CN101691612B - 鸡肉风味物质基因诊断试剂盒及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸡肉风味物质基因诊断试剂盒及使用方法，属于分子生物学技术领域，本发明试剂盒包括ADSL基因PCR扩增的上下游引物混合物P1、ADSL基因LDR反应的探针的混合物L1、A-FABP基因PCR扩增上下游引物混合物P2、A-FABP基因LDR反应的探针的混合物L2及Tag酶、DNA连接酶；所述的方法以LDR方法检测这两个基因的基因型，PCR扩增SNP位点所在片段，PCR产物的连接酶检测反应；ADSL基因第二外显子C3484T突变对IMP有显著影响，TT基因型个体的IMP含量最高且显著高于CC和CT；A-FABP基因第一外显子C51T突变对IMF有显著影响，TT基因型个体的IMP含量最高显著高于CC和CT，TTTT基因型组合为鸡肉风味物质含量最高的肉鸡个体。

Description

鸡肉风味物质基因诊断试剂盒及使用方法

技术领域

本发明涉及一种鸡肉风味物质基因诊断试剂盒及使用方法，属于分子生物学技术领域。 

背景技术

优质肉鸡业是我国的特色产业，越来越多的消费者开始追求鸡肉的风味，2008年生产量超过42亿只，市场份额已占到肉鸡总产量55％以上，并呈逐年上升趋势。以往只针对肉鸡生长性能和体组成的传统选育，降低了鸡肉风味物质下降，而仅凭传统选育手段，很难达到肉鸡产量、生长性能与鸡肉风味物质同时提高的目标。目前，随着分子生物学技术的发展，利用分子遗传标记来辅助选育既具有良好肉品质风味，又不影响肉鸡生长速度和体重的优质肉鸡品种已成为现代家禽育种的发展方向。 

优质肉鸡育种中肉质性状的选育是关键环节，而肉质的风味是肉质性状的一个非常重要的指标。肌肉肌苷酸(IMP)含量是影响肉质风味的重要因素，而腺苷琥珀酸裂解酶(ADSL)是IMP合成过程中的关键酶之一，对于最终肌肉肌苷酸含量具有重要的影响。肌内脂肪(IMF)与肉质和口感呈正相关，影响肉质的嫩度、剪切力、风味和多汁性，而脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因(A-FABP)的遗传变异对肌内脂肪(IMF)的含量有显著影响。近几年的研究表明，ADSL基因(季从亮等，2004；束婧婷等，2007)和A-FABP基因(Gerbens等，1998；叶满红，2003等；罗桂芬等，2006)，是影响肉品质风味的主效基因或与主效基因相连锁的基因，可作为鸡肉风味物质选择的分子遗传标记。 

连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)LDR是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。通过多重PCR(Multiplex PCR)获得含有待检测突变位点的基因片段，高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行，最后通过测序仪电泳读取检测结果。该技术具有特异性高、检测快速、通用性强、适用范围广、成本低廉等特点，目前已成功应用于人类疾病相关基因分子标记的SNP检测和基因诊断试剂盒的研发。 

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡肉风味物质基因诊断试剂盒及使用方法，在于为鸡肉风味物质相关基因的检测提供一种快速、简便、价格低廉的基因诊断方法，有利于筛选出风味物质含量最高的肉鸡个体，指导鸡肌肉风味物质的分子标记选育。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种鸡肉风味物质基因诊断试剂盒，其特征是，所述的试剂盒包括ADSL基因PCR扩增的上下游引物混合物P1、ADSL基因LDR反应的探针的混合物L1、A-FABP基因PCR扩增上下游引物混合物P2、A-FABP基因LDR反应的探针的混合物L2及Tag酶和DNA连接酶。 

ADSL基因PCR扩增的上下游引物混合物P1表示的信息为： 

ADSL上游引物序列5’-CACTGCTGTCCCAAAGCTG-3’  ， 

ADSL下游引物序列5’-GCAGGCAGGAAAATGAAAGT-3’。 

ADSL基因LDR反应的探针的混合物L1表示三根探针，三根探针表示的信息为： 

A探针ADSL_MODIFY序列： 

5’P-GAAGTTGCTCCAAGGTGAATGATGGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM 3’ 

B探针ADSL_C序列： 

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCGTGTTATCCCCTACGTAACAG-3’ 

C探针ADSL_T序列： 

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCGTGTTATCCCCTACGTAACAA-3’。 

A-FABP基因PCR扩增上下游引物混合物P2表示的信息为： 

A-FABP上游引物序列5’-GACCAGTTTGTGGGCACCT-3’， 

A-FABP下游引物序列5’-TTTCTCACCCAGCTCTTTCA-3’。 

A-FABP基因LDR反应的探针的混合物L1表示三根探针，三根探针表示的信息为： 

D探针A-FABP_MODIFY序列： 

5’P-AAGTTTTCACTAGAAAGGAGCTTCCTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM 3’ 

E探针A-FABP_C序列： 

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTACCCAGCTCTTTCATATAGTCCTCG-3’ 

F探针A-FABP_T序列： 

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCAGCTCTTTCATATAGTCCTCA-3’。 

所述方法包括下列步骤： 

1)、PCR扩增SNP位点所在片段； 

2)、PCR产物的连接酶检测反应。 

所述的PCR扩增SNP位点所在片段有以下步骤： 

1)、PCR扩增反应体系准备，在200μl的PCR薄壁管中，加入20μL PCR反应体系，充分混匀后短暂离心，最后加入20μl石蜡油；20μL PCR反应体系由1μl 50ng/μl DNA模板、2μl 10×PCR反应缓冲液、0.6μl 100mM Mg2+、2μl 20mM dNTP、4μl 5×Q-solution、0.2μl 5U/μl Tag酶、9.8ul ddH₂O、0.4μl 5pM/μl上下游引物混合物P1或P2组成； 

2)、在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上设置如下PCR扩增反应程序：先95℃变性15分钟；再经过35个循环，每个循环 包括94℃30秒、56℃复性1分钟30秒、72℃1分钟；然后72℃延伸5分钟、最后4℃保存；程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增； 

3)、反应结束后，取2μl反应产物点样在3.0％琼脂糖胶中，然后在0.5×TBE缓冲液中电泳40分钟，检测PCR产物扩增片段大小，以ADSL基因扩增产物片段为99bp，A-FABP基因扩增产物片段为75bp，判定PCR扩增片段是否正确； 

4)、剩余反应产物保存于-20℃。 

所述的PCR产物的连接酶检测反应有以下步骤： 

1)在PCR扩增产物中加入等体积dd H₂O稀释，作为连接反应的模板； 

2)在200μl的PCR薄壁管中，加入10μL连接酶检测反应体系，充分混匀后短暂离心，最后加入10μl石蜡油；10μL连接酶检测反应体系由1μl PCR产物、1μl 10×PCR反应缓冲液、1μl 0.5 pM/each探针混合物(L1或L2)、0.05μl 40U/μl DNA连接酶、6.95μl ddH₂O组成； 

3)在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上设置如下程序：先94℃2分钟，然后30个循环反应，每个循环包括94℃30秒、55℃2分钟，最后4℃保存，程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行连接反应； 

4)在每个上样孔中加入10μl Loading Buffer，0.25μl内参标记1μl ABI GS-500 ROX荧光标记分子量标准，最后加入0.5μl的LDR产物，充分混匀后上样，运用ABI377测序仪进行测序胶毛细管电泳； 

5)应用GENESCAN^TM672软件进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准；应用Genemapper软件进行数据分 析和基因分型，基因分型标准为ADSL基因连接产物检测出双峰86bp±0.5bp/88bp±0.5bp为CT基因型，单峰86bp±0.5bp为CC基因型，单峰88bp±0.5bp为TT基因型；A-FABP基因连接产物检测出双峰82±0.5bp/84±0.5bp为CT基因型，单峰82bp±0.5bp为CC基因型，单峰84bp±0.5bp为TT基因型。 

本发明依据国内外和本人对鸡肉风味物质和分子遗传学研究的结果，发现ADSL基因第二外显子C3484T突变对IMP有显著影响，TT基因型个体的IMP含量最高且显著高于CC和CT；A-FABP基因第一外显子C51T突变对IMF有显著影响，TT基因型个体的IMP含量最高显著高于CC和CT，这两个基因均在鸡肉风味物质形成过程中起调控作用。以LDR方法检测这两个基因的基因型，TTTT基因型组合为鸡肉风味物质含量最高的肉鸡个体。 

附图说明

图1为本发明试剂盒结构示意图； 

图2为ADSL基因PCR产物扩增结果图片； 

图3为A-FABP基因PCR产物扩增结果图片。 

图4为本发明分型截图，注：双峰表示杂合基因型，单峰表示纯合基因型；各个峰下面的矩形中的数值表示片段大小，如sz 85.80表示85.80bp。 

具体实施方式

结合附图和实施例进一步说明本发明，如图1所示，本发明试剂盒包括ADSL基因PCR扩增的上下游引物混合物P1，ADSL基因LDR反应的探针的混合物L1，A-FABP基因PCR扩增上下游引物混合物P2，A-FABP基因LDR反应的探针的混合物L2及Tag酶和DNA连接酶。 

本发明提供的鸡肉风味物质基因诊断试剂盒，是直接以受测鸡种的血液提取的DNA基因组为模板，利用LDR技术检测出ADSL和A-FABP的基因型，基因型组合共有9种——CCCC、CCCT、CCTT、CTCC、CTCT、CTTT、TTCC、TTCT、TTTT，其中TTTT基因组合型个体风味物质最丰富。该试剂盒包括表1所述成分。 

表1试剂盒组成 

P1表示用于ADSL基因PCR扩增的上下游引物混合物，具体引物信息如下： 

ADSL上游引物序列5’-CACTGCTGTCCCAAAGCTG-3’， 

ADSL下游引物序列5’-GCAGGCAGGAAAATGAAAGT-3’， 

扩增产物片段为99bp。 

P2表示用于A-FABP基因PCR扩增上下游引物混合物，具体引物信息如下 

A-FABP上游引物序列5’-GACCAGTTTGTGGGCACCT-3’， 

A-FABP下游引物序列5’-TTTCTCACCCAGCTCTTTCA-3’， 

扩增产物片段75bp。 

L1表示用于ADSL基因LDR反应的三根探针的混合物，三根探针具体信息如下： 

A探针ADSL_MODIFY序列： 

5’P-GAAGTTGCTCCAAGGTGAATGATGGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM 3’ 

B探针ADSL_C序列： 

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCGTGTTATCCCCTACGTAACAG-3’ 

C探针ADSL_T序列： 

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCGTGTTATCCCCTACGTAACAA-3’ 

若检测位点位点是C，则A，B探针经过LDR连接反应产物为86bp； 

若检测位点位点是T，则A，C探针经过LDR连接反应产物为88bp。 

L2表示用于ADSL基因LDR反应的三根探针的混合物，三根探针具体信息如下： 

D探针A-FABP_MODIFY序列： 

5’P-AAGTTTTCACTAGAAAGGAGCTTCCTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM 3’ 

E探针A-FABP_C序列： 

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTACCCAGCTCTTTCATATAGTCCTCG-3’ 

F探针A-FABP_T序列： 

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCAGCTCTTTCATATAGTCCTCA-3’ 

若检测位点位点是C，则D，E探针经过LDR连接反应产物为82bp； 

若检测位点位点是T，则D，F探针经过LDR连接反应产物为84bp。 

鸡肉风味物质基因诊断试剂盒的方法，其操作步骤如下： 

1 PCR扩增SNP位点所在片段 

1)PCR扩增反应体系准备 

按照表2所述，在200μl的PCR薄壁管中，加入20μL PCR反应体系，充分混匀后短暂离心，最后加入20μl石蜡油。 

鸡肉风味物质基因诊断试剂盒的方法，其操作步骤如下： 

1 PCR扩增SNP位点所在片段： 

1)PCR扩增反应体系准备，在200μl的PCR薄壁管中，加入20μL PCR反应体系，充分混匀后短暂离心，最后加入20μl石蜡油；20μL PCR反应体系由1μl 50ng/μl DNA模板、2μl 10×PCR反应缓冲液、0.6μl 100mM Mg2+、2μl 20mM dNTP、4μl 5×Q-solution、0.2μl 5U/μl Taq酶、9.8ul ddH₂O、0.4μl 5pM/μl上下游引物混合物P1或P2组成； 

2)在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上设置如下PCR 扩增反应程序：先95℃变性15分钟；再经过35个循环，每个循环包括94℃30秒、56℃复性1分钟30秒、72℃1分钟；然后72℃延伸5分钟、最后4℃保存；程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增； 

3)反应结束后，取2μl反应产物点样在3.0％琼脂糖胶中，然后在0.5×TBE缓冲液中电泳40分钟，检测PCR产物扩增片段大小，以ADSL基因扩增产物片段为99bp，A-FABP基因扩增产物片段为75bp，判定PCR扩增片段是否正确； 

4)剩余反应产物保存于-20℃。 

2 PCR产物的连接酶检测反应： 

1)在PCR扩增产物中加入等体积dd H₂O稀释，作为连接反应的模板； 

2)在200μl的PCR薄壁管中，加入10μL连接酶检测反应体系，充分混匀后短暂离心，最后加入10μl石蜡油；10μL连接酶检测反应体系由1μl PCR产物、1μl 10×PCR反应缓冲液、1μl 0.5pM/each探针混合物(L1或L2)、0.05μl 40U/μl DNA连接酶、6.95μl ddH₂O组成； 

3)在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上设置如下程序：先94℃2分钟，然后30个循环反应，每个循环包括94℃30秒、55℃2分钟，最后4℃保存，程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行连接反应； 

4)在每个上样孔中加入10μl Loading Buffer，0.25μl ABIGS-500 ROX荧光标记分子量标准，最后加入0.5μl的LDR产物，充分混匀后上样，运用ABI377测序仪进行测序胶毛细管电泳； 

5)应用GENESCAN^TM672软件进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准；应用Genemapper软件进行数据分 析和基因分型，基因分型标准为ADSL基因连接产物检测出双峰86bp±0.5bp/88bp±0.5bp为CT基因型，单峰86bp±0.5bp为CC基因型，单峰88bp±0.5bp为TT基因型；A-FABP基因连接产物检测出双峰82±0.5bp/84±0.5bp为CT基因型，单峰82bp±0.5bp为CC基因型，单峰84bp±0.5bp为TT基因型。 

例证结果说明 

按照本试剂盒的操作步骤，检测91日龄300只文昌鸡的ADSL和A-FABP的基因型，筛选出鸡肉风味物质最丰富的基因型组合TTTT个体。 

1、ADSL和A-FABP基因PCR扩增检测结果如图2、3所示； 

2、ADSL基因和A-FABP基因分型结果如表2所示； 

PCR产物连接酶反应检测后，经Genemapper数据分析的结果，ADSL基因和A-FABP基因两个SNP位点的分型截图见表2，结合ADSL和A-FABP基因分型结果，筛选出代表风味物质最丰富的文昌鸡个体——TTTT基因型组合个体。 

Claims (4)

1.一种鸡肉风味物质基因诊断试剂盒，其特征是，所述的试剂盒包括ADSL基因PCR扩增的上下游引物混合物P1、ADSL基因LDR反应的探针的混合物L1、A-FABP基因PCR扩增上下游引物混合物P2、A-FABP基因LDR反应的探针的混合物L2及Taq酶和DNA连接酶；

所述的P1是：

ADSL上游引物序列5’-CACTGCTGTCCCAAAGCTG-3’，

ADSL下游引物序列5’-GCAGGCAGGAAAATGAAAGT-3’；

所述的L1是：

A探针ADSL_MODIFY序列：

5’P-GAAGTTGCTCCAAGGTGAATGATGGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM 3’

B探针ADSL_C序列：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCGTGTTATCCCCTACGTAACAG-3’

C探针ADSL_T序列：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCGTGTTATCCCCTACGTAACAA-3’；

所述的P2是：

A-FABP上游引物序列5’-GACCAGTTTGTGGGCACCT-3’，

A-FABP下游引物序列5’-TTTCTCACCCAGCTCTTTCA-3’；

所述的L2是：

D探针A-FABP_MODIFY序列：

5’P-AAGTTTTCACTAGAAAGGAGCTTCCTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM 3’

E探针A-FABP_C序列：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTACCCAGCTCTTTCATATAGTCCTCG-3’

F探针A-FABP_T序列：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCAGCTCTTTCATATAGTCCTCA-3’。

2.一种使用权利要求1所述诊断试剂盒的方法，其特征是，所述方法包括下列步骤：

1)、PCR扩增SNP位点所在片段；

2)、PCR产物的连接酶检测反应。

3.根据权利要求2所述的使用权利要求1诊断试剂盒的方法，其特征是，所述的PCR扩增SNP位点所在片段有以下步骤：

1)、PCR扩增反应体系准备，在200μl的PCR薄壁管中，加入20μL PCR反应体系，充分混匀后短暂离心，最后加入20μl石蜡油；20μL PCR反应体系由1μl 50ng/μl DNA模板、2μl 10×PCR反应缓冲液、0.6μl 100mM Mg2+、2μl 20mM dNTP、4μl 5×Q-solution、0.2μl 5U/l Taq酶、9.8ul ddH₂O、0.4μl 5pM/μl上下游引物混合物P1或P2组成；

2)、在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上设置如下PCR扩增反应程序：先95℃变性15分钟；再经过35个循环，每个循环包括94℃30秒、56℃复性1分钟30秒、72℃1分钟；然后72℃延伸5分钟、最后4℃保存；程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增；

3)、反应结束后，取2μl反应产物点样在3.0％琼脂糖胶中，然后在0.5×TBE缓冲液中电泳40分钟，检测PCR产物扩增片段大小，以ADSL基因扩增产物片段为99bp，A-FABP基因扩增产物片段为75bp，判定PCR扩增片段是否正确；

4)、剩余反应产物保存于-20℃。

4.根据权利要求2所述的使用权利要求1诊断试剂盒的方法，其特征是，所述的PCR产物的连接酶检测反应有以下步骤：

1)在PCR扩增产物中加入等体积dd H₂O稀释，作为连接反应的模板；

2)在200μl的PCR薄壁管中，加入10μL连接酶检测反应体系，充分混匀后短暂离心，最后加入10μl石蜡油；10μL连接酶检测反应体系由1μl PCR产物、1μl 10×PCR反应缓冲液、1μl 0.5pM/探针混合物(L1或L2)、0.05μl 40U/μl DNA连接酶、6.95μl ddH₂O组成；

3)在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上设置如下程序：先94℃2分钟，然后30个循环反应，每个循环包括94℃30秒、55℃2分钟，最后4℃保存，程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行连接反应；

4)在每个上样孔中加入10μl上样缓冲液，0.25μl内参标记1μl ABI GS-500 ROX荧光标记分子量标准，最后加入0.5μl的LDR产物，充分混匀后上样，运用ABI377测序仪进行测序胶毛细管电泳；

5)应用GENESCAN^TM672软件进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准；应用Genemapper软件进行数据分析和基因分型，基因分型标准为ADSL基因连接产物检测出双峰86bp±0.5bp/88bp±0.5bp为CT基因型，单峰86bp±0.5bp为CC基因型，单峰88bp±0.5bp为TT基因型；A-FABP基因连接产物检测出双峰82±0.5bp/84±0.5bp为CT基因型，单峰82bp±0.5bp为CC基因型，单峰84bp±0.5bp为TT基因型。

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