CN109182479A - 一种实时荧光定量pcr通用型荧光探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种实时荧光定量PCR通用型荧光探针及其应用。通用型荧光探针，包括由5’端至3’端依次相连的核苷酸序列和荧光基团及淬灭基团，具体序列为：/淬灭基团A/cgTTCTACCCTCagAACg/荧光基团T/ACTGaaCCTGacCgTACA，或为：/荧光基团A/cgTTCTACCCTCagAACg/淬灭基团T/ACTGaaCCTGacCgTACA；所述荧光基团包括但不限于FAM、TET、Texas Red、VIC或Cy5，所述淬灭基团包括但不限于BHQ1或BHQ2。利用该通用荧光探针进行实时荧光定量PCR，可以实现实时检测，无需PCR后续处理，无需每次单独设计合成探针，节省探针设计和合成时间，具有易于操作、降低成本、结果稳定性好且易于分析的优势，具有很好的应用前景。

Description

一种实时荧光定量PCR通用型荧光探针及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种实时荧光定量PCR通用型荧光探针及其应用。
背景技术
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR，qR-PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。在各领域具有广泛的应用基础，包括临床疾病诊断、动物疾病检测、食品安全检测、医学、农牧、生物相关分子生物学定量等科学研究等等。
目前市场上qR-PCR采用较多的是荧光杂交水解探针。以TaqMan探针为例，此方法是通过在探针5 '端和3 '端上标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，在PCR过程中，只有当DNA聚合酶扩增到探针杂交结合到模板的位点时，其5 '-3 '核酸外切酶的活性切割掉探针5 '端的报告基团，游离的报告基团远离淬灭基团，打破能量的传递，激发报告基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到。但是这种方法，需要针对目的基因或突变位点设计特异性探针，不同基因或突变位点均需重新设计、合成，存在成本高且费时的问题。而且这种方法要求的因相隔距离近才能满足的荧光淬灭，可能会导致非杂交探针发生的非特异性背景荧光非常高。
而另一种使用较多的是由Tyagi 和Kramer发明的分子信标。分子信标(Molecular beacon，MB )是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近，在复性温度下，模板不存在时，形成茎环结构，当加热变性会使互补配对的茎环双链解开，从而，使得荧光基团与淬灭剂分开而发光。但是这种方法和TaqMan探针一样，不能直接检测DNA扩增，所以，生成的信号强弱，受到探针杂交效率的影响。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有实时荧光定量PCR技术存在的缺陷和不足，提供一种通过标记引物直接结合扩增产物，从而直接检测和定量的，节省设计和合成时间、降低成本、结果稳定性好且易于分析的用于实时荧光定量PCR的通用探针。
本发明的目的是提供一种实时荧光定量PCR通用型荧光探针。
本发明另一目的是提供所述实时荧光定量PCR通用型荧光探针的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种实时荧光定量PCR通用型荧光探针，包括由5’端至3’端依次相连的核苷酸序列和荧光基团及淬灭基团，具体序列如下：
/淬灭基团A/cgTTCTACCCTCagAACg/荧光基团T/ACTGaaCCTGacCgTACA，
或为：/荧光基团A/ cgTTCTACCCTCagAACg /淬灭基团T/ACTGaaCCTGacCgTACA；
所述荧光基团包括但不限于FAM、TET、Texas Red、VIC或Cy5，所述淬灭基团包括但不限于BHQ1或BHQ2。
本通用型探针所用序列，包含一段与人类基因序列相似性低于20%的相对独特序列，及标记了荧光基团和淬灭基团的茎环结构。使用时将通用探针、特异性上游引物和下游引物按一定比例混合为混合引物，对DNA模板进行PCR扩增，当PCR产物在延伸扩增过程中，茎环结构得以打开，荧光被检测到，从而以检测目标基因的表达。利用该通用荧光探针进行实时荧光定量PCR，可以实现实时检测，且无需PCR后续处理，无需每次单独设计合成探针，节省探针设计和合成时间，具有易于操作、降低成本、结果稳定性好。
另外，所述通用型荧光探针在作为实时荧光定量PCR探针中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
一种实时荧光定量PCR方法，是以上述通用型荧光探针作为探针进行实时荧光定量PCR。
优选地，所述的实时荧光定量PCR方法包括如下步骤：
S1. 提取样品核酸，并设计特异性检测上游引物和下游引物；
S2. 将权利要求1所述通用型荧光探针、上游引物和下游引物按比例混合；
S3. 配制PCR反应体系，进行实时荧光PCR扩增；
S4. 根据实时检测的荧光信号强度进行结果分析。
其中，步骤S1所述核酸包括基因组DNA、RNA或cDNA等。
具体地作为一个可选择的方案，当检测目标基因为基因RGMB时，所述特异性检测上游引物和下游引物的序列分别为：
上游引物RGMB F：GGCCTGGCCACTCATAGATA
下游引物RGMB R ：
ACTGAACCTGACCGTACATCATCTGTCACAGCTTGGTA。
作为另一个可选择的方案，当检测目标基因为基因GAPDH时，特异性检测上游引物和下游引物的序列分别为：
上游引物GAPDH F：AAGGTCATCCATGACAACTT
下游引物GAPDH R：
ACTGAACCTGACCGTACAGCCATCCACAGTCTTCTG。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种全新的实时荧光定量PCR通用型荧光探针，包含一段与人类基因序列相似性低于20%的相对独特序列，及标记了荧光基团和淬灭基团的茎环结构。使用时将通用探针、特异性上游引物和下游引物按一定比例混合为混合引物，对DNA模板进行PCR扩增，当PCR产物在延伸扩增过程中，茎环结构得以打开，荧光被检测到，从而以检测目标基因的表达。与现有普通荧光引物相比，利用该通用荧光探针进行实时荧光定量PCR，可以实现实时检测，无需PCR后续处理；与Taqman等荧光探针相比，无需每次单独设计合成探针，节省探针设计和合成时间，降低了成本，此通用探针兼具引物和探针双重功能，稳定性好也易于分析，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为实施例2利用本发明通用荧光探针检测基因RGMB的qR-PCR扩增曲线图。
图2为实施例3利用本发明通用荧光探针检测基因GAPDH的qR-PCR扩增曲线图。
图3为实施例4对于探针特异性和有效性的检测结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 通用荧光探针
1、一种实时荧光定量PCR通用型荧光探针，包括由5’端至3’端依次相连的核苷酸序列和荧光基团及淬灭基团，具体序列为：
/淬灭基团A/cgTTCTACCCTCagAACg/荧光基团T/ACTGaaCCTGacCgTACA，
或为：/荧光基团A/ cgTTCTACCCTCagAACg /淬灭基团T/ACTGaaCCTGacCgTACA；
所述荧光基团包括但不限于FAM、TET、Texas Red、VIC或Cy5，所述淬灭基团包括但不限于BHQ1或BHQ2。
2、上述通用型荧光探针的使用方法，即一种新的实时荧光定量PCR方法，是以所述通用型荧光探针作为探针进行实时荧光定量PCR，具体包括如下步骤：
S1. 提取样品核酸，并设计特异性检测上游引物和下游引物；
S2. 将所述通用型荧光探针、上游引物和下游引物按比例混合；
S3. 配制PCR反应体系，进行实时荧光PCR扩增；
S4. 根据实时检测的荧光信号强度进行结果分析。
其中，步骤S1所述核酸包括基因组DNA、RNA或cDNA等。
实施例2 通用荧光探针的应用
以基因RGMB为例，验证本发明通用型荧光探针的可行性和可靠性。
1、设计检测引物如下：
上游引物RGMB F：
GGCCTGGCCACTCATAGATA
下游引物RGMB R：
ACTGAACCTGACCGTACATCATCTGTCACAGCTTGGTA
2、扩增方法
（1）首先提取样品基因组DNA，然后将所述通用型荧光探针、上游引物和下游引物按比例混合，配制PCR反应体系（10μl）如下表1：
表1 PCR反应体系
（2）按上述反应体系进行实时荧光PCR扩增，扩增程序如下表2：
表2 PCR程序
（3）根据实时检测的荧光信号强度进行结果分析。
3、qR-PCR扩增曲线如图1所示，12例人组织样品中RGMB基因扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好 ，表明各管样本扩增效率接近。
实施例3 通用荧光探针的应用
以基因GAPDH为例，验证本发明通用型荧光探针的可行性和可靠性。
1、设计检测引物如下：
上游引物GAPDH F：AAGGTCATCCATGACAACTT
下游引物GAPDH R：
ACTGAACCTGACCGTACAGCCATCCACAGTCTTCTG
2、扩增方法
（1）首先提取样品基因组DNA，然后将所述通用型荧光探针、上游引物和下游引物按比例混合，配制PCR反应体系（10μl）如下表3：
表3 PCR反应体系
（2）按上述反应体系进行实时荧光PCR扩增，扩增程序同表2所示。
（3）根据实时检测的荧光信号强度进行结果分析。
3、qR-PCR扩增曲线如图2所示，12例人组织样品中GAPDH基因扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好 ，表明各管样本扩增效率接近。
实施例4 通用荧光探针的应用
另外，设置了四个实验组进行试验：
第一组：同时加了探针和cDNA；
第二组：没有加探针有加cDNA；
第三组：加cDNA和没有探针通用序列的引物；
第四组：有引物和探针但没有cDNA。
结果如图3所示，此图示样品分别（第一组）同时加了探针和cDNA；（第二组）没有加探针有加cDNA；（第三组）加cDNA和没有探针通用序列的引物；（第四组）有引物和探针但没有cDNA，扩增出的PCR产物依次的大小差异，证明探针的有效性和特异性。曲线图示探针用于绝对定量时，对标准品拷贝数检测拟合的曲线。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种实时荧光定量PCR通用型荧光探针，其特征在于，包括由5’端至3’端依次相连的核苷酸序列和荧光基团及淬灭基团，具体序列为：
/淬灭基团A/cgTTCTACCCTCagAACg/荧光基团T/ACTGaaCCTGacCgTACA，
或为：/荧光基团A/ cgTTCTACCCTCagAACg /淬灭基团T/ACTGaaCCTGacCgTACA。
2.根据权利要求1所述通用型荧光探针，其特征在于，所述荧光基团包括但不限于FAM、TET、Texas Red、VIC或Cy5，所述淬灭基团包括但不限于BHQ1或BHQ2。
3.权利要求1所述通用型荧光探针在作为实时荧光定量PCR探针中的应用。
4.一种实时荧光定量PCR方法，其特征在于，以权利要求1所述通用型荧光探针作为探针进行实时荧光定量PCR。
5.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 提取样品核酸，并设计特异性检测上游引物和下游引物；
S2. 将权利要求1所述通用型荧光探针、上游引物和下游引物按比例混合；
S3. 配制PCR反应体系，进行实时荧光PCR扩增；
S4. 根据实时检测的荧光信号强度进行结果分析。
6.根据权利要求5所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤S1所述核酸包括基因组DNA、RNA或cDNA。
7.根据权利要求5所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，当检测目标基因为基因RGMB时，特异性检测上游引物和下游引物的序列分别为：
上游引物RGMB F：GGCCTGGCCACTCATAGATA
下游引物RGMB R ：
ACTGAACCTGACCGTACATCATCTGTCACAGCTTGGTA。
8.根据权利要求5所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，当检测目标基因为基因GAPDH时，特异性检测上游引物和下游引物的序列分别为：
上游引物GAPDH F：AAGGTCATCCATGACAACTT
下游引物GAPDH R：
ACTGAACCTGACCGTACAGCCATCCACAGTCTTCTG。
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