KR20090111268A - 모계 유전성 청각장애와 관련있는 미토콘드리아 유전자의Ｃ1494Ｔ 돌연변이를 검출하기 위한 ＴａｑＭａｎ ＭＧＢ프로브 및 그 용도 - Google Patents
모계 유전성 청각장애와 관련있는 미토콘드리아 유전자의Ｃ1494Ｔ 돌연변이를 검출하기 위한 ＴａｑＭａｎ ＭＧＢ프로브 및 그 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 모계 유전성 청각장애와 관련있는 미토콘드리아 유전자의 C1494T 돌연변이 검출에 사용가능한 실시간 정량적 MGB 프로브 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서는 각각의 Taqman 돌연변이형, 야생형 MGB 프로브와, 한 쌍의 프라이머를 제작하였다. 실시간 정량적 Taqman MGB 프로브 방법에 의해 모계 유전성 청각장애와 관련있는 미토콘드리아 유전자의 C1494T 돌연변이의 유전자형을 분석한다. 따라서, 모계 유전성 청각장애를 진단할 수 있다.
Description
본 발명은 유전공학 분야에 속하는 것으로서, 특히 미토콘드리아 유전자의 돌연변이와 관련있는 모계 유전성 청각장애를 진단하는 프로브 및 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 모계 유전성 청각장애와 관련있는 미토콘드리아 유전자의 C1494T 돌연변이를 검출하는데 사용되는 실시간 정량 TaqMan MGB 프로브 및 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 미토콘드리아 유전자의 돌연변이와 관련있는 모계 유전성 청각장애를 진단하는데 사용되는 키트 또는 유사 제품을 제조함에 있어서의, 상기 MGB 프로브 및 관련 제품의 용도를 포함한다.
아미노글리코사이드 유형의 항생제(스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 토브라마이신 및 마이크로노마이신 등)는 넓은 항균 스펙트럼 효과와 저렴한 가격으로 인하여 임상에서 그람 음성균과 양성균 감염의 치료에 널리 사용되고 있다. 그러나, 이러한 항생제는 심각한 청각독성 부작용을 가지고 있어, 환자에게서 돌이킬 수 없는 청력상실을 초래하기도 한다. 최근 10년간의 연구에 따르면, 일부 아미노글리코사이드로 인해 청각장애가 발생된 환자들은 모계 유전력과 관련 있으며, 아울러 미토콘드리아 DNA 12S rRNA 유전자(이하, 미토콘드리아 유전자 또는 mtDNA로 약칭함)의 제1494위치에서 C→T(이하 C1494T 돌연변이로 약칭함) 상동적인 점 돌연변이와 관련있는 것으로 밝혀졌다(Zhao H et al，American Journal of Human Genetics, 2004, 74: 139-152; Wang Q et al，Biochem Biophys Res Commun. 2006，340: 583-588). 1회 투여량의 아미노글리코사이드 약물 투여는 상기 돌연변이를 보유보유한 개체에서 심각한 청력장애를 초래할 수 있다. 현재까지의 연구 결과에 의하면, 상기 돌연변이를 보유한 거의 모든 개체는 다양한 투여량의 아미노글리코사이드 항생제를 투여받은 후 중증 또는 심각한 청력상실을 경험하게 되는데, 이는 후천성 청각장애의 중요한 원인이 된다. 이러한 유형의 청각장애는 확실한 유전자 변화와 유발 원인이 파악되었으므로, 예방가능한 질병이다.
미토콘드리아 유전자의 C1494T 돌연변이(mtDNA C1494T 돌연변이)는 최근에 명확해진, 아미노글리코사이드 유형 약물의 1회 투여량 투여시 청각장애를 유발할 수 있는 미토콘드리아 유전자의 돌연변이 유형이다. 중국에서는 이미 미토콘드리아 유전자의 C1494T 돌연변이 모계 유전성 청각장애 가족 4 가계가 발견되었으며, 각 가계에서의 발병된 사람의 수는 2-28명으로 다양하였다. 아직 아주 많은 유사한 유형의 가계들은 발견 및 보고되지 않았지만, 상기 돌연변이가 산발적 청각장애 중에서 일정 비율을 차지하는 것을 감안하면, 이러한 청각장애의 예방은 아주 중요한 의미를 갖는다. 예방에서 가장 중요한 포인트는 스크리닝을 통하여 mtDNA C1494T 돌연변이를 보유한 개체를 발견하여, 상기 개체가 아미노글리코사이드 유형 의 항생제와 접촉하지 않도록 하여 중증 청각장애의 발생을 막는 것이다.
2004년에 mtDNA C1494T와 청각장애 간의 관련성이 발견된 이래, 상기 돌연변이에 대한 검출은 주로 직접적인 서열 분석을 통한 방법으로, 서열 분석은 유전자 돌연변이를 검출하는 효과적인 방법이기는 하지만, 비싸고, 절차가 복잡하며, 시간이 많이 소요되는 문제점이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명자는 간단, 신속, 정확하고, 오염을 줄일 수 있으며, 저렴한 검출 방법을 고안하였으며, 이를 통하여 mtDNA C1494T 돌연변이에 대하여 폭넓은 스크리닝을 진행하고자 하는 요구를 만족시킨다.
본 발명의 원리는 하기 내용과 같다.
모계 유전성 청각장애와 관련있는 미토콘드리아 유전자 서열(서열번호 5)에서 C1494T 돌연변이를 검출하기 위하여, 상기 유전자 서열의 1494bp 부위를 포함하는 TaqMan MGB 프로브(프로브는 1482bp에서 1508bp까지의 서열 포함)를 제작하고, 상기 MGB 프로브 단편의 5' 말단에 형광 리포터 그룹을, 3' 말단에는 비-형광 퀀칭 그룹 MGB를 표지하였다. 이때, MGB 프로브의 1494bp 위치에서 염기 C가 T로 치환된 경우라면, 이는 돌연변이 실시간 정량적 MGB 프로브(또는 돌연변이 또는 돌연변이형 MGB 프로브, 돌연변이 Taqman MGB 프로브)라고 지칭하며, MGB 프로브의 1494bp에 대응되는 염기가 여전히 C이면 야생형 실시간 정량적 MGB 프로브(또는 야생형 MGB 프로브, 야생형 Taqman MGB 프로브)라고 지칭한다.
돌연변이형과 야생형 MGB 프로브의 5' 말단 형광 리포터 그룹은 서로 상이하므로, 서로 다른 파장의 형광을 방출한다(다양한 파장의 형광은 실시간 정량적 형광 PCR 기기 상에서 각각 기록될 수 있으며, 분석 프로그램에서 다양한 색상이나 표시로 나타남). 돌연변이형 MGB 프로브는 C1494T 돌연변이가 발생된 주형과 완전히 매칭되지만 야생형 주형과 완전히 매칭되지 않으며, 야생형 MGB 프로브는 C1494T 돌연변이가 발생한 주형과는 완전히 매칭되지 않지만 야생형 주형과는 완전히 매칭될 수 있어, 따라서, 서로 다른 MGB 프로브는 다른 주형과 결합하여, 상이한 파장의 형광을 방출시킬 수 있다.
실시간 정량 PCR 증폭 시스템에서, 모계 유전성 청각장애와 관련있는 미토콘드리아 유전자 서열인 서열번호 5를 증폭시키는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머(임의의 바이오 프로그램에 의하여 제작할 수 있음)를 투입하고, 돌연변이형 실시간 정량 MGB 프로브를 투입하며, 필요에 따라 야생형 실시간 정량적 MGB 프로브를 투입한다.
MGB 프로브는 아주 짧기 때문에(약 12-25bp의 길이), 5' 말단의 형광 리포터 그룹이 에너지를 흡수한 후 에너지를 인접한 3' 말단 비-형광 퀀칭 그룹에 전달할 수 있는데, 3' 말단 비-형광 퀀칭 그룹은 5'말단 형광 리포터 그룹의 형광 방출을 제한하고 있다. 이로 인해, MGB 프로브가 완전한 상태일 때, 즉, 5' 말단 형광 리포터 그룹이 3'말단 비-형광 퀀칭 그룹의 차폐를 벗어나지 못한 상태일 때에는, MGB 프로브 5' 말단 형광 리포터 그룹으로부터 방출되는 형광은 검출되지 않는다.
일 예로, 프라이머, 돌연변이형 MGB 프로브 및 야생형 MGB 프로브를 동시에 실시간 정량적 PCR 반응 시스템에 투입한다. 시스템에서, 주형이 변성되고 저온에서 어닐링될 때, 프라이머와 MGB 프로브 모두 주형에 결합한다. 프라이머의 작용에 의해 주형을 따라 MGB 프로브가 결합한 부분까지 연장되며, Taq 효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성(이 활성은 이중 가닥 특이적이며, 유리형의 단일 체인 MGB 프로브는 온전한 상태로 유지됨)은 MGB 프로브 5' 말단에 연결된 형광 리포터 그룹을 MGB 프로브로부터 절단하여 반응 시스템으로 유리시키며, 이로써 3' 말단 비-형광 퀀칭 그룹의 차폐를 벗어나게 되어, 빛의 자극을 받아 광신호를 방출하게 된다. 즉, 하나의 DNA 체인을 증폭할 때마다 하나의 형광 분자가 생성되어 형광 신호의 누적과 PCR 산물이 동시에 이루지며, 즉 형광 신호의 세기와 대응 PCR 산물의 생성은 선형 함수 관계이다. 주형이 C1494T 돌연변이형일 경우에는, 돌연변이형 MGB 프로브가 주형과 완전히 매칭되게 결합되어, PCR 반응에서 5'말단 형광 리포터 그룹이 Taq 효소에 의해 계속적으로 절단되어 3' 말단 비-형광 퀀칭 그룹의 차폐로부터 벗어나게 됨으로써, 형광 세기는 PCR 산물 증가에 따라 계속적으로 증가하게 된다. 그러나, 야생형 MGB 프로브는 상기 주형과는 하나의 염기 차이로 인해 결합할 수 없기 때문에, 돌연변이형 MGB 프로브의 방출에 해당되는 형광 신호만 검출할 수 있다. 주형이 C1494C 야생형일 경우, 야생형 MGB 프로브가 주형과 완전히 매칭되게 결합되고, 돌연변이형 MGB 프로브는 단일 염기 차이로 인해 주형과 결합할 수 없기 때문에, 야생형 MGB 프로브의 방출에 해당되는 형광 신호만 검출할 수 있다. 돌연변이형과 야생형 MGB 프로브의 5'말단이 각각 서로 다른 형광 리포터 그룹과 연결되어 있기 때문에, 방출되는 여러가지 색상의 형광에 따라 해당 주형을 구별할 수 있으며, 이를 통해 샘플에 모계 유전성 청각장애 관련 미토콘드리아 유전자가 포함되었는지의 여부를 검출할 수 있다.
다른 일 예로, 실시간 정량 PCR 반응 시스템에 돌연변이형 MGB 프로브만 투입할 수도 있다. 이때 주형이 돌연변이형일 경우, 최종으로 돌연변이형 MGB 프로브의 방출에 해당되는 형광 신호만 검출할 수 있으며, 이로써 샘플내에 모계 유전성 청각장애 관련 미토콘드리아 유전자의 C1494T 돌연변이가 존재함을 알 수 있고, 이를 통해 환자가 미토콘드리아 유전자 돌연변이성 모계 유전성 청각장애에 걸렸음을 확진할 수 있다. 주형이 야생형일 경우, 최종으로 돌연변이형 MGB 프로브의 방출에 해당되는 형광 신호를 검출할 수 없으며, 이로써 샘플내에 모계 유전성 청각장애 관련 미토콘드리아 유전자의 C1494T 돌연변이가 존재하지 않음을 확인할 수 있고, 이를 통해 환자가 미토콘드리아 유전자 돌연변이성 모계 유전성 청각장애에 걸리지 않았음을 확진할 수 있다.
다시 말하면, 하나의 시스템에 C1494T 돌연변이형 주형에 대응되는 돌연변이형 MGB 프로브를 투입하기만 해서 검출을 진행할 수 있다. 허나, 동시에 C1494C 야생형 주형에 대응되는 야생형 MGB 프로브를 투입하면 역검증을 통해 이중 결과를 얻을 수 있어, 더욱 정확한 결과를 얻을 수 있다.
따라서, 상기 발명 원리에 의하여, 본 발명은 모계 유전성 청각장애 관련 미토콘드리아 유전자의 C1494T 돌연변이 검출에 사용되는 실시간 정량 MGB 프로브를 제공하는 것을 첫번째 목적으로 한다. 상기 MGB 프로브의 5' 말단은 모계 유전성 청각장애 관련 미토콘드리아 유전자 서열, 즉 서열번호 5에서 1482-1487 bp 영역에 위치되며, 3' 말단은 미토콘드리아 유전자 서열인 서열번호 5에서 1503-1508 bp 영역에 위치되며, 아울러 상기 MGB 프로브 단편의 5' 말단은 리포터 그룹으로 표지되며, 3' 말단은 비-형광 퀀칭 그룹 MGB로 표지되며, 1494bp 위치의 염기 C는 T로 치환된 경우 이를 돌연변이형 실시간 정량 MGB 프로브이라고 한다.
또한, 당업계에서 TaqMan 프로브는 3' 말단에 표지된 퀀칭 그룹에 따라 두 가지, 일반적인 TaqMan 프로브와 TaqMan MGB 프로브로 분류할 수 있다. 일반적인 TaqMan 프로브의 퀀칭 그룹은 형광 퀀칭 그룹이고, MGB 프로브의 퀀칭 그룹은 비-형광 퀀칭 그룹이다. 이는 자체적으로 형광을 발생시키지 못하며, 백그라운드 신호 세기를 크게 낮출 수 있다. 아울러, 프로브에 MGB (Minor Groove Binder) 수식기가 연결되어 있기 때문에 프로브의 Tm 값은 약 10℃ 높아질 수 있다. 동일한 Tm 값을 얻기 위해, MGB 프로브는 일반적인 TaqMan 프로브보다 더 짧게 제작할 수 있으며, 이로써 합성 원가를 낮출 수 있을 뿐 아니라 프로브 제작 성공율도 크게 증가시킬 수 있다. 그 이유는, 주형 DNA의 염기 구성이 이상적이지 못한 상황에서, 짧은 프로브가 긴 것에 비해 제작하기 쉽기 때문이다. mtDNA 1494 위치와 그 주변의 염기 구성의 특징에 따라 수많은 연구와 실험을 거쳐, 본 발명의 TaqMan MGB 프로브의 5' 말단은 서열번호 5의 1485-1488bp 영역에 위치하는 것이 바람직하고, 3' 말단은 1503-1505bp 영역에 위치하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 TaqMan MGB의 5' 말단이 1487-1488bp에 위치하고, 3' 말단이 1503bp에 위치하는 것으로 확인되었다.
일 특정 예에서, 돌연변이형 MGB 프로브의 뉴클레오티드 서열은 모계 유전성 청각장애 관련 미토콘드리아 유전자 서열인 서열번호 5에서 1487-1503bp 영역에 위치하며(예를 들면, 서열번호 1에 표시된 뉴클레오티드 서열), 그리고 5' 말단 형광 리포터 그룹은 FAM 형광 리포터 그룹이고, 3' 말단 그룹은 비-형광 퀀칭 그룹 MGB이다.
본 발명은 돌연변이형 MGB 프로브와 함께 사용할 수 있는 야생형 MGB 프로브를 제공하는 것을 두번째 목적으로 한다. 돌연변이형 실시간 MGB 프로브에 비해, 야생형 실시간 MGB 프로브는 1494bp 위치의 염기가 여전히 C이고, 5' 말단 형광 리포터 그룹은 돌연변이형 MGB 프로브의 5' 말단 형광 리포터 그룹과 다르며, 프로브의 시작점이 1487bp이 아니라 1488bp인 것 이외에는 다른 구조는 동일하다.
일 특정 예에서, 야생형 MGB 프로브의 뉴클레오티드 서열은 모계 유전성 청각장애 관련 미토콘드리아 유전자 서열인 서열번호 5에서 1488-1503bp 영역에 위치하며(예를 들면, 서열번호 2에 표시된 뉴클레오티드 서열), 5' 말단 형광 리포터 그룹은 HEX 형광 리포터 그룹이고, 3' 말단은 비-형광 퀀칭 그룹 MGB이다.
여기서, 5' 말단 형광 리포터 그룹과 대응되는 3' 말단 비-형광 퀀칭 그룹은 당업계에서 사용가능한 모든 형광 리포터 그룹 또는 비-형광 퀀칭 그룹일 수 있으며, 당업자들에게는 형광 리포터 그룹과 대응되는 비-형광 퀀칭 그룹을 선택하는 것은 숙지된 기술이다. 예를 들면, 형광 염료인 FAM과 HEX는 VIC, JOE 등과 같은 기타 형광 그룹 또는 염료로 대체할 수 있다.
본 발명은 실시간 정량 MGB 프로브와 공동으로 사용하는 PCR 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 제공하는 것을 세번째 목적으로 한다. 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 C1494T 돌연변이를 포함하는 모계 유전성 청각장애 관련 미토콘드리아 유전자 서열인 서열번호 5를 증폭시키는데 사용된다. 여기에서, 정방향 프라이머(길이 약 15-24bp)의 5' 말단은 서열번호 5(C1494T의 상류)의 1-1464bp 영역에 위하며, 역방향 프라이머(길이 약 15-24bp)의 3' 말단은 서열번호 5(C1494T의 하류)의 1615bp-16568bp 영역에 위치하며; 정방향 프라이머(길이 약 15-24bp)의 5' 말단은 서열번호 5(C1494T의 상류)의 1000-1464bp 영역에 위치하고, 역방향 프라이머(길이 약 15-24bp)의 3' 말단은 서열번호 5(C1494T의 하류)의 1615bp-2000bp 영역에 위치하는 것이 바람직하며; 정방향 프라이머(길이 약 15-24bp)의 5' 말단은 서열번호 5(C1494T의 상류)의 1400-1464bp 영역에 위치하고, 역방향 프라이머(길이 약 15-24bp)의 3' 말단은 서열번호 5(C1494T의 하류)의 1615bp-1700bp 영역에 위치하는 것이 더욱 바람직하며; 정방향 프라이머(길이 약 15-24bp)의 5' 말단은 서열번호 5(C1494T의 상류)의 1464bp 위치에 위치하고, 역방향 프라이머(길이 약 15-24bp)의 3' 말단은 서열번호 5(C1494T의 하류)의 1615bp 위치에 위치하는 것이 가장 바람직하다.
일 특정 예에서, 정방향 프라이머는 모계 유전성 청각장애 관련 미토콘드리아 유전자 서열인 서열번호 5에서 1464-1481bp의 뉴클레오티드 서열이며, 상기 서열은 서열목록에서 서열번호 3이고, 역방향 프라이머는 서열번호 5에서 1592-1615 bp의 뉴클레오티드 서열이며, 상기 서열은 서열목록에서 서열번호 4이다.
일 특정 예에서, 여러가지 바이오 프로그램을 이용하여 상기 프라이머를 제작할 수 있으며, Genetool Lite 프로그램(미국 Biotools사의 프로그램)으로 제작하는 것이 바람직하다.
본 발명은 모계 미토콘드리아 관련 청각장애 유전 질병의 진단에 사용되는 키트에서의 상기 MGB 프로브의 용도를 네번째 목적으로 한다.
일 특정 예에서, 본 발명은 발명 원리와 디자인된 프라이머 및 Taqman MGB 프로브를 이용하여 체외에서 모계 유전성 청각장애 관련 미토콘드리아 유전자 C1494T 돌연변이를 검출하는 키트를 제공함으로써, 모계 미토콘드리아 청각장애를 진단한다. 상기 키트는 하기를 포함한다.
1. 혈액 샘플 DNA 분리 시약;
2. PCR 증폭 반응용 시약 혼합물, Hotstar Mastermix 혼합물이 바람직함;
3. C1494C 부위 또는 C1494T 돌연변이 부위를 포함하는 모계 유전성 미토콘드리아 청각장애 관련 유전자 서열인 서열번호 5를 증폭하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(동일비로 혼합하는 것이 바람직함);
4. 전술한 실시간 정량 돌연변이형 Taqman MGB 프로브;
5. 필요에 따라, 설명서.
일 특정예에서, 상기 키트는 상기 야생형 실시간 정량적 Taqman MGB 프로브를 포함할 수 있다.
다른 일 특정 예에서, 상기 키트에 포함된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 전술한 바와 같으며, 정방향 프라이머는 서열번호 3에 표시된 뉴클레오티드에서 선택되고, 역방향 프라이머는 서열번호 4에 표시된 뉴클레오티드에서 선택되는 것이 바람직하다.
다른 일 특정 예에서, 돌연변이형 MGB 프로브의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1에 표시된 뉴클레오티드 서열에서 선택되는 것이 바람직하고, 이의 5' 말단 형광 리포터 그룹은 FAM 형광 리포터 그룹이고, 3' 말단은 비-형광 퀀칭 그룹 MGB를 표지된다.
다른 일 특정 예에서, 야생형 MGB 프로브의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2에 표시된 뉴클레오티드 서열에서 선택되는 것이 바람직하고, 이의 5' 말단 형광 리포터기는 HEX 형광 리포터 그룹이고, 3' 말단은 비-형광 퀀칭 그룹 MGB로 표지된다.
다른 일 특정 예에서, 상기 키트내 상기 혈액 샘플 DNA 분리용 시약은 발바닥 혈액 DNA를 추출하는 용액I이고, 이의 주요 성분은 Chelex(ABI사의 제품)이거나, 또는 혈액 샘플 DNA 분리용 시약은 말초 혈액 DNA를 추출하는 시약이며, 시중에 판매되는 제품을 사용한다. "키트"라는 용어는 키트 이외의 다른 용어도 포함하며, 이는 키트와 유사한 구조, 성분 및 생물학 기능을 구비한 생물학 제품임을 주지하여야 한다.
다른 일 특정 예에서, 본 발명은 체외에서 모계 유전성 청각장애 관련 미토콘드리아 유전자의 C1494T 돌연변이를 검출하는데 있어 상기 MGB 프로브 또는 키트의 용도를 제공한다. 다른 일 특정 예에서, 본 발명은 모계 유전성 미토콘드리아 관련 청각장애를 진단하는(즉, 모계 유전성 청각장애 관련 미토콘드리아 유전자의 C1494T 돌연변이를 검출하는) 제품(약물, 시약, 키트 등 제품)을 생산하는데 있어서의 상기 MGB 프로브 또는 키트의 용도를 제공한다.
모계 유전성 청각장애 관련 미토콘드리아 유전자의 C1494T 돌연변이를 검출하는 기술은 종래 방법(예를 들면, Hae III 효소 절단 분석) 등에 비해 다음과 같은 이점을 가지고 있다.
1. 본 발명의 미토콘드리아 유전자 C1494T의 돌연변이를 검출하는 방법은 조작 절차와 반응 시간 모두 직접적인 서열분석 방법에 비해 보다 효율적이다. 본 발명은 1회의 PCR 과정을 거쳐 바로 mtDNA C1494T 돌연변이가 존재하는지 검출할 수 있어, 서열분석 방법에 비하여 PCR한 후 아가로스 전기영동 분석, PCR 산물 정제, 서열분석, 서열분석 반응 산물의 정제 등 4 단계의 작업이 생략되며, PCR 반응 이후의 처리 과정에서 오염될 위험성이 감소되며, 시간도 종래 조작 시간 12 시간을 1.5 시간으로 단축시킨다.
2. 본 발명의 두 개의 MGB 프로브는 각각 C1494T 돌연변이형과 C1494C 야생형에 대응되는 것으로서, 동시에 하나의 시스템에 존재할 경우 각각의 MGB 프로브는 서열이 완전히 매칭되는 주형과 결합하기 때문에 특이성이 아주 높다. 일부 주형에서, 만일 돌연변이형 MGB 프로브의 5' 말단 형광(예를 들면, FAM 형광)은 검출되지만, 야생형 MGB 프로브의 5' 말단 형광(예를 들면, HEX 형광)이 검출되지 않는다면, 상기 주형은 C1494T 돌연변이형으로 단정할 수 있으며, 이와 상반되는 결과라면 C1494C 야생형으로 단정할 수 있다. 그리고, 이론상 하나의 시스템에 C1494T 돌연변이형 주형에 대응되는 MGB 프로브만 투입하여도 진단을 진행할 수 있다. 그렇지만 동시에 C1494C 야생형 주형에 대응되는 야생형 MGB 프로브를 투입하면 역검증의 이중 결과를 얻을 수 있어 더욱 정확한 결과를 얻을 수 있다. 이 밖에도, MGB 프로브의 높은 특이성과 스펙트럼 기술의 민감성으로 인해 본 발명은 우수한 반복성, 높은 특이성과 민감성 및 용이한 조작성을 갖는다.
3. 본 발명의 결과 판독은 실시간 정량 PCR 기기의 분석 프로그램의 보조하에 진행되기 때문에 자동화율이 높고 인위적인 오차를 피할 수 있다.
4. 본 발명에서 제공하는 키트 또는 관련 제품으로 C1494T 돌연변이 검출을 진행하는 것은 기타 방법에 비해 원가가 보다 낮다.
상기에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 MGB 프로브 및 키트는 국내 관련 분야의 요구를 충족시키며, 조작이 간편하고, 판독이 직관적이며, 특이성과 민감성이 높고, 가격이 저렴한 등의 이점은, 국내적으로 모계 유전성 청각장애 관련 미토콘드리아 유전자 C1494T 돌연변를 스크리닝하여 아미노글리코사이드 항생제 사용 전에 예방 검사에 이로운 조건을 제공하며, 이로써 아미노글리코사이드 유형의 항생제에 민감한 개체에서 약물성 청각장애 유발 가능성을 근본적으로 감소시킬 수 있다.
도 1은 72개의 상이한 유전자형에 대한 실시간 정량 PCR 분석의 결과 일부이다(Allelic data for Cycling A.FAM/Sybr, Cycling A.JOE).
도 2는 72개의 상이한 유전자형에 대한 실시간 정량 PCR 분석의 결과 일부이다.
모계 유전성 청각장애 관련 미토콘드리아 유전자에서의 C1494T 돌연변이 검출
1. 검출 샘플
중국인민해방국총병원 청각장애 분자진단센터 청각장애 자원라이브러리에서 감각신경성 청각장애 환자 72명을 선택하여, 개체의 말초 혈액 DNA를 추출(원혜군 등, 중화이비인후과잡지, 1998, 33(2): 67-70; 이위민 등, 임상이미인후과잡지, 2001, 15(증간): 53-58)하여 검출 샘플로 하였다.
2. MGB 프로브와 프라이머 디자인
기 공개된 미토콘드리아 유전자 서열(Cambridge Sequence 또는 NCBI 사람 미토콘드리아 유전자 서열 NC_001807.4 또는 NT_006713.14 등, 또는 서열번호 5)을 기초로 하고, Genetool Lite 프로그램을 이용하여 프리이머와 Taqman MGB 프로브 서열을 디자인한다.
돌연변이형 MGB 프로브(T1)의 뉴클레오티드 서열은 모계 유전 미토콘드리아 청각장애 유전자 서열인 서열번호 5에서 1487-1503 bp 영역에 위치하며(예를 들면, 서열번호 1에 표시된 뉴클레오티드 서열), 형광 리포터 그룹은 FAM 형광 리포터 그룹이며, 형광 퀀칭 그룹은 TAMRA 형광 퀀칭 그룹이고, MGB 프로브 구조는 아래와 같다:
5' FAM-CCGTCACTCTCCTCAAG-MGB 3'
야생형 MGB 프로브(T2)의 뉴클레오티드 서열은 모계 유전성 미토콘드리아 청각장애와 관련있는 유전자 서열인 서열번호 5에서 1488-1503bp 영역에 위치하며(예를 들면, 서열번호 2에 표시된 뉴클레오티드 서열), 형광 리포터 그룹은 HEX 형광 리포터 그룹이고, 형광 퀀칭 그룹은 TAMRA 형광 퀀칭 그룹이고, MGB 프로브 구조는 아래와 같다:
5' HEX-CGTCACCCTCCTCAAG -MGB 3'
정방향 프라이머(F1)는 모계 유전성 미토콘드리아 청각장애와 관련있는 유전자 서열인 서열번호 5에서 1464-1481bp의 뉴클레오티드 서열이며, 이 서열은 서열목록의 서열번호 3이고, 역방향 프라이머(R1)는 1592-1615bp의 뉴클레오티드 서열이며, 이 서열은 서열목록의 서열번호 4이다.
3. PCR 증폭 반응
상기에서 제작한 MGB 프로브 뉴클레오티드 서열, 서열번호 1, 서열번호 2 및 프라이머 서열, 서열번호 3, 서열번호 4, 인공적으로 합성된 MGB 프로브 T1, T2, 정방향 프라이머 F1과 역방향 프라이머 R1, 그리고 상기 추출한 샘플의 말초 혈액의 DNA를 주형으로 하여 실시간 정량적 PCR 증폭 반응을 진행하였다.
반응 시스템:
주형 10ng
Hotstar Mastermix 10㎕
프라이머 F1, R1(2pmol/l) 각 1㎕
MGB 프로브 T1(2pmol/l) 1㎕
그외, 필요에 따라 1㎕의 T2(2pmol/l) 투입하고,
총 부피가 20㎕이 되도록 3차 증류수를 첨가한다.
반응 조건은 표 1에 나타내었다.
95℃에서 10분간 변성시키고, 95℃에서 30초간 변성한 다음, 60℃에서 30초 간 어닐링하며, 이러한 과정을 모두 40회 진행하고, 각 사이클의 어닐링 단계에서 형광을 측정한다.
표 1
| 사이클 | 사이클 포인트 |
| 95℃에서 10분간 유지 | |
| 반복 (40 회) | 단계 1: 95℃에서 30초간 유지 |
| 단계 2: 60℃에서 30초 유지, Cycling A(FAM/Sybr,JOE)로 수득 |
4. 결과
72명의 피검사자 중에서, 실시간 정량 Taqman MGB 프로브 방법으로 모두 10명의 mtDNA C1494T 돌연변이 보유자가 확인되었다.
도면에서 동그라미가 없는 선은 기록된 FAM 형광이고, 동그라미가 있는 선은 HEX 형광이다. 프로그램 분석결과는 표 2를 참조한다.
5. 실시간 정량 Taqman MGB 프로브 방법의 신뢰도 검증
모든 검출된 개체의 1494bp 부위에 대하여 모두 직접 서열분석 방법으로 검증한 결과, 실시간 정량 Taqman MGB 프로브 방법으로 검출된 C1494T 돌연변이를 지닌 10명의 청각장애 환자와 C1494T 돌연변이를 보유하지 않은 62명 개체의 결과는 직접 서열분석으로 검사한 결과와 완전히 동일하였다. 이는 본 발명의 방법의 C1494T 돌연변이 검출 신뢰도와 안정성을 의미한다. 구체적인 수치는 표 2를 참조한다.
표 2
| 72개의 샘플 | 실시간 정량적 형광 Taqman MGB 프로브법 | 직접 서열분석법 | |
| MGB 프로브T1 | MGB 프로브 T1+T2 | ||
| C1494T 돌연변이 | 10, 강한 신호 | 10 | 10 |
| C1494C 야생성 | 62, 신호 무 또는 약함 | 62 | 62 |
본 발명은 모계 유전성 청각장애와 관련있는 미토콘드리아 유전자의 C1494T 돌연변이를 검출하는 TaqMan MGB 프로브 및 관련 제품에 관한 것으로서, 간편하고, 빠르고, 정확하며, 오염이 적고, 적은 비용으로, mtDNA C1494T 돌연변이에 대하여 대규모 스크리닝을 진행하고자 하는 요구를 만족시킬 수 있다.
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GATCACAGGT CTATCACCCT ATTAACCACT CACGGGAGCT CTCCATGCAT TTGGTATTTT 60
CGTCTGGGGG GTATGCACGC GATAGCATTG CGAGACGCTG GAGCCGGAGC ACCCTATGTC 120
GCAGTATCTG TCTTTGATTC CTGCCTCATC CTATTATTTA TCGCACCTAC GTTCAATATT 180
ACAGGCGAAC ATACTTACTA AAGTGTGTTA ATTAATTAAT GCTTGTAGGA CATAATAATA 240
ACAATTGAAT GTCTGCACAG CCACTTTCCA CACAGACATC ATAACAAAAA ATTTCCACCA 300
AACCCCCCCT CCCCCGCTTC TGGCCACAGC ACTTAAACAC ATCTCTGCCA AACCCCAAAA 360
ACAAAGAACC CTAACACCAG CCTAACCAGA TTTCAAATTT TATCTTTTGG CGGTATGCAC 420
TTTTAACAGT CACCCCCCAA CTAACACATT ATTTTCCCCT CCCACTCCCA TACTACTAAT 480
CTCATCAATA CAACCCCCGC CCATCCTACC CAGCACACAC ACACCGCTGC TAACCCCATA 540
CCCCGAACCA ACCAAACCCC AAAGACACCC CCCACAGTTT ATGTAGCTTA CCTCCTCAAA 600
GCAATACACT GAAAATGTTT AGACGGGCTC ACATCACCCC ATAAACAAAT AGGTTTGGTC 660
CTAGCCTTTC TATTAGCTCT TAGTAAGATT ACACATGCAA GCATCCCCGT TCCAGTGAGT 720
TCACCCTCTA AATCACCACG ATCAAAAGGA ACAAGCATCA AGCACGCAGC AATGCAGCTC 780
AAAACGCTTA GCCTAGCCAC ACCCCCACGG GAAACAGCAG TGATTAACCT TTAGCAATAA 840
ACGAAAGTTT AACTAAGCTA TACTAACCCC AGGGTTGGTC AATTTCGTGC CAGCCACCGC 900
GGTCACACGA TTAACCCAAG TCAATAGAAG CCGGCGTAAA GAGTGTTTTA GATCACCCCC 960
TCCCCAATAA AGCTAAAACT CACCTGAGTT GTAAAAAACT CCAGTTGACA CAAAATAGAC 1020
TACGAAAGTG GCTTTAACAT ATCTGAACAC ACAATAGCTA AGACCCAAAC TGGGATTAGA 1080
TACCCCACTA TGCTTAGCCC TAAACCTCAA CAGTTAAATC AACAAAACTG CTCGCCAGAA 1140
CACTACGAGC CACAGCTTAA AACTCAAAGG ACCTGGCGGT GCTTCATATC CCTCTAGAGG 1200
AGCCTGTTCT GTAATCGATA AACCCCGATC AACCTCACCA CCTCTTGCTC AGCCTATATA 1260
CCGCCATCTT CAGCAAACCC TGATGAAGGC TACAAAGTAA GCGCAAGTAC CCACGTAAAG 1320
ACGTTAGGTC AAGGTGTAGC CCATGAGGTG GCAAGAAATG GGCTACATTT TCTACCCCAG 1380
AAAACTACGA TAGCCCTTAT GAAACTTAAG GGTCGAAGGT GGATTTAGCA GTAAACTAAG 1440
AGTAGAGTGC TTAGTTGAAC AGGGCCCTGA AGCGCGTACA CACCGCCCGT CACCCTCCTC 1500
AAGTATACTT CAAAGGACAT TTAACTAAAA CCCCTACGCA TTTATATAGA GGAGACAAGT 1560
CGTAACATGG TAAGTGTACT GGAAAGTGCA CTTGGACGAA CCAGAGTGTA GCTTAACACA 1620
AAGCACCCAA CTTACACTTA GGAGATTTCA ACTTAACTTG ACCGCTCTGA GCTAAACCTA 1680
GCCCCAAACC CACTCCACCT TACTACCAGA CAACCTTAGC CAAACCATTT ACCCAAATAA 1740
AGTATAGGCG ATAGAAATTG AAACCTGGCG CAATAGATAT AGTACCGCAA GGGAAAGATG 1800
AAAAATTATA ACCAAGCATA ATATAGCAAG GACTAACCCC TATACCTTCT GCATAATGAA 1860
TTAACTAGAA ATAACTTTGC AAGGAGAGCC AAAGCTAAGA CCCCCGAAAC CAGACGAGCT 1920
ACCTAAGAAC AGCTAAAAGA GCACACCCGT CTATGTAGCA AAATAGTGGG AAGATTTATA 1980
GGTAGAGGCG ACAAACCTAC CGAGCCTGGT GATAGCTGGT TGTCCAAGAT AGAATCTTAG 2040
TTCAACTTTA AATTTGCCCA CAGAACCCTC TAAATCCCCT TGTAAATTTA ACTGTTAGTC 2100
CAAAGAGGAA CAGCTCTTTG GACACTAGGA AAAAACCTTG TAGAGAGAGT AAAAAATTTA 2160
ACACCCATAG TAGGCCTAAA AGCAGCCACC AATTAAGAAA GCGTTCAAGC TCAACACCCA 2220
CTACCTAAAA AATCCCAAAC ATATAACTGA ACTCCTCACA CCCAATTGGA CCAATCTATC 2280
ACCCTATAGA AGAACTAATG TTAGTATAAG TAACATGAAA ACATTCTCCT CCGCATAAGC 2340
CTGCGTCAGA TTAAAACACT GAACTGACAA TTAACAGCCC AATATCTACA ATCAACCAAC 2400
AAGTCATTAT TACCCTCACT GTCAACCCAA CACAGGCATG CTCATAAGGA AAGGTTAAAA 2460
AAAGTAAAAG GAACTCGGCA AATCTTACCC CGCCTGTTTA CCAAAAACAT CACCTCTAGC 2520
ATCACCAGTA TTAGAGGCAC CGCCTGCCCA GTGACACATG TTTAACGGCC GCGGTACCCT 2580
AACCGTGCAA AGGTAGCATA ATCACTTGTT CCTTAAATAG GGACCTGTAT GAATGGCTCC 2640
ACGAGGGTTC AGCTGTCTCT TACTTTTAAC CAGTGAAATT GACCTGCCCG TGAAGAGGCG 2700
GGCATAACAC AGCAAGACGA GAAGACCCTA TGGAGCTTTA ATTTATTAAT GCAAACAGTA 2760
CCTAACAAAC CCACAGGTCC TAAACTACCA AACCTGCATT AAAAATTTCG GTTGGGGCGA 2820
CCTCGGAGCA GAACCCAACC TCCGAGCAGT ACATGCTAAG ACTTCACCAG TCAAAGCGAA 2880
CTACTATACT CAATTGATCC AATAACTTGA CCAACGGAAC AAGTTACCCT AGGGATAACA 2940
GCGCAATCCT ATTCTAGAGT CCATATCAAC AATAGGGTTT ACGACCTCGA TGTTGGATCA 3000
GGACATCCCG ATGGTGCAGC CGCTATTAAA GGTTCGTTTG TTCAACGATT AAAGTCCTAC 3060
GTGATCTGAG TTCAGACCGG AGTAATCCAG GTCGGTTTCT ATCTACTTCA AATTCCTCCC 3120
TGTACGAAAG GACAAGAGAA ATAAGGCCTA CTTCACAAAG CGCCTTCCCC CGTAAATGAT 3180
ATCATCTCAA CTTAGTATTA TACCCACACC CACCCAAGAA CAGGGTTTGT TAAGATGGCA 3240
GAGCCCGGTA ATCGCATAAA ACTTAAAACT TTACAGTCAG AGGTTCAATT CCTCTTCTTA 3300
ACAACATACC CATGGCCAAC CTCCTACTCC TCATTGTACC CATTCTAATC GCAATGGCAT 3360
TCCTAATGCT TACCGAACGA AAAATTCTAG GCTATATACA ACTACGCAAA GGCCCCAACG 3420
TTGTAGGCCC CTACGGGCTA CTACAACCCT TCGCTGACGC CATAAAACTC TTCACCAAAG 3480
AGCCCCTAAA ACCCGCCACA TCTACCATCA CCCTCTACAT CACCGCCCCG ACCTTAGCTC 3540
TCACCATCGC TCTTCTACTA TGAACCCCCC TCCCCATACC CAACCCCCTG GTCAACCTCA 3600
ACCTAGGCCT CCTATTTATT CTAGCCACCT CTAGCCTAGC CGTTTACTCA ATCCTCTGAT 3660
CAGGGTGAGC ATCAAACTCA AACTACGCCC TGATCGGCGC ACTGCGAGCA GTAGCCCAAA 3720
CAATCTCATA TGAAGTCACC CTAGCCATCA TTCTACTATC AACATTACTA ATAAGTGGCT 3780
CCTTTAACCT CTCCACCCTT ATCACAACAC AAGAACACCT CTGATTACTC CTGCCATCAT 3840
GACCCTTGGC CATAATATGA TTTATCTCCA CACTAGCAGA GACCAACCGA ACCCCCTTCG 3900
ACCTTGCCGA AGGGGAGTCC GAACTAGTCT CAGGCTTCAA CATCGAATAC GCCGCAGGCC 3960
CCTTCGCCCT ATTCTTCATA GCCGAATACA CAAACATTAT TATAATAAAC ACCCTCACCA 4020
CTACAATCTT CCTAGGAACA ACATATGACG CACTCTCCCC TGAACTCTAC ACAACATATT 4080
TTGTCACCAA GACCCTACTT CTAACCTCCC TGTTCTTATG AATTCGAACA GCATACCCCC 4140
GATTCCGCTA CGACCAACTC ATACACCTCC TATGAAAAAA CTTCCTACCA CTCACCCTAG 4200
CATTACTTAT ATGATATGTC TCCATACCCA TTACAATCTC CAGCATTCCC CCTCAAACCT 4260
AAGAAATATG TCTGATAAAA GAGTTACTTT GATAGAGTAA ATAATAGGAG CTTAAACCCC 4320
CTTATTTCTA GGACTATGAG AATCGAACCC ATCCCTGAGA ATCCAAAATT CTCCGTGCCA 4380
CCTATCACAC CCCATCCTAA AGTAAGGTCA GCTAAATAAG CTATCGGGCC CATACCCCGA 4440
AAATGTTGGT TATACCCTTC CCGTACTAAT TAATCCCCTG GCCCAACCCG TCATCTACTC 4500
TACCATCTTT GCAGGCACAC TCATCACAGC GCTAAGCTCG CACTGATTTT TTACCTGAGT 4560
AGGCCTAGAA ATAAACATGC TAGCTTTTAT TCCAGTTCTA ACCAAAAAAA TAAACCCTCG 4620
TTCCACAGAA GCTGCCATCA AGTATTTCCT CACGCAAGCA ACCGCATCCA TAATCCTTCT 4680
AATAGCTATC CTCTTCAACA ATATACTCTC CGGACAATGA ACCATAACCA ATACTACCAA 4740
TCAATACTCA TCATTAATAA TCATAATAGC TATAGCAATA AAACTAGGAA TAGCCCCCTT 4800
TCACTTCTGA GTCCCAGAGG TTACCCAAGG CACCCCTCTG ACATCCGGCC TGCTTCTTCT 4860
CACATGACAA AAACTAGCCC CCATCTCAAT CATATACCAA ATCTCTCCCT CACTAAACGT 4920
AAGCCTTCTC CTCACTCTCT CAATCTTATC CATCATAGCA GGCAGTTGAG GTGGATTAAA 4980
CCAAACCCAG CTACGCAAAA TCTTAGCATA CTCCTCAATT ACCCACATAG GATGAATAAT 5040
AGCAGTTCTA CCGTACAACC CTAACATAAC CATTCTTAAT TTAACTATTT ATATTATCCT 5100
AACTACTACC GCATTCCTAC TACTCAACTT AAACTCCAGC ACCACGACCC TACTACTATC 5160
TCGCACCTGA AACAAGCTAA CATGACTAAC ACCCTTAATT CCATCCACCC TCCTCTCCCT 5220
AGGAGGCCTG CCCCCGCTAA CCGGCTTTTT GCCCAAATGG GCCATTATCG AAGAATTCAC 5280
AAAAAACAAT AGCCTCATCA TCCCCACCAT CATAGCCACC ATCACCCTCC TTAACCTCTA 5340
CTTCTACCTA CGCCTAATCT ACTCCACCTC AATCACACTA CTCCCCATAT CTAACAACGT 5400
AAAAATAAAA TGACAGTTTG AACATACAAA ACCCACCCCA TTCCTCCCCA CACTCATCGC 5460
CCTTACCACG CTACTCCTAC CTATCTCCCC TTTTATACTA ATAATCTTAT AGAAATTTAG 5520
GTTAAATACA GACCAAGAGC CTTCAAAGCC CTCAGTAAGT TGCAATACTT AATTTCTGTA 5580
ACAGCTAAGG ACTGCAAAAC CCCACTCTGC ATCAACTGAA CGCAAATCAG CCACTTTAAT 5640
TAAGCTAAGC CCTTACTAGA CCAATGGGAC TTAAACCCAC AAACACTTAG TTAACAGCTA 5700
AGCACCCTAA TCAACTGGCT TCAATCTACT TCTCCCGCCG CCGGGAAAAA AGGCGGGAGA 5760
AGCCCCGGCA GGTTTGAAGC TGCTTCTTCG AATTTGCAAT TCAATATGAA AATCACCTCG 5820
GAGCTGGTAA AAAGAGGCCT AACCCCTGTC TTTAGATTTA CAGTCCAATG CTTCACTCAG 5880
CCATTTTACC TCACCCCCAC TGATGTTCGC CGACCGTTGA CTATTCTCTA CAAACCACAA 5940
AGACATTGGA ACACTATACC TATTATTCGG CGCATGAGCT GGAGTCCTAG GCACAGCTCT 6000
AAGCCTCCTT ATTCGAGCCG AGCTGGGCCA GCCAGGCAAC CTTCTAGGTA ACGACCACAT 6060
CTACAACGTT ATCGTCACAG CCCATGCATT TGTAATAATC TTCTTCATAG TAATACCCAT 6120
CATAATCGGA GGCTTTGGCA ACTGACTAGT TCCCCTAATA ATCGGTGCCC CCGATATGGC 6180
GTTTCCCCGC ATAAACAACA TAAGCTTCTG ACTCTTACCT CCCTCTCTCC TACTCCTGCT 6240
CGCATCTGCT ATAGTGGAGG CCGGAGCAGG AACAGGTTGA ACAGTCTACC CTCCCTTAGC 6300
AGGGAACTAC TCCCACCCTG GAGCCTCCGT AGACCTAACC ATCTTCTCCT TACACCTAGC 6360
AGGTGTCTCC TCTATCTTAG GGGCCATCAA TTTCATCACA ACAATTATCA ATATAAAACC 6420
CCCTGCCATA ACCCAATACC AAACGCCCCT CTTCGTCTGA TCCGTCCTAA TCACAGCAGT 6480
CCTACTTCTC CTATCTCTCC CAGTCCTAGC TGCTGGCATC ACTATACTAC TAACAGACCG 6540
CAACCTCAAC ACCACCTTCT TCGACCCCGC CGGAGGAGGA GACCCCATTC TATACCAACA 6600
CCTATTCTGA TTTTTCGGTC ACCCTGAAGT TTATATTCTT ATCCTACCAG GCTTCGGAAT 6660
AATCTCCCAT ATTGTAACTT ACTACTCCGG AAAAAAAGAA CCATTTGGAT ACATAGGTAT 6720
GGTCTGAGCT ATGATATCAA TTGGCTTCCT AGGGTTTATC GTGTGAGCAC ACCATATATT 6780
TACAGTAGGA ATAGACGTAG ACACACGAGC ATATTTCACC TCCGCTACCA TAATCATCGC 6840
TATCCCCACC GGCGTCAAAG TATTTAGCTG ACTCGCCACA CTCCACGGAA GCAATATGAA 6900
ATGATCTGCT GCAGTGCTCT GAGCCCTAGG ATTCATCTTT CTTTTCACCG TAGGTGGCCT 6960
GACTGGCATT GTATTAGCAA ACTCATCACT AGACATCGTA CTACACGACA CGTACTACGT 7020
TGTAGCCCAC TTCCACTATG TCCTATCAAT AGGAGCTGTA TTTGCCATCA TAGGAGGCTT 7080
CATTCACTGA TTTCCCCTAT TCTCAGGCTA CACCCTAGAC CAAACCTACG CCAAAATCCA 7140
TTTCACTATC ATATTCATCG GCGTAAATCT AACTTTCTTC CCACAACACT TTCTCGGCCT 7200
ATCCGGAATG CCCCGACGTT ACTCGGACTA CCCCGATGCA TACACCACAT GAAACATCCT 7260
ATCATCTGTA GGCTCATTCA TTTCTCTAAC AGCAGTAATA TTAATAATTT TCATGATTTG 7320
AGAAGCCTTC GCTTCGAAGC GAAAAGTCCT AATAGTAGAA GAACCCTCCA TAAACCTGGA 7380
GTGACTATAT GGATGCCCCC CACCCTACCA CACATTCGAA GAACCCGTAT ACATAAAATC 7440
TAGACAAAAA AGGAAGGAAT CGAACCCCCC AAAGCTGGTT TCAAGCCAAC CCCATGGCCT 7500
CCATGACTTT TTCAAAAAGG TATTAGAAAA ACCATTTCAT AACTTTGTCA AAGTTAAATT 7560
ATAGGCTAAA TCCTATATAT CTTAATGGCA CATGCAGCGC AAGTAGGTCT ACAAGACGCT 7620
ACTTCCCCTA TCATAGAAGA GCTTATCACC TTTCATGATC ACGCCCTCAT AATCATTTTC 7680
CTTATCTGCT TCCTAGTCCT GTATGCCCTT TTCCTAACAC TCACAACAAA ACTAACTAAT 7740
ACTAACATCT CAGACGCTCA GGAAATAGAA ACCGTCTGAA CTATCCTGCC CGCCATCATC 7800
CTAGTCCTCA TCGCCCTCCC ATCCCTACGC ATCCTTTACA TAACAGACGA GGTCAACGAT 7860
CCCTCCCTTA CCATCAAATC AATTGGCCAC CAATGGTACT GAACCTACGA GTACACCGAC 7920
TACGGCGGAC TAATCTTCAA CTCCTACATA CTTCCCCCAT TATTCCTAGA ACCAGGCGAC 7980
CTGCGACTCC TTGACGTTGA CAATCGAGTA GTACTCCCGA TTGAAGCCCC CATTCGTATA 8040
ATAATTACAT CACAAGACGT CTTGCACTCA TGAGCTGTCC CCACATTAGG CTTAAAAACA 8100
GATGCAATTC CCGGACGTCT AAACCAAACC ACTTTCACCG CTACACGACC GGGGGTATAC 8160
TACGGTCAAT GCTCTGAAAT CTGTGGAGCA AACCACAGTT TCATGCCCAT CGTCCTAGAA 8220
TTAATTCCCC TAAAAATCTT TGAAATAGGG CCCGTATTTA CCCTATAGCA CCCCCTCTAC 8280
CCCCTCTAGA GCCCACTGTA AAGCTAACTT AGCATTAACC TTTTAAGTTA AAGATTAAGA 8340
GAACCAACAC CTCTTTACAG TGAAATGCCC CAACTAAATA CTACCGTATG GCCCACCATA 8400
ATTACCCCCA TACTCCTTAC ACTATTCCTC ATCACCCAAC TAAAAATATT AAACACAAAC 8460
TACCACCTAC CTCCCTCACC AAAGCCCATA AAAATAAAAA ATTATAACAA ACCCTGAGAA 8520
CCAAAATGAA CGAAAATCTG TTCGCTTCAT TCATTGCCCC CACAATCCTA GGCCTACCCG 8580
CCGCAGTACT GATCATTCTA TTTCCCCCTC TATTGATCCC CACCTCCAAA TATCTCATCA 8640
ACAACCGACT AATCACCACC CAACAATGAC TAATCAAACT AACCTCAAAA CAAATGATAA 8700
CCATACACAA CACTAAAGGA CGAACCTGAT CTCTTATACT AGTATCCTTA ATCATTTTTA 8760
TTGCCACAAC TAACCTCCTC GGACTCCTGC CTCACTCATT TACACCAACC ACCCAACTAT 8820
CTATAAACCT AGCCATGGCC ATCCCCTTAT GAGCGGGCAC AGTGATTATA GGCTTTCGCT 8880
CTAAGATTAA AAATGCCCTA GCCCACTTCT TACCACAAGG CACACCTACA CCCCTTATCC 8940
CCATACTAGT TATTATCGAA ACCATCAGCC TACTCATTCA ACCAATAGCC CTGGCCGTAC 9000
GCCTAACCGC TAACATTACT GCAGGCCACC TACTCATGCA CCTAATTGGA AGCGCCACCC 9060
TAGCAATATC AACCATTAAC CTTCCCTCTA CACTTATCAT CTTCACAATT CTAATTCTAC 9120
TGACTATCCT AGAAATCGCT GTCGCCTTAA TCCAAGCCTA CGTTTTCACA CTTCTAGTAA 9180
GCCTCTACCT GCACGACAAC ACATAATGAC CCACCAATCA CATGCCTATC ATATAGTAAA 9240
ACCCAGCCCA TGACCCCTAA CAGGGGCCCT CTCAGCCCTC CTAATGACCT CCGGCCTAGC 9300
CATGTGATTT CACTTCCACT CCATAACGCT CCTCATACTA GGCCTACTAA CCAACACACT 9360
AACCATATAC CAATGATGGC GCGATGTAAC ACGAGAAAGC ACATACCAAG GCCACCACAC 9420
ACCACCTGTC CAAAAAGGCC TTCGATACGG GATAATCCTA TTTATTACCT CAGAAGTTTT 9480
TTTCTTCGCA GGATTTTTCT GAGCCTTTTA CCACTCCAGC CTAGCCCCTA CCCCCCAATT 9540
AGGAGGGCAC TGGCCCCCAA CAGGCATCAC CCCGCTAAAT CCCCTAGAAG TCCCACTCCT 9600
AAACACATCC GTATTACTCG CATCAGGAGT ATCAATCACC TGAGCTCACC ATAGTCTAAT 9660
AGAAAACAAC CGAAACCAAA TAATTCAAGC ACTGCTTATT ACAATTTTAC TGGGTCTCTA 9720
TTTTACCCTC CTACAAGCCT CAGAGTACTT CGAGTCTCCC TTCACCATTT CCGACGGCAT 9780
CTACGGCTCA ACATTTTTTG TAGCCACAGG CTTCCACGGA CTTCACGTCA TTATTGGCTC 9840
AACTTTCCTC ACTATCTGCT TCATCCGCCA ACTAATATTT CACTTTACAT CCAAACATCA 9900
CTTTGGCTTC GAAGCCGCCG CCTGATACTG GCATTTTGTA GATGTGGTTT GACTATTTCT 9960
GTATGTCTCC ATCTATTGAT GAGGGTCTTA CTCTTTTAGT ATAAATAGTA CCGTTAACTT 10020
CCAATTAACT AGTTTTGACA ACATTCAAAA AAGAGTAATA AACTTCGCCT TAATTTTAAT 10080
AATCAACACC CTCCTAGCCT TACTACTAAT AATTATTACA TTTTGACTAC CACAACTCAA 10140
CGGCTACATA GAAAAATCCA CCCCTTACGA GTGCGGCTTC GACCCTATAT CCCCCGCCCG 10200
CGTCCCTTTC TCCATAAAAT TCTTCTTAGT AGCTATTACC TTCTTATTAT TTGATCTAGA 10260
AATTGCCCTC CTTTTACCCC TACCATGAGC CCTACAAACA ACTAACCTGC CACTAATAGT 10320
TATGTCATCC CTCTTATTAA TCATCATCCT AGCCCTAAGT CTGGCCTATG AGTGACTACA 10380
AAAAGGATTA GACTGAACCG AATTGGTATA TAGTTTAAAC AAAACGAATG ATTTCGACTC 10440
ATTAAATTAT GATAATCATA TTTACCAAAT GCCCCTCATT TACATAAATA TTATACTAGC 10500
ATTTACCATC TCACTTCTAG GAATACTAGT ATATCGCTCA CACCTCATAT CCTCCCTACT 10560
ATGCCTAGAA GGAATAATAC TATCGCTGTT CATTATAGCT ACTCTCATAA CCCTCAACAC 10620
CCACTCCCTC TTAGCCAATA TTGTGCCTAT TGCCATACTA GTCTTTGCCG CCTGCGAAGC 10680
AGCGGTGGGC CTAGCCCTAC TAGTCTCAAT CTCCAACACA TATGGCCTAG ACTACGTACA 10740
TAACCTAAAC CTACTCCAAT GCTAAAACTA ATCGTCCCAA CAATTATATT ACTACCACTG 10800
ACATGACTTT CCAAAAAACA CATAATTTGA ATCAACACAA CCACCCACAG CCTAATTATT 10860
AGCATCATCC CTCTACTATT TTTTAACCAA ATCAACAACA ACCTATTTAG CTGTTCCCCA 10920
ACCTTTTCCT CCGACCCCCT AACAACCCCC CTCCTAATAC TAACTACCTG ACTCCTACCC 10980
CTCACAATCA TGGCAAGCCA ACGCCACTTA TCCAGTGAAC CACTATCACG AAAAAAACTC 11040
TACCTCTCTA TACTAATCTC CCTACAAATC TCCTTAATTA TAACATTCAC AGCCACAGAA 11100
CTAATCATAT TTTATATCTT CTTCGAAACC ACACTTATCC CCACCTTGGC TATCATCACC 11160
CGATGAGGCA ACCAGCCAGA ACGCCTGAAC GCAGGCACAT ACTTCCTATT CTACACCCTA 11220
GTAGGCTCCC TTCCCCTACT CATCGCACTA ATTTACACTC ACAACACCCT AGGCTCACTA 11280
AACATTCTAC TACTCACTCT CACTGCCCAA GAACTATCAA ACTCCTGAGC CAACAACTTA 11340
ATATGACTAG CTTACACAAT AGCTTTTATA GTAAAGATAC CTCTTTACGG ACTCCACTTA 11400
TGACTCCCTA AAGCCCATGT CGAAGCCCCC ATCGCTGGGT CAATAGTACT TGCCGCAGTA 11460
CTCTTAAAAC TAGGCGGCTA TGGTATAATA CGCCTCACAC TCATTCTCAA CCCCCTGACA 11520
AAACACATAG CCTACCCCTT CCTTGTACTA TCCCTATGAG GCATAATTAT AACAAGCTCC 11580
ATCTGCCTAC GACAAACAGA CCTAAAATCG CTCATTGCAT ACTCTTCAAT CAGCCACATA 11640
GCCCTCGTAG TAACAGCCAT TCTCATCCAA ACCCCCTGAA GCTTCACCGG CGCAGTCATT 11700
CTCATAATCG CCCACGGGCT TACATCCTCA TTACTATTCT GCCTAGCAAA CTCAAACTAC 11760
GAACGCACTC ACAGTCGCAT CATAATCCTC TCTCAAGGAC TTCAAACTCT ACTCCCACTA 11820
ATAGCTTTTT GATGACTTCT AGCAAGCCTC GCTAACCTCG CCTTACCCCC CACTATTAAC 11880
CTACTGGGAG AACTCTCTGT GCTAGTAACC ACGTTCTCCT GATCAAATAT CACTCTCCTA 11940
CTTACAGGAC TCAACATACT AGTCACAGCC CTATACTCCC TCTACATATT TACCACAACA 12000
CAATGGGGCT CACTCACCCA CCACATTAAC AACATAAAAC CCTCATTCAC ACGAGAAAAC 12060
ACCCTCATGT TCATACACCT ATCCCCCATT CTCCTCCTAT CCCTCAACCC CGACATCATT 12120
ACCGGGTTTT CCTCTTGTAA ATATAGTTTA ACCAAAACAT CAGATTGTGA ATCTGACAAC 12180
AGAGGCTTAC GACCCCTTAT TTACCGAGAA AGCTCACAAG AACTGCTAAC TCATGCCCCC 12240
ATGTCTAACA ACATGGCTTT CTCAACTTTT AAAGGATAAC AGCTATCCAT TGGTCTTAGG 12300
CCCCAAAAAT TTTGGTGCAA CTCCAAATAA AAGTAATAAC CATGCACACT ACTATAACCA 12360
CCCTAACCCT GACTTCCCTA ATTCCCCCCA TCCTTACCAC CCTCGTTAAC CCTAACAAAA 12420
AAAACTCATA CCCCCATTAT GTAAAATCCA TTGTCGCATC CACCTTTATT ATCAGTCTCT 12480
TCCCCACAAC AATATTCATG TGCCTAGACC AAGAAGTTAT TATCTCGAAC TGACACTGAG 12540
CCACAACCCA AACAACCCAG CTCTCCCTAA GCTTCAAACT AGACTACTTC TCCATAATAT 12600
TCATCCCTGT AGCATTGTTC GTTACATGGT CCATCATAGA ATTCTCACTG TGATATATAA 12660
ACTCAGACCC AAACATTAAT CAGTTCTTCA AATATCTACT CATCTTCCTA ATTACCATAC 12720
TAATCTTAGT TACCGCTAAC AACCTATTCC AACTGTTCAT CGGCTGAGAG GGCGTAGGAA 12780
TTATATCCTT CTTGCTCATC AGTTGATGAT ACGCCCGAGC AGATGCCAAC ACAGCAGCCA 12840
TTCAAGCAAT CCTATACAAC CGTATCGGCG ATATCGGTTT CATCCTCGCC TTAGCATGAT 12900
TTATCCTACA CTCCAACTCA TGAGACCCAC AACAAATAGC CCTTCTAAAC GCTAATCCAA 12960
GCCTCACCCC ACTACTAGGC CTCCTCCTAG CAGCAGCAGG CAAATCAGCC CAATTAGGTC 13020
TCCACCCCTG ACTCCCCTCA GCCATAGAAG GCCCCACCCC AGTCTCAGCC CTACTCCACT 13080
CAAGCACTAT AGTTGTAGCA GGAATCTTCT TACTCATCCG CTTCCACCCC CTAGCAGAAA 13140
ATAGCCCACT AATCCAAACT CTAACACTAT GCTTAGGCGC TATCACCACT CTGTTCGCAG 13200
CAGTCTGCGC CCTTACACAA AATGACATCA AAAAAATCGT AGCCTTCTCC ACTTCAAGTC 13260
AACTAGGACT CATAATAGTT ACAATCGGCA TCAACCAACC ACACCTAGCA TTCCTGCACA 13320
TCTGTACCCA CGCCTTCTTC AAAGCCATAC TATTTATGTG CTCCGGGTCC ATCATCCACA 13380
ACCTTAACAA TGAACAAGAT ATTCGAAAAA TAGGAGGACT ACTCAAAACC ATACCTCTCA 13440
CTTCAACCTC CCTCACCATT GGCAGCCTAG CATTAGCAGG AATACCTTTC CTCACAGGTT 13500
TCTACTCCAA AGACCACATC ATCGAAACCG CAAACATATC ATACACAAAC GCCTGAGCCC 13560
TATCTATTAC TCTCATCGCT ACCTCCCTGA CAAGCGCCTA TAGCACTCGA ATAATTCTTC 13620
TCACCCTAAC AGGTCAACCT CGCTTCCCCA CCCTTACTAA CATTAACGAA AATAACCCCA 13680
CCCTACTAAA CCCCATTAAA CGCCTGGCAG CCGGAAGCCT ATTCGCAGGA TTTCTCATTA 13740
CTAACAACAT TTCCCCCGCA TCCCCCTTCC AAACAACAAT CCCCCTCTAC CTAAAACTCA 13800
CAGCCCTCGC TGTCACTTTC CTAGGACTTC TAACAGCCCT AGACCTCAAC TACCTAACCA 13860
ACAAACTTAA AATAAAATCC CCACTATGCA CATTTTATTT CTCCAACATA CTCGGATTCT 13920
ACCCTAGCAT CACACACCGC ACAATCCCCT ATCTAGGCCT TCTTACGAGC CAAAACCTGC 13980
CCCTACTCCT CCTAGACCTA ACCTGACTAG AAAAGCTATT ACCTAAAACA ATTTCACAGC 14040
ACCAAATCTC CACCTCCATC ATCACCTCAA CCCAAAAAGG CATAATTAAA CTTTACTTCC 14100
TCTCTTTCTT CTTCCCACTC ATCCTAACCC TACTCCTAAT CACATAACCT ATTCCCCCGA 14160
GCAATCTCAA TTACAATATA TACACCAACA AACAATGTTC AACCAGTAAC TACTACTAAT 14220
CAACGCCCAT AATCATACAA AGCCCCCGCA CCAATAGGAT CCTCCCGAAT CAACCCTGAC 14280
CCCTCTCCTT CATAAATTAT TCAGCTTCCT ACACTATTAA AGTTTACCAC AACCACCACC 14340
CCATCATACT CTTTCACCCA CAGCACCAAT CCTACCTCCA TCGCTAACCC CACTAAAACA 14400
CTCACCAAGA CCTCAACCCC TGACCCCCAT GCCTCAGGAT ACTCCTCAAT AGCCATCGCT 14460
GTAGTATATC CAAAGACAAC CATCATTCCC CCTAAATAAA TTAAAAAAAC TATTAAACCC 14520
ATATAACCTC CCCCAAAATT CAGAATAATA ACACACCCGA CCACACCGCT AACAATCAAT 14580
ACTAAACCCC CATAAATAGG AGAAGGCTTA GAAGAAAACC CCACAAACCC CATTACTAAA 14640
CCCACACTCA ACAGAAACAA AGCATACATC ATTATTCTCG CACGGACTAC AACCACGACC 14700
AATGATATGA AAAACCATCG TTGTATTTCA ACTACAAGAA CACCAATGAC CCCAATACGC 14760
AAAACTAACC CCCTAATAAA ATTAATTAAC CACTCATTCA TCGACCTCCC CACCCCATCC 14820
AACATCTCCG CATGATGAAA CTTCGGCTCA CTCCTTGGCG CCTGCCTGAT CCTCCAAATC 14880
ACCACAGGAC TATTCCTAGC CATGCACTAC TCACCAGACG CCTCAACCGC CTTTTCATCA 14940
ATCGCCCACA TCACTCGAGA CGTAAATTAT GGCTGAATCA TCCGCTACCT TCACGCCAAT 15000
GGCGCCTCAA TATTCTTTAT CTGCCTCTTC CTACACATCG GGCGAGGCCT ATATTACGGA 15060
TCATTTCTCT ACTCAGAAAC CTGAAACATC GGCATTATCC TCCTGCTTGC AACTATAGCA 15120
ACAGCCTTCA TAGGCTATGT CCTCCCGTGA GGCCAAATAT CATTCTGAGG GGCCACAGTA 15180
ATTACAAACT TACTATCCGC CATCCCATAC ATTGGGACAG ACCTAGTTCA ATGAATCTGA 15240
GGAGGCTACT CAGTAGACAG TCCCACCCTC ACACGATTCT TTACCTTTCA CTTCATCTTG 15300
CCCTTCATTA TTGCAGCCCT AGCAACACTC CACCTCCTAT TCTTGCACGA AACGGGATCA 15360
AACAACCCCC TAGGAATCAC CTCCCATTCC GATAAAATCA CCTTCCACCC TTACTACACA 15420
ATCAAAGACG CCCTCGGCTT ACTTCTCTTC CTTCTCTCCT TAATGACATT AACACTATTC 15480
TCACCAGACC TCCTAGGCGA CCCAGACAAT TATACCCTAG CCAACCCCTT AAACACCCCT 15540
CCCCACATCA AGCCCGAATG ATATTTCCTA TTCGCCTACA CAATTCTCCG ATCCGTCCCT 15600
AACAAACTAG GAGGCGTCCT TGCCCTATTA CTATCCATCC TCATCCTAGC AATAATCCCC 15660
ATCCTCCATA TATCCAAACA ACAAAGCATA ATATTTCGCC CACTAAGCCA ATCACTTTAT 15720
TGACTCCTAG CCGCAGACCT CCTCATTCTA ACCTGAATCG GAGGACAACC AGTAAGCTAC 15780
CCTTTTACCA TCATTGGACA AGTAGCATCC GTACTATACT TCACAACAAT CCTAATCCTA 15840
ATACCAACTA TCTCCCTAAT TGAAAACAAA ATACTCAAAT GGGCCTGTCC TTGTAGTATA 15900
AACTAATACA CCAGTCTTGT AAACCGGAGA TGAAAACCTT TTTCCAAGGA CAAATCAGAG 15960
AAAAAGTCTT TAACTCCACC ATTAGCACCC AAAGCTAAGA TTCTAATTTA AACTATTCTC 16020
TGTTCTTTCA TGGGGAAGCA GATTTGGGTA CCACCCAAGT ATTGACTCAC CCATCAACAA 16080
CCGCTATGTA TTTCGTACAT TACTGCCAGC CACCATGAAT ATTGTACGGT ACCATAAATA 16140
CTTGACCACC TGTAGTACAT AAAAACCCAA TCCACATCAA AACCCCCTCC CCATGCTTAC 16200
AAGCAAGTAC AGCAATCAAC CCTCAACTAT CACACATCAA CTGCAACTCC AAAGCCACCC 16260
CTCACCCACT AGGATACCAA CAAACCTACC CACCCTTAAC AGTACATAGT ACATAAAGCC 16320
ATTTACCGTA CATAGCACAT TACAGTCAAA TCCCTTCTCG TCCCCATGGA TGACCCCCCT 16380
CAGATAGGGG TCCCTTGACC ACCATCCTCC GTGAAATCAA TATCCCGCAC AAGAGTGCTA 16440
CTCTCCTCGC TCCGGGCCCA TAACACTTGG GGGTAGCTAA AGTGAACTGT ATCCGACATC 16500
TGGTTCCTAC TTCAGGGTCA TAAAGCCTAA ATAGCCCACA CGTTCCCCTT AAATAAGACA 16560
TCACGATG 16568
Claims (10)
- 모계 유전성 청각장애와 관련있는 미토콘드리아 유전자의 C1494T 돌연변이를 검출하기 위한 실시간 정량 TaqMan MGB 프로브로서,상기 프로브의 5’말단은 모계 유전성 청각장애와 관련있는 미토콘드리아 유전자 서열인 서열번호 5에서 1482-1488 bp 영역에 위치되고;상기 프로브의 3’말단은 모계 유전성 청각장애와 관련있는 미토콘드리아 유전자 서열인 서열번호 5에서 1503-1508 bp 영역에 위치되고;상기 프로브 단편의 5' 말단은 리포터로 표지되어 있으며;상기 프로브 단편의 3' 말단은 비-형광 퀀칭 그룹인 MGB로 표지되어 있으며;상기 프로브의 서열에서 서열번호 5의 1494bp에 해당되는 염기가 C에서 T로 치환되어 있으며, 이를 돌연변이형 실시간 정량 MGB 프로브라고 하는 것을 특징으로 하는 실시간 정량적 TaqMan MGB 프로브.
- 제 1항에 있어서,야생형 MGB 프로브를 더 포함하며;상기 야생형 MGB 프로브는, 1494bp의 염기가 C이고 5’말단 형광 리포터 그룹이 돌연변이형 MGB 프로브의 5’말단 형광 리포터 그룹과 상이하고, 프로브의 시작점이 1487bp이 아니라 1488bp인 것을 제외하고는, 상기 돌연변이형 실시간 정량 MGB 프로브와 동일한 것을 특징으로 하는 실시간 정량 TaqMan MGB 프로브.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서,상기 돌연변이형 MGB 프로브의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열로부터 선택되거나, 또는 상기 야생형 MGB 프로브의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 실시간 정량 TaqMan MGB 프로브.
- 제 3항에 있어서,상기 돌연변이형 MGB 프로브 5' 말단의 형광 리포터 그룹은 FAM 형광 리포터 그룹이고, 야생형 MGB 프로브 5' 말단의 형광 리포터 그룹은 HEX 형광 리포터 그룹인 것을 특징으로 하는 실시간 정량 TaqMan MGB 프로브.
- 모계 유전성 청각장애와 관련있는 미토콘드리아 유전자 서열인 서열번호 5에서 C1494T 돌연변이를 실시간 정량적으로 검출하여, 모계 유전성 미토콘드리아 청각장애를 진단하기 위한 키트로서,1. 혈액 샘플 DNA 분리용 시약;2. PCR 증폭 반응용 시약 혼합물;3. C1494C 부위 또는 C1494T 돌연변이 부위를 포함하는 모계 유전성 미토콘드리아 청각장애와 관련있는 유전자 서열인 서열번호 5를 증폭하기 위한 정방향 프라이머와 역방향 프라이머;4. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한항에 따른 실시간 정량 돌연변이형 Taqman MGB 프로브; 및5. 선택적으로, 설명서를 포함하는 것을 특징으로 하는 모계 유전성 미토콘드리아 청각장애의 진단 키트.
- 제 5항에 있어서,제 2항 내지 제 4항 중 어느 한항에 따른 야생형 실시간 정량 TaqMan MGB 프로브를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 5항 또는 제6항에 있어서,상기 정방향 프라이머는 서열번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열로부터 선택되며, 역방향 프라이머는 서열번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한항에 있어서,상기 반응용 시약 혼합물은 Hotstar Mastermix 혼합액이고,상기 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 같은 비율로 혼합되며,상기 혈액 샘플 DNA 분리용 시약은 발바닥 혈액 DNA 분리에 사용되는 용액I이며, 이의 주요 성분은 Chelex인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한항에 있어서,상기 반응용 시약 혼합물은 Hotstar Mastermix 혼합물이고,상기 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 동일 비율로 혼합되며,상기 혈액 샘플 DNA 분리용 시약은 말초 혈액 DNA 분리에 사용되는 시약인 것을 특징으로 하는 키트.
- 모계 유전성 청각장애와 관련있는 미토콘드리아 유전자의 C1494T 돌연변이를 검출하기 위한, 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한항에 따른 TaqMGB 프로브 또는 제 5항 내지 제 9항 중 어느 한항에 따른 키트의 용도.
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