CN107287304A - 一种基于hrm检测基因多态性的引物组合物的应用 - Google Patents

一种基于hrm检测基因多态性的引物组合物的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107287304A
CN107287304A CN201710519746.7A CN201710519746A CN107287304A CN 107287304 A CN107287304 A CN 107287304A CN 201710519746 A CN201710519746 A CN 201710519746A CN 107287304 A CN107287304 A CN 107287304A
Authority
CN
China
Prior art keywords
snp
primer
hrm
application according
primers
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710519746.7A
Other languages
English (en)
Inventor
廖翔
李洪波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Laibo Medical Technology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Laibo Medical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Laibo Medical Technology Co Ltd filed Critical Beijing Laibo Medical Technology Co Ltd
Priority to CN201710519746.7A priority Critical patent/CN107287304A/zh
Publication of CN107287304A publication Critical patent/CN107287304A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种基于HRM检测基因多态性的引物组合物的应用，该引物组合物包括正向引物F、反向引物R、SNP特异引物1和SNP特异引物2；正向引物F和反向引物R用于扩增基因中共有保守序列，正向引物F和SNP特异性引物1用于扩增等位基因1特异性序列，正向引物F和SNP特异性引物2用于扩增基因2特异序列；SNP特异引物1和SNP特异引物2其中之一为5’端增加了GC尾巴的修饰的SNP特异引物。本发明引物组合物应用于基于HRM检侧基因多态性时，其扩增出两个特异性片段，增加了各扩增产物Tm之间的差异，有效排除了假阳性结果，从而提高了结果的特异性和可靠性。

Description

一种基于HRM检测基因多态性的引物组合物的应用
技术领域
本发明涉及一种基于HRM检测基因多态性的引物组合物的应用，属于基因多态性(SNPs)检测领域。
背景技术
单核苷酸多态性即SNPs是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A、G、C、T)替换而引起的多态性，是新一代多态性遗传标记。SNPs在生物基因组中广泛存在，如人类30亿个碱基中每千个碱基出现一次，在整个基因组共有300万以上的SNPs。SNPs在人类疾病研究，尤其是精准医疗、肿瘤和遗传病的早期检测、胎儿遗传病筛查中具有重要应用价值。现在已知许多遗传病跟特定的基因位点变异有关，还有些药物的治疗效果跟个体的特定基因SNP型相关，例如氯吡格雷的治疗效果就与个体的特定基因SNP型相关，现有技术表明药物代谢酶的基因多态性是影响氯吡格雷疗效的主要因素，其是近年来精准医疗的热点。根据相关文献报道，CYP2C19*2的SNP型与氯吡格雷的治疗效果相关。CYP2C19*2基因型是CYP2C19基因的第5外显子在第681位的突变(681G/A)，可造成外显子5'端40bp碱基缺失，并改变之后的mRNA阅读框架，产生出一个无功能的蛋白(CYP2C19*2酶)。
鉴于SNPs的重要应用价值，目前已开发多种方法用于SNPs的检测，主要有以下几种：
(1)限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)，该方法利用限制性内切酶对PCR片段进行酶切，通过电泳区分片段，根据电泳结果区分是否存在SNP。
(2)变性梯度凝胶电泳(DGGE)，该方法利用长度相同的双链DNA片段解链温度不同的原理，通过梯度变性胶将DNA片段分开。
(3)测序法，对SNP所在DNA区段进行直接测序比较，即可明确不同材料SNP类型。
然而，上述电泳及其他常见的核酸变异分析技术需要复杂的处理，无法真正实现闭管操作，容易引起污染导致假阳性检测，难以实现批量自动化分析。
HRM技术是在定量PCR的基础上发展起来的后PCR分析方法，通过监测双链DNA熔解曲线的变化来区分DNA变异，其分辨率最高可以区分单碱基差异。扩增和分析都是在封闭的体系内自动完成，而且一次可以进行384个反应，有望克服上述现有检测SNPs技术的缺陷。然而，由于SNP差异引起的Tm值很小，该差异值仅略高于高精度仪器的分辨率，实验误差稍微高一点，就无法稳定地区分不同基因型，具体而言，单个碱基差异的双链DNA的熔解温度(Tm值)差异通常只有0.1～0.5℃，虽然仪器的温度分辨率能达到0.1℃，但是实际上由于重复性等因素影响，相同样品间的Tm值误差也在0.1～0.3℃，导致实验的稳定性差，结果可信度低。因此，HRM技术的以上缺陷严重限制了其在检测SNP中的应用。
因此，本领域亟需开发一种稳定性高，结果可信度高，简单方便，检测样品规模大的检测SNP的技术。
发明内容
有鉴于本领域对SNP检测的迫切需要，本发明的目的之一在于提供引物组合物或含其的试剂盒在制备基于HRM检测基因多态性的系统中的应用，该引物组合物能够应用于HRM，高效可靠的检测SNP。
为此，本发明提供一种引物组合物或含其的试剂盒在制备基于HRM检测基因多态性的系统中的应用；
所述引物组合物包括正向引物F、反向引物R、SNP特异引物1和SNP特异引物2；所述正向引物F和所述反向引物R用于扩增基因中共有保守序列，所述正向引物F和所述SNP特异性引物1用于扩增等位基因1特异性序列，所述正向引物F和所述SNP特异性引物2用于扩增等位基因2特异序列；
SNP特异引物1和SNP特异引物2其中之一为5’端增加了GC尾巴的修饰的SNP特异引物。
本发明中所述系统也可以称为一种“套组”或“套件”，其中包括了本发明中引物组合物或含其的试剂盒，亦可包括其他试剂、材料及仪器设备等组件，作为一种产品例如试剂套件的形式，各组件可按照预定的位置在大包装中分别放置或是独立包装后成套销售及使用。
本发明所述修饰的SNP特异引物是指在正常设计的SNP特异引物上进行修饰。
本发明通过实验证明通过在SNP特异引物1和SNP特异引物2其中之一的5’端增加GC尾巴，即单个SNP特异引物加GC尾巴，能够显著改变不同SNP型特异扩增产物的Tm。采用这种方式在不影响特异性的情况下，能使不同SNP型特异扩增产物的Tm相差高达2℃以上，该方式有效克服了HRM技术应用于检测SNP中的瓶颈。优选地，所述GC尾巴的长度为3～7。所述GC尾巴是指仅含G和C碱基的序列。此外，本发明实验结果证明，本发明引物组合物能够有效的排除假阳性结果，显著提高了结果的可信度，其正确率可达100％。
作为本发明前述应用的一具体实施方式，所述基于HRM检测基因多态性可包括如下步骤：
(1)将待检DNA样品、所述引物组合物、PCR扩增反应液及与双链DNA结合的荧光染料混合；
(2)对步骤(1)所得混合物实施PCR扩增；
(3)对步骤(2)所得PCR扩增产物进行HRM分析，判断待检测样品的SNP类型。
作为本发明前述应用的一具体实施方式，步骤(3)中HRM分析的温度范围为65～90℃，升温速度为0.02℃/sec。
作为本发明前述应用的一具体实施方式，步骤(2)中PCR扩增条件为：95℃/10sec，62℃/10sec，72℃/10sec，进行35～45个循环。
本发明所述的引用组合物可应用于检测基因CYP2C19*2的SNP型。在这种情况下，优选地，在基于HRM检测CYP2C19*2基因多态性的引物组合物中：
所述正向引物F为TTTTCCCACTATCATTGATTATTTCC(SEQ ID NO:1)；
所述反向引物R为GTCCCGAGGGTTGTTGAT(SEQ ID NO:2)；
所述SNP特异引物1为GGCGGCGTAATTTGTTATGGGTTCCT(SEQ ID NO:3)；
所述SNP特异引物2为TTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCCC(SEQ ID NO:4)。
优选地，所述正向引物、所述SNP特异引物1、所述SNP特异引物2与所述反向引物R的摩尔比为1～5：0.5～2：0.5～2：0.5～2。
作为本发明前述应用的一具体实施方式，所述试剂盒还包括与双链DNA结合的荧光染料。优选地，所述荧光染料为LC Green或Eva Green。
作为本发明前述应用的一具体实施方式，所述试剂盒还可包括dNTP、缓冲液和聚合酶中的一种或多种。
本发明所述引物组合物应用于基于HRM检侧基因多态性时，其扩增出两个特异性片段，增加了各扩增产物Tm之间的差异，有效排除了假阳性结果，从而提高了结果的特异性和可靠性。此外，本发明仅需使用普通、通用型PCR扩增方法和试剂，其通用性好、成本低，并且不需要对引物进行荧光修饰，研发和生产成本低，方法简便，能够一次分析数百个样品。
综上可知，本发明提供了前述引物组合物或含其的试剂盒在制备基于HRM检测基因多态性的系统中的应用。所述引物组合物是在单个SNP特异引物加GC尾巴，其能够显著改变不同SNP型特异扩增产物的Tm，有效克服了HRM技术应用于检测SNP中的瓶颈，具有重大的价值及广阔的市场前景。
附图说明
图1为本发明实施例1引物组合物扩增出的产物的HRM分析结果图。
图2为本发明对比例1引物组合物扩增出的产物的HRM分析结果图。
图3为本发明对比例2引物组合物扩增出的产物的HRM分析结果图。
图4为图3的局部放大图。
图5为本发明实施例2引物组合物扩增出的临床样品的产物的HRM分析结果图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1
本实施例提供用于检测CYP2C19*2的引物组合物及其应用，首先配制的全套引物组合物C2-PM(5:2:2:1)：
C2-PM是由终浓度为5μM F+2μM RG+2μM RA+1μM R组成的水溶液；
C2-PM中F为正向引物，其序列为：TTTTCCCACTATCATTGATTATTTCC(SEQ ID NO:1)；
RG为SNP特异性引物2，其序列为：TTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCCC(SEQ ID NO:4)；
RA为SNP特异性引物1，其序列为：GGCGGCGTAATTTGTTATGGGTTCCT(SEQ ID NO:3)；
R为反向引物，其序列为：GTCCCGAGGGTTGTTGAT(SEQ ID NO:2)。
取100μl 2×Premix Taq(日本Takara公司，货号R004A)，加入10μl 20×Eva绿(Eva Green,美国Biotium公司，货号31000)和50μl纯水，配制为通用1×mix。
取80μl通用1×mix，加10μl C2-PM配制为PCR反应液。
在384孔板中每孔加入9μl反应液、1μl 104拷贝/μl标准质粒C2A、C2G、C2AG(人工合成等位基因1和等位基因2的全序列，分别插入到克隆载体pUC57，得到两种SNP型特异的纯合子标准质粒C2A和C2G，将两种纯合子质粒等量混合得到杂合子标准质粒C2AG。)或者水，然后将其放入罗氏480 II(Roche 480 II)实时荧光定量PCR系统中，设置检测模式为：SYB绿/HRM染料(SYB Green/HRM dye)，反应体积10μl。预热：95℃，10min，进行PCR扩增。
本实施例等位基因1的全序列为：
TGGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCGGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTATTGATTGC(SEQ ID NO:5)。
本实施例等位基因2的全序列为：
TGGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCAGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTATTGATTGC(SEQ ID NO:6)。
PCR扩增条件为：95℃/10sec，60℃/10sec，72℃/10sec，进行45个循环，随后进行HRM分析，其中，熔解曲线分析温度范围为65～90℃，每℃读取25次，即升温速度0.02℃/sec。点击运行，开始实验。运行结束后，点击“分析(Analysis)”，选择分析方法“熔点曲线基因分型(Melt Curve Genotyping)”，使用仪器默认参数进行分析。
分型结果如图1，从图1中可以看出，本发明方法能很好地区分杂合子基因型和两种纯合子基因型以及空白对照。等位基因1纯合子只有等位基因1型特征峰(Tm＝73.1℃)和共有序列特征峰(Tm＝76.8℃)；等位基因2纯合子只有等位基因2型特征峰(Tm＝69.4℃)和共有序列特征峰；杂合子则是三个特征峰都有。空白对照只有等位基因1型特征峰，没有共有序列特征峰，很容易判断是假阳性。
对比例1
本对比例采用与实施例1相同的步骤进行，仅是采用C2-PM’代替实施例1中的C2-PM，其余步骤均相同，C2-PM’由5μM F+2μM RG+2μM RA组成，即相较于实施例1，C2-PM’未添加反向引物R，所得结果如图2所示，从图2中可以看出，空白对照有一个跟等位基因1型特征峰很相似的扩增产物峰，极易将其误认是等位基因1型纯合子，得出错误的结论。但若采用实施例1的引物组合物，则不会将空白对照误认为等位基因1型纯合子，这是因为在空白对照中，它没有出现共有序列特征峰，因此，可明确判断上述扩增产物峰为假阳性结果。对比实施例1与对比例1的结果可以明显看出，本发明引物组合物能够明显提高判断的可靠性，大大提高结果的可信度。鉴于在检测待检DNA样品的SNP时，标准实验操作都要求设置空白对照，即不加任何样品但是含有反应液中其它所有成分的反应体系，以判定扩增反应确实是样品特异性的，而不是反应液自身进行的非特异扩增，在这种情况下，在引物组合中加入反向引物将极有利于排除假阳性结果，提高实验结果的正确率。
对比例2
本对比例只采用共有序列引物进行常规HRM实验，具体实验步骤为:
本对比例采用与实施例1相同的步骤进行，仅是采用C2-PM”代替实施例1中的C2-PM，其余步骤均相同，其中，C2-PM”由5μM F+5μM R组成，即相较于实施例1，C2-PM”中只有正向引物F和反向引物R，没有SNP特异引物。
所得结果如图3所示，从图3中可以看出，Tm差异太小，无法区分出SNP型，将顶峰区域放大，如图4所示，从图4中肉眼勉强能看出三种峰值，分别是76.9、77.1和77.2℃，最大差异不过0.3℃，。分析软件将这些样品判定为同一个型，根本区分不开为哪种SNP。
实施例2
本实施例采用临床样品进行CYP2C19*2基因分型实验，共检测了50个临床样品，具体实施步骤为：
取480μl实施例1中通用1×mix，加60μl实施例1中C2-PM，配制为PCR反应液。
在384孔板中每孔加入9μl反应液及1μl 104拷贝/μl标准质粒C2A、C2G、C2AG(人工合成等位基因1和等位基因2的全序列，其序列同实施例1，分别插入到克隆载体pUC57，得到两种SNP型特异的纯合子标准质粒C2A和C2G，将两种纯合子质粒等量混合得到杂合子标准质粒C2AG。)作阳性对照，并以水作空白对照，及临床DNA样品(该临床样品是从血液中提取的DNA)，然后将其放入罗氏480 II(Roche480II)实时荧光定量PCR系统中，设置检测模式为：SYB绿/HRM染料(SYB Green/HRM dye)，反应体积10μl。预热：95℃，10min进行PCR扩增。PCR扩增条件为：95℃/10sec，60℃/10sec，72℃/10sec，进行45个循环，随后进行HRM分析，其中，熔解曲线分析温度范围为65～90℃，每℃读取25次，即升温速度0.02℃/sec。所得结果如图5所示，经与阳性对照比对，本实施例共检查出3个等位基因1型纯合子、21个等位基因2型纯合子，26个杂合子。为了验证结果的可靠性，本发明将上述PCR产物送交公司进行全序列测定，测序结果显示的基因型跟HRM分析结果完全一致，表明本实验检测SNP基因型的正确率为100％。
最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。
序列表
<110> 北京美莱博医学科技有限公司
<120> 一种基于HRM检测基因多态性的引物组合物的应用
<130> GAI17CN0108
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttttcccact atcattgatt atttcc 26
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcccgaggg ttgttgat 18
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggcggcgtaa tttgttatgg gttcct 26
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tttttaagta atttgttatg ggttccc 27
<210> 5
<211> 220
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tggcatattg tatctatacc tttattaaat gcttttaatt taataaatta ttgttttctc 60
ttagatatgc aataattttc ccactatcat tgattatttc ccgggaaccc ataacaaatt 120
acttaaaaac cttgctttta tggaaagtga tattttggag aaagtaaaag aacaccaaga 180
atcgatggac atcaacaacc ctcgggactt tattgattgc 220
<210> 6
<211> 220
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tggcatattg tatctatacc tttattaaat gcttttaatt taataaatta ttgttttctc 60
ttagatatgc aataattttc ccactatcat tgattatttc ccaggaaccc ataacaaatt 120
acttaaaaac cttgctttta tggaaagtga tattttggag aaagtaaaag aacaccaaga 180
atcgatggac atcaacaacc ctcgggactt tattgattgc 220

Claims (10)

1.引物组合物或含其的试剂盒在制备基于HRM检测基因多态性的系统中的应用；
所述引物组合物包括正向引物F、反向引物R、SNP特异引物1和SNP特异引物2；所述正向引物F和所述反向引物R用于扩增基因中共有保守序列，所述正向引物F和所述SNP特异性引物1用于扩增等位基因1特异性序列，所述正向引物F和所述SNP特异性引物2用于扩增等位基因2特异序列；
SNP特异引物1和SNP特异引物2其中之一为5’端增加了GC尾巴的修饰的SNP特异引物。
2.根据权利要求1所述的的应用，其中，所述基于HRM检测基因多态性包括如下步骤：
(1)将待检DNA样品、所述引物组合物、PCR扩增反应液及与双链DNA结合的荧光染料混合；
(2)对步骤(1)所得混合物实施PCR扩增；
(3)对步骤(2)所得PCR扩增产物进行HRM分析，判断待检测样品的SNP类型。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，步骤(3)中HRM分析的温度范围为65～90℃，升温速度为0.02℃/sec。
4.根据权利要求2所述的应用，其中，步骤(2)中PCR扩增条件为：95℃/10sec，62℃/10sec，72℃/10sec，进行35～45个循环。
5.根据权利要求2所述的应用，其中，所述GC尾巴的长度为3～7。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的应用，其中，所述基因为CYP2C19*2。
7.根据权利要求6中任一项所述的应用，其中，所述正向引物F为TTTTCCCACTATCATTGATTATTTCC；
所述反向引物R为GTCCCGAGGGTTGTTGAT；
所述SNP特异引物1为GGCGGCGTAATTTGTTATGGGTTCCT；
所述SNP特异引物2为TTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCCC；
优选地，所述正向引物、所述反向引物R、所述SNP特异引物1与所述SNP特异引物2的摩尔比为1～5：0.5～2：0.5～2：0.5～2。
8.根据权利要求1～5中任一项所述的应用，其中，所述试剂盒还包括与双链DNA结合的荧光染料。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述荧光染料为LC Green或Eva Green。
10.根据权利要求8所述的应用，其中，所述试剂盒还可包括dNTP、缓冲液和聚合酶中的一种或多种。
CN201710519746.7A 2017-06-30 2017-06-30 一种基于hrm检测基因多态性的引物组合物的应用 Pending CN107287304A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710519746.7A CN107287304A (zh) 2017-06-30 2017-06-30 一种基于hrm检测基因多态性的引物组合物的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710519746.7A CN107287304A (zh) 2017-06-30 2017-06-30 一种基于hrm检测基因多态性的引物组合物的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107287304A true CN107287304A (zh) 2017-10-24

Family

ID=60098614

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710519746.7A Pending CN107287304A (zh) 2017-06-30 2017-06-30 一种基于hrm检测基因多态性的引物组合物的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107287304A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111286552A (zh) * 2020-03-13 2020-06-16 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种鉴别鸭疫里默氏杆菌野毒株和疫苗株的pcr-hrm引物及方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101861402A (zh) * 2007-10-05 2010-10-13 株式会社百奥尼 引物序列内包含无碱基部分的、用于pcr扩增的引物
CN103898233A (zh) * 2014-04-18 2014-07-02 宁波大学 一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒及其检测方法
CN103923988A (zh) * 2014-04-04 2014-07-16 宋竞岩 用于检测等位基因cyp2c19*2的引物组合及检测试剂盒
CN104073556A (zh) * 2014-05-20 2014-10-01 宁波大学 一种辅助诊断糖尿病的检测试剂盒及其使用方法
CN104073548A (zh) * 2013-03-27 2014-10-01 沈迪 基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法及其试剂盒
CN104178561A (zh) * 2014-05-20 2014-12-03 宁波大学 一种辅助诊断2型糖尿病的检测试剂盒及其使用方法
CN104673882A (zh) * 2013-11-26 2015-06-03 宁波大学 Bud13-znf259基因单核苷酸多态性的检测方法、试剂盒和应用
CN106636337A (zh) * 2016-10-12 2017-05-10 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 一种基于多重hrm分析的氯吡格雷耐药基因检测方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101861402A (zh) * 2007-10-05 2010-10-13 株式会社百奥尼 引物序列内包含无碱基部分的、用于pcr扩增的引物
CN104073548A (zh) * 2013-03-27 2014-10-01 沈迪 基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法及其试剂盒
CN104673882A (zh) * 2013-11-26 2015-06-03 宁波大学 Bud13-znf259基因单核苷酸多态性的检测方法、试剂盒和应用
CN103923988A (zh) * 2014-04-04 2014-07-16 宋竞岩 用于检测等位基因cyp2c19*2的引物组合及检测试剂盒
CN103898233A (zh) * 2014-04-18 2014-07-02 宁波大学 一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒及其检测方法
CN104073556A (zh) * 2014-05-20 2014-10-01 宁波大学 一种辅助诊断糖尿病的检测试剂盒及其使用方法
CN104178561A (zh) * 2014-05-20 2014-12-03 宁波大学 一种辅助诊断2型糖尿病的检测试剂盒及其使用方法
CN106636337A (zh) * 2016-10-12 2017-05-10 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 一种基于多重hrm分析的氯吡格雷耐药基因检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
曹春鸽等: "应用HRM技术对CYP2C19*2 和CYP2C19*3 进行双重", 《遗传》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111286552A (zh) * 2020-03-13 2020-06-16 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种鉴别鸭疫里默氏杆菌野毒株和疫苗株的pcr-hrm引物及方法
CN111286552B (zh) * 2020-03-13 2022-06-24 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种鉴别鸭疫里默氏杆菌野毒株和疫苗株的pcr-hrm引物及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105861678B (zh) 一种用于扩增低浓度突变靶序列的引物和探针的设计方法
CN107406842A (zh) 检测基因组编辑
Wittwer et al. Nucleic acid techniques
JP6914831B2 (ja) 標的核酸の高感度検出方法
CN107119107A (zh) 一种检测人类cyp2c19基因多态性的方法及试剂盒
CN103923974A (zh) 一种检测egfr基因外显子20 t790m点突变的试剂盒和方法
Tucker et al. Genotyping by high-resolution melting analysis
Li et al. Rapid and sensitive screening and identification of CRISPR/Cas9 edited rice plants using quantitative real-time PCR coupled with high resolution melting analysis
CN104131092B (zh) 一种基于高分辨率熔解曲线的多snp鉴定方法
WO2019222835A1 (en) Sex identification of cannabis plants
CN101622363B (zh) 用于检测jak2基因的突变的探针及其用途
JP6490990B2 (ja) Ｃｙｐ２ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット、ｃｙｐ２ｃ１９遺伝子増幅用キット、遺伝子増幅方法、多型解析方法、及び薬効判定方法
KR20160106041A (ko) Ｎｒａｓ 및 ｂｒａｆ 핵산의 멀티플렉스 분석을 위한 조성물 및 방법
CN103103259A (zh) 确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒以及引物
CN108060213A (zh) 基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测snp位点用探针和试剂盒
CN107287304A (zh) 一种基于hrm检测基因多态性的引物组合物的应用
CN113249459A (zh) 用于精神分裂症患者用药指导的基因群检测的引物组及相关用途、相应的试剂盒和使用方法
CN114277108B (zh) 用于snp位点检测的引物探针组合、试剂盒和方法
JP5757909B2 (ja) 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用試薬キット
Zhang et al. Single nucleotide polymorphism genotyping of ALDH2 gene based on asymmetric PCR and fluorescent probe-mediated melting curves
CN105779570B (zh) 一种检测snp位点的方法
CN104073548A (zh) 基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法及其试剂盒
CN113981069A (zh) 检测adrb1基因g1165c多态性的引物、试剂盒及其检测方法和应用
CN106011298A (zh) 一种ApoE试剂盒、引物及其用途
CN109825572A (zh) 一种检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的试剂盒及其检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20171024

RJ01 Rejection of invention patent application after publication