CN101684486B - 线粒体琥珀酸脱氢酶基因突变检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测样品中是否存在线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)基因变异的试剂，以及包含所述试剂的试剂盒，所述的试剂或试剂盒可用于进行嗜铬细胞瘤的易感性分析。本发明还公开了优化的获得SDH基因扩增产物的方法，以及确定待测核酸样品中是否存在SDH基因变异的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)基因突变检测方法及试剂盒。
背景技术
头颈部家族性副神经节瘤是头颈部非嗜铬组织的良性肿瘤，最常见的部位是颈动脉体。作为化学感受器，颈动脉体可感知循环中的低氧刺激，进而产生一系列的全身性反应，而慢性缺氧可导致颈动脉体细胞增生。哺乳动物细胞在缺氧时的适应性反应依赖于线粒体的功能，通过增加活性氧簇(ROS)的产生进而在低氧诱导因子-1(HIF-1)的作用下，激活促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子(VEGF)和糖酵解酶的转录，最终增加氧的输送，促进酵解ATP的产生。因此，线粒体的功能与头颈部家族性副神经节瘤的发生有关。该瘤易感基因位于11q23，而线粒体SDH的亚单位SDHD基因就位于此。已经有研究证实，SDH的缺陷是颈动脉体肿瘤，也称为化学感受器瘤的原因，而SDHD基因就是其易感基因。
嗜铬细胞瘤和颈动脉体瘤可同时出现在一个家系或一个个体中，表明二者在发病机制中可能有一定联系。许多研究已发现在家族性和散发性嗜铬细胞瘤中存在SDHD、SDHB基因突变。据报道，与头颈部副神经节瘤和嗜铬细胞瘤有关的SDHD和SDHB基因突变的分布中，SDHD基因靠近5’端部分的胚系突变多表现为单发或家族性嗜铬细胞瘤或至少有嗜铬细胞瘤的多发副神经节瘤，而在3’端部分的突变则出现头颈部副神经节瘤。嗜铬细胞瘤SDHB基因突变位于外显子2～7，而头颈部副神经节瘤SDHB基因突变则在靠近5’端的外显子2和3上。对一例携带SDHB基因胚系突变R46Q的散发性恶性嗜铬细胞瘤患者的发现，线粒体SDH的电子传递链活性完全丧失，EPAS1、VEGF、VEGFR21、VEGFR22表达增高。表明嗜铬细胞瘤SDHB基因突变与头颈部家族性副神经节瘤SDHD基因突变的后果类似，可使肿瘤组织低氧反应基因表达增加而促进血管形成。可见，SDHD锚定区和SDHB酶接触中心对维持线粒体SDH的活性都是必需的。异位、复发及恶性嗜铬细胞瘤与SDHB突变明显相关，在有SDHB基因突变的肿瘤中，其血管结构显示典型的恶性特征，因此，SDHB基因的突变应视为恶性和复发的高危因素。现有一些研究报道见Internal Medicine of China，Apr.2007，Vol2，No.2，254-256；国际泌尿系统杂志，2006年1月第26卷第1期，68-72；上海交通大学学报(医学版)，Vol26No.1，Jan 2006，30-33。
目前，对于基因变异的检测较为常用的技术仍然是PCR技术，然而，对于SDHB和SDHD的扩增而言，由于通常以待测个体的血样基因组DNA为模板，复杂度较高，很难得到理想的目的基因片段。因此，对于SDHB和SDHD基因突变的检测还有待于进一步优化。
发明内容
本发明的目的在于提供一类对于线粒体琥珀酸脱氢酶基因(特别是B亚单位和D亚单位)突变检测特别有用的引物，以及一种优化的线粒体琥珀酸脱氢酶基因突变检测方法。
在本发明的第一方面，提供一种检测样品中是否存在线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)基因变异的试剂，其特征在于，所述的试剂是引物对，选自下组：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2(特异性扩增SDHB基因外显子1)；
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4(特异性扩增SDHB基因外显子2)；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6(特异性扩增SDHB基因外显子3)；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8(特异性扩增SDHB基因外显子4)；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10(特异性扩增SDHB基因外显子5)；
SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12(特异性扩增SDHB基因外显子6)；
SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14(特异性扩增SDHB基因外显子7)；
SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16(特异性扩增SDHB基因外显子8)；
SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18(特异性扩增SDHD基因外显子1)；
SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20(特异性扩增SDHD基因外显子2)；
SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22(特异性扩增SDHD基因外显子3)；和/或
SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24(特异性扩增SDHD基因外显子4)。
在另一优选例中，所述的线粒体琥珀酸脱氢酶基因包括：
线粒体琥珀酸脱氢酶B亚单位(SDHB基因)，线粒体琥珀酸脱氢酶D亚单位(SDHD基因)。
在本发明的第二方面，提供一种检测样品中是否存在线粒体琥珀酸脱氢酶基因变异的试剂盒，所述的试剂盒中含有选自前述的一种或多种引物对。
在另一优选例中，所述的试剂盒中含有SEQ ID NO：1-24的引物。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：
PCR扩增试剂(包括但不限于：dNTP，DNA聚合酶)；
核酸提取试剂；和/或
使用说明书和/或核酸序列分析软件。
在本发明的第三方面，提供一种获得线粒体琥珀酸脱氢酶基因(片段)扩增产物的方法，所述的方法包括：以核酸样品为模板，利用选自前述的引物对进行PCR扩增，获得扩增产物。
在另一优选例中，在进行PCR扩增时，PCR热循环步骤如下：
(a)94±1℃进行30±5秒；
(b)59±4℃退火45±5秒；
(c)72±1℃进行45±5秒；
重复步骤(a)-(c)30±5次。
在另一优选例中，在进行PCR扩增时，
若以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物，退火温度是58±1℃；
若以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为引物，退火温度是56±1℃；
若以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6为引物，退火温度是62±1℃
若以SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8为引物，退火温度是58±1℃；
若以SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12为引物，退火温度是58±1℃；
若以SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16为引物，退火温度是58±1℃；
若以SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18为引物，退火温度是58±1℃；
若以SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20为引物，退火温度是56±1℃；
若以SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22为引物，退火温度是58±1℃；或
若以SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24为引物，退火温度是60±1℃。
在另一优选例中，在进行PCR热循环前，还包括模板变性步骤：95±1℃进行3±2(较佳的是3±1)分钟；和
在进行PCR热循环后，还包括延伸步骤：72±1℃进行10±2(较佳的是10±1)分钟。
在另一优选例中，在PCR扩增体系中，还加入二甲基亚砜(DMSO)，其在PCR扩增体系中的终浓度按照体积为3-10％；较佳的是3-8％；更佳的是4-6％，如5％。
在本发明的第四方面，提供一种确定待测核酸样品中是否存在线粒体琥珀酸脱氢酶基因变异的方法，所述的方法包括：
(1)采用所述的方法从待测核酸样品中扩增线粒体琥珀酸脱氢酶基因片段；
(2)分析(1)扩增产物中线粒体琥珀酸脱氢酶基因片段的序列，并与野生型线粒体琥珀酸脱氢酶基因中对应的序列进行比较；如果存在不同，则表明测核酸样品中存在线粒体琥珀酸脱氢酶基因变异。
在另一优选例中，所述的野生型线粒体琥珀酸脱氢酶基因SDHB的序列参见GenBank登录号NT_004610.18，所述的野生型线粒体琥珀酸脱氢酶基因SDHD参见GenBank登录号NT_033899.7。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了采用本发明优化的引物进行PCR扩增获得的扩增产物的电泳结果。其中，泳道1-9分别表示DNA Marker，以及利用表1中SDHB-1、SDHB-2、SDHB-3、SDHB-4、SDHB-5、SDHB-6、SDHB-7、SDHB-8相应引物进行PCR扩增获得的扩增产物的电泳结果。
图2显示了采用本发明优化的引物进行PCR扩增获得的扩增产物的电泳结果。其中，泳道1-5分别表示DNA Marker、以及利用表1中SDHD-1、SDHD-2、SDHD-3、SDHD-4相应引物进行PCR扩增获得的扩增产物的电泳结果。
图3显示了采用其它引物进行PCR扩增获得的扩增产物的电泳结果。其中，泳道1-13分别表示DNA Marker，以及利用表2中SDHB-1-a、SDHB-2-a、SDHB-3-a、SDHB-4-a、SDHB-5-a、SDHB-6-a、SDHB-7-a、SDHB-8-a、SDHD-1-a、SDHD-2-a、SDHD-3-a、SDHD-4-a相应引物进行PCR扩增获得的扩增产物的电泳结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，找到了一类特别适合于扩增线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)基因(包括SDHB基因或SDHD基因)的引物，所述引物经过合理的设计、优选而获得，用于PCR扩增时特异性良好，且扩增效率高。本发明人还优化了PCR扩增反应，进一步提高了扩增效率。
SDH基因
线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)是三羧酸循环和有氧电子传递呼吸链中的关键酶之一，包含A、B、C、D4个亚单位。亚单位A(SDHA，黄素蛋白)和B(SDHB，铁硫蛋白)形成酶接触中心，而亚单位C(SDHC)和D(SDHD)组成线粒体膜内复合酶II锚定区，4个亚单位分别由4个基因编码。SDHA基因定位于5p15，基因组DNA包含38kb，编码黄素蛋白。SDHB基因定位于1p36.1-p35，基因组DNA包含近40kb，8个外显子，编码铁硫蛋白亚单位，有252个氨基酸。SDHC基因定位于1q21，基因组DNA包含近50kb，6个外显子，编码琥珀酸2辅酶Q氧化还原酶中细胞色素b大亚单位(cybL)，有140个氨基酸。SDHD基因定位于11q23，基因组DNA包含19kb，4个外显子和3个内含子，4个外显子碱基对分别为52bp、117bp、145bp、163bp，编码琥珀酸-辅酶Q氧化还原酶中细胞色素b小亚单位(cybS)，有103个氨基酸。
SDH的各亚单位中，SDHB基因和SDHD基因的变异与嗜铬细胞瘤和颈动脉体瘤的发生和发展密切相关。并且，也已发现，SDHB基因或SDHD基因在患病人群中变异率很高；而在正常人群中变异率很低。因此，本发明中，除非另外说明，所述的SDH基因是指SDHB基因(或基因片段)或SDHD基因(或基因片段)。
SDH基因变异的检测试剂或试剂盒
基于SDHB基因和SDHD基因与嗜铬细胞瘤和颈动脉体瘤的密切相关性，可以通过分析SDHB基因或SDHD基因的变异情况：(i)进行嗜铬细胞瘤和颈动脉体瘤的鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)早期评估相关人群嗜铬细胞瘤和颈动脉体瘤的患病风险，早期监测早期防治。
可采用各种技术来检测SDHB基因或SDHD基因变异位点，较为方便的是用SDHB基因或SDHD基因特异的引物进行聚合酶链反应(PCR)，对SDHB基因或SDHD基因进行扩增，对扩增产物进行序列测定，从而判断是否发生变异。该技术也可检测SDHB基因或SDHD基因的转录产物。
在检测SDHB基因或SDHD基因变异时，检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。
本发明人在研究中发现，检测SDHB基因或SDHD基因突变时，利用一般的引物，PCR扩增时的特异性差，扩增效率低下。因此，需要设计和筛选特异性好的引物。经过大量的试验和比较，本发明人找到了分别对应于SDHB基因的8个外显子和SDHD基因的4个外显子的引物，经验证所述引物获得的扩增产物既包含了SDHB基因或SDHD基因各外显子上尽可能完整的序列，且特异性非常好，PCR扩增成功率接近100％，特别适用于复杂体系的PCR扩增。各引物的核苷酸序列及其较佳的退火温度如表1所示。
表 1引物核苷酸序列
本发明还提供了用于在分析物中检测含有SDHB基因或SDHD基因变异的试剂盒，该试剂盒包括装在适当容器中的、用于特异性扩增SDHB基因或SDHD基因的引物，并且用所述引物扩增出的扩增产物含有SDHB基因或SDHD基因相关外显子上疾病相关的变异部位。所述的试剂盒中含有选自表1的至少一对引物，用于获得相关的SDHB基因或SDHD基因外显子上包含变异位点的序列。最佳的，所述的试剂盒中含有表1中所有的引物对，这样更有利于完整地分析SDHB基因和SDHD基因各外显子序列的变异情况。
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR扩增等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、洗液等。这些试剂均是本领域人员所了解的。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等，便于本领域人员使用和分析。
获得SDH基因扩增产物的方法
本发明人还提供了一种优化的从核酸样品中获得SDH基因扩增产物的方法，所述的方法包括：以核酸样品为模板，利用选自表1的引物对进行PCR扩增，获得扩增产物。
利用所述的引物，采用常规的PCR扩增方法即可获得较为理想的扩增结果。一种可选的PCR扩增方法中，PCR热循环步骤如下：(a)94±1℃进行30±5秒；(b)59±4℃退火45±5秒；(c)72±1℃进行45±5秒；重复步骤(a)-(c)30±5次。
进行PCR热循环前的模板变性步骤可根据本领域常规的方法。较佳的方法如下：95±1℃进行3±2；更佳的是95±0.5℃进行3±1分钟。
进行PCR热循环后后的序列延伸步骤可根据本领域常规的方法。较佳的方法如下：72±1℃进行10±2分钟；较佳的是72℃进行10±1分钟。
除了采用本发明的引物，本发明对PCR扩增体系中其它各成分及其终浓度没有特别的限制，本领域人员可根据常规建立PCR体系时采用的一般成分及其浓度来建立PCR扩增体系。用于PCR扩增的模板(如基因组DNA)也可采用本领域的常规方法提取获得。
作为本发明的优选方式，在PCR扩增体系中，还加入二甲基亚砜(DMSO)，其在PCR扩增体系中的终浓度按照体积为3-10％；较佳的是3-8％；更佳的是4-6％。DMSO的应用可一定程度地降低反应体系中引物二聚体的形成或错配的形成。
采用本发明的获得SDHB基因或SDHD基因扩增产物的方法，扩增效率和特异性均非常理想，且特别适合于复杂体系的PCR扩增，例如以血样基因组DNA作为PCR模板的扩增。
本发明还提供了一种确定待测核酸样品中是否存在SDH基因变异的方法，所述的方法包括：采用前述的方法从待测核酸样品中扩增SDH基因片段，获得扩增产物；以及分析扩增产物中SDH基因片段的序列，并与野生型SDH基因中对应的序列进行比较；如果存在不同，则表明测核酸样品中存在SDH基因变异。
通过判断SDH基因变异的情况，可进一步得知受试者嗜铬细胞瘤或颈动脉体瘤的患病风险，从而达到早期监测早期防治的目的。
本发明的主要优点在于：
(1)首次针对SDHB基因和SDHD基因的多个外显子设计了合适的引物，所述引物在用于PCR扩增时特异性良好，扩增效率高。
(2)优化了获得SDH基因扩增产物的方法，所述方法精确、快速、稳定，成功率高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
利用优化的引物测定散发性嗜铬细胞瘤患者基因突变情况
1、获取待测者血样基因组DNA
采集散发性嗜铬细胞瘤患者的外周抗凝血5ml，使用U-gene Blood DNAKit进行血液基因组DNA的抽提，具体步骤：
(1)在1.5ml离心管中加入250μl全血样品。
(2)加入250μl的XY缓冲液(U-gene)，振荡混合均匀。
(3)再加入20μl的蛋白酶K(10mg/ml)，剧烈振荡混合均匀。
(4)56℃温浴过夜。
(5)加入260μl的无水乙醇，振荡混合，12000rpm离心1分钟，使溶液中的固体沉淀物甩至管底。
(6)将DNA分离柱置于一个2ml的收集管中，将上步得到溶液倒入柱子中，8000rpm离心1min，弃去该收集试管和流出液。
(7)分离柱放于另一新的收集管，加入700μl的乙醇稀释的DNA洗涤缓冲液(U-gene)洗涤，8000rmp离心1min，保留该收集管，弃去流出液。
(8)重复(7)一次。
(9)使用同上的收集管，用12000rmp离心2min以甩干柱子。
(10)将分离柱置于新的1.5ml离心管中，在空气中放置5min左右以待乙醇气味消退，同时预热DNA洗脱液(U-gene)以备用。
(11)将200μl的DNA洗脱液加入柱子中，并在室温中放置3min，12000rpm离心3min。
(12)重复(11)一次。
(13)弃去分离柱，获取DNA洗脱液，其中含待测者的基因组DNA，作为PCR模板。
2、PCR实验准备
缓冲液必须全部融化，振荡均匀；dNTP融化后需放入冰块中；Taq酶(申能博采Taq DNA聚合酶)需要放入冰块中，避免手指接触和长时间暴露于空气中；模板(待测者的基因组DNA)完全融化后，放入冰块中。
3、PCR反应体系
4、PCR操作过程
(1)制备预混液：一般先加入ddH2O，然后加入引物、缓冲液、DMSO(加入DMSO后振荡混匀)，加入dNTP，最后加入Taq酶，立即振荡混和均匀；
(2)把模板加入到PCR薄壁管的底部，最后一管加入ddH2O作为阴性对照；
(3)将PCR预混液分装到每一个PCR反应管中；
(4)全部溶液加完后，离心以保证管壁上没有残留PCR反应液。
PCR反应的一般程序：
95℃ 3min，变性；
94℃ 30sec，表1相应退火温度下45sec，72℃ 45sec，进行30循环。
72℃ 10min，延伸；
22℃保存。
利用上述的方法、表1引物及其优化的温度进行PCR扩增，然后分析扩增产物中相关的序列，确定102例散发性嗜铬细胞瘤患者的血样中SDHB和SDHD的基因突变情况。
102例散发性嗜铬细胞瘤患者中，肾上腺嗜铬细胞瘤91人(89％)，副神经节细胞瘤10人(10％)，肾上腺嗜铬细胞瘤合并副神经节细胞瘤1人(1％)。其中恶性16人(16％)，平均年龄(43.85±13.92)岁。每份标本使用SDHB基因8个外显子和SDHD基因4个外显子的不同引物，分别进行测序分析，并测定其碱基序列。
本组标本的PCR测序结果共发现4个突变，分别是：
(1)在SDHB基因2号外显子，第287位由C→T，导致相应的密码子由CGA→TGA，使编码精氨酸Arg的CGA变为终止密码子TGA，R46X；
(2)在SDHB基因3号外显子，第419位由C→T，导致相应的密码子由CGA→TGA，使编码精氨酸Arg的CGA变为终止密码子TGA，R90X；
(3)在SDHB基因7号外显子，第876位由G→A，导致相应的密码子由CGC→CAC，导致氨基酸由精氨酸变成组氨酸，R242H；
(4)在SDHD基因3号外显子，第228位由A→G，导致相应的密码子由AGT→GGT，导致氨基酸由丝氨酸变成甘氨酸，S73G。
注：上述基因和蛋白的位点编号基于整个SDH基因及其编码的整条肽链，所涉及基因和蛋白的Genbank号分别为：
SDHB：NM_003000.2和NP_002991.2；
SDHD：NM_003002.1和NP_002993.1。
采用表1的各引物进行PCR扩增SDHB或SDHD，扩增的成功率接近100％，几乎没有非特异性扩增或扩增产物特别少的情况。
实施例2 PCR扩增条件的优化
以1例散发性嗜铬细胞瘤患者的血样基因组DNA为模板，分别采用表1中所示的引物扩增SDHB和SDHD外显子，PCR扩增方法和条件与实施例1相同，获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1-2。可见，各PCR反应产物呈单一的目的基因片段的条带，且条带亮度强、明显且清晰，无杂带。
同样以前述1例散发性嗜铬细胞瘤患者的血样基因组DNA为模板，采用以下表2所列的引物(所述引物是根据SDHB和SDHD序列设计但不同于表1中的引物)进行PCR扩增，扩增方法和条件与实施例1相同。
表2 引物核苷酸序列
同样，对采用表2引物PCR扩增后获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图3。由结果可见，其中一些引物扩增得到了非特异性的产物(即产生多于一条的电泳条带)；一些目的基因片段的条带显示很不明显，可能是获得的扩增产物少，扩增效率低下。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海交通大学医学院附属瑞金医院
<120>线粒体琥珀酸脱氢酶基因突变检测方法和试剂盒
<130>082593
<160>48
<170>PatentIn version 3.3
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<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>44
<210>45
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>45
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
<400>47
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>48
Claims (11)
1.一种检测样品中是否存在线粒体琥珀酸脱氢酶B亚单位基因变异的试剂，其特征在于，所述的试剂是引物对，选自下组：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；
SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；和/或
SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。
2.一种检测样品中是否存在线粒体琥珀酸脱氢酶D亚单位基因变异的试剂，其特征在于，所述的试剂是引物对，选自下组：
SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；
SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；
SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22；和/或
SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24。
3.一种检测样品中是否存在线粒体琥珀酸脱氢酶B亚单位基因变异的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有下列引物对：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；
SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；和
SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。
4.一种检测样品中是否存在线粒体琥珀酸脱氢酶D亚单位基因变异的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有下列引物对：
SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；
SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；
SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22；和
SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有：
PCR扩增试剂；
核酸提取试剂；
核酸序列分析软件；和/或
使用说明书。
6.一种获得线粒体琥珀酸脱氢酶B亚单位基因扩增产物的方法，其特征在于，所述的方法包括：
以血样基因组DNA为模板，利用选自权利要求1的引物对进行PCR扩增，获得扩增产物。
7.一种获得线粒体琥珀酸脱氢酶D亚单位基因扩增产物的方法，其特征在于，所述的方法包括：
以血样基因组DNA为模板，利用选自权利要求2的引物对进行PCR扩增，获得扩增产物。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，在进行PCR扩增时，PCR热循环步骤如下：
(a)94±1℃进行30±5秒；
(b)59±4℃退火45±5秒；
(c)72±1℃进行45±5秒；
重复步骤(a)-(c)30±5次。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在进行PCR扩增时，
若以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物，退火温度是58±1℃；
若以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为引物，退火温度是56±1℃；
若以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6为引物，退火温度是62±1℃；
若以SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8为引物，退火温度是58±1℃；
若以SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12为引物，退火温度是58±1℃；
若以SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16为引物，退火温度是58±1℃；
若以SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18为引物，退火温度是58±1℃；
若以SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20为引物，退火温度是56±1℃；
若以SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22为引物，退火温度是58±1℃；或
若以SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24为引物，退火温度是60±1℃。
10.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，
在进行PCR热循环前，还包括模板变性步骤：95±1℃进行3±2分钟；或
在进行PCR热循环后，还包括延伸步骤：72±1℃进行10±2分钟。
11.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，在PCR扩增体系中，还加入二甲基亚砜，其在PCR扩增体系中的终浓度为3-10％(体积)。
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| 郑欣.SDH基因与嗜铬细胞瘤.《国外医学内分泌学分册》.2005,第25卷(第1期),58-60. * |
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