CN102851358A - 糖尿病视网膜病变相关基因多态性检测试剂盒及其制备与用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，其包括与糖尿病视网膜病变相关的23个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点多重PCR预扩增引物和单碱基延伸引物序列，以及人外周血基因组DNA提取液、多重PCR预扩增反应液、阴性对照、阳性对照、预扩增产物纯化试剂、PCR产物单碱基延伸反应液和延伸产物纯化试剂；本发明还提供一种该试剂盒的制备方法，采用敏感性及特异性均较高的基因测序法检测糖尿病视网膜病变相关的SNP位点，可以快速、有效、准确、经济地检测出23个糖尿病视网膜病变相关基因多态性位点的基因型，为糖尿病视网膜病变的早期诊断和临床预后提供参考。

Description

糖尿病视网膜病变相关基因多态性检测试剂盒及其制备与用途

技术领域

本发明涉及糖尿病视网膜病变早期诊断和临床预后评价中相关基因多态性的检测试剂盒，以及该试剂盒制备和在糖尿病视网膜病变早期诊断和临床预后评价中的用途。本发明涉及的糖尿病视网膜病变相关的23个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，23个SNP位点突变或其中几个突变可诊断糖尿病视网膜病变以及评价该患者的临床预后状况。 

背景技术

目前，糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一，也是一种世界范围内主要的致盲性眼病，是遗传因素与环境因素共同作用的结果。目前仅能通过询问临床病史、观察患者是否具有典型的DR临床表现确诊。对于临床表型不典型的DR、潜在DR的糖尿病患者，以及发病初期的DR患者，由于缺乏基础临床表现而难以在做出准确诊断。 

糖尿病视网膜病变是一个多基因、多阶段疾病，其发病机制复杂，目前公认的学说有：醛糖还原酶途径、非酶性糖基化作用、蛋白激酶C激活、血管舒张性前列腺素产物、视网膜生长因子产生、视网膜毛细血管血流改变等，整个病理过程涉及代谢酶、炎症、细胞因子、信号转导及离子通道等相关基因的变化[Radha V，Rema M，Mohan V，et al.Genes and diabetic retinopathy.Indian J Ophthalmol 2002；50(1)：5-11.]。基因多态性是指人类基因组中同一位置的基因或DNA序列具有不同类型，在人群中具有一定的分布频率。在基因组中，不同个体DNA序列上的单个碱基的差异称为单核苷酸多态性。近年来，随着基因多态性与糖尿病视网膜病变关系的研究不断深入和扩展，已经筛选出可能与之相关的数十种基因。 

目前，还没有专门针对糖尿病视网膜病变相关基因进行检测的成熟产品和 方法。本发明针对世界范围内已报道的糖尿病视网膜病变相关基因多态性，发明了检测糖尿病视网膜病变23个相关基因多态性的试剂盒产品及其制备方法，其中分别为脂肪炎症因子的6个SNP位点、血管紧张素II 1型受体相关受体的5个SNP位点以及血管内皮生长因子A的12个SNP位点，可以快速、有效、准确、经济地检测出23个糖尿病视网膜病变相关基因多态性位点，为糖尿病视网膜病变的早期诊断和临床预后提供有价值的指导。 

发明内容

糖尿病视网膜病变是个多基因疾病，整个发病过程中涉及代谢酶、炎症、细胞因子、信号转导及离子通道等相关基因的变化，这些遗传基因多态性与DR的发病和发展密切相关。本发明遴选出与糖尿病视网膜病变密切相关的23个关键的单核苷酸多态性位点，其中分别为脂肪炎症因子的6个SNP位点、血管紧张素II 1型受体相关受体的5个SNP位点以及血管内皮生长因子A的12个SNP位点，通过提取基因组DNA并进行聚合酶链式反应(PCR)及测序检测SNP位点突变状况，早期诊断和临床预后评价糖尿病视网膜病变。 

本发明涉及一种快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括与糖尿病视网膜病变相关的23个单核苷酸多态性位点多重PCR预扩增引物和单碱基延伸引物。 

本发明涉及快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，包括与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点多重PCR预扩增引物，其序列如下： 

本发明涉及快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点单碱基延伸引物，其序列如下： 

本发明还提供一种快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒制备方法。该试剂盒包括：人外周血基因组DNA提取液、多重PCR预扩增反应液、阴性对照、阳性对照、多重PCR预扩增产物纯化试剂、单碱基延伸反应液和单碱基延伸产物纯化试剂； 

其中，人外周血基因组DNA提取液包括：去离子水，6M NaI，氯仿/异戊醇混合液，异丙醇和无水乙醇； 

多重PCR预扩增反应液包括：10×PCR缓冲液，2U-5U的Taq酶，0.2～1.0mM的dNTPs，如上所述的1-11SNP位点的多重PCR预扩增引物混合物，以及如上所述的12-23SNP位点的多重PCR预扩增引物混合物，该两种预扩增引物混合物的用量分别都为0.2μmol； 

阴性对照为去离子水； 

阳性对照为已知基因型人基因组DNA样品； 

多重PCR预扩增产物纯化试剂为虾碱性磷酸酶SAP和核酸外切酶ExoI； 

单碱基延伸反应液包括：5μl预反应混合液、如上所述的1-11SNP位点的多重PCR预扩增引物相对应的的11个单碱基延伸引物，与如上所述的12-23SNP位点的多重PCR预扩增引物相对应的的11个单碱基延伸引物混合物，上述两种延伸引物混合物的用量分别都为0.2μmol； 

单碱基延伸产物纯化试剂为6μl的碱性磷酸酶CIP。 

本发明还提供所述试剂盒在检测糖尿病视网膜病变相关的23个基因多态性中的应用，以及在早期诊断和临床预后提供指导中的用途。 

附图说明

图1表示本发明所述的人外周血基因组提取液提取基因组DNA的电泳图； 

图2表示本发明所述的每个SNP位点引物预扩增产物电泳图； 

图3表示本发明的试剂盒检测的每个SNP位点的峰图。 

具体实施方式

本发明通过自主设计筛选得到的糖尿病视网膜病变密切相关的基因的23个SNP位点多重PCR预扩增引物和单碱基延伸引物，提取得到的基因组DNA应用该多重PCR预扩增引物进行PCR扩增得到预扩增产物，经虾碱酶消化纯化后进行单碱基延伸反应，单碱基延伸产物纯化后上机基因测序，能快速、有效、准确、经济地检测出23个糖尿病视网膜病变相关基因多态性位点，制备成检测糖尿病视网膜病变密切相关基因多态性的试剂盒，并为糖尿病视网膜病变的早期诊断和临床预后提供重要的指导。 

对本发明涉及的检测糖尿病视网膜病变密切相关基因多态性的试剂盒进行具体说明。本发明涉及一种快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括与糖尿病视网膜病变相关的23个单核苷酸多态性位点预扩增引物和延伸引物序列。 

本发明涉及快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，包括与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点多重PCR预扩增引物，其序列如下： 

本发明涉及快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点单碱基延伸引物，其序列如下： 

本申请的引物采用本领域技术人员熟知的方法制备，如通过引物设计软件(例如Primer5.0、DNAstar等)，设计与糖尿病视网膜病变密切相关的23个SNP位点的多重PCR预扩增引物和单碱基延伸引物，设计得到的引物由专业公司进行合成，如大连宝生物公司、美国Invitrogen公司等。 

本发明涉及检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒的制备除了使用该23个SNP位点的多重PCR预扩增引物和单碱基延伸引物外，使用人外周血基因组DNA提取液、多重PCR预扩增反应液、阴性对照、阳性对照、多重PCR预扩增产物纯化试剂、单碱基延伸反应液和单碱基延伸产物纯化试剂来实施。 

人外周血基因组DNA提取液包括：去离子水，6M NaI，氯仿/异戊醇混合液，异丙醇和无水乙醇； 

多重PCR预扩增反应液包括：10×PCR缓冲液，2U-5U的Taq酶，0.2～1.0mM的dNTPs，如上所述的1-11SNP位点的多重PCR预扩增引物混合物，以及如上所述的12-23SNP位点的多重PCR预扩增引物混合物，该两种多重PCR预扩增引物混合物的用量分别都为0.2μmol； 

阴性对照为去离子水； 

阳性对照为已知基因型人基因组DNA样品； 

多重PCR预扩增产物纯化试剂为虾碱性磷酸酶SAP和核酸外切酶ExoI； 

单碱基延伸反应液包括：5μl预反应混合液、如上所述的1-11SNP位点的预扩增引物相对应的的11个单碱基延伸引物，与如上所述的12-23SNP位点的预扩增引物相对应的的12个单碱基延伸引物混合物，上述两种延伸引物混合物的用量分别都为0.2μmol； 

延伸产物纯化试剂为6μl的碱性磷酸酶CIP。 

采用本发明检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，对糖尿病视网膜病变患者来源的外周血样本进行检测本发明确定的与DR密切相关的23个单核苷酸多态性位点突变状况。本发明试剂盒对DR密切相关的23个单核苷酸多态性能达到检出率在99％以上，准确率在99％以上，检测时间在48小 时以内完成。因而，本发明试剂盒通过对与DR密切相关的23个单核苷酸多态性位点的检测，能用于早期诊断DR和临床预后评价，为患者和临床医生提供重要的指导。 

以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。 

实施例一 

糖尿病视网膜病变患者外周血样本23个SNP位点PCR预扩增 

来自糖尿病视网膜病变患者外周血10ml(与患者签署了知情同意书)，按外周血基因组DNA抽提纯化的方法抽提患者外周血中基因组DNA。提取的基因组DNA为多重PCR预扩增模板，取用1×TAE缓冲液加热溶解的1％(m/v)琼脂糖凝胶进行电泳，检测DNA质量，图1中显示13个DR外周血样本提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳后为单一条带，无杂带，表明PCR预扩增模板纯度很高。 

获取DR外周血样本基因组DNA模板后，进行多重PCR预扩增，目的富集延伸模板。多重PCR预扩增反应条件如下： 

1)PCR反应体系： 

针对与DR密切相关的23个SNP位点分两个多重PCR预扩增反应体系，其中一个使用到上述1-11SNP位点的上游和下游多重PCR预扩增引物，另一个为上述中12-23SNP位点的上游和下游多重PCR预扩增引物；10×Buffer、dNTP和Taq酶为kapa biosystems公司购买的，DNA为上述获得基因组DNA模板。 

2)将配制好的体系放入PTC-100PCR仪(MJ公司)中，应用扩增程序如下：95℃5分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，共32个循环；72℃8分钟。 

3)预扩增产物质检：取2μl多重PCR预扩增产物上样，取用1×TAE缓冲液加热溶解的1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳，检测DR外周血样本多重PCR预扩增23个SNP位点的扩增情况。 

图2中为一个DR外周血样本多重PCR预扩增23个SNP位点的情况，显示23个对应的SNP位点全部扩增获得，即与糖尿病视网膜病变密切相关的23个SNP位点全部PCR预扩增出来。 

预扩增产物纯化：每个DR外周血样本取每个预扩增产物3μl，用去离子水稀释到15μl混匀。取该混合产物用于纯化。纯化体系如下：37℃1小时，75℃15分钟。目的去除多余预扩增引物及dNTP，避免干扰后续延伸。 

其中SAP酶为Fermentas公司购买的、ExoI酶为NEB公司购买的。 

实施二 

糖尿病视网膜病变患者外周血样本23个SNP位点基因测序 

取实施例一种经虾碱酶消化纯化的PCR预扩增产物，进行单碱基延伸反应，单碱基延伸反应体系如下： 

1)延伸体系： 

针对与DR密切相关的23个SNP位点分两个单碱基延伸反应体系，其中一个使用到与权力要求书1中1-11SNP位点预扩增引物相对应的11个单碱基延伸引物，另一个为与权力要求书1中12-23SNP位点预扩增引物相对应的12个单碱基延伸引物；其中Ready Reaction Mix为ABI公司购买的。 

2)将配制好的延伸反应体系放入PTC-100PCR仪(MJ公司)中，延伸条件：96℃10秒，50℃5秒，60℃30秒，共27个循环。 

3)单碱基延伸产物纯化：6μl延伸反应产物加入0.5个活性单位CIP(NEB公司)；37℃1.0小时，75℃15分钟。 

4)向96孔板(Corning公司)中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液(0.5：8.5)9μl，PCR延伸产物1.0μl； 

5)96孔板放置PTC-100PCR仪中95℃变性3分钟，上3730XL测序仪(ABI公司)进行检测； 

6)数据分析：将检测得到的原始数据文件导入到分析软件(3730XL测序仪自带的，ABI公司)中进行分析。 

图3中显示测序仪检测的与DR密切相关的23个SNP每个位点的峰图，对23个SNP每个位点全部检出。 

实施三 

本发明提供的用于检测糖尿病视网膜病变密切相关的23个SNP位点的试剂盒制备，包括人外周血基因组DNA提取液、多重PCR预扩增反应液(含该23个SNP位点的预扩增引物)、阴性对照、阳性对照、多重PCR预扩增产物纯化试剂、单碱基延伸反应液(含该23个SNP位点的延伸引物)和单碱基延伸产物纯化试剂： 

人外周血基因组DNA提取液包括：100ml去离子水，10ml的6mol/L NaI，100ml氯仿/异戊醇混合液，50ml异丙醇和50ml无水乙醇； 

多重PCR预扩增反应液包括：120ul 10×PCR缓冲液、15μl的5U/μl Taq酶、20μl的2.5mM的dNTPs，23个SNP位点中11个SNP位点的多重PCR预扩增引物混合物20μl，10μmol/L，12个SNP位点的多重PCR预扩增引物混合物20μl，10μmol/L； 

阴性对照为5ml去离子水； 

阳性对照为50μl 50ng/μl已知多态性人基因组DNA样品； 

预扩增产物纯化试剂为500μl 1U/μl虾碱性磷酸酶(SAP)和10μl 20U/μl核酸外切酶ExoI； 

单碱基延伸反应液包括：500μl预反应混合液、23个SNP位点中与PCR预扩增对应的11个SNP位点的单碱基延伸引物混合物20μl，10μmol/L，与PCR预扩增对应的12个SNP位点的单碱基延伸引物混合物20μl，10μmol/L； 

单碱基延伸产物纯化试剂为50μl 1U/μl的碱性磷酸酶(CIP)。 

PCR用96孔板以及使用说明书。 

各组分进行分装，组装成试剂盒。 

实施四 

本发明制备的试剂盒对临床DR外周血样本的23个SNP检出率 

采集482例临床糖尿病视网膜病变外周血样本(与捐献者签署知情同意书)，采用本发明制备的检测糖尿病视网膜病变密切相关的23个SNP位点的试剂盒，根据实施例一所述的方法进行检测。全部检出，检出率100％。 

各位点检出率统计结果： 

Claims (5)

1.一种快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点多重PCR预扩增引物和单碱基延伸引物；其中，所述的与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点多重PCR预扩增引物的序列如下：

所述的与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点单碱基延伸引物的序列如下：

。

2.一种快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，其包括：人外周血基因组DNA提取液、多重PCR预扩增反应液、阴性对照、阳性对照、预扩增产物纯化试剂、PCR产物单碱基延伸反应液和延伸产物纯化试剂；

其中，人外周血基因组DNA提取液包括：去离子水，6M NaI，氯仿/异戊醇混合液，异丙醇和无水乙醇；

PCR预扩增反应液包括：10×PCR缓冲液，2U-5U的Taq酶，0.2～1.0mM的dNTPs，权利要求1所述的1-11SNP位点的预扩增引物混合物，以及权利要求1所述的12-23SNP位点的预扩增引物混合物，该两种预扩增引物混合物的用量分别都为0.2μmol；

阴性对照为去离子水；

阳性对照为已知基因型人基因组DNA样品；

预扩增产物纯化试剂为虾碱性磷酸酶SAP和核酸外切酶ExoI；

PCR产物单碱基延伸反应液包括：5μl预反应混合液、权利要求1所述的1-11SNP位点的预扩增引物相对应的的11个延伸引物，与权利要求1所述的12-23SNP位点的预扩增引物相对应的的11个延伸引物混合物，上述两种延伸引物混合物的用量分别都为0.2μmol；

延伸产物纯化试剂为6μl的碱性磷酸酶CIP。

3.一种如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其使用步骤如下：

步骤一，糖尿病视网膜病变患者外周血样本23个SNP位点PCR预扩增

取来自糖尿病视网膜病变患者外周血10ml，按外周血基因组DNA抽提纯化的方法抽提患者外周血中基因组DNA，取2μl用1×TAE缓冲液加热溶解的1％琼脂糖凝胶进行电泳，检测DNA质量，所述百分比为m/v；

获取的糖尿病视网膜病变患者外周血样本基因组DNA模板后，提取的基因组DNA为多重PCR预扩增模板，进行PCR预扩增，目的富集延伸模板； 

PCR预扩增反应条件如下：

1)PCR反应体系如下：

针对与糖尿病视网膜病变密切相关的23个SNP位点分两个预扩增反应体系，其中一个使用如权力要求1所述的1-11SNP位点的上游和下游多重PCR预扩增引物，另一个使用如权力要求1所述的12-23SNP位点的上游和下游多重PCR预扩增引物；DNA为上述获得基因组DNA模板。

2)将配制好的体系放入PTC-100PCR仪中，应用扩增程序如下：95℃，5分钟；94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，30秒；共32个循环；72℃，8分钟；

3)预扩增产物质检：取2μlPCR预扩增产物上样，取用1×TAE缓冲液加热溶解的1％琼脂糖凝胶电泳，检测DR外周血样本PCR预扩增23个SNP位点的扩增情况，所述百分比为m/v；

预扩增产物纯化：每个糖尿病视网膜病变外周血样本取每个预扩增产物3μl，用去离子水稀释到15μl混匀；取该混合产物用于纯化；纯化程序如下：37℃，1小时；75℃，15分钟；消化体系如下：

步骤二，糖尿病视网膜病变患者外周血样本23个SNP位点基因测序取上述经纯化的PCR预扩增产物，进行单碱基延伸反应，延伸反应体系如 下：

1)延伸体系：

针对与糖尿病视网膜病变密切相关的23个SNP位点分两个单碱基延伸反应体系，其中一个使用如权利要求1所述的1-11SNP位点多重PCR预扩增引物相对应的11个单碱基延伸引物，另一个使用如权力要求1所述的12-23SNP位点多重PCR预扩增引物相对应的12个单碱基延伸引物；

2)将配制好的延伸反应体系放入PTC-100PCR仪中，延伸条件：96℃，10秒；50℃，5秒；60℃，30秒；共27个循环；

3)延伸产物纯化：6μl延伸反应产物加入0.5个活性单位CIP；纯化条件：37℃，1.0小时；75℃，15分钟；

4)向96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液9μl，单碱基延伸产物1.0μl，该分子量内标和甲酰胺混合液中两者的体积比为0.5∶8.5；

5)96孔板放置PTC-100PCR仪中95℃变性3分钟，上3730XL测序仪进行检测；

6)数据分析：将检测得到的原始数据文件导入到分析软件中进行分析。

4.一种如权利要求1-3所述的快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒的制备方法。

5.根据权利要求1～3任一项所述的试剂盒在检测糖尿病视网膜病变相关的23个基因多态性中的应用。 

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