CN1372005A - 中国石斛属植物及其药材的dna分子鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中国石斛属植物及其药材DNA分子鉴别的方法。在建立了中国石斛属植物rDNA ITS区全序列数据库的基础上,对待检植物或药材样品进行了总DNA提取、PCR扩增、PCR产物纯化、DNA序列测定、分析等过程。当待检植物或药材与数据库中某石斛属植物的DNA序列相符时为该种石斛。根据中国石斛属植物rDNA ITS区的数据库,设计出鉴别铁皮石斛的高特异性鉴别引物,能成功进行铁皮石斛原植物及药材的高特异性PCR鉴别。

Description

中国石斛属植物及其药材的DNA分子鉴别方法
本发明涉及一类石斛药材的DNA分子鉴别方法，属生药学领域。石斛为珍贵中药材，应用历史悠久，在《神农本草经》中列为上品，具有滋阴清热、生津养胃、润肺止咳等功效。现代药理研究表明，石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力及扩张血管的作用，因此石斛在临床上及中药复方中被广泛应用。《中国药典》收载石斛为：铁皮石斛(Dendrobium candidum)、金钗石斛(Dendrobium nobile.)、束花石斛(Dendrobium chrysanthum)、粉花石斛(Dendrobium loddigesii)、流苏石斛(Dendrobium fimbriatum)等兰科石斛属植物的新鲜或干燥茎。另有一些种被有关省、自治区的地方标准所收载。然而，商品市场上石斛规格繁多，基源十分复杂，几乎中国石斛属所有植物均当作石斛药用。
由于大多数石斛属植物在未开花时或在加工成药材(干燥茎)时，依据其外部形态特征较难鉴别其种类，因而《神农本草经》将其称之为“医工难辨”的种类。有的种利用显微结构或理化方法亦难以鉴定其基源。随着分子生物学的迅猛发展，随机引物扩增DNA多态性(RAPD)、AP-PCR、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)等分子标记方法不断被用于中药材的鉴别。其中RAPD、AP-PCR、RFLP等方法对模板DNA的要求较高，往往导致不稳定的实验结果，从而影响了鉴定的准确性。
本发明的目的是提供一种鉴别中国石斛属植物及其药材的DNA分子鉴别方法，用特定的DNA序列对中国石斛属植物及药材进行种间鉴别，使中国石斛属植物及其药材的鉴别更可靠、正确。
本发明首先对中国石斛属植物的rDNA ITS区序列进行测序，建立了中国石斛属植物rDNA ITS区(包括ITS1，5.8S，ITS2)的全序列数据库(见附表)，再在此基础上对石斛类药材作高特异性PCR鉴定以及基因芯片鉴定。
本发明中利用rDNA ITS区DNA序列鉴别中国石斛属植物所采用的步骤如下：(1)总DNA提取
取待检植物新鲜的茎、叶片或药材，用无菌水处理后，在液氮中研成粉末，用QIAGEN试剂盒、CTAB等方法提取总DNA。(2)PCR扩增
设计一对石斛属rDNA ITS区的扩增引物P1、P2，序列如下：P1为5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3’，位于18S上；P2为5’-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’，位于26S上，在30μL的体系中完成PCR扩增反应，以ddH2O代替模板DNA作空白对照。(3)PCR产物纯化
PCR产物用Wizard或Watson剂盒纯化，按试剂盒操作指南进行。(4)DNA序列测定
用BigDyeTM测序试剂盒进行测序反应，测序反应的参数为：Mix 1μl，纯化后的DNA片段15-45ng，Primer 1.6pmol，buffer 1.2μl，ddH2O适量，用ABI 310全自动测序仪进行序列测定。(5)DNA序列数据分析所得rDNA ITS区序列输入计算机后，用对位排列软件(如Clustal)进行对位排列，并辅以人工校对。用MEGA或PAUP等遗传分析软件分析待检样品的DNA序列，并判断所属中国石斛属的种。
本发明还利用高特异性PCR鉴别引物鉴定铁皮石斛原植物及其药材的基源，首先参照所测中国石斛属植物的rDNA ITS序列数据库，设计一对铁皮石斛的高特异性鉴别引物，上游鉴别引物TP-JB01S：5’-GTGCTGCTGAGATAAAATCCACTG-3’的设计参考了铁皮石斛rDNA ITS区的ITS1部分，铁皮石斛在该位点的碱基为G，均不同于石斛属其它植物的碱基。下游鉴别引物TP-JB01X：5’-CCACCATGCACATCCGAG CCTTAGT-3’的设计参照了铁皮石斛rDNA ITS区的ITS2序列，铁皮石斛的ITS2区域与引物TP-JB01X在3’端结合位点的第一个碱基为A，均不同于中国石斛属其它植物的碱基。上、下游引物完全与铁皮石斛的rDNA ITS区的碱基序列互补。
在进行高特异性PCR鉴别之前，首先运用引物P1、P2(序列同上文)对铁皮石斛及其相似种进行扩增，检测是否所有样品都能扩增出约430bp左右的片段以及扩增片段的亮度，以验证模板DNA的质量、调整模板DNA的浓度。然后，运用鉴别引物TP-JB01S，TP-JB01X对模板DNA进行扩增。当退火温度控制在66℃时，只有铁皮石斛能被扩增出来，而其它的石斛均为阴性，用琼脂糖电泳可以检测扩增反应的结果。
根据类似方法可以设计出其它中国石斛属植物及药材的鉴别引物。
中国石斛属植物的rDNA ITS区序列为中国药科大学生药学研究室首次完成测序工作，本发明对中国石斛属36种植物rDNA ITS区的序列进行分析后表明，石斛属植物的rDNA ITS区的居群差异一般在2-6个碱基之间(数据库中仅列出各种石斛的一个居群样本的rDNA ITS区序列)。本发明利用特定的重复多拷贝rDNA ITS区序列，通过CLUSTAL、MEGA等系列分析软件就可以对待检石斛属植物进行分析比较，最终鉴别出石斛的具体种。由于rDNA ITS序列能较好地反映植物的种间差别，因此，利用本方法鉴别中国石斛属植物及药材且具有高度的准确性。随着DNA测序成本的降低，此方法将会更加经济实用。
由于绝大多数药检部门尚不具备DNA测序条件，依靠DNA序列分析鉴别石斛种类的实用性因此受到很大限制。本发明还根据中国石斛属植物的rDNA ITS序列，设计出鉴别石斛属植物的引物，从而进行高特异性PCR鉴别，以适应各药检部门的检测需要。
近年来，基因芯片技术得到了迅猛发展，基因芯片鉴定的关键是选择合适的DNA目的片段以及由此设计而成的高特异性鉴别引物。在本发明中，中国石斛属rDNA ITS序列以及根据它们所设计的高特异性引物均可应用于基因芯片鉴别。
下面提供本发明的实施例。
实施例一  利用中国石斛属植物rDNA ITS区的碱基序列鉴定石斛植物及药材的基源
本实施例取外形似石斛的3种待检原植物叶或茎0.1g，分别编号为待检种1、待检种2，待检种3，均通过以下步骤进行鉴别：(1)总DNA提取
用无菌水冲洗干净，在液氮中研成粉末。根据QIAGEN试剂盒的使用指南进行总DNA提取或采用CTAB法以及其它方法提取总DNA。(2)PCR扩增
石斛属ITS区的扩增引物为P1、P2，序列如下：P1为5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3’，位于18S上；P2为5’-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’，位于26S上。PCR扩增反应在30μL的体系中完成，反应液含10mmol.L-1 Tris-HCl，PH8.3，50mmol.L-1 KCl，1.5mmol.L-1 MgCl2，0.1％Triton X-100，Taq酶1U，4种dNTP各150mmol.L-1，两个引物各10mmol.L-1，DNA模板约100ng。反应循环参数为95℃预变性4min，95℃ 1min，52℃ 45s，72℃ 2min，共30个循环后，72℃延伸7min补齐。以ddH2O代替模板DNA作空白对照。(3)PCR产物纯化
PCR产物用Wizard或Watson试剂盒纯化，按试剂盒操作指南进行。(4)DNA序列测定
用BigDyeTM测序试剂盒进行测序反应，测序反应的参数为：Mix 1μl，纯化后的DNA片段15-45ng，Primer 1.6pmol，buffer 1.2μl，ddH2O适量。测序反应条件为：95℃预变性5min，95℃30s，50℃20s，60℃4min，共35个循环。扩增产物纯化后用10μlTSR溶解，热循环仪上变性2分钟，移入全自动测序专用管，用ABI 310全自动测序仪进行序列测定。(5)DNA序列数据分析
ITS1和ITS2的起止范围参照Genbank中兰科ITS范围，所得DNA序列输入计算机后，用Clustal软件对位排列，并辅以人工校对。用MEGA软件分析各样品DNA序列间的差异。
经上述步骤(4)对三个待检种的rDNA ITS区序列测定结果如下；待检种1〔来自云南〕：TCGAGACCGAATTATATCGAGTGATTTATATAACCTGTAAAAATTTGCGTTGGCTATTGCTGCCGAAATAAAATCTATCCCAATCATCATCTGAACCCCCCTCCTTGGGGCGGAGATGCGATGAAGGATGGATGAACCCCAAACCGGCGCAGCATTGCGCCAAGTGAATAACGAAACAATATCCCTAAAATGGGTTTTGTAGCATGGCAATGCTATTGCATGCCATATGGATTGACATGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTTAGATGCTCCGTGCCTTGTCATCAATTTATGGAAGTGTTGGTGAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCGTCGTGCTCCTCGGCACGGCGGGCTGAAGAGCGGGGCATCATCTCGTTGGCTGCGTACAATAAGTGGTGGATAAAGGATAAGGCCTATTGTATTGTGCGTGCTAGCCCGAGAGATGATCATATTATTTTGGTGATCCCAAATCATGCGTCCATCCTTAGATGACGTTTTGAAT待检种2〔来自云南〕：TCGAGACTGAAATACATCGAGCGATCTTGAGAACCCGTCAAAATAAGTGGTGGCTATAGCTGCCGAGATAATATTCATTTGAATCATCGTCTCATCCCCTCATTGGGGTTGGGACGTGATGAAGGATGGATAGAACCCCAAATCGGCGCAGCGTTGCGCCAAGGAAACATTGAAACATGAGCCCTAAAATGGGTTTAGTAGAATGGGGTGTTGTTACATGCCATAAGAATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAACAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAATCGGCCAAGGGCACGTCCGCCTGGGTGTCATACATTTTATCGCTCCATGCCTAGCCACACATCGATGGATGTATTGGCAAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGCACGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAACAATACGTGGTGGATTAAAGCAAGGCCGATGCTATTGTGTCGTGCATGCCTAAGAGATGATCATACCTTTGAGGTGATCCCAAATCATGCGTTGATCCATGGATGGCGCTTTGAAT待检种3〔来自广西环江〕：TCGAGACCGAACACCAACGAGCAATTTTGTGAACCCGTTAAAAAAAGCGGCGGCTCTTGCTGCTGAGATAAAATCCACTGGAGTCATCGCCTCATCCCCTCTATGGGGTGTGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTAAAATCGGCGCAGCGTAGCGCCAAGGGAAACTTGAAACACAAGCCCATAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGTTGTCGCACGCCATATCGATTGACATGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCAAGGCCAACCGGCTAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCTCTCCGTGCCTAATCTCCCATCCATGGATGTGTTACTAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCCTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCATCTTCTCGTTGGTTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAAAAAGGCCTATGCTATTGTGATAAGCGCGCCCGAGAGATGATCATACTTTTTAGGTGATCCCAATCATGCGCTAATCCATGGATGGCGTATCGAAT
经上述步骤(5)的DNA数据分析，三样品的各项检测结果如下：待检种1
1.与数据库中齿瓣石斛(Dendrobium devonianum)的碱基差异为0
2.与数据库中齿瓣石斛(Dendrobium devonianum)的转换及颠换总数为：0
3.与数据库中齿瓣石斛(Dendrobium devonianum)的相对遗传距离为0％
4.在NJ树上，待检种1与数据库中的齿瓣石斛(Dendrobium devonianum)聚类在一起，置信度为100％。
鉴别结论为：待检种1为齿瓣石斛(Dendrobium devonianum)。待鉴种2
1.与数据库中兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)的碱基差异为0
2.与数据库中兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)的转换及颠换总数为：0
3.与数据库中兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)的相对遗传距离为0％
4.在NJ树上，待检种2与数据库中的兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)聚类在一起，置信度为100％。
鉴别结论为：待检种2为兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)。待检种3
1.与数据库中铁皮石斛(Dendrobium officinale)的碱基差异为2
2.与数据库中铁皮石斛(Dendrobium officinale)的转换及颠换总数为：2
3.与数据库中铁皮石斛(Dendrobium officinale)的相对遗传距离为0.3％
4.在NJ树上，待检种3与数据库中的铁皮石斛(Dendrobium officinale)聚类在一起，置信度为100％。
鉴别结论为：待检种3为铁皮石斛(Dendrobium officinale)。
当然，步骤(5)除了用软件进行比较外，通过烦琐的人工也可比较，并得出同样的结纶。
实施例二  利用高特异性PCR鉴别引物鉴定铁皮石斛原植物及药材的基源(1)待检植物总DNA提取
将待检品用无菌水冲洗干净，在液氮中研成粉末。根据QIAGEN试剂盒的使用指南进行总DNA提取或采用CTAB法以及其它方法提取总DNA。(2)模板DNA的质量检测
运用引物P1、P2(P1、P2序列同实施例一)对待检品总DNA进行扩增，检测是否所有样品都能扩增出约430bp左右的片段以及扩增片段的亮度，以验证模板DNA的质量、调整模板DNA的浓度。
PCR扩增反应在30μL的体系中完成，反应液含10mmol.L-1 Tris-HCl，PH8.3，50mmol.L-1 KCl，1.5mmol.L-1 MgCl2，0.1％Triton X-100，Taq酶1U，4种dNTP各150mmol.L-1，两个引物各10mmol.L-1，DNA模板约100ng。反应循环参数为95℃预变性4min，95℃ 1min，66℃ 45s，72℃ 2min，共30个循环后，72℃延伸7min补齐。以ddH2O代替模板DNA作空白对照。(3)运用鉴别引物TP-JB01S，TP-JB01X对模板DNA进行扩增。
当退火温度调整到66℃时，只有铁皮石斛能被扩增出来，而其它石斛均为阴性。在高特异性PCR鉴别反应中，若待检品为阳性扩增，则该种石斛即为铁皮石斛，用琼脂糖电泳可以检测扩增反应的结果。
运用铁皮石斛的高特异性鉴别引物可用于铁皮石斛的基因芯片的检测过程。
                           序列附表(中国石斛属常见36种植物rDNA ITS区(包括ITS1，5.8S，ITS2)的全序列数据库)1.铁皮石斛(Dendrobium officinale)[(Dendrobium candidum)《中国药典》]—广西西林居群、浙江天台山居群TCGAGACCGAACACCAACGAGCAATTTTGTGAACCCGTTAAAAAAAGCGGCGGCTCTTGCTGCTGAGATAAAATCCACTGGAGTCATCGCCTCATCCCCTCTATGGGGTGTGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTAAAATCGGCGCAGCGTAGCGCCAAGGGAATCTTGAAACACAAGCCCATAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGTTGTCGCACGCCATATCGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCAAGGCCAACCGGCTAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCTCTCCGTGCCTAATCTCCCATCCATGGATGTGTTACTAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCCTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCATCTTCTCGTTGGTTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAAAAAGGCCTATGCTATTGTGATAAGCGCGCCCGAGAGATGATCATACTTTTTAGGTGATCCCAATCATGCGCTAATCCATGGATGGCGTATCGAAT2.大苞鞘石斛(Dendrobium wardiaum)—云南居群TCGAGACTGAAACACAACGAGCGATTTTGAGAACCCGTAAAAATAAGCGGCGGCTCTTGCTGCTGAAACAAAATCCAGCCCGGTCATCGCCTCTTCCCCTTTTCGGGGTGGGGACATGATCAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCCTCGCGCCAAGGCAATATCAAAACACAAGCCTTAAAATGGGTTACGTGGGATGGGGTGCTGTGCACGCCATATCGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTTTGTCGCTCCGTGTCTAGTCTCCCATCGATGGATGTGCTGGCGAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGAGCTGCAGGGCGGGTCGTCTTCTCGTTGGCTGCGGGCAATAGAGGGTGGATTAAAGAGAAGGCCTATGCTATTGTGTCGAGCGTGCCGGAGAGATGATCAAACATTTTTAGGTGATCCCAATTCTTGCGTCGATCCACGGATGGCGTTGTAAT3.细茎石斛(Dendrobium moniliforme)—云南、广西居群TCGAGACCGAAACACAACGAGCGATTTTGTGAACCTGTAAAAATAAGCGGTGGCTCTTGCTGCTGCGATAAAATCCACCCGAGTCATCGCCTCATCCCCTCTTTGGGGTGGGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCGTTGCGCCAAGGGAATCTTGAAGCACAAGCCCATAAATGGGTTTCGTGGGATGGGGTGCTGTCGCACGCCATATTGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCTGAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCACTCCGTGCCTACTCTCCCATCCATGGATGTGTTGCTAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCGTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCATCTTCTCGTTGGTTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAATAAGGCCTATGCTATTGTGTCAAGCGCGCCCGAGAGATGATCATACTTTTTAGGTGATCCCAATTCATGCGTTGATCCAGGAGGCGTATCGAAT4.粉花石斛(Dendrobium loddigesii)—广西居群TCGAGACTGAAATATATTGAGCGATCTTGAGAACCCGTCAAAATAAGCGATGGCTATAGTTGTCGAGATAAAATTCATCCCAGTCGTCATGTCATCCTCTTTTGCGGGGTTGGGGACATGATGAAGGATGGATGAACCCACAAATCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGAAATAATGAAATACGAGCCCTAAAATGGGTTTTATGAAATGGGGTGTTGTTGCATTCCTTATGATTGACATGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAGTCATTTTATCGCTCTGTGCCAAGCTACCCATCGATTGATGTGTTGGCGAAGGCTTGGATGTGCATTATGGCTCATCGTGCCCCCTGGCGCGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGACTGAAGGGAGACCTATGCTATTGTGTCGTGCATGCCTAAGAGTTGATCATACCTTTGAGGAGATCCCAAATCATGCGTCGATCTATGGACGGCGCTTTGAAT5.串珠石斛(Dendrobium falconeri)—云南居群TCGAGACCGAAACACATTGAGCGATTTTGACAACCCGTAAAATTAAGCGGCGGCACTTGCTGCTGAGATAAAATCCACCCAAATCATTAGCCTTATCCCTCTTAGGGGCTGGGGACGTGATGAAGGTTGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGTAATATCGAAACACAAGCCTTTGAATGGGTTTTGTGGGATTGGGTGCTATCGCACACCATATCGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAGCCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTTTGTCGCTCCGTGCCTAGTCTCCCATCGATCGATGTGCTGGCGAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGGGCTGAAGGATGGGTTATCTTTTCGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGATTAAAGAGAAGGCTATGCTATTGTGTCAAGCGTGCCTGAGTGATGATCATACTTTTACGGAGATCCATTCATGCGTCGATCCCAGGATGGCGTGGAAT6.肿节石斛(Dendrobium pendulum)—云南居群TCGAGACTGAAACACAACGAGCGATTTTGAGAACTCGTAATAATAAGCGGTGGCTCTTGCTGCTGAGATAAAATCCAGCCCAGTCATCGCCTCTTCCCTTTTTGGGGTGGGGACGTGATCAAGGATGGATGAACCATCAAATCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGCAATATAAAAACACAAGCCTTAAATTGGGTTTCGTGAGATGGGGTGCTGTCGCACGCCATATCGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTAGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGTCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCGTTTTGTCGCTTCGTGCCTAGCCACCCATCGATGGATGTGTTGGCCAGGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGGGCTGAAGTGTGGGTCGTCTTCTCACTGGCTGCGAACAATAGGGGGTGGATAAAAGAGAAGGCTCTACTATTGTGTCGAGCGTGCCGGAGAGGTGGTTATATAATTTTTCGTGATCCCAATTCAAGCGTCGATCCACGGATGGCGTTTGCAAT7.报春石斛(Dendrobium primulinum)—云南居群TCGAGACTGAAATATATTGAGCGATCTTGAGAACCTGTCAAAATAAGTGGTGGCTATAGCTACCGAGATAAAATTCATCCCAATCGTTGCCTAATCCCCTCTTCGGGGTGTGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCCAAAATCGGCGCAGCGTCGCGCCAAGGGAATATCGAAACACAAGCCCTAAAATGGGATTTGTGGAATGGGGTGCTGTAGCATCTATAATATGGTTTGAAATACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAATCGGCCAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAGACATTTTGTCGCTTCGTGCCTAGCCACCCATCGATGGATGTGTTGGCCAGGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCATCGTCTTGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGATTAAAGCGATGCCTATGATATTGTGTCGTGCATGCCTAAGAGATGATCATAACTTTGAGGTGATCCCAAATCATGCGTTGATCCACGGATGGTGCTTGAAT8.兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)—云南居群TCGAGACTGAAATACATCGAGCGATCTTGAGAACCCGTCAAAATAAGTGGTGGCTATAGCTGCCGAGATAATATTCATTTGAATCATCGTCTCATCCCCTCATTGGGGTTGGGACGTGATGAAGGATGGATAGAACCCCAAATCGGCGCAGCGTTGCGCCAAGGAAACATTGAAACATGAGCCCTAAAATGGGTTTAGTAGAATGGGGTGTTGTTACATGCCATAAGAATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAACAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAATCGGCCAAGGGCACGTCCGCCTGGGTGTCATACATTTTATCGCTCCATGCCTAGCCACACATCGATGGATGTATTGGCAAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGCACGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAACAATACGTGGTGGATTAAAGCAAGGCCGATGCTATTGTGTCGTGCATGCCTAAGAGATGATCATACCTTTGAGGTGATCCCAAATCATGCGTTGATCCATGGATGGCGCTTTGAAT9.杯鞘石斛(Dendrobium gratiosissimum)—云南居群TCGAGACTGAAACACAACGAGCGATTTTGAGAACCCGTTAAAATAAGCGGCAGCTCTTGCTGCTGAGACAAAATCCAGCCCGGTCATCGCCTCTTCCCCTTTTGGGGTGGGGGCGTGATCAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCCTCGCGCCAAGGCAATATCAAACACAAGCCTTAAAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGCTGTGCACGCCATATTGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTTTGTCGCTCCGTGTCTAGTCTCCCATCGATGGATGTGCTGGCGAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCGTGGTGCCCCACGGTGCGGCGGGTTGAAGGGCGGGTCCTCTTCTCGTTGGCTGCGGACAATAGAGGGTGGATTAAAAGAAGGCCTATGCTATTGTGTCGAGCGTGCCGGAGAGATGATCATTCTTTTTAGGTGATCCCAATTCATGCGTCGATCCACGGATGGCGTTGTAAT10.霍山石斛(Dendrobium huoshanense)—安徽霍山居群TCGAGACCGAAACACAACGAGCGATTTTGTGAACCTGTAAAAATAAGCGGTGGCTCTTGCTGCTGCGATAAAATCCACCCGAGTCATCGCCTCATCCCCTCTTTGGGGTGGGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCGTAGCGCCAAGGGAATCTTGAAGCACAAGCCCATAAATGGGTTTCGTGGGATGGGGTGCTGTCGCACGCCATATTGATTGACACGACTCTCGGCAATGTATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCTGAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTGTCGCTCCGTGCCTAGTCTCCCATCGATCGATGTGCTGGCGAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCGTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCATCTTCTCGTTGGCTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAATAAGGCCTATGCTATTGTGTCAAGCGCGCCCGAGAGATGGTCATACTTTTTAGGTGATCCCAATTCATGCGTTGATCCATGGATGGCGTATGAAT11.晶帽石斛(Dendrobium crystallinum)—云南居群TCGAGACCGAAACACAACGAGCGATTTTGAGAACCCGTTAAAATAATTTGGTGGCTCTTGCTGCCTGATAAAATCCACCCCAGTCATCGCCGCATGCCCTCTTTGGGGCGGGGACGTGATGAAGGATGGATGTACCCTCAAATCGGCGCAGCGTCGCGCCAAGGGAATCTTGAAACACAAGCCCAAAAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGCTGTCGCACGCCATATTGATTGACACGACTTTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCTGAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTGTTCGCTCCGTGTCTAGTCTCCCATCGATGGATGTGCTGGCGAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCCGGTCATCTTCTCGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGATAAAAGAGAAGGCCTGTGATATTGTGTCGGCGTGCCTGAGAGATGATCGTACCTTTTTAGGTGATCCCAATTCATGCGTCGATCCTCGGATGGCGTTTGAAT12.罗河石斛(Dendrobium lohohense)—云南居群TCGAGACCGAAACACATCGAGCAATTTTGAGAACCTGTCAAAATAAGCGGTGGATATTGCTGCTGCGACATAATCCATCCAAGTCGTCGCCTCATCCCATCTCGGGGCGGGGACGCGACGAAGGATGGATGAACCCTCAAACCGGCGCAGCGTTGCGCCAAGGGAATCATCAAACATGAGCCCTAGAATGGGTTTTGTGGCATTGGGTGTTATTCACGCCATATGGATTGACACGACTTTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTACATCTCTCCACGTCAAGTCACCCTTCGATGGATGGGCTGGCGAAGGCTTGGATGTGCACAGTGGCTCGTCGTGCCACTTGGTGCGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCGTCATCCTCTTGGCCGCGAACAATAATGGGTGGATTAAAGCGATGCCTAAGTTATTGTGTCGTGCATGCCTAAGAGATGATTATACTTTTAAGTGATCCCAATTCATGCGTCGATCCAGGATGACGTTTTGAAT13.齿瓣石斛(Dendrobium devonianum)—云南居群TCGAGACCGAATTATATCGAGTGATTTATATAACCTGTAAAAATTTGCGTTGGCTATTGCTGCCGAAATAAAATCTATCCCAATCATCATCTGAACCCCCCTCCTTGGGGCGGAGATGCGATGAAGGATGGATGAACCCCAAACCGGCGCAGCATTGCGCCAAGTGAATAACGAAACAATATCCCTAAAATGGGTTTTGTAGCATGGCAATGCTATTGCATGCCATATGGATTGACATGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTTAGATGCTCCGTGCCTTGTCATCAATTTATGGAAGTGTTGGTGAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCGTCGTGCTCCTCGGCACGGCGGGCTGAAGAGCGGGGCATCATCTCGTTGGCTGCGTACAATAAGTGGTGGATAAAGGATAAGGCCTATTGTATTGTGCGTGCTAGCCCGAGAGATGATCATATTATTTTGGTGATCCCAAATCATGCGTCCATCCTTAGATGACGTTTTGAAT14.玫瑰石斛(Dendrobium crepidatum)—云南居群TCGAGCCGAAATACATCGAGCAATTGTAGACCCTGTCAACATAAGTGGTGGCTACTGCTAAATCCATTCCAATCATTGCCTTGTCCCCTCTTTGCGGTTGGGATGTGATGAAGAGATGGGTGAACCCTCAAACCGGCGCAGCATCGCGTCAATGGAAAAATCAAAACACAAGTCCAAAAATGGGTTTTGTGGCATGGGGTGCTTTTGCTGGCCCCTTATGGATTGACACGACTTTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAATCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTTTGTTGCTCCGTGTCCACCTCACGATGGATGTGCTGGTGTAGGCTCGGATGTGCATGCTGGCTCGTCGTATCACCCCAGGTGCGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCATCTATCTCGTTTGCGGGCCAACTAATAAGGGGTGGATTGAAGAGAGGTCTATGCTATTTTGTCGTGCATGCGCTGAGAGATGATTAACTTTTTTGTGATCCCAAATC?TGCATCGATC？TGGATGATGCTTTGAAT15.束花石斛(Dendrobium chrysanthum)—云南居群TCGAGACCGAAATACCTCGAGCGATCTTGAGAACCCGTCAAAATAAGCGGTGGCTACTGCTGCCGAGATAAAATCCATCCAAGACATCGCCCCATACCCTCTTTGCGGTGAGGACGTGATGAAGGATGGATGAAACCTCAAACCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGGAAATTAGAAACACGAGCCCTAAAATGGGTTTTGTGGCATGGGGTGCTGTTGCTCGCTCCATATGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTATTTGAACGCAAGTTGCGCCCAAGGCCAACCTGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTTTGTTGCTCCGTGTCTCGTCACCCATCAATGGATGTGCTGGCGAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCCCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGGGCTTAAGAGCGGGTCGCCATCTCGTTGGTTGCGAACAATAAGGGGTGGATTAAATGGAGGCCTATGCTATTGTGTCGTGCATGCCTAAGAGATTAAATTTTTTAGGTGATCCCAAATCACGCGTCGATCCACGGATGAGCTTGAAT16.喇叭唇石斛(Dendrobium lituiflorum)—云南居群TCGAGACTGAAACACGAGCGATTTTGAGAACCCGTAAAAATAAGCGGCGGCTCTTGCTGCTGAGACAAAATCCAGCCCGATCATCGCCTCTTCCCCTTTTTGGGGTGGGGACGCGATCAAGGATGGATGGACCCTCAAATCGGCGCAGCGTCGCGCCAAGGCAATATCAAAACACAAGCCTTAAAATGGGTTTCGTGGGATGGGGTGCTGTGCACGCCATATCGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGTGTCAAGCATTTTGTCGCTCCGTGTCTAGTCTCCCATCGTTGGATGTGCTGGTGAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCCCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGGGCTGAAGGGTCGATTGTCTTCTCGTTGGCTGCGGACAATAGAGGGTGGATTAAAATGAAGGCCTATGCTATTGTGTCGAGCATGCTGGAGAGATGATCGTACATATTTAGGCGATCCCAATTCATGCGTCAATCCATGGATGGCGTTTGGAAT17.重唇石斛(Dendrobium hercoglossum)—云南居群TCGAGACCGAAACACAATGAGCGATTTTGTGAACCTGTAAAAATAAGCGGTGCCTGTAGTGCTGCGATAAAATCCCACTCGAGTCATCGC？TCATCCCCCTCTTTGGGGTGGGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCGTAGCGCCAAGGGAATCTTGAAACACAAGCCCATAAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGCTGTCGCACGCCATATTGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCTGAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCGCTCCGTGCCTAGTCTCCCATCCATGGATGTGTTGCCAAGGCTCGGATGTGC？CGGTGGCTCGTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCATCTTCTCGTTGGCTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAATAAGGCCTATGCTATTGTGTCAAGCGCGCCTGAGAGATGGTCATACTTATTAGGTGACCCAATTCATGCGTCGATCCAGGAGGCGTATCGAAT18.曲茎石斛(Dendrobium flexicaule)—河南居群TCGAGACCGAACACCAACGAGCAATTTTGTGAACCCGTTAAAAAAAGCGGCGGCTCTTGCTGCTGAGATAAAATCCACTGGAGTCATCGCCTCATCCCCTTTATGGGGTGTGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTAAAATCGGCGCAGCGTAGCGCCAAGGGAATCTTGAAACACAAGCCCATAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGTTGTCGCACGCCATATGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCAAGGCCAACCGGCTAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCTCTCCGTGCCTAATCTCCCATCCATGGATGTGTTACTAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCCTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCATCTTCTCGTTGGTTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAAAAAGGTCTATGCGATTGTGATAAGCGCGCCCGTGAGATGATCATACTTTTTAGGTGAGCCCAATTCATGCGCTAATCCAGGAGGCGTATCGAAT19.钩状石斛(Dendrobium aduncum)—广西居群TCGAGACCGAAACACAACGAGCAATTTCGTGAACCCGTAAAAATAAGCGGTGGCTCTTGCTGCTGAGATAAAATCCACCCGAGTCATCGCCTCATCCCCTCTTTGGGGCGGGGATGTGATGAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCGTAGCGCCAAGGGAATCTTGAAACACAAGCCCATAAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGTTGTCGCACGCCATATCAATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCTAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCGCTCCGTGCCTAATCTCCCATCCATGTATGTGTTGCAAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCCTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGCCGGGTCATCTTCTCGTTGGTTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAACAAGGCCATAGCTGTTGTGATATGCGCGCCCGAGAGATGATCATACTTTTTAGGTGATCCCAATTCATGCGCTGATCCAGGAGGCGTATCGAAT20.伏牛石斛(Dendrobium funiushanense)—河南居群TCGAGACCGAAACACAACGAGCGATTTTGTGAACCTGTAAAAATAAGCGGTGGCTCTTGCTGCTGCGATAAAATCCACCCGAGTCATCGCCTCATCCCCTCTTTGGGGTGGGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCGTAGCGCCAAGGGAATCTTGAAACACAAGCCTATAAATGGGTTTTGTGGTATGGGGTGTTGTCGCACGCCATATTGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACTGGCTGAGGGAACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCACTCTGTGCCTAGTCTCCCATCCATGGATGTGTTGCCAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCGTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCTGGTCATCTTCTCGTTGGCTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAATAAGGCCTATGCTATTGTGTCAAGCGCGCCTGAGAGATGGTCATACTTTTCTATGTGATCCCAATTCATGCGTTGATCCAGGAGGCGTATCGAAT21.竹枝石斛(Dendrobium salaccense)—云南居群TCGAGACCGAAATATATCGAGCAATTTTGAGAACCTGTCAAAATAAGCGGTGGATATTGCTGCTGCGACATAATCCATCCAAGTCGTCGCCTCATCCCATCTTCGGGGCGGGGACGCGACGAAGGATGGATGAACCCTCAAACCGGCGCAGCGTTGTGCCAAGGGAATATCAAAACATGAGCCCTAGAATGGGTTTTTGTGGCATTGGGTGTTATTGCACGCCATATGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTACATCGCTCCATGTCAAGTCACCCTTCGATGGATGGGCTGGCGAAGGCTTGGATGTGCACAGTGGCTCGTCGTGCCACTTGGTGCGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCGTCATCCTCTTGGCCGCGAACAATAATGGGTGGATTAAAGCGATGCCTAAGTTATTGTGTGTGCATGCCTAAGAGATGATTATACTTTTTAAGTGATCCCAATTCATGCGTCGATCCATGGATGACGTTTTTGAAT22.鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum)—云南居群TCGAGACCGAAATACACCGAGCGATCTTGAGAACCCATCAAAACAAGCAGGGGCTAATGCTGCTGCAGAAAAAATTCATCCCAGTCGGTGCCTCATCCCAACCTTGGGGTGGGGACGTGACAAAGGATGGACGAACCCACAAACCGGCGCAGCGTCGCGCCAAGGGATTATCGAAACATGAGACCTAAAATAGGTTTTGTGGCTTGGGGTGCTGCTGCACGCCATATGGATTGGCACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAATCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCGTTACGTCGCTCCGTGTCCAGCCACCCGTCGATGGATGGGCTGGCGATGGCTCGGATGTGCACAGTGGCTCCTCGTGCCCCTCGGCACGGCGGGCTTAAGAGCGGGTAATCATCTCGTTGGCTGCGAACAATATGGGGTGGATAAATGCGATGCTTATGATATTGTGCCGTGCATGCCCGAGAGATGATCATACTTATTCAGGTGATCCCAAACCATGCGTCGATCCATGGATGGCGTTTTGAAT23.密花石斛(Dendrobium densiflorum)—云南居群TCGAGACCAAAATAAATCGAGCGATTTGGAGAACCGGTCAAAATAAGCGGTGATTATTATTTCCGTGATGAACGCCATCCCAGTCGTTACCTCATCCCCTTAGGGTCGAGGATGCGAGTAAGGATGGATGAACACTCAAGCCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGGAAATATCGAAACATGAGCCCTTAAATGGGTTTGGTGGAATGGGGTGCTGTTGCACGCCATATGGATTGACATGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCACGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACTGGCCAAGGGCACGTTTGCCTGGGCGTCAAGCGTTATGTCGCTTCGTGTCAACTCCATCCCGTCGATGTATGGGCTGGCGAAGGCTCGGATGTGCAGAGTGGCTCATCGTGCCCCTCGGTGCGGCGAGCTGAAGAGCGGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAACGATAAGGGGTGGATTAAAGCGAGGCCTATGTTATTGTGTCGTGTATGCTCGAGAGAAGATTATACATACTCAGGAGATCCCAAATCATGCGTCGATCAAAGGATGGCGCTTGGAAT24.球花石斛(Dendrobium thyrsiflorum)—云南居群TCGAGACCAAAATAAATCGAGCGATTTGGAGAACCGGTCAAAATAAGCGGTGATTATTATTTCCGTGATGAACGCCATCCCAGTCGTTACCTCATCCCCTTAGGGTCGAGGATGCGAGTAAGGATGGATGAACACTCAAGCCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGGAAATATCGAAACATGAGCCCTTAAATGGGTTTGGTGGAATGGGGTGCTGTTGCACGCCATATGGATTGACATGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCACGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACTGGCCAAGGGCACGTTTGCCTGGGCGTCAAGCGTTATGTCGCTTCGTGTCAACTCCATCCCGTCGATGTATGGGCTGGCGAAGGCTCGGATGTGCAGAGTGGCTCATCGTGCCCCTCGGTGCGGCGAGCTGAAGAGCGGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAACGATAAGGGGTGGATTAAAGCGAGGCCTATGTTATTGTGTCGTGTATGCTCGAGAGAAGATTATACATACTCAGGAGATCCCAAATCATGCGTCGATCAAAGGATGGCGCTTGGAAT25.细叶石斛(Dendrobium hancockii)—云南居群TCGAGACCGAAATACATCGAGCGATTTTGAGAACTCGTCAAAATAAGAGGTGGCTGTTGCTGCTTCGATAAAATCCGTCTCAGTCGTCGCCTCATCCCCTCTTTGGGGCGGGGGCGCGATGAAGGATGGATGAACACTCAAACCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGCAATATCGAAACACGAGCCCTAAAATGGGTTTTATGGCTTGGTGTGCTTTTGCACGCCATATGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCGATCGTTACGTCGCTCCGTGTCAAAGTCCCCCATCGTCGGATGGGTTGGCGAAGGCTCGGACGTGCACAGTGGCTCGTCGTGCCCCCCGGCGCGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCATCATCTCGTTGGATGCGGACAATAAGGGGTGGATTAAAGTGAGGCCTATGTTATTGTGCCGTGCATGCCTAAGAGATGATAGTGCTTTTTTGGTGATCCCAAATCATGCGCCGATCCACAGATGGCGTTTTGAAT26.线叶石斛(Dendrobium aurantiacum)—广西居群TCGAGACCGAAATGCATCGAGTGATCTTGAGAACCCATCAAAATAAGCGGTGGCCGCTGCTGCTGCGAAAAAGATCCAGCCCAGTCGTCGCCTCGCCCCAGCCTTGGGGCGGGGACCCGACGAAGGACGGATGAACTCTCAAACCGGCGCAGCGTCGCGCCAAGGAAAAATTGAAACACGAGACCTAAAAAGGGCTCTGTGGCTTGGGGTGCTGTTGCATGCCATATGGATTCACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGTGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACAGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCGTTACGTCGCTCCATGCCAAGTCACCCATCGATGGATGGGCCGGTGAAGGCTCGGATGTGCATAGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCATTATCTTGTTGGCTGCGGCAATAATGGGTGGATAAACGCGAGGCCTATGTTATTGTGTCGTGCATGCCTAAGATATGATTAAACTTTTTAGGTGATCCCAAATCATGCGTCGATCCACGGATGGCGTTTTGAAT27.长苏石斛(Dendrobium brymerianum)—云南居群TCGAGACCGAAATACATCGAGCGATCTTGAGAACCCATCAAAATAAGCGGTGGCTATTGCTGCTGCGAATAAAATCCATCCCAATTATCGCCTCATCCCATCCTAGGGGCGGGGACGTGATAAAGGATGGATGAACCCTCAAACCGGCGCAGCGTCGCGCCAAGGCAATATTGAAACACGAGCCCTAAATCGGGTTTTGTGGCTTGGGGTGCTGTTGCACGTCATCTGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGTGTCAAGCGTTGCGTCGCTCCGTGTCAAGTCACCCATTGATGGATGGGTTGGCGAAGGCTTGGATGTGCATAGTGGCTCGTCGTGCCCCTCAGCGCGGCGGGCTGAAGAGTGGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAATAATAAGGGGTGGATAAAAGCGAGGCAGATGTTATTGTGTTGTGCATGCCTAAGAGATGATTATACTTTTAAGATGATCCCAAATCATGCGTCGATCCATGGATGGCGTTTTGAAT28.流苏石斛(Dendrobium fimbriatum)—云南居群TCGAGACCGAAATACATCGAGCGATTTGGAGAACTTGTCAAAATAAGCGGTGGCTATTGCTGTCGTGATAAAATCCATCCCAGTCATTGCTTCATCCCCTTCTGGGCGGGGATGCGATGAAGGATGGATGAACAATCAAACCGGCGCAGCATTGCGCCAAGGGAATATCGAAACACGAGCCCCAAAATGGGTTTGGTGGCATGGGGTGCTGCTGCATACCATATGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTTGCCTCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTATTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCGTTACGTCACTCCGTGTCAAGTCATCCCATCGATGGATGGGCTGGCGAGTGCTCGGATGTGCAGAGTGGCTCCTCGTGCCCCTCGGCGCGGTGTGCTGAAGAGCAGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGATTAAATCAAGGCCTATGTTATTGTGTCGTATGCCTTAGAGAAGATCATACTTTTTGGGAGATCCAAAATCATGCGTCGATCCATGGATGGCGTTTGAAT29.短棒石斛(Dendrobium capillipes)—云南居群TCGAGACCGAAATGTATCGAGCGATTTGGAGAACCTGTCAAAAGATGCGGCAGCTATTGTTGCTGCATTAAAACTGTCCCAGTCGTCATCTCATCCCCTTTGGGGCGGGAGCGCGATGAAGGATGGAAGAACACTCAAACCGGTGCAATATCGCGCCAAGGAAATATCAAAATATGAGCCCCTAAATGGGTTTGTTGGCATTGGGTGATATTGCACTCATGTGGATTGACATGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGTGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCCGCCTGGGTGTCAAGCATTATGTTGCTCCATGCCAACTCTATCCCATCGAAGGATGGGATGGCGAAGGCTTGGATGTGTAGAGTGGCTCGTCGTGTCCAACGGTGCGGCGGGCTCAAAAGCGGTTCTTCATCTCACTGGCTGAGAACAATAACGGGTGGATTTAAGCGAGGCCTATGTTATTGTGTCGTGCATGCCACCGAGAAGATTATACTTATTCAGGTCATCCCAAGCCAAGCACTGATCCAAGGATGGCGTTTGGAAT30.棒节石斛(Dendrobium findlayanum)—云南居群TCGAGACCGAAACACAGTGAGCGATTTTGTGAACCCGTAAAAATAAGCGGCGGCTTTTGCTGCTGAGATAAAATCCACTCGAGTCATCGCCTCATCCCCTCTTTGGGGCGGGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCGAAGCGCCAAGGGAATCTTGAAACACAAGCCCATAAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGCTGCCGCACGCCATATCGATTGACATGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAATCGGCTAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCGCTCCGTGCCTAGTCTCCCATCCAAGGATGTGTTGCCAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCGTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCATCTTCTCGTTGGCTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAATAAGGCCTATGCTATTGTGTCAAGCGCGCCTGAGAGATGATCATACTTTTTAGGTGATCCCAATTCATGCGCCGATCCATGGATGGCGTATCTGAAT31金钗石斛(Dendrobium nobile)—云南丽江居群TCGAGACCGAAACACAATGAGCGATTTTGTGAACCTGTAAAAATAAGCGGTGCCTGTAGTGCTGCGATAAAATCCACTCGAGTCATCGCCTCATCCCCTCTTTGGGGTGGGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCGTAGCGCCAAGGGAATCTTGAAACACAAGCCCATAAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGCTGTCGCACGCCATATTGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCTGAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCGCTCCGTGCCTAGTCTCCCATCCATGGATGTGTTGCCAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCGTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCATCTTCTCGTTGGCTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAATAAGGCCTATGCTATTGTGTCAAGCGCGCCTGAGAGATGGTCATACTTATTAGGTGATCCCAATTCATGCGTCGATCCATGGATGGCGTATCGAAT32.反瓣石斛(Dendrobium ellipsophyllum)—云南居群TCGAGACCGAAATACATCGAGCGATTTGGAGAACCCGTCAAAGTAAGCGGTGGCTATCGTTGCCATGATGAAAGCCATCCCAGATGCTGCCTCATCCCCTTGGGGGCGGGGAGCGTGATGAAGGATGGATGAACACTCAAATCGGCGCAGCGTCGCGCCAAGGGAATGTCGAAACACGAGATCACCAATGGGTTCTGGTGGCATGGGGTGCTGTTGCACGCCATACGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCGTTACGTCACTTCGTGTCAGCTCCATCCCATCGAAGGATGGGCTGGTGAAGGCTCGGATGTGGAGGGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCTTCATCTCGTCGGCCGCGAACAATAAGGGGTGGATTAAATCGAGGCCTGTGCTATTGTGTCGTGTGCGCCCGAGAGGAGATCATATGTTATCGGGTGATCCCAAATCATGCGTCGATCCACGGATGGCGCTCGGAAT33.翅萼石斛(Dendrobium cariniferum)—云南居群TCGAGACCGAAATACATCGAGCGATTTGGAGAACCCGTCAAAATAAGCGGTGGCTATTGTTGCCGCGATAAAATCCATCCCAATCGTTGCCTCATCCCCTTGGGGGCGGGGATGCGATGAGGGTTGGATGAACACTCAAACCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGTAGTAACGAAACTTGAGCCCTTAAATGGGTCTTGTGGCATGGGGTGCTATTGCACGCCATATGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCGTTACGTCACTCCGTGCCAACTCCATTCCATCGATGGATGGGCCGGTGAAGGCTCGGATGTGTAGAGTGGCTCGTCGTGCCCGTCGGTGCGGCGGGTTGAAGAGTGGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGAATAAAGTGAGACCTATGTTATTGTGTCGTGTATGCCTGAGAGAAGACCATTATCAGGAGATCCCAAATCATGCGTCGATCCATGAATGGCGTTTGGAAT34.黑毛石斛(Dendrobium williamsonii)—云南居群TCGAGACCGAAATACATCGAGCGATTTGGAGAACCCGTCAAAATAAGCGGTGGCTATTGTTGCCGCGATAAAATCCATCCCAATCGTTGCCTCATCCCCTTGGGGGCGGGGATGCGATGAGGGTTGGATGAACACTCAAACCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGTAGTAACGAAACTTGAGCCCTTAAATGGGTCTTGTGGCATGGGGTGCTATTGCACGCCATATGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCGTTACGTCACTCCGTGCCAACTCCATTCCATCGATGGATGGGCCGGTGAAGGCTCGGATGTGTAGAGTGGCTCGTCGTGCCCGTCGGTGCGGCGGGTTGAAGAGTGGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGAATAAAGTGAGACCTATGTTATTGTGTCGTGTATGCCTGAGAGAAGACCATTATCAGGAGATCCCAAATCATGCGTCGATCCATGAATGGCGTTTGGAAT35.景洪石斛(Dendrobium exile)—云南居群TCGAGACGAAAATATATCGAACGATTTGGAGAACTAGTAAATATAAGCCGTGGTTATTACATCTGCGAAAGAAGCCATCCCATTTGTAATCTCACATCCCATCGAGGGAGAGATCATGAATAAGGATGGTTGAACACATAAACCGGCGCAGCATAGCGCCAAGGGATAAATAGAAGCACAAGCCCTTAAATGGGTTTGAAGGCATGGTGTGCTGTTGCGCCCAATAAGGATTGACATGACTCTCGACAATGGATATCTCGGCTCTTGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTTTGTCACTCCGAGTCTATTCCATCCCTTGGATGGTGTGCTGGCAGAGGCTTGGATGTGTAGAGTGGCTCGTCGTACCCCTCGGTACGGCGGGTTGAAGAGTGGATAATCAGCTTGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGATTAAATCGAGGCCTGTGTTATTGTCTTGCGTATGCCTGAGAGAAGATTATGCATTGTTAGGTGATCCAAAATCATGCGTACATCCTCGGATGGCGTTTGGAAT36.剑叶石斛(Dendrobium acinaciforme)—云南居群
TCGAGACTAGAATACATCGAATGATTTGGATAACAAGTCAACATAAGCAGTGGATATTATATCTGCAAAAGAAGCCAT
CCTCCTCATAACCTCACATCCCCTCGATGGCGAGGTCATGAATAATGATGGAAGAACACTCAAACCGGCGCAGCATCG
CGCCAAGGGATATATCGAAGCACAAGCCCATAAATGGGTTTGGTGGCATGGTGTGCCGTTGCGCCCCATAAGGATCGA
CATGACTCTCGACAATGGATATCTCGGCTCTTGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGC
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TCAAGCATTACGTCACTCCGAGTTAATTTCATCCCTACAATGGTTGGGCTGGCAGAGGCTTGGATGTGCAGAGTGGCT
CATCGTGCCGCTCGGTGCGGTGGGCTGAAGAACGGATCATCAGCTCGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGATTAAAG
CGAGGCCTGTGTTATTGTGTCGAGTATGCCCGAGAGAATATCATGGTCAGGTGATCCCAAATCATGCGTCGATCCCTG
GATGGCGTATTGGAAT

Claims (5)

1.一种中国石斛属植物及其药材的DNA分子鉴别方法，建立中国石斛属常见植物rDNA ITS区，包括ITS1、5.8S、ITS2区的全序列数据库(见序列附表)，其特征是然后按如下步骤：(1)总DNA提取
取待检植物新鲜的茎、叶片或药材，用无菌水处理后，在液氮中研成粉末，用QIAGEN试剂盒、CTAB法以及其它方法提取总DNA。(2)PCR扩增
石斛属rDNA ITS区扩增引物P1、P2的序列如下：P1为5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3’，位于18S上；P2为5’-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’，位于26S上。利用该引物对总DNA进行PCR扩增反应，并以ddH2O代替模板DNA作空白对照。(3)PCR产物纯化
PCR产物用Wizard或Watson等试剂盒纯化，按试剂盒操作指南进行。(4)DNA序列测定
用BigDyeTM测序试剂盒进行测序反应，测序反应的参数为：Mix 1μl，纯化后的DNA片段15-45ng，Primer 1.6pmol，buffer 1.2μl，ddH2O适量，用ABI 310全自动测序仪进行序列测定。(5)DNA序列数据分析及种类的鉴别
待检种的rDNA ITS区的序列一经测定，用对位排列软件进行对位排列，并辅以人工校对，用遗传分析软件分析各待检种样品DNA序列与数据库中各序列间的差异。通过分析比较，最终判断出待检种所属的物种。
2.根据权利要求1的中国石斛属植物及其药材的DNA分子鉴别方法，其特征是所说的对位排列软件是Clustal软件。
3.根据权利要求1的中国石斛属植物及其药材的DNA分子鉴别方法，其特征是所说的DNA遗传分析软件是MEGA软件。
4.根据权利要求1的中国石斛属植物及其药材的DNA分子鉴别方法，其特征是所说的DNA遗传分析软件是PAUP软件。
5.铁皮石斛原植物及药材的高特异性PCR鉴别方法，其特征是对照所测中国石斛属植物的DNA序列数据库，设计出鉴别铁皮石斛的高特异性鉴别引物，铁皮石斛鉴别引物为：上游鉴别引物TP-JB01S：5’-GTGCTGCTGAGATAAAATCCACTG-3’下游鉴别引物TP-JB01X：5’-CCACCATGCACATCCGAGCCTTAGT-3’；具体步骤为：(1)总DNA提取
取待检植物新鲜的茎、叶片或药材，用无菌水处理后，在液氮中研成粉末，用QIAGEN试剂盒、CTAB法以及其它方法提取总DNA。(2)模板DNA的质量检测
运用引物P1、P2，序列如下：P1为5’-CGTAACAAGGTTT CCGTAGGTGAAC-3’，位于18S上；P2为5’-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’，位于26S上，利用该引物对总DNA进行PCR扩增反应，对待检品总DNA进行扩增，以验证模板DNA的质量、调整模板DNA的浓度。(3)运用鉴别引物TP-JB01S，TP-JB01X对模板DNA进行扩增，将退火温度升至66℃，能被扩增出来的即是铁皮石斛，而其它石斛均为阴性。
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