CN1873027A - 一种用于体外诊断非综合征性常染色体隐性遗传耳聋基因gjb2突变的引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于体外诊断非综合征性常染色体隐性遗传耳聋基因GJB2基因全编码区突变及233－235delC热点突变的引物。该引物可以一次性完成GJB2全编码区和两侧重要剪切序列的扩增。本发明还提供含有该引物和ApaI内切酶的试剂盒或类似产品，其可用于体外检测GJB2基因全编码区突变及233－235delC热点突变。该试剂盒或类似产品除了通过引物扩增、ApaI酶切鉴定GJB2基因突变的功能之外，还可同时用相同的正向引物进行测序PCR反应，利用测序仪直接测序，一次单向检测GJB2全编码区的突变位点；对于发现的缺失或插入杂合突变，用相同的反向引物进行测序。因此该试剂盒或类似产品适用于对非综合征性常染色体隐性遗传耳聋基因GJB2基因突变进行大规模的筛查及诊断、遗传咨询。

Description

一种用于体外诊断非综合征性常染色体隐性遗传 耳聋基因GJB2突变的引物及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体是涉及一种用于体外诊断非综合征性常染色体隐性遗传耳聋基因GJB2基因全编码区突变及233-235delC热点突变的引物。本发明还涉及该引物在制备用于体外诊断非综合征性常染色体隐性遗传耳聋基因GJB2全编码区突变的试剂盒或类似产品中的应用，具体是涉及含有该引物的试剂盒或类似产品，其可用于体外诊断非综合征性常染色体隐性遗传耳聋基因GJB2基因全编码区突变及233-235delC热点突变。

背景技术

目前，有1/1000-3/1000的儿童出生时为极重度耳聋。一半以上的儿童期耳聋为遗传性聋，并且大多数为常染色体隐性及非综合征性聋。在遗传性聋当中，70％以上为非综合征性聋(Cremers C W等，Ann N YAcad Sci，1991，630：191-196)，其中75-80％为常染色体隐性遗传。常染色体隐性遗传性聋患者中50％为GJB 2突变(Kelley PM等，Am JHum Genet，1998，62：792-799)；其余50％为其它基因突变所引起，并且多数只在1-2个家系中存在。GJB2基因突变与遗传性非综合征性耳聋密切相关，是其主要致病原因。GJB2基因编码的Cx26属于缝隙连接蛋白基因家族(SEQ ID NO：4，编码区两侧各有200个碱基的非翻译区序列)，形成的缝隙连接通道在电解质、第二信使和代谢产物的传导和交换中起重要作用。GJB2基因编码区的突变导致无功能蛋白质的产生，缝隙连接缺损，使钾离子回流进入内淋巴液的循环受到影响，Corti氏器钾中毒，从而引起感音神经性聋。已发现GJB2基因有108种突变方式(http://davinci.crg.es/deafness/2005-1-30)，突变热点存在种族差异。我们采用酶切的方法，对广东、广西、河南、河北、山西、黑龙江、吉林、内蒙古、安徽、北京等地区聋哑学校的998例散发非综合征性耳聋患儿进行了GJB2 233-235位点的检测，同时对204例听力正常儿童进行对照检测。结果发现，998例患儿中173例(17.33％)发现有235delC(即第235位点C缺失，下同)突变，其中76例为235delC纯合突变(7.61％)，97例为235delC杂合突变(9.72％)；正常对照204例，发现235delC杂合突变2例(0.98％)，未发现235delC纯合突变。结果表明，在中国人中，儿童非综合征性常染色体隐性遗传性耳聋主要为GJB2基因突变所致，其突变的主要方式为233-235delC(即233、235位点中C缺失，下同)，检出率为17.33％，同时发现各地GJB2基因233-235delC突变的检出率不同(参见表2)。鉴于该基因233-235delC突变在我国非综合征性常染色体阴性遗传性耳聋患者中所占比例较高，使得其成为一种必要的待检基因。

我们利用直接测序的方法，从以上所述广东、广西、河南、河北、山西、黑龙江、吉林、内蒙古、安徽、北京等地区聋哑学校的998例散发非综合征性耳聋患儿中，酶切显示233-235delC杂合突变的患儿进行正、反向测序，并在各地抽取40-50例进行GJB2基因全编码区突变检测，同时抽取100例听力正常儿童进行对照检测。发现GJB2基因233-235delC杂合突变者约一半伴有另一个突变位点，检出率为49.02％，其中299-300delAT(即第299-300位点AT缺失，下同)占72％；在无233-235delC突变者中发现3个其他突变。结果表明，在中国人中，儿童非综合征性常染色体隐性遗传性耳聋GJB2基因233-235delC突变为主要突变方式，且多伴有另一个突变位点，即299-300delAT突变为另一个主要的突变方式。

大部分进行遗传咨询的家庭由正常听力的父母和耳聋患儿组成，咨询目的为了解再次生出聋儿的可能性。由于导致语前聋的环境因素的存在，有时无法判断患者是否为遗传性聋。GJB2基因的突变鉴定，给遗传咨询带来了很大帮助。同时，GJB2基因的突变鉴定给咨询后的治疗也带来很大帮助。由于GJB2相关性耳聋者的螺旋神经节细胞的数量正常，因此在耳蜗植入后GJB2相关性耳聋患儿的言语理解能力强于非GJB2相关性患儿，GJB2突变相关性耳聋为人工耳蜗植入的指征，并预示患儿耳蜗植入的预后良好。因此，检测鉴定GJB2基因的突变应当作为耳聋筛查的一项常规内容。

目前，检测鉴定GJB2基因的方法多种多样，包括限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、限制酶切指纹一单链构象多态性分析(REF-SSCP)、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、变性梯度凝胶电泳法(DGGE)、变性高效液相色谱分析(dHPLC)及直接测序(DS)等。但是上述方法由于成本高，需要昂贵的设备，操作复杂，技术要求高，并且耗时耗力，并不适合筛查和推广使用。

由于我们发现中国人GJB2基因的突变热点在233-235位点，且具有该位点突变的耳聋患者即可确定其耳聋为GJB2基因突变所致；233-235位点中缺失碱基C后，导致230-235位点序列的改变，因此与野生型样品相比，GJB2基因230-235位点delC突变的样品不能被内切酶ApaI酶切。而酶切的前提是对GJB2基因全编码区各突变点的高效扩增和序列分析，因此设计合适的正反向引物一次扩增GJB2基因全编码区、适用于测序反应并保证无片断丢失和非特异性扩增是非常重要的。

发明内容

本发明是基于以下原理进行实施：由于我们发现中国人GJB2基因的突变热点在233-235位点，且具有该位点突变的耳聋患者即可确定其耳聋为GJB2基因突变所致；233-235位点缺失碱基C后，导致230-235位点序列的改变。相比之下，野生型样品的GJB2基因230-235位点可以找到相应的内切酶ApaI，因此设计合适的正反向引物一次扩增GJB2基因全编码区并结合酶切法，可用于体外诊断非综合征性常染色体隐性遗传耳聋基因GJB2全编码区突变及233-235delC突变。

因此，本发明第一个目的是提供用于体外诊断非综合征性常染色体隐性遗传耳聋基因GJB2全编码区突变的引物，其中正向引物Fn1的3’末端位于如序列SEQ ID NO：3所示的GJB2基因编码区上游约115bp处，反向引物Fn1的3’末端位于该编码区下游约110bp处，正向引物Fn1和反向引物R3c长度范围在18-22bp，并能完全扩增GJB2基因编码区。

该引物通过通过下述的方案设计：

使用Genetool Lite程序(美国Biotools公司提供的软件)协助设计引物，通过PC R扩增，将GJB2编码区完全扩增，然后用该基因的230-235位点相应的限制性酶消化，检测233-235delC突变位点的存在；对于发现233-235delC杂合突变者进行直接测序，检测另一个致病突变位点的存在。引物的设计是本发明的关键，我们通过上百次实验，进行了大量的引物设计和验证工作，最后发现如果正向引物Fn1的3’末端位于如序列SEQ ID NO：3(GJB2基因编码区)所示的GJB2基因编码区上游约115bp处，反向引物Fn1的3’末端位于该编码区下游约110bp处，正向引物Fn1和反向引物R3c长度范围在18-22bp，就能完全扩增GJB2基因编码区。由此，最终可选择具有极高扩增效率一对或几对引物，一次性扩增GJB2全编码区和重要剪切部位。所设计的引物中，正向引物Fn1的3’末端位于编码区的上游约115bp处，；反向引物R3c的3’末端位于编码区的下游约110bp，正向引物Fn1和反向引物R3c长度范围在18-22bp，就能完全扩增GJB2基因编码区。

在该发明目的一个实施方案中，所使用的软件程序包括但不限于：Genetool Lite程序(美国Biotools公司提供的软件)、Vector NTI、Oligo、Genestar、DNAMAN、DNASTAR、DNAtool、proteintool、Enzyme、pDRAW、Primer3、Primer5、Seq Convertor、DNAassist等等。

在该发明目的另一个实施方案中，引物设计的指导思想是将GJB2基因的编码区(第二外显子)完全扩增，提供限制性酶切位点，保证测序过程中无片断丢失。使用GenetoolLite程序协助设计引物，设计原则为根据己知的GJB2基因的序列，使正向引物Fn1的3’末端位于编码区的上游约115bp处，反向引物R3c的3’末端位于编码区的下游约110bp处，从而使PCR扩增后的产物包含整个编码区，并超出编码区范围100bp，可预防测序反应中部分片段的丢失。推荐测序应用ABI3730序列分析仪。

用以上设计的引物Fn1、R3c，以被测样本的DNA为模板，通过PCR扩增后能够获得明亮清晰的944bp的条带。若模板为野生型分子，则944bp的PCR产物存在ApaI酶切位点，ApaI酶切后获得585bp和359bp两个条带；若模板为233-235delC纯合突变型分子，则导致230-235位点序列改变，944bp的PCR产物不存在ApaI酶切位点，不能被ApaI切开，酶切后仍是944bp 1个条带；若模板为233-235delC杂合突变型分子，则944bp的PCR产物有1条带可被ApaI酶切，另1条带不能被ApaI切开，酶切后获得944bp、585bp和359bp 3个条带。利用此区别，可以对233-235delC突变型分子进行简单、快速的测定。

用以上设计的引物Fn1、R3c，对发现233-235delC杂合突变的DNA PCR产物进行正、反向测序发应扩增，纯化后变性、直接测序，可以准确的检测到全编码区的突变位点。

根据上述原理和实施方案的筛选结果，其中正向引物Fn1序列优选选自具有序列表或表1中的SEQ ID NO：1所示的序列，反向引物R3c序列优选选自具有序列表或表1中的SEQ ID NO：2所示的序列；正反向引物可用于测序PCR反应，直接测序保证检测到GJB2全部编码区，无片段丢失；引入的限制酶ApaI内切酶(GGGCC↓C)，其识别序列位于GJB2基因DNA的核苷酸230-235位点。

                  表1  合成的引物序列

序列	名称	5’-3’引物序列	扩增长度
				SEQ IDNO：1	Fn1	5′-TTGGTGTTTGCTCAGGAAGA-3′	944bp
SEQ IDNO：2	R3c	5′-GGCCTACAGGGGTTTCAAAT-3′

本发明第二个目的是提供该引物在制备用于体外诊断非综合征性常染色体隐性遗传耳聋基因GJB2 233-235delC突变的试剂盒或类似产品中的应用。

具体地说，该应用是提供一种用于体外诊断非综合征性常染色体隐性遗传耳聋基因GJB2的233-235delC突变的试剂盒或类似产品，包括：

(1)PCR扩增反应试剂，包括dNTP、10×PCR缓冲液、Mg++、三蒸水、Taq酶；

(2)等比例混合的正向引物Fn1和反向引物R3c；

(3)限制性酶ApaI及其配套的缓冲液；

(4)阳性标本对照、阴性标本对照；如果需要，还包括

(5)使用说明书。

上述试剂盒或类似产品适用于直接提供DNA的被测样本。

如果检测过程中还涉及样品或血样DNA的提取，则试剂盒或类似产品还包括用于提取血样DNA的试剂。该试剂可以是提取足根血DNA的溶液I，其主要成分为Chelex(ABI公司产品)的DNA裂解液的溶液I；也可以是为提取外周血DNA的提取试剂(选用市售产品配套使用)。

也就是说，根据取血方式或被测样本形式的不同，本发明的试剂盒有三种类型可供选用，三种类型中除了提取血样DNA的试剂外，其余组分都相同。一型试剂盒的提取血样DNA的试剂为用作DNA裂解液的溶液1，其主要成分是Chelex(ABI公司产品)，适用于足跟血血片被测样本；二型试剂盒的提取血样DNA的试剂为外周血DNA试剂盒(选用市售产品配套使用)，适用于外周血被测样本；三型试剂盒不含提取血样DNA的试剂，适用于直接提供DNA的被测样本。

由此可见，该发明目的所述的试剂盒或类似产品，其主要功能在于将所有试剂集成在一个小盒内，使得DNA提取、核酸片段扩增、酶切及测序鉴定可以在试剂盒提供的试剂基础上顺序完成。

应当指出，术语“类似产品”是指具有不同于试剂盒的名称，但与试剂盒具有类似结构或组分以及生物学功能的生物学产品。

本发明的第三个发明目的是在上述试剂盒或类似产品能酶切鉴定GJB2基因突变基础上，提供一种还可同时对GJB2基因编码区进行测序的试剂盒或类似产品。该试剂盒或类似产品除含有上述试剂盒或类似产品的组成之外，还包括用于对GJB2基因编码区进行测序的PCR纯化试剂、测序PCR反应及变性试剂。其中PCR纯化试剂包括PH＝5.2的3M醋酸钠、100％酒精、75％酒精、125mM EDTA，测序PCR反应及变性试剂包括2.5×Bigdye、5×Buffer、甲酰胺。

用本发明的方法检测非综合征性常染色体隐性遗传性耳聋GJB2基因突变有以下优点：

1.本研究主要创新点和特点是通过上百次实验发现高效扩增GJB2基因全长开放阅读框架(ORF)序列和两侧至少50bp的侧翼序列的引物，该引物PCR稳定、特异，作为测序引物工作时不论正向还是反向均一次性读完GJB2全部ORF和两侧剪切部位序列。

2.ApaI酶切法的操作步骤简单，限制性酶国内供应源丰富，成本低，这些特点为在全国范围内实行GJB2基因233-235delC突变的筛查和遗传咨询提供了便利的条件，从而减少遗传性耳聋患儿出生的机会。

3.用ApaI酶切纯合突变型分子，不能被ApaI切开；用ApaI酶切杂合突变型分子，有1条带被ApaI切开，另1条带不能被切开，酶切后可见3条带；用ApaI酶切野生型分子，可完全被ApaI切开，酶切后可见2条带。只要在此位点的突变，均可利用本方法检测。因此，本发明的方法直接、可靠。

4.利用本发明所涉及引物的酶切法和测序法结合，大大提高了GJB2基因诊断的工作效率，由酶切法提示无235delC杂合突变的个体，仅须通过单向测序即可完成GJB2全序列测定(若全序列测定发现其他位点的杂合框架位移突变，再补行反向测序)；酶切法提示235delC杂合突变个体，则同时行正反向测序，本方法将节约40％的测序量。

附图说明

图1是ApaI酶切法鉴定GJB2基因233-235delC突变的2％琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1、3-5：无233-235delC突变患者；泳道2：233-235delC杂合突变患者；泳道6：233-235delC纯合突变患者；泳道7、8：阴性对照；泳道9：阳性对照；泳道10：分子量标志。

图2-A是AGJB2基因233-235delC纯合突变的PCR产物直接测序。

图2-B是GJB2基因233-235delC杂合突变的PCR产物直接测序。

图2-C是野生型GJB2基因的PCR产物直接测序。

图3-A是GJB2基因299-300delAT杂合突变PCR产物直接测序。

图3-B是GJB2基因299-300delAT杂合突变PCR产物直接测序。

具体实施方式

现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。除非有其它说明，本发明的实施例使用本领域中的传统分子生物学、细胞生物学、PCR扩增和突变技术等等。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。参见，例如，Sambrookand Russell″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″(2001)；Cloning：A Practical Approach，″Volumes I and II(D.N.Glover，ed.，1985)″；T.A Brown“Genome”BIOS Scientific Publishers Limited.

实施例1  非综合征性常染色体隐性遗传耳聋基因GJB2基因突变的ApaI酶切法鉴定

1.检测样本

收集中国各地聋哑学校的998例非综合征性耳聋患儿，经PCR扩增GJB2基因编码区，用酶切方法初步分析已知的233-235位点。同时，取204例听力正常儿童作为对照组。对酶切显示233-235delC杂合突变的患儿进行正、反向测序，并在各地抽取40-50例进行GJB2基因全编码区突变检测，同时抽取100例听力正常儿童进行对照检测。

2.引物设计

使用GenetoolLite程序协助设计改良引物，根据己公开的线粒体基因剑桥序列(Cambridge Sequence)，引物的设计方案为：

使正向引物Fn1的3’末端位于编码区的上游约115bp处，反向引物R3c的3’末端位于编码区的下游约110bp处(参照表1)；

3.PCR扩增反应

根据上述设计的引物序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，通过人工合成(通过给定序列由自动化核酸合成仪合成)得到正向引物Fn1和反向引物R3c，并以上述提取的被测样本周边血DNA为模板，进行PCR扩增反应：

反应体系：

模板                     100ng

引物Fn 1，R3c            各5pmol

10×dNTP                 5μl

10×Buffer               5μl

Mg⁺⁺                    终浓度15mmol/L

Taq酶                2.5u

加三蒸水             至50μl体积

反应条件：

94℃5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，30个循环；72℃延伸5min。

用2％琼脂糖凝胶电泳检查产物。PCR扩增后Fn1、R3c能够获得明亮清晰的944bp的条带。若模板为233-235delC纯合突变型分子，则944bp的PCR产物，不能被ApaI切开；若模板为233-235delC杂合突变型分子，PCR产物有1条带ApaI切开，酶切后可见3条带；若模板为野生型分子，则PCR产物可完全被ApaI切开，酶切后可见2条带。

4.ApaI酶切检测

被测样本的PCR扩增产物按下述条件检测233-235delC突变。

酶切反应体系：

PCR产物                    5μl

10×缓冲液                 1μl

ApaI限制性酶               15u

三蒸水补足体积至10μl，37℃温育2小时。酶切反应物用2％琼脂糖凝胶检查。

5.结果

998例患儿中发现173例(17.33％％)为235delC突变，其中76(7.61％)为235delC纯合突变，97(9.72％)为235delC杂合突变，各地区突变率不同(参见表2)。对照组204例正常儿童中检测只有2例可见235delC杂合突变，余均为正常，携带率为0.98％。76例患儿的Fn1R3c的PCR产物不能被ApaI酶切开(参见图1的泳道6)，表明其为233-235delC纯合性突变。97例患儿及2例听力正常儿童的PCR产物有1条带被ApaI酶切开，另1条带无法切开(参见图1的泳道2)，表明其为233-235delC杂合性突变。其余患者及听力正常儿童的PCR产物可被ApaI酶切开，表明其不存在233-235delC突变。

实施例2.直接测序法检验ApaI酶切法的可靠性

步骤1-4除样品提取足根血DNA之外，其余与实施例1的步骤1-4相同。以下是对直接测序的过程，其中使用前述的试剂盒。

5.PCR产物纯化1

被测样本的PCR扩增产物按下述条件进行第一步纯化：

加入0.5倍体积醋酸钠(PH＝5.2)、2.5倍体积100％酒精，室温放置20分钟，5700转离心20分钟，去上清；

加入75％酒精200ul，5700转离心15分钟，去上清，95℃烘干1分钟；

加入20ul双蒸水溶解；经凝胶电泳测定DNA含量后，将其稀释成5ng/ul。

6.测序PCR反应

纯化并稀释后的PCR扩增产物按下述条件扩增：

反应体系为10ul：

模板                             1ul

引物                             1.5ul

2.5×Bigdye                      0.5ul

5×Buffer                        1.5ul

三蒸水                           5.5ul

反应条件：

96℃1min；94℃10sec，50℃5sec，60℃4min，25个循环。

7.PCR产物纯化2

被测样本的测序PCR扩增产物按下述条件进行第二步纯化：

加入1ul 125mM EDTA、1ul 3M醋酸钠、25ul 100％酒精，室温放置15min，5700转室温离心20min后去上清；

加入75％酒精200ul，反复混匀，离心15min后去上清，重复此步骤；

95℃烘干5min后，加入甲酰胺13ul溶解；置于PCR仪95℃变性5min后迅速放入冰中4min，方可进行测序。

8.直接测序法检测ApaI酶切法可靠性的结果

广东、广西、河南、河北、山西、黑龙江、吉林、内蒙古、安徽、北京等地区聋哑学校的998例散发非综合征性耳聋患儿中，对酶切显示233-235delC杂合突变的患儿进行正、反向测序，并在各地抽取40-50例进行GJB2基因全编码区突变检测，同时抽取100例听力正常儿童进行对照检测。发现GJB2基因233-235delC杂合突变者约一半伴有另一个突变位点，检出率为49.02％，其中299-300delAT占72％；无233-235delC突变者有3例存在另一个突变。其结果证明根据ApaI酶切表明，PCR扩增产物未被切开的7例耳聋患者，其扩增产物的测序图均为233-235delC纯合性突变；PCR扩增产物有1条带被切开，另1条带未被切开的102例耳聋患者，其扩增产物的测序图均为233-235delC杂合性突变；而PCR扩增产物完全被切开的耳聋患者，其扩增产物的测序图均为233-235位点正常图，表明无233-235delC突变，以上结果参见图2-A/B/C。酶切方法与直接测序的吻合率为100％，说明使用本发明方法检测GJB2突变的可靠性、稳定性和高效性。

233-235位点突变在非综合征性常染色体隐性遗传性耳聋患者中的频率(17.33％)及在听力正常儿童中携带率(0.98％)的明显不同、49.02％的233-235delC杂合突变患儿伴有另一个突变位点，最常见的为299-300delAT占72％(参见图3-A/B)，说明本发明方法检测GJB2基因突变在大规模筛查及诊断、遗传咨询中的重要性。

表2  不同地区非综合征性耳聋患儿235delC突变频率

省份	人数	235delC	235delC纯合	235delC杂合
					内蒙古河北北京吉林黑龙江山西河南安徽广东广西	139695058441881543616991	35(25.18％)16(23.19％)11(22％)11(18.97％)8(18.18％)34(18.08％)24(15.58％)6(16.67％)22(13.02％)6(6.59％)	15(10.79％)7(10.15％)5(10％)7(12.07％)3(6.82％)12(6.38％)11(7.14％)2(5.56％)13(7.69％)1(1.10％)	20(14.39％)9(13.04％)6(12％)4(6.90％)5(11.36％)22(11.70％)13(8.44％)4(11.11％)9(5.33％)5(5.49％)
	998	173(17.33％	76(7.61％)	97(9.72％)

                                              序列表

<210>SEQ ID NO：1

<211>20bp

<212>DNA

<212>正向引物Fn1

         5′-TTGGTGTTTGCTCAGGAAGA-3′

<210>SEQ ID NO：2

<211>20bp

<212>DNA

<213>反向引物R3c

            5′-GGCCTACAGGGGTTTCAAAT-3′

<210>SEQ ID NO：3

<211>1081bp

<212>DNA

<213>GJB2基因编码区(下划线)及两侧各200个碱基的非翻译区序列

CATTTAATCCTATGACAAACTAAGTTGGTTCTGTCTTCACCTGTTTTGGTG

AGGTTGTGTAAGAGTTGGTGTTTGCTCAGGAAGAGATTTAAGCATGCTTG

CTTACCCAGACTCAGAGAAGTCTCCCTGTTCTGTCCTAGCTAGTGATTCC

TGTGTTGTGTGCATTCGTCTTTTCCAGAGCAAACCGCCCAGAGTAGAAG A

TGGATTGGGGCACGCTGCAGACGATCCTGGGGGGTGTGAACAAACA

CTCCACCAGCATTGGAAAGATCTGGCTCACCGTCCTCTTCATTTTTCG

CATTATGATCCTCGTTGTGGCTGCAAAGGAGGTGTGGGGAGATGAGC

AGGCCGACTTTGTCTGCAACACCCTGCAGCCAGGCTGCAAGAACGT

GTGCTACGATCACTACTTCCCCATCTCCCACATCCGGCTATGGGCCCT

GCAGCTGATCTTCGTGTCCACGCCAGCGCTCCTAGTGGCCATGCACG

TGGCCTACCGGAGACATGAGAAGAAGAGGAAGTTCATCAAGGGGGA

GATAAAGAGTGAATTTAAGGACATCGAGGAGATCAAAACCCAGAAGG

TCCGCATCGAAGGCTCCCTGTGGTGGACCTACACAAGCAGCATCTTC

TTCCGGGTCATCTTCGAAGCCGCCTTCATGTACGTCTTCTATGTCATG

TACGACGGCTTCTCCATGCAGCGGCTGGTGAAGTGCAACGCCTGGCC

TTGTCCCAACACTGTGGACTGCTTTGTGTCCCGGCCCACGGAGAAGA

CTGTCTTCACAGTGTTCATGATTGCAGTGTCTGGAATTTGCATCCTGC

TGAATGTCACTGAATTGTGTTATTTGCTAATTAGATATTGTTCTGGGA

AGTCAAAAAAGCCAGTTTAACGCATTGCCCAGTTGTTAGATTAAGAAAT

AGACAGCATGAGAGGGATGAGGCAACCCGTGCTCAGCTGTCAAGGCTCA

GTCGCTAGCATTTCCCAACACAAAGATTCTGACCTTAAATGCAACCATTT

GAAACCCCTGTAGGCCTCAGGTGAAACTCCAGATGCCACAATGGAGCTC

TGCTCCCCTAAAGCCTCAAAACA

<210>SEQ ID NO：4

<211>6bp

<212>DNA

<213>Apa I限制性内切酶位点

GGGCC↓C

Claims (9)

1.一种用于体外诊断非综合征性常染色体隐性遗传耳聋基因GJB2全编码区突变的引物，其特征在于：正向引物Fn1的3’末端位于如序列SEQ ID NO：3所示的GJB2基因编码区上游约115bp处，反向引物Fn1的3’末端位于该编码区下游约110bp处，正向引物Fn1和反向引物R3c长度范围在18-22bp，并能完全扩增GJB2基因编码区。

2.根据权利要求1所述的引物，其中正向引物Fn1选自具有如SEQID NO：1所示的引物序列；反向引物Fn1选自具有如SEQ ID NO：2所示的引物序列。

3.权利要求1或2所述的引物在制备用于体外诊断非综合征性常染色体隐性遗传耳聋基因GJB2全编码区突变的试剂盒或类似产品中的应用。

4.一种用于体外诊断非综合征性常染色体隐性遗传耳聋基因GJB2的233-235delC突变的试剂盒或类似产品，包括：

(1)PCR扩增反应试剂，包括dNTP、10×PCR缓冲液、Mg++、三蒸水、Taq酶；

(2)等比例混合的权利要求1或2所述的正向引物Fn1和反向引物R3c；

(3)限制性酶ApaI及其配套的缓冲液；

(4)阳性标本对照、阴性标本对照；如果需要，还包括

(5)使用说明书。

5.根据权利要求4所述的试剂盒或类似产品，其中还包括用于提取血样DNA的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒或类似产品，其中所述的提取血样DNA的试剂为提取足根DNA的溶液I，其主要成分为Chelex的DNA裂解液的溶液I。

7根据权利要求5所述的试剂盒或类似产品，其中所述的提取血样DNA的试剂为提取外周血DNA的提取试剂。

8.权利要求4-7中任何一项所述的试剂盒或类似产品，其中还包括用于对GJB2基因编码区进行测序的PCR纯化试剂、测序PCR反应及变性试剂。

9.权利要求8所述的试剂盒或类似产品，其中PCR纯化试剂包括PH＝5.2的3M醋酸钠、100％酒精、75％酒精、125mM EDTA，测序PCR反应及变性试剂包括2.5×Bigdye、5×Buffer、甲酰胺。

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