CN109825572A - 一种检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括检测与异丙酚的敏感性相关基因的SNP位点5HT2A rs6313、Sodium channel rs6746030、GABRA1 rs2279020、GABRA2 rs11503014及CHRM2 rs2283265的特异性引物与对所述SNP位点进行单碱基延伸的单碱基延伸引物。本发明试剂盒能准确、快速、简便地检测与异丙酚的敏感性相关的基因位点；本发明检测方法，应用基因组学技术，能根据SNP位点碱基结果，确定患者对异丙酚的敏感性，从而能指导预测手术中异丙酚的用量，提供精准的异丙酚麻醉方案。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的试剂盒及其检测方法。
背景技术
目前，异丙酚是临床首选的一种新型的非巴比妥类静脉全麻药，由于其具有起效迅速、苏醒迅速完全、可控性强、不良反应少等优点，已广泛用于临床麻醉诱导、维持及辅助硬膜外麻醉。临床麻醉，对异丙酚的输注量有着极高的要求，异丙酚输注过多，会增加心血管系统、神经系统意外，如低血压(1.1％)、心动过缓(0.4％)，术后注意力、反应力、协调性削弱、记忆力下降，引发异丙酚输注综合征组织灌注不足，引发休克，严重造成患者死亡；异丙酚输注过低，会出现术中知晓，使患者在手术过程中异常痛苦。在临床手术过程中，异丙酚主要应用于机械通气患者的镇静过程，临床观察可见，长期应用异丙酚，会产生耐受现象，同时，异丙酚的需求量不同个体也存在很大差异性。所以在患者进行手术麻醉前，提前了解其对异丙酚的敏感性从而提供精准的异丙酚输注量显得尤为重要。
异丙酚的临床使用过程中每个个体之间的用量差异很大，而造成个体之间差异的遗传物质基础之一就是单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，SNPs在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。作为第三代遗传标志，SNP与人体许多表型差异、药物易感性与疾病易感性密切相关。SNP在基因组中的大量存在，使其成为一个强有力的工具，在疾病定位与克隆、药物的设计和测试以及生物学的基础研究中起了非常重要的作用。
个体化诊断治疗是未来医学发展的大方向。将个体化的靶点定位于某个基因，甚至是单个核苷酸，发现疾病的遗传标志物，将有助于根据每个患者的不同遗传背景来开展疾病预防、诊断和治疗。基因的SNP是形成个体间差异的重要遗传学基础，通过SNP与疾病和药物治疗的关联性分析，使得医生不仅可以通过所检测出的SNP预测、确定与疾病有关的基因，同时也将能够事先把握患者个体对于某种药物的反应特点，并根据这一特点选择治疗效果最好，不良反应等危险性最小的药物对患者进行精准治疗。
最近的研究表明：基因多态性在异丙酚的敏感性中有着重要作用，异丙酚的敏感性与 5HT2A rs6313、Sodium channel rs6746030、GABRA1 rs2279020、GABRA2 rs11503014及 CHRM2 rs2283265基因存在密切关系。因此，通过检测患者的异丙酚相应的基因来指导临床患者用药，对临床患者的异丙酚使用量进行精准调控，能使患者在整个用药期间更加安全，具有重要的意义。在个体化诊断与治疗快速发展的背景下，5HT2A rs6313、Sodiumchannel rs6746030、GABRA1 rs2279020、GABRA2 rs11503014及CHRM2 rs2283265与异丙酚敏感性的紧密联系使其成为极具医学潜力的SNP位点，因此急需找到一种简便易行的基因分型方法来满足精准医学的发展。
发明内容
本发明旨在提供一种检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的试剂盒及其检测方法，能准确、快速、简便地检测与异丙酚的敏感性相关的基因位点，根据SNP位点碱基结果，确定患者对异丙酚的敏感性。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的试剂盒，其不同之处在于：所述试剂盒包括五对SNP位点基因型的特异性引物与五条单碱基延伸引物，针对检测的基因为五个与异丙酚的敏感性相关基因：5HT2A、Sodium channel、GABRA1、GABRA2和CHRM2基因；
所述特异性引物是指针对5HT2A rs6313、Sodium channel rs6746030、GABRA1rs2279020、 GABRA2 rs11503014和CHRM2 rs2283265五个SNP位点，能特异性扩增出包括所述五个SNP 位点的DNA片段的引物对；
所述单碱基延伸引物是指对所述包括所述五个SNP位点的DNA片段进行单碱基延伸反应的引物。
在上述技术方案中，所述特异性引物序列如下：
5HT2A rs6313正向引物：ACGTTGGATGATTTTCAGAGTCGACTGTCC，
反向引物：ACGTTGGATGCCAGGCTCTACAGTAATGAC；
Sodium channel rs6746030正向引物：ACGTTGGATGGGTTTTCCTGATGTTCCACC，
反向引物：ACGTTGGATGTGCATGTCTTTCTTGTCAGG；
GABRA1 rs2279020正向引物：ACGTTGGATGACCACAGGCCAAAACATCTC，
反向引物：ACGTTGGATGAAGTGTGGTTCCAGAAAAGG；
GABRA2 rs11503014正向引物：ACGTTGGATGCGTCTCTCAATCATCAAGTC，
反向引物：ACGTTGGATGCCTTTTAGTTAGGGATTCGTG；
CHRM2 rs2283265正向引物：ACGTTGGATGATGAGGAAACAGGCTCATAG，
反向引物：ACGTTGGATGTCAGATCCTGTCACTGACAC。
在上述技术方案中，所述单碱基延伸引物序列如下：
5HT2A rs6313单碱基延伸引物：TCTACAGTAATGACTTTAACTC
Sodium channel rs6746030单碱基延伸引物：gaattTCTTTCTTGTCAGGTTGTGTA；
GABRA1 rs2279020单碱基延伸引物：gaCAGAAAAGGTAAATGCTTTAAT；
GABRA2 rs11503014单碱基延伸引物：GAGATTACTTCCTGGACT；
CHRM2 rs2283265单碱基延伸引物：AGTGACCTTAGGCAAGTT。
在上述技术方案中，所述试剂盒还包括：用于扩增样本中含有所述五个SNP位点的DNA的特异性引物的扩增反应液；用于纯化所述DNA的SAP酶的纯化反应液；用于得到所述五个SNP位点的碱基检测结果的单碱基延伸引物的延伸反应液。
本发明还提供了一种检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的检测方法，所述检测方法使用所述试剂盒，通过对所述五个SNP位点进行判断，寻找与疾病相关的位点，确定患者对异丙酚的敏感性。
在上述技术方案中，所述通过对SNP位点进行判断包括以下步骤：
步骤1)提取待检测样本的基因组DNA；
步骤2)以步骤1)得到的所述基因组DNA为模板，利用权利要求2所述特异性引物和权利要求4所述PCR扩增反应液进行PCR扩增反应扩增出含有SNP位点的一段DNA；
步骤3)使用SAP酶去掉步骤2)所得PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸和引物，得到样本DNA片段；
步骤4)向步骤3)所得反应液中加入权利要求1所述单碱基延伸引物，并采用单碱基延伸终止反应液对样本DNA进行单碱基延伸终止反应，将反应产物经树脂纯化后，得到用于SNP 分析的目的基因；
步骤5)经过基因型频率和等位基因频率计算，并检验Hardy-Weinberg平衡和MAF，通过Pearson卡方检验，分析步骤4)所得目的基因在位点上基因型和等位基因的差异，确定SNP位点的碱基，根据SNP位点碱基结果，确定患者对异丙酚的敏感性。
在上述技术方案中，步骤2)中进行PCR扩增反应的反应条件是：94℃预变性15min；94℃变性20s、56℃退火30s、72℃延伸1min，共进行45个循环；72℃延伸3min；4℃保存。
在上述技术方案中，步骤5)中根据SNP位点碱基结果，确定患者对异丙酚的敏感性时，当得到所述5HT2A基因rs6313位点的碱基结果表现为GG和GA基因型时，或当得到所述Sodium channel基因rs6746030位点碱基结果表现为AA和GA基因型时，或当得到所述GABRA1基因rs2279020位点碱基结果表现为GG基因型时，或当得到所述GABRA2 基因rs11503014位点碱基结果表现为CG基因型时，或当得到所述CHRM2基因rs2283265 位点碱基结果表现为CC基因型时，则提示患者对异丙酚敏感。
本发明的有益效果：
1).本发明提供的特异性引物及单碱基延伸引物可以准确的扩增和延伸与异丙酚的敏感性相关的基因，灵敏度高，特异性好。
2).本发明的试剂盒能准确、快速、简便地检测与异丙酚的敏感性相关的基因位点。
3).本发明提供的与异丙酚的敏感性相关基因多态性的检测方法，应用基因组学技术，根据SNP位点碱基结果，确定患者对异丙酚的敏感性，从而能指导预测手术中异丙酚的用量，提供精准的异丙酚麻醉方案。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用于限定本发明的范围。
本发明检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括五对SNP位点基因型的特异性引物与五条单碱基延伸引物，针对检测的基因为五个与异丙酚的敏感性相关基因：5HT2A、Sodium channel、GABRA1、GABRA2和CHRM2基因；
所述特异性引物是指针对5HT2A rs6313、Sodium channel rs6746030、GABRA1rs2279020、 GABRA2 rs11503014、CHRM2 RS2283265五个SNP位点，能特异性扩增出包括所述五个 SNP位点的DNA片段的引物对；
所述单碱基延伸引物是指对包括5HT2A rs6313、Sodium channel rs6746030、GABRA1rs2279020、GABRA2 rs11503014和CHRM2 RS2283265五个SNP位点的DNA片段进行单碱基延伸反应的引物。
聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)用于扩增位于两段已知序列之间的 DNA区域。每个PCR循环，反应混合体系都在模板变性、引物退火和引物延伸三种不同温度下依序温育。该过程可使用一种可编程序的温度热循环仪而达到自动化。
引物是PCR技术中的重要组成部分，它是一小段单链DNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。
本发明针对每个与异丙酚敏感性相关的基因位点分别设计了一条特异性正向引物、一条反向引物和一条单碱基延伸引物。正向引物最后一个核苷酸分别与异丙酚敏感性相关的基因位点所检测的碱基互补配对，在PCR扩增时联合反向引物对待测DNA模板进行特异性扩增。单碱基延伸引物对包括每个与异丙酚敏感性相关的基因位点的DNA片段进行单碱基延伸反应。
所述特异性引物序列如下：
5HT2A rs6313正向引物：ACGTTGGATGATTTTCAGAGTCGACTGTCC，
反向引物：ACGTTGGATGCCAGGCTCTACAGTAATGAC；
Sodium channel rs6746030正向引物：ACGTTGGATGGGTTTTCCTGATGTTCCACC，
反向引物：ACGTTGGATGTGCATGTCTTTCTTGTCAGG；
GABRA1 rs2279020正向引物：ACGTTGGATGACCACAGGCCAAAACATCTC，
反向引物：ACGTTGGATGAAGTGTGGTTCCAGAAAAGG；
GABRA2 rs11503014正向引物：ACGTTGGATGCGTCTCTCAATCATCAAGTC，
反向引物：ACGTTGGATGCCTTTTAGTTAGGGATTCGTG；
CHRM2 rs2283265正向引物：ACGTTGGATGATGAGGAAACAGGCTCATAG，
反向引物：ACGTTGGATGTCAGATCCTGTCACTGACAC。
所述单碱基延伸引物序列如下：
5HT2A rs6313单碱基延伸引物：TCTACAGTAATGACTTTAACTC；
Sodium channel rs6746030单碱基延伸引物：gaattTCTTTCTTGTCAGGTTGTGTA；
GABRA1 rs2279020单碱基延伸引物：gaCAGAAAAGGTAAATGCTTTAAT；
GABRA2 rs11503014单碱基延伸引物：GAGATTACTTCCTGGACT；
CHRM2 rs2283265单碱基延伸引物：AGTGACCTTAGGCAAGTT。
所述试剂盒还包括：
扩增反应液，所述扩增反应液用于扩增样本中含有5HT2A rs6313、Sodium channelrs6746030、 GABRA1 rs2279020、GABRA2 rs11503014及CHRM2 rs2283265位点的DNA，扩增反应液包括：10xPCR Buffer with 15mM MgCl2 0.5ul、25mM MgCl2 0.4ul、25mM dNTP混合液0.1ul、 0.5uM Primer mix 1ul、5U/μl HotStar Taq酶、10ng/ul DNA 1ul、HPLC级超纯水1.8ul。
纯化反应液，所述纯化反应液用于纯化扩增后的DNA片段，包括三蒸水1.53ul，SAPBuffer 0.17ul，1.7U/ul SAP酶0.3ul。
延伸反应液，所述延伸反应液用于得到所述五个SNP位点的碱基检测结果，包括：三蒸水0.619ul，iPLEX Buffer Plus 0.2ul，iPLEX Terminator mix 0.2ul，iPLEX ExtendPrimer Mix 0.94ul，iPLEX Enzyme 0.041ul及所述扩增反应液和纯化反应液7ul。
一种检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的检测方法，使用所述试剂盒，通过对所述五个SNP位点进行判断，寻找与疾病相关的位点，确定患者对异丙酚的敏感性。
所述通过对SNP位点进行判断包括以下步骤：
步骤1)提取待检测样本的基因组DNA；
步骤2)以步骤1)得到的所述基因组DNA为模板，利用权利要求2所述特异性引物和权利要求4所述PCR扩增反应液进行PCR扩增反应扩增出含有SNP位点的一段DNA；
步骤3)使用SAP酶去掉步骤2)所得PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸和引物，得到样本DNA片段；
步骤4)向步骤3)所得反应液中加入权利要求1所述单碱基延伸引物，并采用单碱基延伸终止反应液对样本DNA进行单碱基延伸终止反应，将反应产物经树脂纯化后，得到用于SNP 分析的目的基因；
步骤5)经过基因型频率和等位基因频率计算，并检验Hardy-Weinberg平衡和MAF，通过Pearson卡方检验，分析步骤4)所得目的基因在位点上基因型和等位基因的差异，确定SNP位点的碱基，根据SNP位点碱基结果，确定患者对异丙酚的敏感性。
当得到所述5HT2A基因rs6313位点的碱基结果表现为GG和GA基因型时，则提示患者对异丙酚敏感；当所述5HT2A基因rs6313位点的碱基结果表现为AA基因型时，则提示患者对异丙酚不敏感。
当得到所述Sodium channel基因rs6746030位点碱基结果表现为AA和GA基因型时，则提示患者对异丙酚敏感；当所述Sodium channel基因rs6746030位点碱基结果表现为GG 基因型时，则提示患者对异丙酚不敏感。
当得到所述GABRA1基因rs2279020位点碱基结果表现为GG基因型时，则提示患者对异丙酚敏感；当所述GABRA1基因rs2279020位点碱基结果表现为AA和AG基因型时，则提示患者不敏感。
当得到所述GABRA2基因rs11503014位点碱基结果表现为CG基因型时，则提示患者对异丙酚敏感；当所述GABRA2基rs11503014位点碱基结果表现为CC基因型时，则提示患者对异丙酚不敏感。
当得到所述CHRM2基因rs2283265位点碱基结果表现为CC基因型时，则提示患者对异丙酚敏感；当所述CHRM2基因rs2283265位点碱基结果表现为AA和CA基因型时，则提示患者对异丙酚不敏感。
本发明试剂盒的检测方法，扩增程序如下所示：
94℃预变性15min；94℃变性20s、56℃退火30s、72℃延伸1min，共进行45个循环；72℃延伸3min；4℃保存。
所述延伸反应液进行单碱基延伸的反应条件是：94℃30s；94℃5s，52℃5s-80℃5s，内部循环5次，外部循环40次；72℃180s；4℃保存。
实施例1
使用所述试剂盒检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的检测方法，步骤如下：
1、基因组DNA的提取
患者手术前两天，抽取患者的动脉血，收集与肝素抗凝管中，通过phenol-chloroform方法提取DNA。
2、SNP基因分型
确定与异丙酚敏感性相关的SNP位点，以SNP位点为中心截取100bp以上长度的基因序列，根据SNP的序列信息，采用AssayDesigner3.1软件进行引物设计后，合成引物。合成后的引物与样品DNA进行PCR反应，混合后的反应产物在Sequenom MassArray系统上进行SNP 基因分型。具体实验流程如下：
(1)引物设计
为多重反应自动设计PCR特异性引物及单碱基延伸引物：
5HT2A rs6313正向引物：ACGTTGGATGATTTTCAGAGTCGACTGTCC，
反向引物：ACGTTGGATGCCAGGCTCTACAGTAATGAC；
Sodium channel rs6746030正向引物：ACGTTGGATGGGTTTTCCTGATGTTCCACC，
反向引物：ACGTTGGATGTGCATGTCTTTCTTGTCAGG；
GABRA1 rs2279020正向引物：ACGTTGGATGACCACAGGCCAAAACATCTC，
反向引物：ACGTTGGATGAAGTGTGGTTCCAGAAAAGG；
GABRA2 rs11503014正向引物：ACGTTGGATGCGTCTCTCAATCATCAAGTC，
反向引物：ACGTTGGATGCCTTTTAGTTAGGGATTCGTG；
CHRM2 rs2283265正向引物：ACGTTGGATGATGAGGAAACAGGCTCATAG，
反向引物：ACGTTGGATGTCAGATCCTGTCACTGACAC。
5HT2A rs6313单碱基延伸引物：TCTACAGTAATGACTTTAACTC；
Sodium channel rs6746030单碱基延伸引物：GaattTCTTTCTTGTCAGGTTGTGTA；
GABRA1 rs2279020单碱基延伸引物：gaCAGAAAAGGTAAATGCTTTAAT；
GABRA2 rs11503014单碱基延伸引物：GAGATTACTTCCTGGACT；
CHRM2 rs2283265单碱基延伸引物：AGTGACCTTAGGCAAGTT。
(2)引物稀释
①稀释单管扩增特异性引物至终浓度100μM，加入去离子水充分振荡混匀使得各引物浓度为0.5μM。
②稀释单管单碱基延伸引物至终浓度500μM，加入引物混合后使得各引物浓度为8μM、10μM、15μM。
③按照DNA合成产品使用说明计算该条引物分子量、质量数和摩尔数，进而根据所需的浓度计算需加入去离子水的量。
(3)PCR扩增反应
①按照384板配置相关试剂。
②已经标化至10～20ng/μL的样本，1000g离心3分钟备用。
③将各PCR组份溶解后置于冰上备用(注意酶一定要保存在冰上，防止在高温中长时间暴露而失活)。
④扩增PCR反应组份见表1。
表1 Sequenom MassArray系统基因分型扩增PCR反应组分
⑤将上述配好的试剂小心混匀后分在12孔的连排管中，每孔加入混匀试剂148uL。
⑥12道移液器吸取混合试剂4μL加入到384孔板中，其中H11、H12、P11、P12 孔留作对照，其孔中不加入引物，只含其他组份。
⑦每板按照标记好的样本板加入相应的模板，加入体积为1μL。
⑧移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。
⑨扩增PCR反应程序：
⑩配置1％琼脂糖凝胶，每排留有25个孔，其中一个作为标记孔，其他加入PCR反应后的产物。
进行电泳，吸取2μL上样缓冲液，1μLPCR产物，电压110V，电流75mA，40分钟后观察结果，如结果良好可继续SAP反应。
(4)SAP反应
①按照384板配置相关试剂，SAP反应相关试剂配制组分见表2。
表2 SAP反应相关试剂配制组分
②将配置好的溶液均匀分配到96孔板中，每孔加入试剂量10μL/板。
③使用机械臂加入试剂，从96孔板中移液2μL到384板的每个孔中。
④移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。
⑤SAP反应程序：
| 温度(℃) | 时间 | 周期 |
| 37 | 40min | |
| 85 | 5min | |
| 4 | ∞ |
(5)单碱基延伸反应
①按照384板配置相关试剂，延伸反应相关试剂配制组分见表3。
表3延伸反应相关试剂组分
②将配置好的溶液均匀分配到96孔板中，每孔加入试剂量10μL/板。
③使用机械臂加入试剂，从96孔板中移液2μL到384孔板的每个孔中。
④移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。
⑤延伸反应程序：
| 温度(℃) | 时间 | 周期 |
| 94 | 30sec | |
| 94 | 5sec | |
| 52 | 5sec | 40cycles |
| 80 | 5sec | 50cycles |
| 72 | 3min | |
| 4 | ∞ |
(6)树脂纯化
完成去盐，导入Assay中，样本表格输入，建板，点样，MassARRAY分析，质量控制及输出报告等实验工作。具体流程如下：
去盐
①在384/6MG Dimple板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干。
②使用Liquid Handler机器臂在384样本板的每个孔中加16μL水。
③将384样本板轻轻翻转过来扣在Dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中。
④将384样本板放置离心机中室温旋转混匀60分钟。
导入Assay
①打开Typer4.0。
②选择Assay Editor。
③右键单击添加一个新的项目。
④右键新建项目名称或现有项目的名称并选择进口检测组。
⑤取消SNP Group选项，将自动取消设计文件和浏览阵列组(.xls文件)。
⑥可以键入一个新的阵列组ID或默认文件名。
⑦单击导入，然后关闭。
⑧关闭阵列编辑器。
样本表格输入
①根据384加样顺序创建样本清单。
②打开Typer4.0，选择Plate Editor。
③单击Sample Tab，右键新建样本文件夹。
④右键新建样本清单。
⑤打开并浏览创建的样本清单，输入样本组名称，导入完成。
建板
①打开Typer4.0。
②选择Plate Editor。
③右键单击添加新用户。
④右键单击添加新项目。
⑤右键单击添加板。
⑥板型ID和选择板式。
⑦找到Assay Tab。
⑧选中板中需添加的孔，右键单击并选择添加Assay。
⑨找到Sample Tab，选中板中需添加的孔，右键单击并选择添加Sample。
⑩保存板文件。
点样
①离心：去盐后的产物4,000转/分离心4分钟，使树脂沉淀。
②核查体积。
a)在主菜单中选择Transfer。
b)加载一个Method。
c)设定Dispense Speed参数。
d)选定Volume Check。
e)选Run并且观察体积。
f)依据体积调整Dispense Speed参数获得合适的体积。
③在芯片上点样，方法同体积核查步骤。
④在芯片上点Calibrant，注意在Method里选中Calibrant。
Mass ARRAY分析
①在RT计算机上打开RT程序。
②按下COMPACT上的Probe Scout Plate Out按钮，然后把芯片放到Scout板上并放回COMPACT中，然后按Probe In按钮。
③打开Chip Linker并连接CHIP和Plate。
a)双击Chip Linker。
b)找到在Plate Editor里建立的板。
c)选择iPLEX模式。
d)选择Genotype或者Genotype+Area模式。
e)选择Dispenser类型。
f)输入实验名称。
g)输入芯片条形码。
h)选择添加、创建。
④把条形码名称输入Acquire中，点击Barcode Report，结果正确后点击AUTO RUNSETUPtab。
⑤CHIP扫描。
质量控制
①打开Typer4.0，点击TypeAnalyzer。
②打开扫描结果。
③检查质控点。
④查看Assay的得率和分型图。
输出报告
①分型图。
②分别导出原始的基因分型数据和结合分型图后的基因分型数据。
③检查数据文件的完整性和正确性。
④将结果保存入相应存储媒介并递交生物信息室分析。
3、结果判定
经过基因型频率和等位基因频率计算，并检验Hardy-Weinberg平衡和MAF，通过Pearson卡方检验，分析基因在位点上基因型和等位基因的差异，确定SNP位点的碱基，根据SNP位点碱基结果，确定患者对异丙酚的敏感性。
当得到所述5HT2A基因rs6313位点的碱基结果表现为GG和GA基因型时，则提示患者对异丙酚敏感；当所述5HT2A基因rs6313位点的碱基结果表现为AA基因型时，则提示患者对异丙酚不敏感。
当得到所述Sodium channel基因rs6746030位点碱基结果表现为AA和GA基因型时，则提示患者对异丙酚敏感；当所述Sodium channel基因rs6746030位点碱基结果表现为GG 基因型时，则提示患者对异丙酚不敏感。
当得到所述GABRA1基因rs2279020位点碱基结果表现为GG基因型时，则提示患者对异丙酚敏感；当所述GABRA1基因rs2279020位点碱基结果表现为AA和AG基因型时，则提示患者不敏感。
当得到所述GABRA2基因rs11503014位点碱基结果表现为CG基因型时，则提示患者对异丙酚敏感；当所述GABRA2基rs11503014位点碱基结果表现为CC基因型时，则提示患者对异丙酚不敏感。
当得到所述CHRM2基因rs2283265位点碱基结果表现为CC基因型时，则提示患者对异丙酚敏感；当所述CHRM2基因rs2283265位点碱基结果表现为AA和CA基因型时，则提示患者对异丙酚不敏感。
本发明的试剂盒能准确、快速、简便地检测与异丙酚的敏感性相关的基因位点，本发明提供的与异丙酚的敏感性相关基因多态性的检测方法，应用基因组学技术，根据SNP位点碱基结果，确定患者对异丙酚的敏感性，从而能指导预测手术中异丙酚的用量，提供精准的异丙酚麻醉方案。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的保护范围。另外，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改或变型，所有的这些等价形式同样属于本申请所要求限定的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括五对SNP位点基因型的特异性引物与五条单碱基延伸引物，针对检测的基因为五个与异丙酚的敏感性相关基因：5HT2A、Sodium channel、GABRA1、GABRA2和CHRM2基因；
所述特异性引物是指针对5HT2A rs6313、Sodium channel rs6746030、GABRA1rs2279020、GABRA2rs11503014和CHRM2rs2283265五个SNP位点，能特异性扩增出包括所述五个SNP位点的DNA片段的引物对；
所述单碱基延伸引物是指对所述包括所述五个SNP位点的DNA片段进行单碱基延伸反应的引物。
2.根据权利要求1所述的检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物序列如下：
5HT2A rs6313正向引物：ACGTTGGATGATTTTCAGAGTCGACTGTCC，
反向引物：ACGTTGGATGCCAGGCTCTACAGTAATGAC；
Sodium channel rs6746030正向引物：
ACGTTGGATGGGTTTTCCTGATGTTCCACC，
反向引物：ACGTTGGATGTGCATGTCTTTCTTGTCAGG；
GABRA1rs2279020正向引物：
ACGTTGGATGACCACAGGCCAAAACATCTC，
反向引物：ACGTTGGATGAAGTGTGGTTCCAGAAAAGG；
GABRA2rs11503014正向引物：ACGTTGGATGCGTCTCTCAATCATCAAGTC，
反向引物：ACGTTGGATGCCTTTTAGTTAGGGATTCGTG；
CHRM2rs2283265正向引物：ACGTTGGATGATGAGGAAACAGGCTCATAG，
反向引物：ACGTTGGATGTCAGATCCTGTCACTGACAC。
3.根据权利要求1所述的检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述单碱基延伸引物序列如下：
5HT2A rs6313单碱基延伸引物：TCTACAGTAATGACTTTAACTC；
Sodium channel rs6746030单碱基延伸引物：
gaattTCTTTCTTGTCAGGTTGTGTA；
GABRA1rs2279020单碱基延伸引物：gaCAGAAAAGGTAAATGCTTTAAT；
GABRA2rs11503014单碱基延伸引物：GAGATTACTTCCTGGACT；
CHRM2rs2283265单碱基延伸引物：AGTGACCTTAGGCAAGTT。
4.根据权利要求1所述的检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的试剂盒，其特征在于：其还包括：
用于扩增样本中含有所述五个SNP位点的DNA的特异性引物的扩增反应液；
用于纯化所述DNA的SAP酶的纯化反应液；
用于得到所述五个SNP位点的碱基检测结果的单碱基延伸引物的延伸反应液。
5.一种检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的检测方法，其特征在于：使用如权利要求1～4任一项所述试剂盒，通过对所述五个SNP位点进行判断，寻找与疾病相关的位点，确定患者对异丙酚的敏感性。
6.根据权利要求5所述的检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的检测方法，其特征在于：所述通过对SNP位点进行判断包括以下步骤：
步骤1)提取待检测样本的基因组DNA；
步骤2)以步骤1)得到的所述基因组DNA为模板，利用权利要求2所述特异性引物和权利要求4所述PCR扩增反应液进行PCR扩增反应扩增出含有SNP位点的一段DNA；
步骤3)使用SAP酶去掉步骤2)所得PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸和引物，得到样本DNA片段；
步骤4)向步骤3)所得反应液中加入权利要求1所述单碱基延伸引物，并采用单碱基延伸终止反应液对样本DNA进行单碱基延伸终止反应，将反应产物经树脂纯化后，得到用于SNP分析的目的基因；
步骤5)经过基因型频率和等位基因频率计算，并检验Hardy-Weinberg平衡和MAF，通过Pearson卡方检验，分析步骤4)所得目的基因在位点上基因型和等位基因的差异，确定SNP位点的碱基，根据SNP位点碱基结果，确定患者对异丙酚的敏感性。
7.根据权利要求6所述的检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的检测方法，其特征在于：步骤2)中进行PCR扩增反应的反应条件是：94℃预变性15min；94℃变性20s、56℃退火30s、72℃延伸1min，共进行45个循环；72℃延伸3min；4℃保存。
8.根据权利要求6所述的检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的检测方法，其特征在于：步骤5)中根据SNP位点碱基结果，确定患者对异丙酚的敏感性时，当得到所述5HT2A基因rs6313位点的碱基结果表现为GG和GA基因型时，或当得到所述Sodium channel基因rs6746030位点碱基结果表现为AA和GA基因型时，或当得到所述GABRA1基因rs2279020位点碱基结果表现为GG基因型时，或当得到所述GABRA2基因rs11503014位点碱基结果表现为CG基因型时，或当得到所述CHRM2基因rs2283265位点碱基结果表现为CC基因型时，则提示患者对异丙酚敏感。
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Cited By (1)
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| CN112980946A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-06-18 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种指导骨骼肌松弛药罗库溴铵用药的基因多态性检测试剂盒及检测方法 |
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