的至少一种积极技术效果：
1、本发明可以通过检测PGC-1α基因的SNP位点即SEQ ID NO.1的第97bp是否发生G97-A97的碱基突变对鸡肌纤维类型性状进行选育。
2、本发明能够为鸡肌纤维类型性状相关基因的检测提供一种快速、简便、价格低廉的基因分析方法，有利于筛选出慢肌纤维含量较多、肉品质相对较好的肉鸡个体，指导鸡肌纤维类型性状的分子标记辅助选育。
3、本发明将鸡PGC-1α基因作为肌肉肌纤维类型性状的候选基因，其外显子的一个SNP位点即SEQ ID NO.1的第97bp G→A突变作为筛选位点，不仅建立了基于连接酶检测(Ligase Reaction Detection,LDR)反应的SNP快速检测方法，而且提供了该SNP位点的遗传变异及其对肌纤维类型的遗传效应，并公开了应用方法。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例中的利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的检测结果图；
图2是根据本发明实施例中的LDR分型图，在图中，双峰106bp±0.5bp/108bp±0.5bp为GA基因型，单峰106bp±0.5bp为GG基因型，单峰108bp±0.5bp为AA基因型。
具体实施方式
下面通过具体的实施例，并结合附图对本发明做进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有材料均为市场上可以购得的，实施例中未提及的具体实验方法，按照本技术领域常规实验方法进行或者为本领域技术人员容易获得的。
在本发明中，如无特殊说明，所用专业术语按照以下所述理解：
1)LDR：连接酶检测(Ligase Reaction Detection,LDR)。
2)SNP：单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)。
实施例1
选取中国地方优质鸡种清远麻鸡和国外引进品种隐性白羽肉鸡为本发明实施例，具体应用本发明的步骤如下：
随机选取上市日龄清远麻鸡(17周龄)和隐性白羽肉鸡(7周龄)的母鸡各200只，翅静脉采血，放入含有抗凝剂的2ml EP管中，用于基因组DNA的提取。
PCR扩增SEQ ID NO.1所示核苷酸序列(序列表SEQ ID NO.1是包含PGC-1α基因外显子G646A突变位点的核苷酸序列，长度为202bp，在该序列的第97bp处有一个G97-A97的碱基突变，)所用引物对序列信息为：
上游引物：5’-TTCCATCGCCAAAATAAAAG-3’(SEQ NO.2所示)，
下游引物：5’-GGAGTTGCTGTAGCCAAAAT-3’(SEQ NO.3所示)。
PCR扩增SNP位点所在片段，PCR扩增体系为：50ng/μL DNA模板1μL、20mMdNTP2μL、100mM Mg2+0.6μL、10×PCR反应缓冲液2μL、10μM上下游引物各0.4μL、5U/μLTaq酶0.2μL、5×Q-solution 4μL、加ddH2O至总体积20μL，
PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s、35个循环，最后72℃延伸8min。
2％琼脂糖凝胶检测PCR产物，结果见图1，片段大小为202bp，判定PCR扩增片段正确。
剩余PCR产物用于LDR分型，LDR三根探针信息为：
A探针PGC-1α_modify序列(SEQ NO.4所示)：
5’-P-TCGGGCATCGGGGAAGGGCTGGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’，
B探针PGC-1α_G序列(SEQ NO.5所示)：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCTCCTGGGGCGGAGGGGTGCCG-3’，
C探针PGC-1α_A序列(SEQ NO.6所示)：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCTCCTGGGGCGGAGGGGTGCCA-3’。
LDR体系为：PCR产物1μL、10×PCR反应缓冲液1μL、0.5μM探针混合物1μL、40U/μLDNA连接酶0.05μL、加ddH2O至总体积10μL；
LDR检测反应程序为：94℃预变性2min、94℃变性30s、60℃退火2min，30个循环。
运用ABI3100DNA测序仪对LDR产物进行测序胶毛细管电泳。
应用GENESCANTM672软件进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准；应用Genemapper软件进行数据分析和基因分型，基因分型标准为连接产物检测出双峰106bp±0.5bp/108bp±0.5bp为GA基因型，单峰106bp±0.5bp为GG基因型，单峰108bp±0.5bp为AA基因型。分型图见图2。
基因型在两个品种鸡中的分布频率分析：利用SPSS软件中的皮卡逊卡方值对基因型频率进行卡方适合性检验，由表1可知，清远麻鸡突变位点的χ2为0.01，隐性白羽肉鸡突变位点的χ2值为0.04，均小于χ2 0.05(2)＝5.99，说明两个品种鸡在该位点上均处于哈代-温伯平衡状态，所抽检的两个品种鸡的个体具有随机性。
表1 两个品种鸡多态性位点的基因型分布
注：χ2 0.05(2)＝5.99，χ2 0.01(2)＝9.21，**表示基因型分布在两个鸡品种间相比差异极显著。
由表1可知，在两个品种鸡中均是等位基因G频率较高，但清远麻鸡等位基因A频率要高于隐性白羽肉鸡。对两个品种鸡的各等位基因型进行卡方独立性检验，结果χ2为22.33，大于χ2 0.01(2)＝9.21，可见基因型分布在两个品种鸡中差异极显著(P<0.01)。
利用SAS9.0软件的一般线性模型对基因型与鸡肌纤维类型百分比进行关联分析，模型为Yij＝μ+Bi+Gj+eij，Yij为性状表现值，μ为总体均数，Bi为品种效应，Gj为基因型效应，eij为随机误差。两个品种鸡腓肠肌外侧头肌纤维比例与基因型的关联分析结果见表2。
表2 两个品种鸡基因型与其腓肠肌外侧头肌纤维比例关联分析
注：品种内同一肌纤维比例中基因型间差异显著用不同肩标表示(P<0.05)，表5同。
由表2可知，在慢肌纤维比例中，两个品种鸡均是AA基因型的最高，显著高于GG和GA基因型(P<0.05)，GG基因型最低，显著低于GA和AA基因型(P<0.05)，清远麻鸡中AA基因型慢肌纤维比例的值比GG基因型慢肌纤维比例的值高9.50％，隐性白羽肉鸡中AA基因型慢肌纤维比例的值比GG基因型慢肌纤维比例的值高6.43％。在快红肌纤维比例中，两个品种鸡均是GA基因型最高，AA基因型次之，GG基因型最低，但三个基因型间差异不显著(P>0.05)。快白肌纤维比例中，两个品种鸡均是GG基因最高，显著高于GA和AA基因型(P<0.05)，但GA基因型和AA基因型间差异不显著(P>0.05)，清远麻鸡中GA基因型最低，其GA基因型快白肌纤维比例值比GG基因型快白肌纤维比例值低7.31％；隐性白羽肉鸡中AA基因型最低，其AA基因型快白肌纤维比例值比GG基因型快白肌纤维比例值低10.48％。
结果说明：两个鸡品种中均是AA基因型慢肌纤维比例的值显著高于GG和GA基因型，GG基因型快白肌纤维比例的值显著高于GA和AA基因型，等位基因A是慢肌纤维比例高的有利标记。
实施例2
为进一步确定本发明遗传标记与鸡肌纤维类型性状的相关性，用实施例1中建立的PCR-LDR快速分型方法，选取基因型均为AA的清远麻鸡母本和父本杂交F1代以及基因型均为AA的隐性白羽肉鸡母本和父本杂交F1代各200只(上市日龄)，测定其腓肠肌外侧头肌纤维类型比例，结果见表3。
表3 两个品种鸡F1代个体腓肠肌外侧头肌纤维类型比例
由表3可知，两个品种鸡F1代均是慢肌纤维比例最高，与表2中AA基因型数据相比，经过选育后两个品种鸡的慢肌纤维比例和快红肌纤维比例都有了提高，而快白肌纤维比例有所下降，由此可见，本发明的分子遗传标记与鸡肌纤维类型性状密切相关，通过对等位基因A的选育，能有效提高清远麻鸡和隐性白羽肉鸡后代慢肌纤维比例。
实施例3：本发明的分子遗传标记在其它品种肉鸡中的应用
随机选取上市日龄广西三黄鸡(17周龄)、北京油鸡(16周龄)、文昌鸡(16周龄)和安卡鸡(7周龄)的母鸡各200只，用实施例1中建立的PCR-LDR快速分型方法进行基因分型，四个品种鸡多态性位点的基因型分布结果见表4。
表4 四个品种鸡多态性位点的基因型分布
由表4可知，在四个品种鸡中均是等位基因G频率较高。
利用SAS9.0软件的一般线性模型对基因型与鸡肌纤维类型百分比进行关联分析，模型为Yij＝μ+Bi+Gj+eij，Yij为性状表现值，μ为总体均数，Bi为品种效应，Gj为基因型效应，eij为随机误差。四个品种鸡腓肠肌外侧头肌纤维比例与基因型的关联分析结果见表5。
表5 四个品种鸡基因型与其腓肠肌外侧头肌纤维比例关联分析
由表5可知，在慢肌纤维比例中，四个品种鸡均是AA基因型的最高，显著高于GG和GA基因型(P<0.05)，GG基因型最低，显著低于GA和AA基因型(P<0.05)，广西三黄鸡中AA基因型慢肌纤维比例的值比GG基因型慢肌纤维比例的值高9.44％，北京油鸡中AA基因型慢肌纤维比例的值比GG基因型慢肌纤维比例的值高8.37％，文昌鸡中AA基因型慢肌纤维比例的值比GG基因型慢肌纤维比例的值高8.84％，安卡鸡中AA基因型慢肌纤维比例的值比GG基因型慢肌纤维比例的值高7.25％。在快红肌纤维比例中，四个品种鸡均是GA基因型最高，AA基因型次之，GG基因型最低，但三个基因型间差异不显著(P>0.05)。快白肌纤维比例中，四个品种鸡均是GG基因最高，显著高于GA和AA基因型(P<0.05)，但GA基因型和AA基因型间差异不显著(P>0.05)，广西三黄鸡中GA基因型最低，其GA基因型快白肌纤维比例值比GG基因型快白肌纤维比例值低8.1％；北京油鸡中AA基因型最低，其AA基因型快白肌纤维比例值比GG基因型快白肌纤维比例值低9.91％；文昌鸡中GA基因型最低，其GA基因型快白肌纤维比例值比GG基因型快白肌纤维比例值低8.16％；安卡鸡中AA基因型最低，其AA基因型快白肌纤维比例值比GG基因型快白肌纤维比例值低10.48％。
结果再次说明，四个鸡品种中均是AA基因型慢肌纤维比例的值显著高于GG和GA基因型，GG基因型快白肌纤维比例的值显著高于GA和AA基因型，等位基因A是慢肌纤维比例高的有利标记，本发明的分子遗传标记可用于多个品种鸡肌纤维类型性状的快速选育。
实施例4：本发明的分子标记在转录水平上的验证
为进一步确定本发明遗传标记对鸡肌纤维类型性状调控作用，本实施例对实施例1中两个品种不同基因型鸡腓肠肌外侧头PGC-1α基因mRNA的表达水平进行检测，具体方法如下：
4.1方法
4.1.1实验动物
来自实施例1中的清远麻鸡和隐性白羽肉鸡，选取基因型为AA和GG的清远麻鸡各30只，基因型为AA和GG的隐性白羽肉鸡各10只，采集两个品种鸡腓肠肌外侧头样品，置于液氮速冻后转入-80℃冰箱保存。4.1.2总RNA提取和cDNA合成
肌肉总RNA提取按TRNzol-A+总RNA提取试剂的说明书进行。RNA样品用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测，保证RNA样品质量可靠。cDNA第一链的合成按照反转录试剂盒的使用说明书进行，用持家基因GAPDH检测cDNA合成质量以及是否有基因组DNA残留。反转录产物保存于-20℃备用。
4.1.3荧光实时定量PCR
4.1.3.1引物设计与合成
根据GenBank中鸡的PGC-1αmRNA序列(GenBank登录号：NM_001006457.1)和GAPDH mRNA序列(GenBank登录号：NM_204305)，运用在线Primer 3进行引物设计，并经Blast和Oligo软件分析减少非特异扩增和引物二聚体对反应的影响，设计的引物交由上海英骏生物工程有限公司合成，引物序列见表6(PGC-1α基因的引物如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示)。
表6 荧光定量用PCR引物
4.1.3.2荧光实时定量PCR
采用SYBR Green I法进行荧光实时定量PCR反应，反应体系如下：2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10μL，上下游引物各0.4μL(10μmol/L)，cDNA模板1μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL，加ddH2O 7.8μL补足20μL。反应条件为：95℃2min；95℃20s、60℃20s、72℃60s，共40个循环，扩增后经熔解曲线检测特异性。每次反应均设空白样品为阴性对照，每个样品设置3个重复。
4.1.4统计分析
相对定量的结果采用2-△△Ct法进行处理，2-△△Ct法计算公式：△△Ct＝(待测组目的基因平均Ct值-待测组看家基因平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct值-对照组看家基因平均Ct值)。其中，Ct(初始循环数)为扩增曲线与阈值曲线交点的横坐标值，即PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数。运用SPSS软件中Univarinate和One-way anova分析PGC-1αmRNA在所检测组织中表达水平，所有数据以平均值±标准误表示，P＜0.05表示差异显著。
4.2结果:
PGC-1αmRNA在AA和GG基因型清远麻鸡和隐性白羽肉鸡中腓肠肌外侧头中的表达水平如下：
用内参GAPDH基因对表达水平进行均一化，并定义PGC-1α基因的mRNA在GG基因型清远麻鸡腓肠肌外侧头中的表达水平为1，以对其它检测肌肉组织中PGC-1αmRNA表达水平进行定量，结果见表7。
表7 AA和GG基因型清远麻鸡和隐性白羽肉鸡腓肠肌外侧头PGC-1αmRNA相对表达量
注：同一品种内不同基因型鸡肌肉组织腓肠肌外侧头PGC-1mRNA表达差异显著用不同小写字母表示，(P＜0.05)，差异倍数是同一品种内AA基因型PGC-1αmRNA表达值与GG基因型PGC-1αmRNA表达值的比值。
由表7可知，PGC-1α基因的mRNA在两个品种鸡的AA基因型腓肠肌外侧头中表达量均显著高于GG基因型腓肠肌外侧头中表达量(P＜0.05)，其差异倍数均达到了2倍以上。由此可见本发明分子标记中G→A的突变，引起了PGC-1α基因在转录水平上发生显著变化，从而导致肌纤维类型的差异。本实施例从PGC-1α基因转录水平再次确认了本发明的遗传标记与鸡肌纤维类型的相关性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记，其特征在于，选择PGC-1α基因外显子第646位核苷酸G→A的突变点作为分子标记，所述分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，在SEQ ID NO.1的第97bp处发生G97-A97的碱基突变。
2.一种利用权利要求1所述鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记进行快速选育方法，其特征在于，检测PGC-1α基因的SNP位点，即SEQID NO.1的第97bp是否发生G97-A97的碱基突变作为选育条件。
3.根据权利要求2所述的利用鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记进行快速选育方法，其特征在于，检测PGC-1α基因的SNP位点即SEQID NO.1的第97bp是否发生G97-A97的碱基突变所采用的步骤包括：
1)PCR扩增SNP位点所在片段；
2)对上步的PCR扩增产物进行LDR检测反应。
4.根据权利要求3所述的利用鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记进行快速选育方法，其特征在于，该方法所用的PCR扩增引物为：
上游引物序列：5’-TTCCATCGCCAAAATAAAAG-3’，
下游引物序列：5’-GGAGTTGCTGTAGCCAAAAT-3’。
5.根据权利要求3所述的利用鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记进行快速选育方法，其特征在于，PCR扩增体系为：
50ng/μL DNA模板1μL、20mMdNTP2μL、100mM Mg2+0.6μL、10×PCR反应缓冲液2μL、10μM上下游引物各0.4μL、5U/μLTaq酶0.2μL、5×Q-solution 4μL、加ddH2O至总体积20μL。
6.根据权利要求5所述的利用鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记进行快速选育方法，其特征在于，PCR扩增反应程序为：
94℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环、最后72℃延伸8min。
7.根据权利要求3所述的利用鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记进行快速选育方法，其特征在于，LDR检测反应探针为：
A探针PGC-1α_modify序列：
5’-P-TCGGGCATCGGGGAAGGGCTGGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’，
B探针PGC-1α_G序列：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCTCCTGGGGCGGAGGGGTGCCG-3’，
C探针PGC-1α_A序列：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCTCCTGGGGCGGAGGGGTGCCA-3’。
8.根据权利要求3所述的利用鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记进行快速选育方法，其特征在于，LDR检测反应的体系为：
PCR产物1μL、10×PCR反应缓冲液1μL、0.5μM探针混合物1μL、40U/μLDNA连接酶0.05μL、加ddH2O至总体积10μL。
9.根据权利要求8所述的利用鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记进行快速选育方法，其特征在于，LDR检测反应的程序为：
94℃预变性2min、94℃变性30s、60℃退火2min，30个循环。
10.一种利用权力要求1所述鸡肌纤维类型性状相关基因的分子标记进行快速选育试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括PGC-1α基因的PCR扩增引物和LDR检测反应探针，PCR扩增引物为：
上游引物序列为：5’-TTCCATCGCCAAAATAAAAG-3’，
下游引物序列为：5’-GGAGTTGCTGTAGCCAAAAT-3’；
LDR检测反应探针为：
A探针PGC-1α_modify序列：
5’-P-TCGGGCATCGGGGAAGGGCTGGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’，
B探针PGC-1α_G序列：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCTCCTGGGGCGGAGGGGTGCCG-3’，
C探针PGC-1α_A序列：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCTCCTGGGGCGGAGGGGTGCCA-3’。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108676806A (zh) * 2018-03-26 2018-10-19 浙江大学 嘉兴黑猪tfb2m基因特征序列、引物及检测试剂盒
CN110079612A (zh) * 2019-05-14 2019-08-02 江苏省家禽科学研究所 一种与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的snp分子标记及其检测方法与应用
CN111676295A (zh) * 2020-05-28 2020-09-18 浙江省农业科学院 一种采食量调控相关基因的研究方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘宏祥: "两品种鸡生长模型探析及PGC-1α基因与肉品质及其相关基因表达的关联分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
刘宏祥等: "清远麻鸡PGC-1α基因多态性与肉质性状的相关性分析", 《中国农学通报》 *
束婧婷等: "PGC-1α基因在两种类型鸡骨骼肌间的表达差异", 《江苏农业学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108676806A (zh) * 2018-03-26 2018-10-19 浙江大学 嘉兴黑猪tfb2m基因特征序列、引物及检测试剂盒
CN108676806B (zh) * 2018-03-26 2020-08-04 浙江大学 嘉兴黑猪tfb2m基因特征序列及肉质性能鉴定方法
CN110079612A (zh) * 2019-05-14 2019-08-02 江苏省家禽科学研究所 一种与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的snp分子标记及其检测方法与应用
CN110079612B (zh) * 2019-05-14 2021-06-25 江苏省家禽科学研究所 一种与鸡体重、腿肌重和腿肌肌纤维性状相关的snp分子标记及其检测方法与应用
CN111676295A (zh) * 2020-05-28 2020-09-18 浙江省农业科学院 一种采食量调控相关基因的研究方法

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