CN1987463B - 实时定量TaqMan MGB探针试剂盒 - Google Patents
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Abstract
实时定量TaqMan MGB探针试剂盒，包括提取血样DNA的试剂、PCR扩增反应试剂混合液、实时定量TaqMan MGB探针和扩增实时定量TaqMan MGB探针的正向引物和反向引物，实时定量TaqMan MGB探针的核苷酸序列位于如母系遗传线粒体耳聋基因序列SEQ ID NO：5所示的1487-1503bp区域中，即如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列CCGTCACTCT CCTCAAG。该实时定量TaqMan MGB探针试剂盒及正、反向引物特异性强、敏感性高，检测结果直观、准确可靠，适用于对母系遗传耳聋线粒体基因C1494T突变的大规模的筛查或预防性检查。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体用于诊断母系线粒体遗传耳聋疾病的探针及其用途，更具体的是涉及用于检测母系遗传线粒体耳聋基因C1494T突变的实时定量TaqMan MGB探针及其用途。本发明还涉及所述MGB探针及其相关产品在制备用于诊断母系遗传线粒体耳聋疾病的试剂盒或类似产品中的应用。
背景技术
氨基糖甙类抗生素(链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素及小诺霉素等)因其广谱高效的抗菌作用以及低廉的价格在临床上被广泛用于控制革兰氏阴性和阳性菌感染，但此类抗生素具有严重的耳毒性副作用，可使患者发生不可逆转的听力损失。近十年来研究发现，部分氨基糖甙类抗生素致聋患者有母系遗传家族史，并与线粒体DNA 12S rRNA基因(以下简称为线粒体基因，或mtDNA)第1494位C→T(以下简称C1494T突变)均质性点突变有关(Zhao H et al，American Journal of Human Genetics,2004,74:139-152；Wang Q et al，BiochemBiophys Res Commun.2006，340:583-588)。单次剂量的氨基糖甙类药物应用即可导致携带此突变个体的重度听力损失。根据目前己有的研究结果可知，几乎携带此突变的个体在应用不同剂量的氨基糖甙类抗生素后均发生严重或较严重的听力损失，是后天性获得性耳聋发生的重要原因。鉴于这一耳聋有明确的基因变化和诱发因素，使得该种耳聋成为一种可以预防的疾病。
线粒体基因C1494T突变(mtDNA C1494T突变)是新近明确的可以由氨基糖甙类药物单次剂量应用导致中毒耳聋的线粒体基因突变类型，在中国已发现线粒体基因C1494T突变突变母系遗传耳聋家系4个，各家系发病人数从2-28人不等，考虑到尚有很多同类家系尚未被发现、报道，以及此突变在散发性耳聋的致病机制中占有一定的比例，对这种耳聋的预防变得更为重要。其预防的关键环节在于通过筛查，检测发现携带mtDNA C1494T突变的个体，绝对禁止此类个体接触氨基糖甙类抗生素，从而避免严重的耳毒性反应发生。
自2004年发现mtDNA C1494T与耳聋的关系以来，对此突变的检测主要应用直接测序的方法，序列测定虽然是评价基因突变的有效方法，但成本高、步骤繁琐、耗时长，为解决这些问题我们设计了一种简单、快速、准确、减少污染而且成本低廉的检测方法，以满足对mtDNA C1494T突变进行广泛筛查的需要。
发明内容
本发明目的通过下述原理实现：
为了检测在母系遗传线粒体基因序列(SEQ ID NO:5)中的C1494T突变，设计覆盖所述基因序列的1494bp位点在内的TaqMan MGB探针，并且在该MGB探针片段的5’末端标记了荧光报告基团、3’末端标记了非荧光淬灭基团MGB，其中：如果MGB探针在1494bp相应的碱基C被替换为T，则称为突变型实时定量MGB探针(或突变型MGB探针、突变型TaqmanMGB探针)；如果MGB探针在1494bp相应的碱基仍旧是C，则称为野生型实时定量MGB探针(或野生型MGB探针、野生型Taqman MGB探针)；
由于突变型和野生型两种MGB探针的5’端荧光报告基团不同，即二者发射波长不同的荧光(不同波长的荧光在实时定量荧光PCR仪器上能被分别记录下来，在分析软件中以不同的颜色或不同的标记反映出来)，因此，突变型MGB探针能与发生C1494T突变的模板完全匹配而不能与野生型模板完全匹配；而野生型MGB探针不能与发生C1494T突变的模板完全匹配、而只能与野生型模板完全匹配；并且不同MGB探针结合模板可发射不同波长的荧光。
在实时定量PCR扩增体系中，加入用于扩增母系遗传线粒体耳聋基因序列SEQ ID NO:5的正向引物和反向引物(可以根据任何生物引物软件进行设计)，并加入突变型实时定量MGB探针，如果需要，还可加入野生型实时定量MGB探针。
由于MGB探针很短(12-25bp左右)，5′端荧光报告基团吸收能量后可将能量转移给邻近的3′端非荧光淬灭基团，而3′端非荧光淬灭基团则可抑制5’端荧光报告基团的荧光发射。因此，MGB探针完整时，即5’端荧光报告基团未脱离3’非荧光淬灭基团的屏蔽时，检测不到MGB探针5′端荧光基团发出的荧光。
在一个实施方案中，将引物和突变型MGB探针和野生型MGB探针同时加入实时定量PCR反应体系中。当体系中的模板变性后低温退火时，引物与MGB探针均与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至MGB探针结合处，Taq酶的5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链MGB探针不受影响)将MGB探针5′端连接的荧光报告基团从MGB探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3′端非荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，也就是荧光信号的强度与相应PCR产物量成线性函数关系。当模板为C1494T突变型时，则突变型MGB探针会与之全匹配结合，PCR反应中5’端荧光报告基团不断被Taq酶切下，脱离3′端非荧光淬灭基团的屏蔽，其荧光强度随PCR产物量的增多而不断增加。而野生型MGB探针因与之存在一个碱基的差别不能结合，故只检测到突变型MGB探针发射所对应的荧光信号；当模板为C1494C野生型时，野生型MGB探针会与模板全匹配结合，突变型MGB探针因与之存在一个碱基的差别不能结合，故只检测到野生型MGB探针发射所对应的荧光信号。由于突变型和野生型MGB探针的5’端分别连接不同的荧光报告基团，因此根据所发射的不同颜色的荧光，即可分辨出荧光所对应的模板，也就检测出样品中是否含有母系遗传线粒体耳聋基因。
在另一个实施方案中，在实时定量PCR反应体系中也可仅加入突变型MGB探针，当模板是突变型时，则最终可检测到突变型MGB探针发射所对应的荧光信号，因而确定样本含有母系遗传线粒体耳聋基因C1494T突变，从而确定患者患有母系线粒体遗传耳聋疾病；当模板是野生型时，则最终不能检测到突变型MGB探针发射所对应的荧光信号，因而确定样本不含有母系遗传线粒体耳聋基因C1494T突变，从而确定患者未患有母系线粒体遗传耳聋疾病。
也就是说，理论上，一个体系中仅加入针对C1494T突变型模板的突变型MGB探针即可进行检测。但是当同时加入的针对C1494C野生型模板的野生型MGB探针时，可以起到反向校正的双保险作用，从而使结果更为准确可靠。
本发明的实时定量TaqMan MGB探针，所述实时定量TaqMan MGB探针的核苷酸序列位于如母系遗传线粒体耳聋基因序列SEQ ID NO:5所示的1487-1503bp区域中，即如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列CCGTCACTCT CCTCAAG，并且在实时定量TaqMan MGB探针片段的5’末端标记了荧光报告基团、3’末端标记了非荧光淬灭基团MGB，称之为突变型MGB探针。
本发明的实时定量TaqMan MGB探针，其中还包含野生型MGB探针，野生型MGB探针的核苷酸序列位于如母系遗传线粒体耳聋基因序列SEQ ID NO:5所示的1488-1503bp区域中，即如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列CGTCACCCT CCTCAAG，并且5’端荧光报告基团不同于突变型实时荧光定量探针的5’端荧光报告基团、3’末端标记了与突变型MGB探针相同的非荧光淬灭基团MGB。
本发明的实时定量TaqMan MGB探针，其中所述突变型MGB探针5’末端的荧光报告基团是FAM荧光报告基团，突变型MGB探针的结构如下：
5'FAM-CCGTCACTCT CCTCAAG-MGB 3'
所述野生型MGB探针5’末端的荧光报告基团是HEX荧光报告基团，野生型MGB探针结构如下：
5'HEX-CGTCACCCT CCTCAAG-MGB 3'。
本发明的实时定量TaqMan MGB探针的正向引物和反向引物，正向引物(F1)是母系遗传线粒体耳聋基因序列SEQ ID NO:5所示的1464-1481bp核苷酸序列，即如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列GCCCTGAAGC GCGTACAC；反向引物(R1)则是母系遗传线粒体耳聋基因序列SEQ IDNO:5所示的1592-1615bp的核苷酸序列，即如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列TAAGCTACACTCTGGTTCGT CCAA。
本发明的实时定量TaqMan MGB探针试剂盒，包括提取血样DNA的试剂、PCR扩增反应试剂混合液、实时定量TaqMan MGB探针和扩增所述实时定量TaqMan MGB探针的正向引物和反向引物，所述实时定量TaqMan MGB探针的核苷酸序列位于如母系遗传线粒体耳聋基因序列SEQ ID NO:5所示的1487-1503bp区域中，即如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列CCGTCACTCTCCTCAAG，并且在实时定量TaqMan MGB探针片段的5’末端标记了荧光报告基团、3’末端标记了非荧光淬灭基团MGB，称之为突变型MGB探针，所述正向引物(F1)是母系遗传线粒体耳聋基因序列SEQ ID NO:5所示的1464-1481bp核苷酸序列，即如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列GCCCTGAAGC GCGTACAC；反向引物(R1)则是母系遗传线粒体耳聋基因序列SEQ ID NO:5所示的1592-1615bp的核苷酸序列，即如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列TAAGCTACACTCTGGTTCGT CCAA。
本发明的实时定量TaqMan MGB探针试剂盒，其中所述的反应试剂混合液是HotstarMastermix混合液；所述的正向引物和反向引物是等比例混和的；所述的提取血样DNA的试剂的主要成分为Chelex。
本发明的实时定量TaqMan MGB探针试剂盒，其中还包含野生型MGB探针，野生型MGB探针的核苷酸序列位于如母系遗传线粒体耳聋基因序列SEQ ID NO:5所示的1488-1503bp区域中，即如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列CGTCACCCT CCTCAAG，并且5’端荧光报告基团不同于突变型实时荧光定量探针的5’端荧光报告基团、3’末端标记了与突变型MGB探针相同的非荧光淬灭基团MGB。
本发明的实时定量TaqMan MGB探针试剂盒，其中所述突变型MGB探针5’末端的荧光报告基团是FAM荧光报告基团，突变型MGB探针的结构如下：
5'FAM-CCGTCACTCT CCTCAAG-MGB 3'
所述野生型MGB探针5’末端的荧光报告基团是HEX荧光报告基团，野生型MGB探针结构如下：
5'HEX-CGTCACCCT CCTCAAG-MGB 3'。
应当指出，5’端荧光报告基团及其相应的3’端非荧光淬灭基团可以是本领域中任何可用的荧光报告基团或非荧光淬灭基团，并且对于本领域技术人员而言，选择这些荧光报告基团及其相应的非荧光淬灭基团也是众所周知的常规技术。例如，荧光染料FAM和HEX可以由其他荧光基团或染料代替，如VIC、JOE等。
上述试剂盒中所述的提取血样DNA的试剂为提取足根血DNA的溶液I，其主要成分为Chelex(ABI公司产品)；或者提取血样DNA的试剂为外周血DNA提取试剂，选用市售产品配套使用。
应当指出，术语“试剂盒”是还应当包括具有不同于试剂盒的名称，但与试剂盒具有类似结构或组分以及生物学功能的生物学产品。
检测母系遗传线粒体耳聋基因C1494T突变与现有技术(如Hae III酶切鉴定方法)相比有以下优点：
1.本发明检测线粒体基因C1494T突变操作步骤和反应时间均较为直接测序法有明显优势：本发明仅需一次PCR过程即可检测出是否存在mtDNA C1494T突变，较测序方法相比简省了PCR后的琼脂糖凝胶电泳检测、PCR产物纯化、测序反应、测序反应产物纯化四个步骤，不仅减少了PCR反应后处理带来的污染风险，还将操作及反应时间由原来的最短12个小时缩短到1.5小时。
2.本发明两条MGB探针设计分别针对C1494T突变型和C1494C野生型，当共同存在于同一体系时每种MGB探针只与序列与其完全匹配的模板结合，故特异性极强。对一份模板而言，如果检测到突变型MGB探针的5’端荧光(如FAM荧光)，未检测到野生型MGB探针的5’端荧光(如HEX荧光)可以肯定为C1494T突变型；如果反之则可肯定为C1494C野生型。并且理论上，一个体系中仅加入针对C1494T突变型模板的突变型MGB探针即可进行诊断。但是当同时加入两种MGB探针时，可以起到反向校正的双保险作用，从而使结果更为准确可靠。此外，MGB探针技术的高特异性和光谱技术的敏感性赋予了本发明重复性好、特异性强、敏感性高和易操作等优点。
3.本发明的结果判读在实时定量PCR仪器的分析软件支持下进行，具有自动化的优点，减少了人为的误差。
4.应用本发明提供的试剂盒或相关产品进行C1494T突变检测，成本较其他常规检测方法更低。
由此可见，本发明的MGB探针及其试剂盒填补了国内相关检测领域的空白，并且其操作简便、判读直观、特异性强、敏感性高、价格低廉等优点为在全国范围内实行母系遗传线粒体耳聋基因C1494T突变的筛查和抗生素应用前预防性检测提供了更为便利的条件，从而根本上减少对氨基糖甙类抗生素敏感的个体发生药物性耳聋的机会。
附图说明
图1所示72例不同基因型的实时定量PCR检测的部分结果图(Allelic data for CyclingA.FAM/Sybr,Cycling A.JOE)。
图2所示72例不同基因型的实时定量PCR检测的部分结果图的图例。
具体实施方式
母系遗传耳聋线粒体基因C1494T突变的检测
1.检测样本
从中国人民解放军总医院聋病分子诊断中心聋病资源库选取感音神经性耳聋患者72人，从被检个体提取外周全血DNA(袁慧军等，中华耳鼻咽喉科杂志，1998，33(2)：67-70；李为民等，临床耳鼻咽喉科杂志，2001，15(增刊):53-58)，作为检测样本。
2.MGB探针和引物设计
根据己公开的线粒体基因序列(Cambridge Sequence或NCBI人线粒体基因组序列NC_001807.4或NT_006713.14等，或序列号SEQ ID NO:5)，使用Genetool Lite程序协助设计引物和Taqman MGB探针序列，其中：
突变型MGB探针(T1)的核苷酸序列位于如母系遗传线粒体耳聋基因序列SEQ ID NO:5所示的1487-1503bp区域中(如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列)，并且荧光报告基团是FAM荧光报告基团，荧光淬灭基团是TAMRA荧光淬灭基团，MGB探针结构如下：
5'FAM-CCGTCACTCTCCTCAAG-MGB 3'
野生型MGB探针(T2)的核苷酸序列位于如母系遗传线粒体耳聋基因序列SEQ ID NO:5所示的1488-1503bp区域中(如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列)，并且荧光报告基团是HEX荧光报告基团，荧光淬灭基团是TAMRA荧光淬灭基团，MGB探针结构如下：
5'HEX-CGTCACCCTCCTCAAG-MGB 3'
正向引物(F1)是母系遗传线粒体耳聋基因序列SEQ ID NO:5所示的1464-1481bp核苷酸序列，其序列为序列表中的SEQIDNO:3；反向引物(R1)是则是其所示的1592-1615bp的核苷酸序列，其序列为序列表中的SEQ ID NO:4。
3.PCR扩增反应
根据上述设计的MGB探针核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、以及引物序列SEQID NO:3、SEQ ID NO:4，通过人工合成得到MGB探针T1、T2、正向引物F1和反向引物R1，并以上述提取的被测样本的外周血DNA为模板，进行实时定量PCR扩增反应：
反应体系：
另外，如果需要，加入1μl的T2(2pmol/l)
加三蒸水至20μl体积。
反应条件如表1所示：
95℃变性10分钟后，接着95℃变性30秒，60℃退火30秒,，共进行40个循环，在每个循环退火时采集荧光。
表1
4.结果
72名受检对象中以实时定量Taqman MGB探针法共检测到10人携带mtDNA的C1494T突变。
附图中不带圆圈标记的线为记录到的FAM荧光,带圆圈标记的线为记录到的HEX荧光。软件分析结果见表2。
5.实时定量Taqman MGB探针法可靠性的检验
所有被检测个体的1494bp位点均经过直接测序法进行验证，结果证明根据实时定量Taqman MGB探针法检测到的携带C1494T突变的10名耳聋患者和不携带C1494T突变的62名个体，与直接测序法结果一致，两种方法的吻合率为100％，说明使用本发明方法检测C1494T突变的可靠性和稳定性。具体数据参见表2。
表2
Claims (3)
1.一种实时定量TaqMan MGB探针试剂盒，其特征在于：包括提取血样DNA的试剂、PCR扩增反应试剂混合液、实时定量TaqMan MGB探针和扩增所述实时定量TaqMan MGB探针的正向引物和反向引物，所述实时定量TaqMan MGB探针的核苷酸序列位于如母系遗传线粒体耳聋基因序列SEQ ID NO:5所示的1487-1503bp区域中，即如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列CCGTCACTCT CCTCAAG，并且在实时定量TaqMan MGB探针片段的5’末端标记了荧光报告基团、3’末端标记了非荧光淬灭基团MGB，称之为突变型MGB探针，所述正向引物(F1)是母系遗传线粒体耳聋基因序列SEQ ID NO:5所示的1464-1481bp核苷酸序列，即如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列GCCCTGAAGC GCGTACAC；反向引物(R1)则是母系遗传线粒体耳聋基因序列SEQ ID NO:5所示的1592-1615bp的核苷酸序列，即如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列TAAGCTACACTCTGGTTCGT CCAA。
2.根据权利要求1所述的实时定量TaqMan MGB探针试剂盒，其特征在于：所述的反应试剂混合液是Hotstar Mastermix混合液；所述的正向引物和反向引物是等比例混和的；所述的提取血样DNA的试剂的主要成分为Chelex。
3.根据权利要求2所述的实时定量TaqMan MGB探针试剂盒，其特征在于：突变型MGB探针5’末端的荧光报告基团是FAM荧光报告基团，突变型MGB探针的结构如下：
5'FAM-CCGTCACTCT CCTCAAG-MGB 3'
野生型MGB探针5’末端的荧光报告基团是HEX荧光报告基团，野生型MGB探针结构如下：
5'HEX-CGTCACCCT CCTCAAG-MGB 3'。
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