CN1245522C - 母系遗传耳聋线粒体基因1555位a→g突变的检测方法及其试剂盒 - Google Patents
母系遗传耳聋线粒体基因1555位a→g突变的检测方法及其试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1245522C CN1245522C CN 03156762 CN03156762A CN1245522C CN 1245522 C CN1245522 C CN 1245522C CN 03156762 CN03156762 CN 03156762 CN 03156762 A CN03156762 A CN 03156762A CN 1245522 C CN1245522 C CN 1245522C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sudden change
- restriction enzyme
- haeiii
- primer
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 title claims abstract description 50
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 5
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 title 1
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 claims abstract description 43
- 231100000895 deafness Toxicity 0.000 claims abstract description 40
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000013461 design Methods 0.000 claims abstract description 15
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 51
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 15
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 12
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 11
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 abstract description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 14
- 230000005570 vertical transmission Effects 0.000 description 14
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 7
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 6
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 5
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 description 3
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 206010033109 Ototoxicity Diseases 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 231100000262 ototoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- DNYGXMICFMACRA-XHEDQWPISA-N Gentamicin C2b Chemical compound O1[C@H](CNC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N DNYGXMICFMACRA-XHEDQWPISA-N 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000002647 aminoglycoside antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- DNYGXMICFMACRA-UHFFFAOYSA-N gentamicin C1A Natural products O1C(CNC)CCC(N)C1OC1C(O)C(OC2C(C(NC)C(C)(O)CO2)O)C(N)CC1N DNYGXMICFMACRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- -1 kantlex Chemical compound 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229960004744 micronomicin Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 229960000707 tobramycin Drugs 0.000 description 1
- NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N tobramycin Chemical compound N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的检测方法。该方使用GenetoolLite程序协助设计改良引物，通过聚合酶链反应引入新的限制酶位点HaeIII，再用相应的酶切反应检测A→G突变。本发明还涉及制备根据该方法的体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的试剂盒，以及该试剂盒在检测所说的A→G突变中的应用。该方法简单、成本低，检测结果直接、可靠，适用于对母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的大规模的筛查或预防性检查。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体是涉及母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的检测方法。本发明还涉及制备根据该方法的体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的试剂盒，以及该试剂盒在检测所说的A→G突变中的应用。
背景技术
氨基糖甙类抗生素(链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素及小诺霉素等)因其广谱高效的抗菌作用以及低廉的价格在临床上被广泛用于控制革兰氏阴性和阳性菌感染，但此类抗生素具有严重的耳毒性副作用，可使患者发生不可逆转的听力损失。近十年来研究发现，部分氨基糖甙类抗生素致聋患者有母系遗传家族史，并与线粒体DNA 12S rRNA基因(以下简称为线粒体基因，或mtDNA)第1555位A→G均质性点突变有关(Prezant TR等，Nat Genet，1993，4：289-294；袁慧军等，中华耳鼻咽喉科杂志，1998，33：67-70)。单次剂量的氨基糖甙类药物应用即可导致携带此突变个体的重度听力损失。根据目前已有的研究结果可知，几乎携带此突变的个体在应用不同剂量的氨基糖甙类抗生素后均发生严重或较严重的听力损失，是后天性获得性耳聋发生的重要原因。鉴于这一耳聋的有明确的基因变化和诱发因素，使得这种耳聋成为一种可以预防的疾病。
在中国已报道的线粒体基因1555A→G(mtDNA1555A→G)突变母系遗传耳聋家系已超过50个，各家系发病人数从2-50人不等，考虑到尚有很多同类家系尚未被发现报道，以及此突变在散发性耳聋的致病机制中占有一定的比例，对这种耳聋的预防变得更为重要。其预防的关键环节在于通过筛查，检测发现携带mtDNA1555A→G突变的个体，绝对禁止此类个体接触氨基糖甙类抗生素，从而避免严重的耳毒性反应发生。
自1993年以耒，对此突变的检测除了直接测序外，最常用的筛选方法为BsmA1(Alw261)酶切法(Fischel-Ghodsian等，Am J Otolaryngol，1993，14：399-403；Fischel-Ghodsian等，Am J Otolaryngol，1997b，18：173-178；袁慧军等，中华耳鼻咽喉科杂志，1998，33：67-70)。在国内外，普遍应用限制性酶BsmA I(Alw26 I)酶切配合序列分析鉴定有无mtDNA1555A→G突变，酶切鉴定方便快捷，结果可靠，但不足的是BsmA I(Alw26I)价格较贵，与常用的限制性酶相比，价格差异达50-100倍，因此，迫切需要一种简单、快速、准确而且成本低的检测方法，以满足对mtDNA1555A→G突变进行广泛筛查的需要。
发明内容
本发明的目的是针对目前检测mtDNA1555A→G突变的方法所存在的缺点，提供一种简单、快速、成本低的检测母系遗传性耳聋mtDNA1555A→G突变的方法；本发明的另一个目的是提供检测母系遗传性耳聋mtDNA1555A→G突变的试剂盒；本发明还有一个目的是提供本发明的试剂盒在预防母系遗传性耳聋中的应用。
本发明的目的通过下述的方案实现：
使用Genetool Lite程序(美国Biotools公司提供的软件)协助设计引物，通过PCR扩增，在被测样本的PCR扩增片段上产生定点突变，从而在该基因的1555位邻近引入一个包括1555位在内的新的限制性酶切位点，然后用相应的限制性酶消化，检测该突变的存在。其中所设计的引物中，正向引物是线粒体DNA的核苷酸1463-1482，其序列为序列表中的SEQ ID NO：1；反向引物是线粒体DNA的核苷酸1575-1556，其中1557位的A置换为C，其序列为序列表中的SEQ ID NO：2；引入的新的限制酶位点为HaeIII，其识别序列位于线粒体DNA的核苷酸1554-1557。本发明人还利用本发明的方法和设计的引物提供用于体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的试剂盒，用于体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变，该试剂盒含有：
1.提取血样DNA的试剂；
2.PCR扩增反应试剂，包括dNTP、10XPCR缓冲液、Mg++、三蒸水、Taq酶；
3.等比例混合的权利要求2所述的正向引物和反向引物；
4.限制性酶HaeIII及其配套的缓冲液；
5.阳性标本对照、阴性标本对照，以及
6.使用说明书。
在本发明的实施方案中，引物设计的指导思想是在1555位点邻近的2-4个碱基引入一个碱基替换，造成可能的能够鉴别mtDNA1555野生型(A)和突变型(G)的新的限制性酶切位点。使用GenetoolLite程序协助设计引物，设计原则为根据已知的线粒体基因的序列，使正向引物的3’末端位于1554位，反向引物在1555位的下游约120bp处，或使反向引物的3’末端位于1556位，正向引物在1555位的上游约120bp处，从而使PCR扩增后的产物包含1555位核苷酸(参照图1)；同时分别在1552、1553和1557、1558位引入可能的碱基置换，使形成的新的限制酶识别序列中包含1555位核苷酸，然后用enetoolLite程序检索出能鉴别线粒体基因1555野生型(A)和1555突变型(G)的新的限制性酶位点。
应用Genetool Lite程序将1553、1552位点分别进行所有可能的碱基替换，未发现能够鉴别1555A→G突变型和野生型的新增限制性酶切位点；将1557、1558位点分别进行所有可能的碱基替换时，Genetool Lite程序发现将1557位点的A替换为C时，在mtDNA1555A→G突变型分子中造成限制性酶HaeIII的识别序列(GGCC)，其切点在1555和1556之间，而在mtDNA1555野生型分子中无此序列(其相应的序列为GACC)。由此设计出反向引物R1为nt1575-nt1556，其中3’端第二个碱基(1557)为异配碱基(T-G)；正向引物F1为nt1463-1482。F1R1扩增子长113bp。
用以上设计的引物F1R1，以被测样本的DNA为模板，通过PCR扩增后能够获得明亮清晰的略大于100bp条带，证明反向引物3’端第二个碱基与模板异配并没有影响PCR的效率。F1R1PCR产物包含mtDNA1555位点，若模板为1555A→G突变型分子，则113bp的PCR产物存在HaeIII酶切位点，HaeIII酶切后获得93bp和20bp两个条带；若模板为mtDNA野生型分子，则113bp的PCR产物不存在HaeIII酶切位点，不能被HaeIII切开，酶切后仍是113bp一个条带。利用此区别，可以对1555A→G突变型分子进行简单、快速的测定。
本发明者还根据本发明中设计的引物序列，通过人工合成(通过给定序列由自动化核酸合成仪合成)获得引物，并与提取血样DNA的试剂；PCR扩增反应试剂，包括dNTP、10×PCR缓冲液、Mg++、三蒸水、Taq酶；限制性酶HaeIII及其配套的缓冲液；阳性标本对照、阴性标本对照，以及使用说明书组合起来，提供了用于体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的试剂盒，其主要功能在于将所有试剂集成在一个小盒内，使得DNA提取、核酸片段扩增、酶切鉴定可以在试剂盒提供的试剂基础上顺序完成。根据取血方式或被测样本形式的不同，本发明的试剂盒有三种类型可供选用，三种类型中除了提取血样DNA的试剂外，其余组分都相同。一型试剂盒的提取血样DNA的试剂为用作DNA裂解液的溶液1，其主要成分是Chelex(ABI公司产品)，适用于足跟血血片被测样本；二型试剂盒的提取血样DNA的试剂为外周血DNA试剂盒(选用市售产品配套使用)，适用于外周血被测样本；三型试剂盒不含提取血样DNA的试剂，适用于直接提供DNA的被测样本。
用本发明的方法检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变与现有技术BsmAI酶切鉴定方法相比有以下优点：
1.本发明的HaeIII酶切法的操作步骤及所需时间与BsmAI酶切鉴定方法基本相同，但BsmAI酶需要从国外购买，供应不及时，而且价格昂贵，而HaeIII限制性酶国内供应源丰富，成本极低，其价格仅为BsmAI的1/50-1/100，这些特点为在全国范围内实行mtDNA1555A→G突变的筛查和抗生素应用前预防性检测提供了便利的条件，从而从根本上减少对氨基糖甙类抗生素敏感的个体发生药物性耳聋的机会。
2.本发明的方法用HaeIII酶切突变型分子，A→G突变型分子能被HaeIII切开，酶切阳性直接表示mtDNA1555A→G突变的存在；而BsmAI切的是野生型分子，A→G突变型分子不能被BsmAI切开，在这种情况下，被测样本除了A→G突变的可能外，不排除其他突变的可能，因此，本发明的方法更直接、可靠。
附图说明
图1是本发明的引物设计方案示意图。
A：正向引物的3’末端位于1554位，反向引物在1555位的下游约120bp处；B：反向引物的3’末端位于1556位，正向引物在1555位的上游约120bp处；图1中，1表示mtDNA；2表示正向引物；3表示反向引物；○表示核苷酸位置。
图2是母系遗传耳聋家系13的系譜图。图中□代表男性个体；○代表女性个体；黑色图标代表发病个体；
代表先证者；/代表已死亡的个体。
图3是HaeIII酶切法鉴定mtDNA1555A→G突变的2％琼脂糖凝胶电泳图。
泳道1-3、5-7：mtDNA1555A-G突变患者；泳道4、8：正常个体；泳道9：分子量标志(100bp间隔)。
具体实施方式
实施例一母系遗传耳聋家系线粒体基1555A→G突变的检测
1.检测样本
选择以母系遗传为传递特征的耳聋家系14个，总人数为301人，其中耳聋患者共84人，受检者中，耳聋患者为33人，与耳聋家系无关的正常听力个体11人，从被检个体提取外周全血DNA(袁慧军等，中华耳鼻咽喉科杂志，1998，33(2)：67-70；李为民等，临床耳鼻咽喉科杂志，2001，15(增刊)：53-58)，作为检测样本。14个家系综合情况见表1，其中家系13的系谱图见图2。其余家系的疾病传递方式均与家系13类似，每个家系均有患者应用过氨基糖甙类抗生素，特点为女性患者若应用过AmAn均发病早、耳聋程度重，若未用过AmAn则听力正常或耳聋发病晚，程度轻。
2.引物设计
使用GenetoolLite程序协助设计改良引物，根据已公开的线粒体基因剑桥序列(Cambridge Sequence)，引物的设计方案有2种：
(1)使正向引物的3’末端位于1554位，反向引物在1555位的下游约120bp处(参照图1，A)；
(2)使反向引物的3’末端位于1556位，正向引物在1555位的上游约120bp处(参照图1，B)，从而使PCR扩增后的产物包含1555位核苷酸。同时分别在1552、1553和1557、1558位引入可能的碱基置换，使形成的新的限制酶识别序列中包含1555位核苷酸，然后用GenetoolLite程序检索出能鉴别线粒体基因1555野生型(A)和1555突变型(G)的新的限制酶位点。应用Genetool Lite程序将1553、1552位点分别进行所有可能的碱基替换，未发现能够鉴别1555A→G突变型和野生型的新增酶切位点；将1557、1558位点分别进行所有可能的碱基替换，Genetool Lite程序发现将1557位点的A替换为C时，在mtDNA1555A→G突变型分子中造成限制性酶HaeIII的识别序列(GGCC)，其切点在1555和1556之间，而在mtDNA1555野生型分子中无此序列(其相应的序列为GACC)。由此设计出反向引物R1为mtDNA nt1575-nt1556，即5′-ACTTACCATGTTACGACTGG-3′，其中3’端第二个碱基(1557)为异配碱基(T-G)，该序列设定为SEQ IDNO：2；另外，设计正向引物F1为mtDNAnt1463-1482，即5′-GGCCCTGAAGCGCGTACACA-3′，该序列设定为SEQ ID NO：1，F1R1扩增子长113bp。
3.PCR扩增反应
根据上述设计的引物序列SEQ ID NO：1和SEQID NO：2，通过人工合成(通过给定序列由自动化核酸合成仪合成)得到正向引物F1和反向引物R1，并以上述提取的被测样本周边血DNA为模板，进行PCR扩增反应：
反应体系：
模板 50ng
引物F1，R1 各50ng
10×dNTP 5μl
10×Buffer 5μl
Mg++ 终浓度1.5mmol/L
Taq酶 1.0u
加三蒸水至50μl体积。
反应条件：
95℃变性5分钟后，接着94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，最后在72℃下再延伸7分钟。
用2％琼脂糖凝胶电泳检查产物。PCR扩增后F1R1能够获得明亮清晰的略大于100bp条带，证明反向引物3’端第二个碱基与模板异配并没有影响PCR的效率，F1R1PCR产物包含mtDNA1555位点，若模板为1555A→G突变型分子，则113bp的PCR产物存在HaeIII酶切位点，HaeIII酶切后获得93bp和20bp两个条带；若模板为mtDNA野生型分子，则113bp的PCR产物不存在HaeIII酶切位点，不能被HaeIII切开，酶切后仍是113bp一个条带。
4.HaeIII酶切检测
被测样本的PCR扩增产物按下述条件检测1555A→G突变。酶切反应体系：
PCR产物 12-18μl
10×缓冲液 3μl
HaeIII限制性酶 5-10u
BSA 0.3μl
三蒸水补足体积至30μl，35℃温育1小时。酶切反应物用2％琼脂糖凝胶检查。
5.结果
如表1所示，在总共14个家系中，13个家系的33个耳聋患者的F1R1扩增产物(113bp)可以被HaeIII切成93bp和20bp两条带，表明其存在mtDNA1555A-G突变(参见图2的泳道1-3、5-7)。另一个家系内的一个耳聋患者的F1R1扩增产物不能被HaeIII切开，表明此家系内不存在mtDNA1555A-G突变(表1中的家系3)，11名与患者无血缘关系的家系内个体以及正常对照个体的F1R1扩增产物均不能被HaeIII切开(参见图2的泳道4、8)，表明其不存在mtDNA1555A→G突变。
6.HaeIII酶切法可靠性的检验
所有被检测个体的1555位点均经过BamAI(Alw26I)酶切检验(袁慧军等，中华耳鼻咽喉科杂志，1998，33(2)：67-70；李为民等，临床耳鼻咽喉科杂志，2001，15(增刊)：53-58)，如表1所示，其结果证明根据HaeIII酶切表明其携带1555A→G突变的33个耳聋患者，其含有1555位点的扩增产物均不能被BamAI切开；而HaeIII酶切表明不携带1555A→G突变的11个正常个体，其含有1555位点的扩增产物均能被BamAI切开。家系3亦表现为母系遗传性氨基糖甙类敏感的耳聋家系，此家系的一个女性受检者HaeIII酶切表明其不携带1555A-G突变，经BamAI(Alw26I)酶切法进一步检测，此患者及其两个妹 表1：母系遗传家系情况及线粒体1555位点检测结果
| 家系编号 | 代数 | 总人数 | 耳聋患者 | 疾病传递方式 | AmAn1用药史 | 受检耳聋患者数 | 1555A-G突变检测 | ||
| 改良引物HaeIII检测 | Alw26检测 | 测序 | |||||||
| 1234567891011121314 | 33333443333244 | 26181722151124141581432589 | 667446854562814 | 母系垂直传递母系垂直传递母系垂直传递母系垂直传递母系垂直传递母系垂直传递母系垂直传递母系垂直传递母系垂直传递母系垂直传递母系垂直传递母系垂直传递母系垂直传递母系垂直传递 | 有有有有有有有有有有有有有有 | 23142231113244 | ++-+++++++++++ | ++-+++++++++++ | ++-+++++++++++ |
1AmAn：氨基糖甙类抗生素妹、及她们的三个子女均表明无1555A-G突变。两种酶切方法的吻合率为100％，说明使用本发明方法检测1555A→G突变的可靠性和稳定性。
此外，每个家系均选取至少1例患者经酶切检测表明具有1555A→G突变的DNA标本进行1555位点的直接测序检查，结果除家系3外，测序结果均显示mtDNA1555位点发生A→G的替换，与HaeIII酶切法的结果完全一致。
实施例二体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位
A→G突变的一型试剂盒及其应用
1.适用于足跟血片的一型试剂盒(100人份)包含以下组分：
(1)溶液I(主要成份为5％Chelex)25ml；
(2)PCR试剂(包括8mM dNTP 150μl、10×PCR缓冲液1ml、25mM Mg++溶液1ml、三蒸水1ml×4管、5u/μl Taq酶25μl)；
(3)正向引物mtDNAnt1463-1482；反向引物mtDNAnt1575-1556，其中mtDNAnt1557位碱基A突变为G，正反向引物按等比例混合(浓度均为10μM)，共150μl；
(4)限制性酶HaeIII，20u/μl，110μl及配套的10×缓冲液1ml；
(5)阳性对照标本125μl、阴性对照标本125μl；
(6)使用说明书。
2.检测对象
选择家系13(见表1)为被测家系，该家系共有4代25个成员，共有8名耳聋患者，发病前均有氨基糖甙类抗生素用药史。本实施例选择其中4名耳聋患者为受检对象。
3.检测方法及结果
按照本试剂盒的使用说明书，用溶液I(主要成份为5％Chelex)提取受检者的足根血血片DNA，并取50ng作为模板，加入引物混合物100ng、10×dNTP 5μl、10×缓冲液5μl、Mg++终浓度为1.5mmol/L，加三蒸水至50μl后，加1.0u Taq酶，95℃变性5分钟后，接着94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，最后在72℃下再延伸7分钟。按同样的PCR反应条件，用试剂盒内提供的1555A→G阳性模板和阴性模板同时作阳性和阴性对照PCR反应，并设立无模板PCR空白对照管，反应后用2％琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物，结果，无模板对照物未见扩增产物，4名患者及阳性、阴性对照标本的PCR产物均为113bp。PCR产物用HaeIII酶切检测，酶切反应体系为30μl，包括：
10×缓冲液 3μl
100×BSA 0.3μl
HaeIII 20u
PCR产物 12-18μl
以三蒸水补足体积，30℃温育1小时。酶切反应物用2％琼脂糖凝胶电泳检查，4名耳聋患者及阳性对照的PCR产物可见93bp和20bp条带，表明mtDNA1555A→G突变阳性；阴性对照仅见113bp条带，表明无mtDNA1555A→G突变。进一步用Alw26酶切和测序証实此4名患者均携带mtDNA1555A→G突变。
实施例三体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位
A→G突变的二型试剂盒及其应用
本实施例选择家系2(参见表1)的6名耳聋患者中的3名为受检对象。除了受检样本为周边血，以及试剂盒中的血样DNA提取剂为市售的周边血DNA提取试剂盒，并用该试剂盒提取周边血DNA以外，试剂盒中其他组分和检测方法与实施例二相同。检测结果见表1。
实施例四体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位
A→G突变的三型试剂盒及其应用
本实施例选择家系11(参见表1)的6名耳聋患者中的3名为受检对象。除了受检样本为从血样提取的DNA，以及试剂盒中不含血样DNA提取剂以外，试剂盒中其他组分和检测方法与实施例二相同。检测结果见表1。
本发明用于体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G的突变。
SEQUENCE LISTING
<110>戴，朴
<120>母系遗传耳聋线粒体基因A-G突变的检测方法及其试剂盒
<130>PatentIn 3.1
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>1
ggccctgaag cgcgtacaca 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>2
acttaccatg ttacgactgg 20
Claims (5)
1.一种母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的检测方法，其特征在于该方法使用Genetool Lite程序协助设计引物，通过PCR扩增，在被测样本的PCR扩增片段上产生定点突变，从而在该基因的1555位邻近引入一个包括1555位在内的新的限制性酶位点，然后用相应的限制性酶消化，检测该突变的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中所设计引物中，正向引物是线粒体DNA的核苷酸1463-1482，其序列为序列表中的SEQ ID NO：1；反向引物是线粒体DNA的核苷酸1575-1556，其中1557位的A置换为C，其序列为序列表中的SEQ ID NO：2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于其中PCR扩增后引入的新的限制性酶位点为HaeIII。
4.根据权利要求2所述的方法的体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有：
(1)提取血样DNA的试剂；
(2)PCR扩增反应试剂，包括dNTP、10×PCR缓冲液、Mg++、三蒸水、Taq酶；
(3)等比例混合的权利要求2所述的正向引物和反向引物；
(4)限制性酶HaeIII及其配套的缓冲液；
(5)阳性标本对照、阴性标本对照；
(6)使用说明书。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于其中所说的提取血样DNA的试剂为提取足跟血DNA的溶液，其主要成分为Chelex。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 03156762 CN1245522C (zh) | 2003-09-10 | 2003-09-10 | 母系遗传耳聋线粒体基因1555位a→g突变的检测方法及其试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 03156762 CN1245522C (zh) | 2003-09-10 | 2003-09-10 | 母系遗传耳聋线粒体基因1555位a→g突变的检测方法及其试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1490415A CN1490415A (zh) | 2004-04-21 |
| CN1245522C true CN1245522C (zh) | 2006-03-15 |
Family
ID=34156961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 03156762 Expired - Fee Related CN1245522C (zh) | 2003-09-10 | 2003-09-10 | 母系遗传耳聋线粒体基因1555位a→g突变的检测方法及其试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1245522C (zh) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101240339B (zh) * | 2005-12-22 | 2010-06-09 | 中国人民解放军总医院 | 检测前庭导水管扩大相关基因slc26a4的227c＞t突变的试剂盒 |
| CN101245379B (zh) * | 2005-12-22 | 2010-06-16 | 中国人民解放军总医院 | 检测前庭导水管扩大相关基因slc26a4的2054g＞t突变的试剂盒 |
| CN101245377B (zh) * | 2005-12-22 | 2011-02-16 | 中国人民解放军总医院 | 检测前庭导水管扩大相关基因slc26a4的1586t＞g突变的试剂盒 |
| CN100385014C (zh) * | 2005-12-22 | 2008-04-30 | 中国人民解放军总医院 | 前庭导水管扩大相关基因突变及其检测方法 |
| CN101492709B (zh) * | 2005-12-22 | 2010-11-24 | 中国人民解放军总医院 | 检测前庭导水管扩大相关基因SLC26A4的387delC突变的试剂盒 |
| CN101245378B (zh) * | 2005-12-22 | 2010-06-16 | 中国人民解放军总医院 | 检测前庭导水管扩大相关基因slc26a4的334c＞t突变的试剂盒 |
| CN1987463B (zh) * | 2006-12-26 | 2015-04-01 | 金政策 | 实时定量TaqMan MGB探针试剂盒 |
| CN1987462B (zh) * | 2006-12-26 | 2015-03-25 | 金政策 | 检测母系遗传线粒体耳聋基因a1555g突变的试剂盒 |
| CN101135666B (zh) * | 2007-10-01 | 2010-04-21 | 中国人民解放军第三军医大学 | 基于线粒体dna c3970t单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒 |
| CN101135667B (zh) * | 2007-10-01 | 2010-05-26 | 中国人民解放军第三军医大学 | 基于线粒体dna g3010a单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒 |
| CN101135665B (zh) * | 2007-10-01 | 2010-05-26 | 中国人民解放军第三军医大学 | 基于线粒体dna t6680c单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒 |
| CN101597638B (zh) * | 2008-06-04 | 2011-12-28 | 博奥生物有限公司 | 一种检测基因多突变位点的方法及其专用试剂盒 |
| CN101768637B (zh) * | 2009-11-20 | 2012-01-04 | 温州医学院 | 用于同时检测线粒体dna a1555g和c1494t突变的试剂盒及其使用方法 |
-
2003
- 2003-09-10 CN CN 03156762 patent/CN1245522C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1490415A (zh) | 2004-04-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1245522C (zh) | 母系遗传耳聋线粒体基因1555位a→g突变的检测方法及其试剂盒 | |
| Ahmed et al. | Revision of agents of black-grain eumycetoma in the order Pleosporales | |
| CN111793704B (zh) | 鉴别布鲁氏菌疫苗株s2和野毒株的snp分子标记及其应用 | |
| CN1372005A (zh) | 中国石斛属植物及其药材的dna分子鉴别方法 | |
| CN1873027A (zh) | 一种用于体外诊断非综合征性常染色体隐性遗传耳聋基因gjb2突变的引物及其应用 | |
| CN114807419A (zh) | 一种利用TaqMan探针和特异性引物鉴别山银花及其制剂的方法 | |
| Gomzhina et al. | New species and new findings of Phoma-like fungi (Didymellaceae) associated with some Asteraceae in Russia | |
| CN1506468A (zh) | 嗜水气单胞菌的pcr检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN101045939A (zh) | 一种hbv dna基因分型的检测方法及其试剂盒 | |
| CN1814806A (zh) | 安氏隐孢子虫pcr检测试剂盒 | |
| CN1932038A (zh) | 检测JAK2V617F突变的方法及其专用引物与TaqMan－MGB探针 | |
| CN1614396A (zh) | 一种检测松材线虫的方法及其专用引物和探针 | |
| CN1680596A (zh) | 淋病奈瑟菌荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN104120166A (zh) | 荧光pcr技术检测pds基因2168 a> g突变的方法及其试剂盒 | |
| CN104711366A (zh) | 一种药物性耳聋基因多通道荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN1588066A (zh) | 乙型肝炎病毒基因分型的荧光pcr检测方法及其试剂盒 | |
| CN1468965A (zh) | Sars病毒的基因检测试剂盒及检测方法 | |
| CN109913589B (zh) | 一种用于检测带状疱疹病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法 | |
| CN1831142A (zh) | 一种用于检测01群霍乱弧菌核苷酸片段的引物和探针序列 | |
| CN1793866A (zh) | 一种松树萎蔫病病原线虫的快速的检测方法 | |
| Ibrokhimov et al. | Identification of nematodes of the genus Teladorsagia parasites of ruminants with the help of species-specific markers based on ITS2 rDNA | |
| CN1563411A (zh) | 大蒜病毒检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN1232653C (zh) | 快速检测哈氏弧菌的试剂盒及检测方法 | |
| Ikromov et al. | Morphological and molecular characteristics of the species Cosmocerca commutata and C. ornata (Nematoda: Cosmocercidae) in Uzbekistan | |
| CN1834260A (zh) | 一种用于检测0139群霍乱弧菌核苷酸片段的引物和探针序列 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SHANDONG SANYUESAN GENE TECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: JIN ZHENGCE Effective date: 20080620 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20080620 Address after: No. 5 swallow mountain villa, Lixia District, Shandong, Ji'nan Patentee after: Shandong March three gene technology Co., Ltd. Address before: No. 46 east east street, Beijing Patentee before: Jin Zhengce |
|
| C57 | Notification of unclear or unknown address | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Jin Zhengce Document name: Notification of Passing Examination on Formalities |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Shandong March three gene technology Co., Ltd. Document name: Notification of Termination of Patent Right |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20060315 Termination date: 20160910 |